RU2346003C2 - Способ очистки интерферона бета человека - Google Patents
Способ очистки интерферона бета человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2346003C2 RU2346003C2 RU2006123539/13A RU2006123539A RU2346003C2 RU 2346003 C2 RU2346003 C2 RU 2346003C2 RU 2006123539/13 A RU2006123539/13 A RU 2006123539/13A RU 2006123539 A RU2006123539 A RU 2006123539A RU 2346003 C2 RU2346003 C2 RU 2346003C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- interferon beta
- washing
- buffer solution
- column
- human interferon
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 84
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 30
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 29
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims abstract description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 51
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 30
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 28
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 21
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 13
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 27
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 abstract 3
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 abstract 3
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 abstract 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 11
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005716 Interferon beta-1a Proteins 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710132632 Protein C4 Proteins 0.000 description 2
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940003504 avonex Drugs 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 229940021459 betaseron Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 210000004544 dc2 Anatomy 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940038850 rebif Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 231100000925 very toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки интерферона бета человека из рекомбинантной культуры, содержащей интерферон бета человека, включающий проведение аффинной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Аффинная хроматография включает адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной хроматографической колонке, промывание колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60 мас.% пропиленгликоля, и промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl, с элюцией фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl. Полученный раствор подвергают диафильтрации и осуществляют ОФ-ВЭЖХ, элюируя интерферонсодержащую фракцию градиентом концентраций этанола от 30-50% до 65-90% при рН 2-5, с последующим концентрированием и гель-фильтрацией продукта. Получаемый интерферон бета характеризуется высокой степенью чистоты (99%) при упрощении технологии выделения. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается способа очистки интерферона бета человека из культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, с использованием аффинной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Уровень техники
Интерфероны в широком смысле слова являются внеклеточными мессенжерами, опосредующими реакционную способность организма-хозяина, и эволюционно консервативными семействами белков, которые выделяются в относительно небольших количествах из клеток. Интерфероны освобождаются из продуцирующих интерфероны клеток в ответ на стимуляцию вирусами, двухцепочечными РНК, различными микроорганизмами или цитокинами, такими как фактор некроза опухолей (TNF) или интерлейкин 1 (IL1), и затем связываются с рецепторами интерферона, локализованными на поверхности соседних клеток. После этого интерфероны индуцируют синтез различных белков, так что реакционная способность и гомеостаз организма-хозяина поддерживаются за счет последовательной передачи сигнала клетками. Таким образом, интерфероны действуют в организме как антивирусные, антипролиферативные и иммунные сигнальные белки и обладают прямым антипролиферативным действием на раковые клетки, вследствие чего привлекают пристальное внимание как терапевтические агенты [Postka S., Langer J. A. and Zoon К. С (1987) Interferons and their actions, Annu. Rev. Biochem. 56:727-777].
Интерфероны принадлежат к классу спиральных физиологически активных веществ. Согласно физико-химическим характеристикам и функциональной активности выделяют два класса интерферонов: тип 1 и 2. Интерфероны альфа, бета, тау и эпсилон являются представителями интерферонов типа 1 [Weissman С and Weber Н. (1986) The Interferon genes, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 33:251-300], а интерферон гамма является представителем интерферонов типа 2. Среди них интерфероны бета, относящиеся к интерферонам типа 1, являются белками, демонстрирующими видовую специфичность. Интерфероны бета также называют интерферонами фибробластов в соответствии с их источником и рН2-стабильными интерферонами согласно их биологическим характеристикам. Интерфероны бета связываются с теми же рецепторами на поверхности клеток, что и интерфероны альфа, принадлежащие к интерферонам типа 1, и затем индуцируют транскрипцию антивирусных факторов в ответ на активацию соответствующих сигнальных систем клетки.
Интерфероны бета представляют собой гликопротеины (около 20% сахарных остатков) с молекулярной массой около 20 кДа и одноцепочечные белки, состоящие из 166 аминокислотных остатков. Известно, что один участок N-гликозилирования играет роль в увеличении стабильности или растворимости, т.е. в улучшении физико-химических функций, скорее, чем участвует в биологической активности или антигенности [Karpusas М., Whytty A., Runkel L, and Hochman P. The structure of human interferon-β: implications for activity CMLS, 54:1203-1216 1998].
