KR20050054005A

KR20050054005A - 인체 인터페론 알파의 제조방법

Info

Publication number: KR20050054005A
Application number: KR1020030087274A
Authority: KR
Inventors: 정종상; 백민지; 안지원; 김기완; 박형기; 이동억; 이현수; 고형곤; 오명석
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2003-12-03
Filing date: 2003-12-03
Publication date: 2005-06-10
Also published as: WO2005054287A1; KR100531670B1

Abstract

본 발명은 (a) 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균의 배양액으로부터 얻어진 대장균 세포를 파쇄하고 인터페론 알파를 변성(denaturation)시킨 다음, 숙성시키는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 용액을 농축하여 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 용출액을 요소를 포함하는 완충용액을 가하여 재구성(refolding)시키는 단계; (d) 단계(c)에서 얻어진 용액을 양이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; 및 (e) 단계(d)에서 얻어진 용출액을 겔-여과 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계를 포함하는 인체 인터페론 알파의 제조방법을 제공하며, 본 발명의 제조방법에 따라 활성형의 인체 인터페론 알파를 높은 수율 및 순도로 제조할 수 있다.

Description

인체 인터페론 알파의 제조방법{Processes for preparing interferon alpha}

본 발명은 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균의 배양액으로부터 활성형의 인터페론 알파를 높은 순도 및 수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

인터페론은 넓은 의미에서 숙주의 반응성을 매개하는 세포 외 메신저로서 상대적으로 작은 크기로 세포 밖으로 분비되며 진화적으로 보존되고 있는 단백질 그룹이다.

바이러스, 이중-가닥 RNA, 각 종미생물 그리고 TNF나 IL1과 같은 사이토카인류에 의해 인터페론을 생산하는 세포들이 인터페론을 생산하여 외부로 분비하면, 분비된 인터페론은 주변에 인터페론의 수용체를 가진 세포의 표면에 결합하게 되고 그 세포의 내부에서 연쇄적인 신호 전달 작용에 의해 숙주에게 반응성과 항상성을 유지할 수 있도록 다양한 단백질들의 합성을 유도하게 된다. 그러므로 인터페론은 생체 내에서 항 바이러스성, 항 분화성, 면역 신호전달 단백질로서 작용하게 되며, 또한 암세포에 대해 직접적으로 항 분화 효과를 보이므로 치료제로서 관심이 매우 높다 (Postka S., Langer J. A. and Zoon K. C. (1987) Interferons and their actions, Annu. Rev. Biochem. 56:727-777).

인터페론은 나선형의 생리활성물질로 분류되며, 물리화학적, 기능적 특징에 따라 1형과 2형의 두 가지로 분류된다. 1형 인터페론은 알파-, 베타-, 타우-, 입실론-인터페론이 있고(Weissman C. and Weber H. (1986) The Interferon genes, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 33:251-300) 2형 인터페론에는 감마 인터페론이 존재한다. 이들 중 1형 인터페론에 속하는 인터페론 알파는 종 특이적인 특성을 나타내는 단백질로서 같은 1형 그룹으로 분류되는 인터페론 베타와 세포 표면의 동일한 수용체에 결합하여 세포 내에서 일련의 신호전달 체계에 의해 항 바이러스성 인자들의 전사를 유도한다.

