CN115819517A - 一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种衍生自嗜中性细胞趋化因子抗菌肽及其制备方法和应用，属于农业畜牧兽医应用领域，其序列如SEQ ID No.1所示，制备方法：通过在具有嗜中性细胞趋化作用的六肽的碳端用GGG片段连接pH响应亲疏水交替肽模板(YXHAXYH)₂，杂合得到多肽KWH，用固相化学合成法合成该多肽KWH；进一步的，提供该抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用；该抗菌肽具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽在128μmol/L浓度下未能引起10％的红细胞溶血；猪小肠上皮细胞IPEC‑J2在64μmol/L肽浓度下的存活率达到127.7％，综上，抗菌肽KWH具有成为抗生素替代物的发展潜力。

Description

一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于农业畜牧兽医应用领域，具体涉及一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽是生物体内广泛存在的一种具有抗菌作用的活性多肽，是生物非特异性防御系统的免疫应答产物，在动物，尤其是获得性免疫系统不健全的动物抵御外界微生物侵袭的过程中发挥了重要的作用。抗菌肽杀菌速度快且不易产生耐药性。因此，抗菌肽的研究已成为药物开发领域的研究热点，在细菌感染的药物开发方面有着广阔的应用前景。天然抗菌肽存在一些不足，这些不足限制了其作为抗生素替代物的应用。对肽分子进行合理的设计和改造是应用抗菌肽的有效途径之一。在炎症反应过程中，在病灶部位的微环境中常常伴随着pH的下降，pH响应性为抗菌肽的设计或改造中值得考虑的一个因素。

巨噬细胞、中性粒细胞等吞噬细胞为代表的固有免疫在宿主防御感染中起早期第一道防线的关键作用。宿主固有免疫的适当激活有利于对细菌的局部清除；因此，调节宿主固有免疫应答是对抗菌策略的一种有益补充。设计能结合固有免疫调节功能的抗菌肽为预防和治疗细菌感染提供了一种有吸引力的思路。

发明内容

基于以上问题，本发明的目的在于公开一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽，是基于对具有嗜中性细胞趋化作用的六肽进行改造获得一种新的抗菌肽，对革兰氏阴性细菌具有较高的杀菌活性，且在酸性环境下杀菌效率较高，该抗菌肽具有较高的细胞选择性，及较低的溶血活性。

本发明的目的采用如下技术方案实现：一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽KWH，其序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(Ⅰ)所示，

本发明的另一目的是提供如上所述的一种衍生自嗜中性细胞趋化因子抗菌肽KWH的制备方法，方法如下：在具有嗜中性细胞趋化作用的六肽，其序列为：MMHWFM的碳端使用GGG片段连接pH响应亲疏水交替肽模板(YXHAXYH)₂，其中，X为疏水性色氨酸，Y为亲水性赖氨酸，H为pH响应性组氨酸，A为丙氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；用固相化学合成法合成该多肽KWH，其正电荷含量为4个，疏水值为0.187；再经过抗菌活性的测定、溶血活性的测定及真核细胞毒性的测定，最终命名为抗菌肽KWH。

本发明的另一目的是提供一种衍生自嗜中性细胞趋化因子抗菌肽KWH在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。

进一步的，所述的革兰氏阴性菌为：大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌或绿脓杆菌。

本发明的有益效果及优点如下：本发明提高了具有嗜中性细胞趋化作用的六肽针对革兰氏阴性细菌的杀菌活性，且杀菌活性在酸性pH情况下显著增强。抗菌肽KWH细胞选择性好，在具有较高杀菌活性的同时，具有较低的溶血活性。对抗菌肽KWH进行抗菌和溶血活性检测，发现KWH对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或绿脓杆菌具有高效的抑制作用，且具有较低的溶血活性和真核细胞毒性，该抗菌肽KWH在128μmol/L浓度下造成8.05％的红细胞溶血，未能引起10％的红细胞溶血；且在64μmol/L肽浓度下猪小肠上皮细胞IPEC-J2细胞的存活率127.7％。综上所述，抗菌肽KWH是一种具有较高应用价值的抗菌肽，具备成为抗生素替代物的发展潜力。

附图说明

图1为本发明的抗菌肽KWH的高效液相色谱图。

图2为本发明的抗菌肽KWH的高效液相质谱图。

图3为本发明的抗菌肽KWH与蜂毒素ME的溶血活性对比图。

图4为本发明的抗菌肽KWH和蜂毒素ME对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的细胞毒性影响对比图。

