CN103732232A - 包含抗生素和分散剂或者抗粘结剂的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含抗生素剂和第二试剂的产品，所述第二试剂是分散剂或者抗粘结剂，具体地是黏液溶解分散剂或者黏液溶解抗粘结剂，所述的产品在关于细菌感染的预防和治疗中有用。

Description

包含抗生素和分散剂或者抗粘结剂的组合物
发明领域
本发明涉及用于预防和治疗细菌感染的产品、组合物、方法和用途。
发明背景
在人/兽药物和农业中广泛地使用抗生素，并且这导致对目前可用的抗生素的耐药性这一日益严重的问题。这与使用单一的抗生素治疗感染性症状或者疾病（也称作单一疗法）特别相关。因此，不仅对于有效和安全的新治疗有着显著的需要，而且对于具有的作用模式使得在靶向病原体群体中最终产生耐药性的风险被最小化或者消除的治疗，和对于可以与其他的治疗组合使用来使得耐药性的机会最小化并延长目前可用的抗微生物剂的效用的治疗有着显著的需要。
在如囊胞性纤维症（CF）的疾病中，富含黏液的环境如肺的细菌感染是常见的。然而，传统的抗生素在这样的环境下倾向于效果不良，并且在这样的环境下使用时，其抗菌效力被大大减弱。
微生物的生物膜是嵌入在聚合物物质的细胞外基质中，并粘附到生物或者非生物表面的微生物细胞群落。在这些生物膜中可以找到一系列的微生物（细菌、真菌和/或原生动物，以及相关的噬菌体和其他病毒）。生物膜在自然界中普遍存在，并且通常存在与多种环境中。科学和医学群体越来越多地认识到生物膜涉及多种感染，特别是对感染治疗的抗性的贡献。
生物膜在哺乳动物的多种疾病状态中是病原剂，并且涉及80%的人类感染。实例包括了皮肤和伤口感染、中耳感染、肠胃道感染、腹膜感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、牙菌斑的形成、眼部感染（包括隐形眼镜污染）、心内膜炎、囊胞性纤维症中的感染和留置医疗设备如关节假体、牙科植入物、导管、和心脏植入物的感染。
就像Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)和European Committeeon Antimicrobial Susceptibility Testing(EUCAST)所描述的那样，一般地将浮游微生物（即，在液体介质中悬浮或者生长的微生物）用作抗微生物剂敏感性研究的模型。生物膜中的微生物与浮游的类似物相比，针对抗微生物剂的处理明显具有更高的耐受性。然而，在生物膜微生物的抗生素敏感性的研究中，没有标准化的方法。
生物膜的形成不仅限于微生物附着到表面的能力。在生物膜中生长的微生物彼此之间的相互作用比与真实物理基质的相互作用更多，所述生物膜最初在所述真实物理基质上形成的。例如，这一现象有利于接合基因转移，所述的接合基因转移在生物膜中的细胞之间发生的速率比在浮游细胞之间的更高。这代表了细菌之间水平基因转移的机会增加，并且由于这能够促进抗生素耐受性或者毒力决定基因从耐受性微生物转移到敏感微生物而是重要的。细菌可以通过称作群体感应的系统彼此联系，通过该系统将信号分子释放到环境中，并且所述信号分子的浓度可以被周围的微生物检测到。群体感应使得细菌能够使协调其行为，从而增强其生存能力。群体感应的响应包括适应营养素的来源，防御可能竞争同样的营养素的其他微生物，以及避免对细菌有潜在危险的毒性化合物。致病性细菌在感染宿主（例如人、其他动物或者植物）的过程中，为了建立成功的感染，协调其毒力来逃避宿主的免疫反应是非常重要的。
生物膜在多种感染性疾病中是关键的角色，所述的感染性疾病例如囊胞性纤维症和牙周炎，血流和尿道感染，以及由于留置医疗设备的存在而发生的感染。生物膜相关的微生物在宿主中引起疾病的建议机制包括以下：（i）抗微生物剂渗透通过生物膜基质的延迟，（ii）留置医疗设备生物膜上细胞或细胞聚集物的脱离，（iii）内毒素的产生，（iv）对宿主免疫系统的耐受性，（v）通过抗微生物剂耐受性和/或毒力决定基因的水平基因转移提供用于生成耐受性有机体的生态位（niche），和（vi）改变的生长速率（即，代谢休眠）（Donlan和Costerton,ClinMicrobiol Rev15:167-193,2002;Parsek和Singh,Annu Rev Microbiol57:677-701,2003;Costerton JW,Resistance of biofilms to stress.In’The biofilm primer’.(Springer Berlin Heidelberg).pp.56-64.2007）。