인터페론 알파는 생산되는 위치에 따라 류코사이트(leukocyte) 인터페론으로도 불리우며 165개의 아미노산으로 구성되어 있고 2개의 이황화 결합이 있는 단일사슬의 단백질이다. 그러나 E.coli 시스템에서 발현된 인터페론 알파는 단일클론 항체 친화성 크로마토그래피 후에 잘못 결합된 이황화 결합이 존재하거나 이황화 결합이 1개만 결합되고 다른 하나는 결합을 이루지 못하고 있거나 또는 2개 모두 결합을 형성하지 못하고 존재하는 알파 인터페론이 함께 혼재하게 된다(S. Pestka and S. J. Tarnowski, Purification of the interferons. Pharma. Theraphy 29;299-319, 1986) 2개의 이황화 결합을 정확히 형성한 인터페론 알파는 SDS-PAGE상에서 제 크기에 이동하게 되지만(FMM, fast-moving monomer) 잘못 결합되거나 결합이 완전하지 못하고 불완전하게 재구성된 인터페론 알파는 제 크기보다 조금 더 큰 위치, 즉 제 크기보다 더 느린 위치에(SMM, slow-moving monomer) 이동하게 된다. 이 SMM들은 구조적으로 불안정하여 정제 공정이 진행되는 중에 지속적으로 올리고머를 형성하거나 HPLC 상에서 불순물로 행동하며, 공정이 완료된 후에 남아있게 되는 SMM들은 생물학적 활성도 상대적으로 FMM보다 낮게 측정되는 경향이 있다 (H. Moorehead et al., Roles of the 29-138 disulfide bond of subtype A of human α interferon in its antiviral activity and conformational stability, Biochemistry 23; 2500-07, 1984).

많은 문헌에서 인터페론 알파의 FMM과 SMM을 분리하는 방법에 대해 언급하고 있다. 즉, 상대적으로 고온과 산성 pH에서 인터페론 알파를 유지시켜 중합체와 SMM을 제거하거나, 변형된 금속 킬레이트 크로마토그래피법을 이용하는 방법, 산화환원제로 올리고머를 단량체로 변환시키는 방법, 역상 HPLC와 CM 컬럼으로 SMM을 제거하는 방법 등이 알려져 있다(EP108585, A. M. Felix et al., Analysis of different forms of recombinant human leukocyte interferons by high performance liquid chromatography, Methods in enzymology, 119; 242-48, 1986, US4432895, US4765903). 그러나 이들 방법들은 모두 SMM을 FMM으로부터 제거하는 방법으로서 실제 적용시 순도를 어느 정도 높일 수는 있지만 수율이 감소되는 문제점이 있다.

또한, 최근에는 대장균에서 생산된 인터페론 알파를 재구성한 후 단일의 컬럼 공정만으로 정제를 완성하여 수율을 높이려는 노력이 있었다. 그러나 색소-친화성(dye-affinity) 크로마토그래피을 사용한 공정에서는 수율을 높일 수는 있었지만 순도면에서는 여전히 SMM이 최종 정제원액에 포함되어 있었고 (S. Swaminathan and N. Khanna, Affinity Purification of Recombinant Interferon-α on a Mimetic Ligand Adsorbent, Protein Expression and Purification, 15;236-242, 1999), Q-세파로스 컬럼을 사용한 공정에서는 수율이 약 7.5%에 불과하다는 문제가 있다(K. R. Babu, S. Swaminathan, S. Marten, N. Khanna and U. Rinas, Production of Interferon-α in high cell density cultures of recombinant Escherichia coli and its single step purification from refolded inclusion body proteins, Appl. Microbiol. Biotechnol., 53; 655-660, 2000).