Достижения в генетической рекомбинантной технологии сделали возможным определение аминокислотной последовательности интерферона бета человека, а также клонирование и экспрессию интерферона бета человека в Е. coli [Taniguchi, Gene 10:11-15, 1980]. Более того, сообщалось также об экспрессии интерферона бета в клетках яичников китайского хомячка (Chinese hamster ovary (СНО) cells) [USP4,966,843, USP5,376,567 и USP5,795,779].
В настоящее время интерфероны бета производятся по технологии генетической рекомбинации и коммерчески доступны под торговыми названиями Betaseron®, Avonex® и Rebif®. Известно, что рекомбинантные интерфероны бета являются эффективными в замедлении развития рассеянного склероза у пациентов с симптомами заболевания и в снятии болевого синдрома при болезни. Более того, рекомбинантные интерфероны бета широко используются как терапевтические агенты при рассеянном склерозе и в то же время являются эффективными в неспецифической регуляции иммунного ответа человека, иммунного ответа на вирусные инфекции и в подавлении пролиферации раковых клеток.
Доступные в настоящее время технологии очистки рекомбинантных интерферонов бета, экспрессируемых в клетках СНО, состоят из 3-5 процедур очистки, включая первичную очистку методом аффинной хроматографии (USP4,278,661, USP4,289,689, USP4,541,952, USP4,808,523 и т.д.), металл-хелатную хроматографию (USP4,257,938, USP4,359,389, USP4,541,952, USP5,244,655 и т.д.), хроматографию на пористом стекле с контролируемым размером пор (CPG, controlled pore glass chromatography) (USP4,359,389, USP5,066,786, USP5,244,655 и т.д.), или хроматографию на Конканавалине А (USP4,289,689, USP4,658,017 и т.д.) с последующей катионообменной хроматографией или обращенно-фазовой хроматографией.
В описанных выше обычных технологиях очистки металл-хелатная хроматография может привести к загрязнению окружающей среды из-за использования тяжелых металлов. Хроматография на пористом стекле или хроматография на Конканавалине А обладает низкой специфичностью. То есть хроматография на Конканавалине А основана на избирательном связывании многих содержащих сахара белков, которые присутствуют в культуре клеток СНО, что приводит к низкой специфичности. Хроматография на пористом стекле позволяет производить разделение молекул по размеру после связывания с белком. Однако эффективность разделения и чистота интерферонов бета ниже, чем при аффинной хроматографии (например, при хроматографии на колонке с Blue-Сефарозой).
Более того, обычные технологии очистки с помощью аффинной хроматографии включают промывание и элюцию с этиленгликолем с использованием моноклональных антител и/или смол, содержащих красители. Однако аффинная хроматография с использованием моноклональных антител требует отдельной стадии удаления негликозилированной формы интерферона бета, что делает массовое производство затруднительным. В частности, используемый для промывания и элюции этиленгликоль является очень токсичным для организма, что ограничивает применение этого способа очистки.
В то же время U.S. Patent No. 4,483,849 раскрывает способ очистки и стабилизации интерферона бета с использованием пропиленгликоля вместо токсичного этиленгликоля при аффинной хроматографии. Способ, раскрываемый в этом патентном документе, включает нанесение интерферон-содержащей культуры на аффинную колонку с красителем, такую как уравновешенный Affi-Gel Blue, промывание колонки 1,0 М буфером NaCl/PO4 и 1,0 М буфером NaCl/PO4, содержащим 40% пропиленгликоля, и затем элюцию интерферона 50% пропиленгликолем. Хотя описываемый в этом патентном документе процесс включает промывку колонки и элюцию, пик желаемого конечного продукта и пик загрязнений накладываются друг на друга, что приводит к снижению чистоты продукта.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение предлагает способ очистки интерферона бета, который включает получение с высокой чистотой продукта первичной очистки интерферона бета с помощью усиленной аффинной хроматографии с использованием нетоксичного пропиленгликоля с последующей обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ-ВЭЖХ).
Таким образом, настоящее изобретение предлагает способ очистки интерферона бета человека из рекомбинантной культуры, содержащей интерферон бета человека, включающий проведение аффинной хроматографии и ОФ-ВЭЖХ, которая включает промывку и элюцию специфическим буферным раствором.
Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предлагается способ очистки интерферона бета человека из культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, с помощью аффинной хроматографии и ОФ-ВЭЖХ, при котором аффинная хроматография включает: адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета человека, на предварительно уравновешенную колонку для аффинной хроматографии, последующую промывку колонки буферным раствором для уравновешивания, промывку колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60% (по весу) пропиленгликоля и промывку колонки промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30% (по весу) пропиленгликоля и 1-2 М NaCl; и элюцию содержащей интерферон бета человека фракции буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60% (по весу) пропиленгликоля и 1-2 М NaCl.
В способе очистки по настоящему изобретению нелимитирующие примеры культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, используемые в качестве образца, включают продуцирующие интерферон бета клетки и штаммы. Например, содержащая рекомбинантный интерферон бета человека культура может быть получена известным методом, описываемым в Carter and Horoszewicz, Pharm. Ther. 8, 359-377, 1980; Strander and Cantell, Ann. Med. Exp.Fenn. 44, 265-273, 1966; Wheelock, Science, 149, 310-311, 1965, и тому подобное. Предпочтительно культура, содержащая рекомбинантный интерферон бета человека, является бессывороточной культурой, полученной из продуцирующих интерферон бета человека рекомбинантных клеток яичников китайского хомячка (СНО).
В способе очистки по настоящему изобретению используемая для аффинной хроматографии хроматографическая колонка может быть обычной аффинной колонкой с красителем, например колонкой (например, колонкой ХК-50 column, Amersham biosciences, Sweden), заполненной Blue-Sepharose 6 (Amersham biosciences, Sweden), или колонкой Affi-Gel Blue (Bio-Rad, America). Буферный раствор для уравновешивания колонки для аффинной хроматографии может быть буферным раствором натрий-фосфат-ЭДТА (рН около 7,2). Аффинная колонка может быть уравновешена 3 объемами колонки (CV) буферного раствора для уравновешивания, например, при линейной скорости около 15-30 см/час.
В способе очистки по настоящему изобретению аффинная хроматография включает адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной аффинной колонке и удаление неспецифически связанного белка путем промывки буферным раствором для уравновешивания.
Аффинная хроматография также включает многоступенчатую промывку, то есть промывку колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60% (по весу) пропиленгликоля и промывку колонки промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30% (по весу) пропиленгликоля и 1-2 М NaCl. Предпочтительно аффинная хроматография также включает промывку колонки промывочным раствором С с рН 6,5-7,5, содержащим 1-2 М NaCl. Предпочтительно каждая промывка проводится с использованием 2-4 объемов колонки (CV) каждого буферного раствора
В способе очистки по настоящему изобретению нет ограничений в последовательности использования промывочных буферных растворов. Например, промывка может быть проведена с использованием промывочного буферного раствора А и затем промывочного буферного раствора В или с использованием промывочного буферного раствора В, а затем промывочного буферного раствора А. Кроме того, промывка может быть проведена с использованием промывочного буферного раствора А, промывочного буферного раствора С и затем промывочного буферного раствора В или с использованием промывочного буферного раствора В, промывочного буферного раствора С и затем промывочного буферного раствора А. Промывка с использованием промывочного буферного раствора А эффективно удаляет загрязнения с высокой гидрофобностью, промывка с помощью промывочного буферного раствора С удаляет гидрофильные загрязнения, а промывка с помощью промывочного буферного раствора В удаляет белковые примеси.
Снятие интерферона бета с колонки может быть осуществлено путем элюции фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60% (по весу) пропиленгликоля, предпочтительно 50% (по весу), и 1-2 М NaCl.
Предпочтительно каждый используемый для промывки или элюции буфер может быть натрий-фосфатным буферным раствором или калий-фосфатным буферным раствором.
В способе очистки по настоящему изобретению промывка буферным раствором, содержащим около 50% пропиленгликоля, позволяет эффективно удалить пики загрязнений в отличие от способа, раскрываемого в U.S. Patent No. 4,483,849, в котором промывка и элюция проводятся ступенчатым градиентом концентрации пропиленгликоля.
В способе очистки по настоящему изобретению вслед за вышеописанной аффинной хроматографией проводится ОФ-ВЭЖХ. Предпочтительно до проведения ОФ-ВЭЖХ полученный при элюции при аффинной хроматографии раствор подвергают диафильтрации на мембране для ультрафильтрации с пределом пропускания по молекулярному весу 10000. При диафильтрации интерферон бета с относительно высокой концентрацией соли может быть доведен до подходящей концентрации соли.