最近的试验证据显示，在生物膜内存在小亚群的特化的非代谢存留（persister）细胞（休眠细胞）。认为这些细胞是生物膜对抗微生物剂高耐受性/抗性的原因。在浮游群体和生物膜群体中都存在多药物抗性的存留细胞，并且其酵母和细菌似乎形成类似的策略来赋予该亚群生存的功能。聚合物基质所提供的保护使得存留细胞避免被清除，并且作为群体恢复的来源。有证据表明，存留细胞是微生物生物膜具有多药物耐受性的主要原因（LaFleur等人,AntimicrobAgents Chemother.50:3839-46,2006;Lewis,Nature Reviews Microbiology5,48-562007）。
为了治疗和预防细菌感染，尤其是与黏液溶解环境相关的细菌感染例如CF肺，仍然需要更好的疗法。除此之外，在治疗或预防细菌感染中，尤其在生物膜环境下，仍然需要限制抗生素的量或者剂量，同时引入能够改善目前可用的疗法的有效性的新型疗法、补充疗法或者调试疗法。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了产品，所述产品包含抗生素剂和第二试剂，所述的第二试剂是分散剂或者抗粘结剂，特别是黏液溶解的分散剂或者黏液溶解的抗粘结剂。
根据一个实施方案，所述的第二试剂可以具有抗微生物活性。供选择地，所述的第二试剂可以不具有固有的直接抗微生物的活性。
本发明包括医药产品，所述的医药产品包含至少一种抗生素剂和至少一种分散剂或者至少一种抗粘结剂，特别是黏液溶解的分散剂或者黏液溶解的抗粘结剂。
还提供了如上所示的用于治疗用途的产品。
根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗或者预防细菌感染的产品。
所述的细菌感染可以是散播性的浮游细菌感染，或者具体地为生物膜。
还提供了预防或者治疗细菌感染的方法，所述的方法包括将治疗有效量的本发明的产品给予需要其的患者的步骤。所述的抗生素剂和分散或抗粘结剂可以按照联合的或者序贯的方式来给予。
详述
产品
根据本发明的第一个方面，提供了产品，所述的产品包括抗生素剂和第二试剂，所述的第二试剂是分散剂或者抗粘结剂。
根据一个实施方案，所述的抗生素是非肽抗生素。优选地，本发明的产品不包含任何肽。
本发明的产品在治疗和预防细菌感染中是有效的，所述的细菌感染包括黏液环境的细菌感染。由于传统的抗生素在该环境下效果较差，因此该症状通常非常难以治疗。除此之外，本发明的产品的试剂一般地协同地组合，提供出人意料地高的抗菌活性。因此抗生素的需要量被最小化了。供选择地，本发明的产品的试剂可以附加地进行组合。
所述的产品的优点在于其显示对建立的细菌聚落，包括细菌聚落中存在的存留细胞，例如生物膜具有抗菌活性，这是清除生物膜的关键步骤。
协同效应
出人意料的是，发现当将抗生素剂和分散剂或抗粘结剂组合时，其抗菌作用一般地协同提高。
部分抑菌浓度（FIC）相当于相互作用系数，该系数表明抗微生物剂的组合是否是协同的、加和的、拮抗的或者中和的。FIC通过将组合试剂的活性（试剂A+试剂B的MIC）和单独试剂的活性（试剂A或者试剂B的MIC）如下地进行比较来确定（Singh等人，2000）：
FIC=MICA[组合]/MICA[单独]+MICB[组合]/MICB[单独]
FIC指数为1表明两种抗微生物剂的加和组合，而FIC指数<1表明是协同组合。中和组合会使得FIC在1到4之间，而高于4的FIC指数则表明两种抗微生物剂之间有拮抗效果。
一般来说，本发明的产品组分的组合的FIC指数小于1，一般地小于0.9，适当地小于0.8，有利地小于0.75或者为约0.75，例如小于0.5或者为约0.5。
供选择地，本发明的产品组分的组合的FIC指数可以大于1，通常地在1和2之间，一般地在1到1.5之间，适当地在1到1.2之间。
在黏液溶解环境下，传统抗生素如妥布霉素、粘菌素、庆大霉素或者环丙沙星显示与当其在非黏液溶解环境中时不同水平的抗菌活性。出人意料的是，当给予分散剂或抗粘结剂如半胱胺时，该传统抗生素的抗菌活性会提高。抗生素和抗粘结剂或分散剂协同地起作用，并且当一起给予或者序贯给予时，活性剂的抗菌活性远高于单独给予。
一般地说，本发明的产品的抗菌活性与单独的抗生素剂的抗菌活性相比高至少两倍，一般地，本发明的产品的抗菌活性与单独的抗生素剂的抗菌活性相比高至少四倍，适当地，高至少八倍，通常地至少高10倍左右。
一般地，对于同样的细菌病原体，本发明的产品的最小抑制浓度（MIC）比单独的抗生素剂的MIC低至少两倍，适当地低至少四倍，一般地低至少八倍，有利地低至少10倍或者低约10倍。
为了得到协同效果，本发明的产品的试剂可以一起或者序贯给予，优选地所述的给予间隔不多于10分钟。
抗生素剂
术语“抗生素”用于表示可以来源于细菌来源的抗菌剂。抗生素剂可以是杀菌的或者是抑制细菌的。