본 발명자들은 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균의 배양액으로부터 활성형의 인터페론 알파를 높은 순도 및 수율로 제조하는 방법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, SMM을 FMM으로 즉, 이황화 결합이 없거나 불완전한 비활성의 인터페론 알파를 완전한 이황화 결합을 갖는 활성형의 인터페론 알파로 전환시킴으로써 최종 산물의 순도 및 수율을 증가시키는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균으로부터 활성형의 인터페론 알파를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균의 배양액으로부터 얻어진 대장균 세포를 파쇄하고 인터페론 알파를 변성(denaturation)시킨 다음, 숙성시키는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 용액을 농축하여 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; (c) 단계(b)에서 얻어진 용출액을 요소를 포함하는 완충용액을 가하여 재구성(refolding)시키는 단계; (d) 단계(c)에서 얻어진 용액을 양이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; 및 (e) 단계(d)에서 얻어진 용출액을 겔-여과 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계를 포함하는 인체 인터페론 알파의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제조방법은 SMM을 FMM으로 즉, 이황화 결합이 없거나 불완전한 비활성의 인터페론 알파를 완전한 이황화 결합을 갖는 활성형의 인터페론 알파로 전환시키는 공정을 포함함으로써 최종 산물의 순도 및 수율을 동시에 증가시킬 수 있다. 본 발명의 제조방법은 종래의 제조방법들 즉, 단일클론항체에서 분리한 여러 종류의 인터페론 알파 풀(pool)에서 각종 컬럼과 화학적 방법을 사용하여 SMM을 제거하기 때문에 순도를 어느 정도 높일 수는 있으나, 공정이 진행될수록 수율이 항상 감소하는 문제점을 효과적으로 해결할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 파쇄 및 변성 단계를 포함한다. 즉, 대장균에서 발현된 인터페론 알파는 이황화 결합이 형성되지 않아서 대부분이 세포 내부에 비활성형의 봉입체(inclusion body) 형태로 엉겨서 존재하며 일부는 세포질에 비활성형의 수용체 형태로 존재한다. 따라서, 대장균 세포를 파쇄하고 인터페론 알파를 수용액 상태로 노출시켜서 변성(denaturation)시키는 단계를 포함하게 된다. 상기 세포의 파쇄는 비드 비터(bead beater) 등의 통상의 파쇄 방법을 사용할 수 있으며, 인터페론 알파의 변성은 완충용액에 일정시간 용해시킨 후 침전물을 제거함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는 대장균 세포를 5∼7 M, 더욱 바람직하게는 약 6M 의 구아니딘 염산을 포함하는 pH 7∼7.5, 더욱 약 바람직하게는 약 pH7.4의 완충용액에 가함으로써 파쇄 및 변성을 동시에 수행할 수 있다. 또한, 상기 파쇄 및 변성 단계를 거친 인터페론 알파 용액은 0.5∼1.5 M, 더욱 바람직하게는 약 1M 의 구아니딘 염산을 포함하는 pH 7∼7.5, 더욱 약 바람직하게는 약 pH7.4의 완충용액에서 약 12∼24시간 동안 숙성시키는 것이 바람직하다. 상기 숙성은 약 2∼8℃ 조건에서 수행할 수 있다.

상기 숙성시켜 얻어진 용액은 예를 들어 밀리포어 펠리콘 시스템(Millipore Pellicon system)을 사용하여 약 100K MWCO 밀리포어 필터(Millipore filter)로 여과 및 농축하여 항체친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩함으로써 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행할 수 있다. 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정에서, 상기 인터페론 알파를 포함한 분획의 용출은 100∼500 mM, 바람직하게는 약 300mM의 염(예를 들어, NaCl)을 포함하는 pH 2∼3, 바람직하게는 약 pH2.0의 완충용액으로 수행될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 이황화 결합이 완성되지 못해서 불안정한 인터페론 알파 및 이황화 결합이 잘못 형성된 인터페론 알파 즉, SMM을 활성형의 인터페론 알파 즉 FMM으로 전환시키는 공정을 포함한다. 즉, 본 공정에 의하여, 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정에서 얻어진 약 75±7%의 SMM 및 약 25±7%의 FMM으로 이루어진 인터페론 알파를 약 75±10% 의 FMM을 포함한 인터페론 알파로 전환되게 된다. 상기 재구성(refolding) 단계는 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정에서 얻어진 용출액을 적절한 방법으로 완충액 교환 공정을 거친 후(예를 들어, 정용여과 (diafiltration)), 1.5∼2.5 M, 바람직하게는 약 2M의 요소를 포함하는 pH 9∼10.5, 바람직하게는 약 pH 10의 글라이신(glycine) 완충용액을 가함으로써 수행할 수 있다. 상기 재구성 단계는 약 16∼20 시간 동안 약하게 교반하면서 수행할 수 있으며, pH를 4이하로 낮춤으로써 반응을 종료시킬 수 있다.