ОФ-ВЭЖХ проводили следующим образом: образец, полученный после диафильтрации, наносили на колонку, и затем фракцию, содержащую интерферон бета человека, элюировали при рН 2-5 градиентом концентрации этанола, содержащим HCl. Более подробно, колонку уравновешивали 0,1% HCl, содержащим 0,1-20%, предпочтительно 5% или менее пропиленгликоля, после чего образец, полученный путем диафильтрации, содержащий 0,1-20%, предпочтительно 5% или менее пропиленгликоля, наносился на колонку. Затем колонку промывали 0,1% НС1, и фракции, содержащие интерферон бета, элюировали линейным градиентом концентрации от 30-50%, предпочтительно 45% этанола, содержащего 0,1% HCl до 65-90%, предпочтительно 70% этанола, содержащего 0,1% HCl.
Колонка для ОФ-ВЭЖХ может быть Protein С4 (размер частиц - 10 мкм, размер пор - 30 Å, Vydac) и может быть уравновешена примерно 5 CV 0,1% раствора НС1, содержащего пропиленгликоль. При ОФ-ВЭЖХ образец, полученный при диафильтрации, пропускали через уравновешенную колонку при подходящей скорости потока, промывали 3 CV или более буферным раствором 0,1% HCl и элюировали линейным градиентом концентрации этанола объемом примерно 10-20 CV, содержащего 0,1% НС1, чтобы таким образом разделить белковые примеси и целевые белки.
Во фракции, содержащей интерферон бета, полученной посредством ОФ-ВЭЖХ, может быть затем проведена замена на новый буферный раствор. Замена на новый буферный раствор может осуществляться посредством гель-фильтрации или концентрирования и диафильтрации.
Например, в случае проведения гель-фильтрации фракции, содержащие интерферон бета, полученные при ОФ-ВЭЖХ, концентрируют до, например, около 200-1000 мкг/мл, диализуют против 10-50 мМ натрий-ацетатного буферного раствора (рН 3,5~5,5) и наносят на хроматографическую колонку для гель-фильтрации (например, Sephacryl S-200, Amersham biosciences), уравновешенную 10-50 мМ, предпочтительно 20 мМ натрий-ацетатным буферным раствором (рН 3,5~5,5). Затем 10-50 мМ натрий-ацетатный буферный раствор (рН 3,5-5,5) пропускают через колонку при подходящей скорости потока, обеспечивая, таким образом, смену раствора искомых белков и отделение и удаление полимеров.
Блок-схема, иллюстрирующая способ очистки по настоящему изобретению, показана на фигуре 1.
Краткое описание фигур
Фигура 1 представляет собой блок-схему способа очистки по настоящему изобретению.
Фигура 2 представляет собой С4 ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография) аналитическую хроматограмму интерферона бета, элюируемого при аффинной хроматографии согласно способу очистки по настоящему изобретению.
Фигура 3 представляет собой С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму интерферона бета, элюируемого без промывки с 50% пропиленгликоля.
Фигуры 4А и 4В представляют собой соответственно С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму буферного раствора для гель-фильтрации и С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму раствора, элюируемого после гель-фильтрации.
Осуществление изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более детально с помощью примеров. Однако нижеследующие примеры приводятся исключительно в качестве иллюстрации и, следовательно, настоящее изобретение не ограничивается ими.
Пример 1: аффинная хроматография
Blue-Sepharose 6 (Amersham biosciences, Sweden) в количестве 350 мл была внесена в колонку ХК-50 (Amersham biosciences, Sweden) для изготовления колонки для аффинной хроматографии. Для уравновешивания колонки через нее пропускали в достаточном количестве 20 мМ натрий-фосфатный буферный раствор, содержащий 1 мМ ЭДТА. После этого через колонку пропускали 25 л бессывороточной культуры клеток яичников китайского хомячка (СНО), содержащей интерферон бета, при скорости потока 5-10 мл/мин, после чего колонку промывали 3 объемами колонки (CV) раствора для уравновешивания.
Около 3 CV 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,2), содержащего 50% пропиленгликоля, пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин для удаления примесных белков, после чего промывали колонку примерно 3 CV буферного раствора для уравновешивания. Затем около 3 CV 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,2), содержащего 2 М NaCl, пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин для удаления примесных белков. И, наконец, около 3 CV 20 мМ натрий-фосфатного буферного раствора (рН 7,2), содержащего 2 М NaCl и 20% пропиленгликоля, пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин для удаления примесных белков.