一般地说，抗生素剂属于氨基糖苷类、安沙霉素、头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类（包括第一、第二、第三、第四和第五代头孢菌素类）、林可酰胺类、大环内酯类、单环内酰胺类、硝基呋喃类、喹诺酮类、青霉素、磺胺类、多肽和四环素类。供选择地或者另外地，所述的抗生素剂可以是对分枝杆菌有效的。
根据一个实施方案，所述的抗生素剂可以是氨基糖苷例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素或者巴龙霉素。
根据一个实施方案，所述的抗生素剂可以是例如格尔德霉素和除莠霉素。
供选择地，所述的抗生素剂可以是头孢烯类例如氯碳头孢。
根据另一个实施方案，所述的抗生素剂是碳青霉烯类例如厄他培南、多尼培南、亚胺培南/西司他丁或者美罗培南。
供选择地，所述的抗生素剂可以是头孢菌素类（第一代），如头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢噻吩（Cefalotin）或头孢噻吩（Cefalothin），或者供选择地为头孢菌素类（第二代），如头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛。供选择地，所述的抗生素剂可以是头孢菌素类（第三代），如头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢布烯、头孢唑肟和头孢曲松，或头孢菌素（第四代），如头孢吡肟和头孢吡普。
所述的抗生素剂可以是林可酰胺类如克林霉素和阿奇霉素，或者大环内酯类如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素和壮观霉素。
供选择地，所述的抗生素剂可以是单环内酰胺类如氨曲南，或者是硝基呋喃如呋喃唑酮或者呋喃妥英。
所述的抗生素剂可以是青霉素，例如阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G或V、哌拉西林、替莫西林和替卡西林。
所述的抗生素剂可以是磺胺类，例如磺胺米隆、磺胺米柯定（Sulfonamidochrysoidine）、磺乙酰胺、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑（Sulfanilimide）、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶、和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（复方新诺明）（TMP-SMX）。
所述的抗生素剂可以是喹诺酮类药物如环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星和替马沙星。
根据一个实施方案，所述的抗生素剂可以是多肽例如杆菌肽、粘菌素和多粘菌素B。
供选择地，所述的抗生素剂可以是四环素类，如去甲金霉素、强力霉素、米诺环素和土霉素。
供选择地或者另外地，所述的抗生素剂可以对分枝杆菌有效。具体地，所述的抗生素剂可以是氯法齐明、氯苯吩嗪、氯苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福布汀、利福喷丁或链霉素。
一般地说，所述的抗生素剂在由革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌和克雷伯氏杆菌属，特别是铜绿假单胞菌所引起的感染的治疗或者预防中是有活性的。
第二试剂
第二试剂可以选自分散剂和抗粘结剂。具体地，所述的第二试剂选自黏液溶解分散剂和黏液溶解抗粘结剂。所述的第二试剂可以是抑制细菌聚落形成的任意试剂，具体地是抑制生物膜形成的任意试剂。作为实例，第二试剂可以抑制细菌的粘附、疏水性和粘质的产生。
根据本发明的一个实施方案，第二试剂不是肽。
术语“分散剂”旨在包括能够将细菌颗粒分散，从而抑制细菌聚落形成的任意试剂。具体地，所述的分散剂可以将细菌生物膜的颗粒分散。所述的分散剂可以促进细菌微生物所产生的粘质（slime），形成生物膜的部分的黏液（mucous）的分散，所述黏液例如生物膜微生物所粘附的细胞所产生的黏液，以及生物膜细菌所产生的黏液。
所述的分散剂可以是黏液溶解剂。所述的黏液溶解剂可以是酶，例如DNA酶（DNase）、褐藻酸酶、蛋白酶或者碳水化合物酶。供选择地，所述的黏液溶解剂可以是小分子，例如胺，如氨基硫醇；或者是酸，如乙二胺四乙酸（EDTA）。所述的胺可以选自乙酰半胱氨酸和半胱胺，优选地为半胱胺。