具体实施方式

下面根据说明书附图举例对本发明做进一步的说明：

实施例1

多肽KWH的设计

具有嗜中性细胞趋化作用六肽的氨基酸序列为：MMHWFM；通过在具有嗜中性细胞趋化作用六肽的碳端使用GGG片段连接pH响应亲疏水交替肽模板(YXHAXYH)₂，其中，X为疏水性色氨酸，Y为亲水性赖氨酸，H为pH响应性组氨酸，A为丙氨酸，得到多肽KWH，其氨基酸序列为KWHAWKHKWHAWKHGGGMMHWFM，为α螺旋结构；多肽KWH的氨基酸序列如表1所示。

表1氨基酸序列

分子式如式(Ⅰ)所示，

多肽KWH的电荷数为+4，疏水值为0.187。

实施例2

固相化学合成法合成多肽KWH

1、多肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个多肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个多肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、多肽的鉴定：将上述得到的多肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(如图1、2所示)与表1中的理论分子量基本一致，多肽的纯度大于95％。

实施例3

多肽KWH抗菌活性的测定

1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定2种多肽：KWH和ME的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的多肽KWH溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有多肽)和阴性对照(既不含菌液也不含多肽)。37℃恒温培养14-18h，用酶标仪在492nm(OD_492nm)处测定光吸收值，确定最小抑菌浓度，检测结果见表2。

表2抑菌活性

通过表2可以看出，多肽KWH对于革兰氏阴性菌表现出较高的抑菌活性，且杀菌活性在酸性pH情况下显著增强。

表3短肽的最小溶血浓度MHC(μM)、平均最小抑菌浓度GM(μM)和选择指数SI值

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mLPBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的多肽KWH溶液混合均匀，每组浓度3个重复。在37℃培养箱内恒温孵育1h；1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的多肽KWH浓度，检测结果见图3。

通过图3可以看出，多肽KWH在128μM浓度内未表现出溶血活性，于对照组蜂毒素ME呈显著性差异。

3、真核细胞毒性的测定：采用MTT法，通过猪小肠上皮细胞IPEC-J2进行细胞毒性检测。

(1)培养基的制备及细胞的培养：将DMEM(培养基)与胎牛血清9:1混合配置完全培养基，并复苏液氮中的猪小肠上皮细胞IPEC-J2，以细胞长满瓶底80％-90％为宜。

(2)待用细胞的试验处理：无菌PBS清洗并重悬细胞3次，并用0.25％胰蛋白酶液对细胞消化处理，使其在瓶底脱落，用完全培养基冲洗，获得单个细胞悬液，同时在96孔板中填入终浓度约为2×10⁴的50μL细胞悬液。

(3)多肽KWH处理：另附96孔板第一孔内加10μL多肽并倍比稀释后，取出50μL肽液加入原96孔板1-10孔，11孔加50μL完全培养基，12孔加100μL完全培养基。恒温培养16h；

(4)毒性检测：取50μL 5mg/mL MTT溶液加入96孔板，再培养3-4h后，加150μLDMSO(二甲基亚砜)，酶标仪OD_570nm测定吸光度。吸光度值越高，证明毒性越弱，反之亦然，检测结果见图4。

通过图4可以看出，多肽KWH在64μM浓度内未表现出对猪小肠上皮细胞IPEC-J2的毒性，于对照组蜂毒素ME呈显著性差异。综上所述，多肽KWH是一种具有较高应用价值的抗菌肽，具备成为抗生素替代物的发展潜力，最终命名为抗菌肽KWH。

Claims (4)

1.一种衍生自嗜中性细胞趋化因子的抗菌肽KWH，其特征在于，其序列如SEQ ID No.1所示，分子式如式(Ⅰ)所示，

2.根据权利要求1所述的一种衍生自嗜中性细胞趋化因子抗菌肽KWH的制备方法，其特征在于，方法如下：通过在具有嗜中性细胞趋化作用的六肽，其序列为：MMHWFM的碳端用GGG片段连接pH响应亲疏水交替肽模板(YXHAXYH)₂，其中，X为疏水性色氨酸，Y为亲水性赖氨酸，H为pH响应性组氨酸，A为丙氨酸，得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；用固相化学合成法合成该多肽KWH，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其正电荷含量为4个，疏水值为0.187；再经过抗菌活性的测定、溶血活性的测定及真核细胞毒性的测定，最终命名为抗菌肽KWH。

3.根据权利要求1所述的一种衍生自嗜中性细胞趋化因子抗菌肽KWH在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌为：大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌或绿脓杆菌。

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