Около 3 CV буферного раствора для элюции (20 мМ натрий-фосфатный буферный раствор, содержащий 2 М NaCl и 50% пропиленгликоля, рН 7,2) пропускали через колонку при скорости потока 5 мл/мин, чтобы получить раствор, содержащий интерферон бета. Чистота полученного элюируемого раствора была протестирована С4 ВЭЖХ аналитической хроматографией, результаты которой представлены на фигуре 2. Согласно данным фигуры 2 чистота интерферона бета составляла около 85% или более.
В контрольном эксперименте аффинную хроматографию проводили согласно описанному выше протоколу за исключением того, что промывка колонки 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7,2), содержащим 50% пропиленгликоля, была пропущена. Чистота полученного при элюции раствора была проанализирована с помощью С4 ВЭЖХ аналитической хроматографии, результаты которой представлены на фигуре 3. Как видно из фигуры 3, в отсутствие промывки 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7,2), содержащим 50% пропиленгликоля, значительно снижается чистота интерферона бета.
Пример 2: обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ-ВЭЖХ)
Интерферон бета-содержащий раствор, полученный по настоящему изобретению в примере 1, подвергнутый диафильтрации с использованием ультрафильтрационной системы (отсекаемый молекулярный вес 10000), был нанесен на колонку для ОФ-ВЭЖХ (Protein С4 (размер частиц -10 мкм, размер пор - 30 Å, Vydac) при скорости потока 2 мл/мин. Затем колонку промывали примерно 3 CV 0,1% буферным раствором НС1 (рН 2,1). Элюцию интерферона бета проводили, используя 0,1% раствор НС1 (А) и раствор (В) - 0,1% НС1 в 90% этаноле, с помощью линейного градиента концентрации от 45% раствора (В) до 80% раствора (В) (около 20 CV) для того, чтобы отделить примесные белки от целевых белков.
Пример 3: гель-фильтрация
Раствор, содержащий интерферон бета, полученный в примере 2, был сконцентрирован до 200 мкг/мл и содержащийся в концентрате этанол был заменен 500 раз или более на 20 мМ натрий-ацетатный буферный раствор (рН 4,0). Получившийся раствор был нанесен на колонку с Sephacryl S-200, (1700 мл, ХК-50/100, Amersham biosciences, Sweden), уравновешенную 20 мМ натрий-ацетатным буферным раствором (рН 3,0) для получения раствора, содержащего интерферон бета.
Пример 4: анализ с помощью ОФ-ВЭЖХ
Каждый из растворов, полученных в примерах 1, 2 и 3, был нанесен на колонку С4 ОФ-ВЭЖХ (Vydac 214ТР54, внутренний диаметр 4,6 мм х 25 см в длину, размер частиц 5 мкм, размер пор 300 Е) при скорости потока 1 мл/мин. После этого через колонку пропускали 20 CV раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, в виде линейного градиента от 30% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, до 80% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, для анализа хроматографической картины.
Фигуры 4А и 4В соответственно демонстрируют С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму буферного раствора для гель-фильтрационной хроматографии и С4 ОФ-ВЭЖХ аналитическую хроматограмму раствора, элюируемого после гель-фильтрационной хроматографии. Из фигур 4А и 4Б можно видеть, что настоящее изобретение позволяет получить интерферон бета высокой степени чистоты.
Промышленная применимость
Согласно способу очистки по настоящему изобретению интерферон бета может быть очищен до высокой степени чистоты, составляющей 99% или более, при использовании нетоксичного пропиленгликоля и усовершенствованной аффинной хроматографии.
Claims (4)
1. Способ очистки интерферона бета человека из культуры, содержащей рекомбинантный интерферон бета человека, включающий проведение аффинной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), где аффинная хроматография включает:
адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной колонке для аффинной хроматографии с последующим промыванием уравновешивающим буферным раствором;
промывание колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60 мас.% пропиленгликоля, и промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl; и
элюцию фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl,
причем раствор, полученный после аффинной хроматографии, подвергают диафильтрации, полученный образец наносят на колонку для ОФ-ВЭЖХ, и затем фракцию, содержащую интерферон бета человека, элюируют при рН 2-5, используя растворы с градиентом концентраций этанола от 30-50% до 65-90%,
причем раствор, полученный ОФ-ВЭЖХ, концентрируют и подвергают гель-фильтрации.