본 발명의 제조방법은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행함으로써, 잔류하는 SMM과 올리고머를 제거한다. 상기 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정은 재구성 단계에서 얻어진 용액의 염 농도를 100mM 이하, 바람직하게는 50mM 이하로 낮추어 pH 3∼6의 조건에서 양이온 교환수지 컬럼에 로딩하고, pH 2∼4.5, 바람직하게는 pH 3∼3.5의 10∼100 mM 바람직하게는 약 50 mM 아세테이트 완충용액으로 컬럼을 세척하고, 20∼70 mM, 바람직하게는 35∼50 mM의 염(예를 들어 NaCl)을 포함한 30 ∼ 100mM, 바람직하게는 약 50mM의 아세테이트 완충용액(pH 5∼5.5)으로 용출시킴으로써 수행할 수 있으며, 용출시켜 얻어진 용액은 역상 고압 액체 크로마토그래피법으로 분석하여 순도를 만족하는 FMM 분획을 얻게 된다. 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로는 CM 세파로스 또는 Q 세파로스 컬럼을 사용할 수 있으며, 염 농도는 밀리포어 펠리콘 시스템(Millipore Pellicon system)을 이용하거나 희석함으로써 낮출 수 있다.

상기 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정에서 얻어진 용출액은 겔-여과 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행함으로써, 완충용액 교환 및 최종 정제를 수행할 수 있다. 상기 겔-여과 컬럼 크로마토그래피 공정은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정에서 얻어진 용출액을 농축하고, 세파덱스 컬럼에 로딩한 후, 50∼200 mM, 바람직하게는 120mM의 염(예를 들어 NaCl)을 포함한 pH 4∼5.5, 바람직하게는 약 pH 5의 암모늄 아세테이트 완충용액으로 용출시킴으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 제조방법을 정제 단계별 공정흐름도로 나타내면 도1과 같다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균(KFCC 10237)을 배양한 배양액을 원심분리하여 대장균만을 모아서 -70℃에 보관하였다. 대장균을 실온에서 적당히 녹인 후 6M 구아니딘 염산을 포함하는 25mM 포스페이트 완충용액(pH7.4)에 30분간 노출시켜서 세포를 파쇄하고 인터페론 알파를 변성(denaturation)시킨 후 1M 구아니딘 염산과 125mM NaCl을 포함하는 25mM 포스페이트 완충용액(pH7.4)에 약하게 교반하면서 4℃ 조건에서 하룻밤 숙성하였다.

실시예 2

실시예 1에서 얻은 인터페론 알파를 포함하는 용액을 밀리포어 펠리콘 시스템(Millipore Pellicon system)을 사용하여 100K MWCO 밀리포어 필터(Millipore filter)로 여과하고 농축한 다음, 인터페론 알파에 대한 단클론 항체(R&D Systems 21101-1)를 CNBr-activated 세파로스 CL4B 수지에 붙여서 제조한 인터페론 알파 단클론 항체 컬럼에 로딩한 후 125mM NaCl을 포함하는 25mM 포스페이트 완충용액(pH7.4)으로 컬럼을 3 컬럼 부피 이상 세척하고 300mM NaCl을 포함한 100mM 시트레이트(Citrate) 완충용액(pH2.0)으로 용출하였다.

실시예 3

실시예 2에서 용출된 시료를 정용여과하여 버퍼 교환한 후, 2M요소를 포함한 50mM 글라이신 완충용액(pH10) 에서 약 18시간 동안 약하게 교반한 후 역상 고압 액체 크로마토그래피법으로 분석하여 재구성 효율을 확인하고 pH를 4이하로 낮추어서 반응을 종료하였다.

상기 실시예 2에서 용출된 시료 및 본 실시예 3에서 얻어진 시료를, 유럽약전(European Pharmacopoeia)의 인터페론 알파-2 분석 방법에서 LC를 이용한 관련 단백질(Related proteins) 분석법을 응용하여, 역상 고압 액체 크로마토그래피법(RP-HPLC)으로 분석하였다. 즉, 소량의 시료를 C18 (Vydac 218TP54, 내경 4.6㎜ x 길이 25㎝, 입자크기 5㎛, 다공크기 300Å) 컬럼에 1ml/min의 유속으로 주입한 다음 0.2%의 트리플루오로아세트산을 포함하는 30% 아세토나이트릴 용액, A에서 0.2%의 트리플루오로아세트산을 포함하는 80% 아세토나이트릴 용액, B까지 동일한 유속으로 1분간 28%B 조건으로 흘리고, 4분동안 33% B까지 직선 농도구배로 흘린 후, 15분간 37%B까지, 다시 10분간 43%B까지, 다시 10분간 60%B까지 직선 농도구배로 흘린 다음, 2분간 60%B 조건으로 흘린다. 다시 8분간 28%B까지 직선 농도구배로 흘린 후 10분간 28%B를 흘려서 나타나는 크로마토그램의 패턴을 210nm 흡광 광도계로 검출하여 분석하였다.