адсорбцию культуры, содержащей интерферон бета, на уравновешенной колонке для аффинной хроматографии с последующим промыванием уравновешивающим буферным раствором;
промывание колонки промывочным буферным раствором А с рН 6,5-7,5, содержащим 30-60 мас.% пропиленгликоля, и промывочным буферным раствором В с рН 6,5-7,5, содержащим 10-30 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl; и
элюцию фракции, содержащей интерферон бета человека, буферным раствором с рН 6,5-7,5, содержащим 40-60 мас.% пропиленгликоля и 1-2 М NaCl,
причем раствор, полученный после аффинной хроматографии, подвергают диафильтрации, полученный образец наносят на колонку для ОФ-ВЭЖХ, и затем фракцию, содержащую интерферон бета человека, элюируют при рН 2-5, используя растворы с градиентом концентраций этанола от 30-50% до 65-90%,
причем раствор, полученный ОФ-ВЭЖХ, концентрируют и подвергают гель-фильтрации.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия промывки дополнительно включает промывку колонки промывочным буферным раствором С с рН 6,5-7,5, содержащим 1-2 М NaCl.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что каждый буферный раствор, используемый для промывки и элюции, является натрий-фосфатным буферным раствором или калий-фосфатным буферным раствором.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что диафильтрацию проводят с использованием мембраны для ультрафильтрации с пределом пропускания по молекулярному весу 10000.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2003-0087552 | 2003-12-04 | ||
| KR10-2003-0087552A KR100524871B1 (ko) | 2003-12-04 | 2003-12-04 | 인터페론 베타의 정제방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006123539A RU2006123539A (ru) | 2008-01-10 |
| RU2346003C2 true RU2346003C2 (ru) | 2009-02-10 |
Family
ID=36647277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006123539/13A RU2346003C2 (ru) | 2003-12-04 | 2004-12-04 | Способ очистки интерферона бета человека |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7780960B2 (ru) |
| EP (1) | EP1697411B1 (ru) |
| JP (1) | JP2007530447A (ru) |
| KR (1) | KR100524871B1 (ru) |
| CN (1) | CN100462370C (ru) |
| AT (1) | ATE521712T1 (ru) |
| AU (1) | AU2004295265B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0417220A (ru) |
| CA (1) | CA2548160C (ru) |
| ES (1) | ES2369911T3 (ru) |
| MX (1) | MXPA06006357A (ru) |
| PL (1) | PL1697411T3 (ru) |
| RU (1) | RU2346003C2 (ru) |
| WO (1) | WO2005054288A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2664924T3 (es) * | 2005-08-26 | 2018-04-24 | Ares Trading S.A. | Procedimiento para la preparación del interferón beta glicosilado |
| KR100848600B1 (ko) * | 2007-02-28 | 2008-07-28 | 인하대학교 산학협력단 | 완충용액을 이용한 재조합 단백질 대량생산 방법 |
| CN114573679A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-06-03 | 深圳科兴药业有限公司 | 分离重组人干扰素α1b异构体的纯化方法 |
| CN114814000A (zh) * | 2022-03-30 | 2022-07-29 | 深圳科兴药业有限公司 | 重组人干扰素的含量检测方法 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5564799A (en) * | 1978-11-07 | 1980-05-15 | Toray Ind Inc | Multi-stage concentration and purification of interferon originated from human fibroblast |
| US4289689A (en) * | 1980-03-14 | 1981-09-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Preparation of homogeneous human fibroblast interferon |
| US4278661A (en) * | 1979-10-12 | 1981-07-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Purification of interferon |
| NL7907791A (nl) * | 1979-10-23 | 1981-04-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| JPS58201794A (ja) * | 1982-05-17 | 1983-11-24 | Toray Ind Inc | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 |
| US4966843A (en) * | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
| US4483849A (en) * | 1983-01-07 | 1984-11-20 | Carter William A | Stabilization and purification of interferon with propylene glycol, resulting in a non-toxic product |
| US4658017A (en) * | 1984-02-14 | 1987-04-14 | Health Research, Inc. (Roswell Park Division) | Method for the large scale purification of human fibroblast interferon |
| US4808523A (en) * | 1984-11-07 | 1989-02-28 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter |
| FR2617763B1 (fr) | 1987-07-07 | 1989-12-01 | Essilor Int | Procede de fabrication de lentille de contact en un polymere proteique naturel, par moulage avant reticulation |
| IT1222427B (it) * | 1987-07-31 | 1990-09-05 | Sclavo Spa | Procedimento per la purificazione di interferone |
| DE4128319A1 (de) | 1991-08-27 | 1993-03-04 | Bioferon Biochem Substanz | Neues rekombinantes human-ifn-beta, verfahren zu dessen herstellung und dieses enthaltende pharmazeutische zubereitungen |
| EP0551535A1 (en) * | 1992-01-13 | 1993-07-21 | SCLAVO S.p.A. | Process for the purification of recombinant human beta interferon, beta interferon thus purified, and pharmaceutical compositions which contain them |
| US7144574B2 (en) | 1999-08-27 | 2006-12-05 | Maxygen Aps | Interferon β variants and conjugates |
-
2003
- 2003-12-04 KR KR10-2003-0087552A patent/KR100524871B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-04 MX MXPA06006357A patent/MXPA06006357A/es active IP Right Grant
- 2004-12-04 US US10/581,602 patent/US7780960B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-04 ES ES04808310T patent/ES2369911T3/es active Active
- 2004-12-04 BR BRPI0417220-5A patent/BRPI0417220A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-12-04 JP JP2006542505A patent/JP2007530447A/ja active Pending
- 2004-12-04 CN CNB2004800397241A patent/CN100462370C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-12-04 RU RU2006123539/13A patent/RU2346003C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-12-04 AU AU2004295265A patent/AU2004295265B2/en not_active Ceased
- 2004-12-04 EP EP04808310A patent/EP1697411B1/en not_active Not-in-force
- 2004-12-04 PL PL04808310T patent/PL1697411T3/pl unknown
- 2004-12-04 AT AT04808310T patent/ATE521712T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-12-04 WO PCT/KR2004/003179 patent/WO2005054288A1/en active Application Filing
- 2004-12-04 CA CA2548160A patent/CA2548160C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0417220A (pt) | 2007-02-21 |
| US7780960B2 (en) | 2010-08-24 |
| EP1697411A1 (en) | 2006-09-06 |
| ES2369911T3 (es) | 2011-12-09 |
| KR20050054209A (ko) | 2005-06-10 |
| ATE521712T1 (de) | 2011-09-15 |
| CN1902225A (zh) | 2007-01-24 |
| AU2004295265A1 (en) | 2005-06-16 |
| CN100462370C (zh) | 2009-02-18 |
| EP1697411A4 (en) | 2008-08-27 |
| JP2007530447A (ja) | 2007-11-01 |
| US20070093649A1 (en) | 2007-04-26 |
| KR100524871B1 (ko) | 2005-10-31 |
| EP1697411B1 (en) | 2011-08-24 |
| PL1697411T3 (pl) | 2011-12-30 |
| AU2004295265B2 (en) | 2009-01-08 |
| CA2548160C (en) | 2011-06-07 |
| CA2548160A1 (en) | 2005-06-16 |
| WO2005054288A1 (en) | 2005-06-16 |
| RU2006123539A (ru) | 2008-01-10 |
| MXPA06006357A (es) | 2006-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR930003665B1 (ko) | 에리스로포이에틴의 정제방법 | |
| RU2358980C2 (ru) | Способ очистки и/или выделения биологически активного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора | |
| CA2704598A1 (en) | Methods of purifying recombinant human erythropoietin from cell culture supernatants | |
| KR20030005005A (ko) | 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 약리학적 활성단백질의 정제방법 | |
| RU2346002C2 (ru) | Способ очистки интерферона бета человека | |
| US4765903A (en) | Purification of monomeric interferon | |
| RU2346003C2 (ru) | Способ очистки интерферона бета человека | |
| US5244655A (en) | Process for the purification of recombinant human beta interferon, beta interferon thus purified and pharmaceutical compositions which contain it | |
| KR100531670B1 (ko) | 인체 인터페론 알파의 제조방법 | |
| CA1329307C (en) | Purification of monomeric interferon | |
| JP4154743B2 (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 | |
| KR100369582B1 (ko) | 재조합알파-인터페론의정제방법 | |
| EP0446850A2 (en) | Process for purifying recombinant human beta-interferon | |
| KR100449821B1 (ko) | 활성형의 재조합 인체 과립성 백혈구 콜로니 자극인자의 정제방법 | |
| JPH03133935A (ja) | ヒト天然型インターロイキン６組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151205 |