상기 실시예 2에서 용출된 시료 및 본 실시예 3에서 얻어진 시료를 역상 고압 액체 크로마토그래피법(RP-HPLC)으로 분석한 결과는 도2a 및 도2b와 같다.

실시예 4

실시예 3에서 얻어진 시료를 희석하여 염 농도를 50mM 로 낮추고, pH 4 조건에서 CM 세파로스 컬럼에 로딩한 후, 50mM 아세테이트 완충용액(pH 3)으로 컬럼을 세척하고, 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5.4)으로 컬럼을 다시 세척한 후, 40mM NaCl을 포함한 50mM 아세테이트 완충용액(pH 5.4)으로 용출하였다. 용출한 용액은 역상 고압 액체 크로마토그래피법으로 분석하여 순도를 만족하는 FMM 분획을 합하였다.

실시예 5

실시예 4에서 얻은 FMM 분획을 약 10 mg/ml의 농도로 농축하고, 세파덱스-G50 컬럼에 로딩한 후 120mM NaCl을 포함한 25mM 암모늄 아세테이트 완충용액(pH5.0)으로 용출하였다. 정제가 완료된 시료를 역상 고압 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.

상기 겔-여과 완충용액과 겔-여과 후의 시료를 실시예 3과 동일한 방법으로 역상 고압 액체 크로마토그래피법(RP-HPLC)으로 분석한 결과는 도3a 및 도3b와 같다.

본 발명의 제조방법은 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균의 배양액으로부터 약 30% ∼ 50% 수준의 높은 효율로 FMM(fast-moving monomer)의 안정한 인터페론 알파를 고순도로 정제할 수 있다.

도1은 본 발명에 따른 제조방법의 정제 단계별 공정흐름도이다.

도2a 및 도2b는 각각 요소를 이용한 재구성 단계 전 및 후의 RP-HPLC 분석결과를 나타낸다.

도3a 및 도3b도 각각 겔-여과 크로마토그래피 완충용액 및 겔-여과 크로마토그래피 후의 RP-HPLC 분석결과를 나타낸다.

Claims

(a) 인체 인터페론 알파를 생산하는 유전자 재조합된 대장균의 배양액으로부터 얻어진 대장균 세포를 파쇄하고 인터페론 알파를 변성(denaturation)시킨 다음, 숙성시키는 단계;

(b) 단계(a)에서 얻어진 용액을 농축하여 항체친화성 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계;

(c) 단계(b)에서 얻어진 용출액을 요소를 포함하는 완충용액을 가하여 재구성(refolding)시키는 단계;

(d) 단계(c)에서 얻어진 용액을 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계; 및

(e) 단계(d)에서 얻어진 용출액을 겔-여과 컬럼 크로마토그래피 공정을 수행하는 단계를 포함하는 인체 인터페론 알파의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 재구성시키는 단계가 1.5∼2.5 M이 요소를 포함하는 pH 9∼10.5의 완충용액을 가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 파쇄 및 변성이 상기 대장균 세포를 5∼7 M 의 구아니딘 염산을 포함하는 pH 7∼7.5 의 완충용액에 가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 숙성이 0.5∼1.5 M 의 구아니딘 염산을 포함하는 pH 7∼7.5 의 완충용액에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피 공정이 단계(c)에서 얻어진 용액의 염 농도를 100mM 이하로 낮추어 pH 3∼6의 조건에서 양이온 교환수지 컬럼에 로딩하고, pH 2∼4.5의 10∼100 mM 아세테이트 완충용액으로 컬럼을 세척한 후, 20∼70 mM의 염을 포함한 30∼100 mM의 아세테이트 완충용액(pH 5∼5.5)으로 용출시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.