术语“抗粘结剂”旨在包括能够抑制细胞、蛋白质和有机体例如微生物之间的粘附，从而预防细菌聚落形成，尤其能够防止细菌生物膜形成或者促进生物膜自我破坏的任意试剂。特别地，所述的抗粘结剂可以防止微生物生物膜中所遇到的所有细胞类型粘结到表面或者基质，所述的细胞类型尤其为游离的活微生物即浮游细胞。抗粘结剂可以包括但不限于透明质酸、肝素或者卡波普934。
所述的第二抗生物膜剂可以是抗菌剂。所述的抗菌剂可以是黏液溶解剂，例如同时具有黏液溶解和抗菌活性的黏液溶解剂。优选地，所述的抗菌剂是半胱胺。
医药产品
前文所述的活性剂可以作为自由或者固定的组合来给予。自由的组合可以作为包含自由组合中所有活性剂的组合包装来提供。固定组合通常是片剂或者胶囊剂。
本发明的试剂可以作为药学上可接受的盐的形式来给予。本发明的药学上可接受的盐可以通过传统的化学方法由包含碱或者酸部分的母体化合物合成。一般地，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或者碱形式与化学计量的合适的碱或者酸在水中或者在有机溶剂中，或者在这两者的混合物中反应来制备；一般地，优选为非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或者乙腈。适用的盐的列表记载于Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,US,1985,p.1418中，将其公开内容引入本文作为参考；还参见Stahl等人,Eds,“Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use”,VerlagHelvetica Chimica Acta and Wiley-VCH,2002。在本文中，使用短语“药学上可接受的”来表示这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，其在可靠的医学判断的范围内适用于接触人类的组织，或者视情况而定适用于接触动物的组织，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症，并且按照合理的收益/风险比提供希望的效果。
本发明因此包括了所公开的化合物的药学上可接受的盐，其中母体化合物通过制备其酸或碱的盐来进行修饰，例如传统的无毒性的盐或者季铵盐，例如由无机或者有机的酸或者碱形成的。这样的酸加成的盐的实例包括了：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基磺酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括了铵盐，碱金属盐如钠盐和钾盐，碱土金属盐如钙盐和镁盐，与有机碱形成的盐如二环己基胺盐，N-甲基-D-葡糖胺，和与氨基酸如精氨酸盐、赖氨酸等形成的盐。此外，碱性含氮基团可被以下试剂季铵化：例如低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸酯如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸酯，长链卤化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物，芳烷基卤化物，如苄基和苯乙基溴化物和其它。
本发明的产品
根据一个实施方案，本发明的产品的抗生素剂不包括肽。适合地，本发明的产品不包括肽。
优选的产品包括非肽的抗生素和分散剂，所述的分散剂尤其地为黏液溶解分散剂如半胱胺。
在本发明的产品中，抗生素剂和第二试剂的比例可以是1:10到10:1，一般地至少为2:1，例如至少为3:1或者4:1。供选择地，在本发明的产品中，抗生素剂和第二试剂的比例可以是1:100到1:2000，例如为1:500到1:1000。根据一个实施方案，抗生素剂和第二试剂的比例是约1:1。优选地，所述的第一抗生素剂是非肽的抗生素，以及第二试剂是半胱胺，并且所述的产品包含了比例为2:1到高达4:1的这些组分。根据另外的实施方案，所述的比例可以是约1:1。
可以同时地、序贯地或者分别地给予所述的活性剂。所述的活性剂可以作为组合包装来提供。所述的组合包装可以包括本发明的产品，以及用于同时、分别或者序贯给予各个活性剂的说明书。对于序贯给予，活性剂可以按照任意的顺序来进行给予。
本发明的产品的活性剂可以作为药物组合物来提供，所述的药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。这对于固定和自由组合都适用。
本发明的活性剂可以通过本领域技术人员已知的任意途径来给予，优选地，优选地以适合该途径的药物组合物的形式以及按照对意图的治疗有效的剂量来给予。活性化合物和组合物可以，例如，经肠道外地、经口服地、经鼻内地、经支气管内地、经肠内地、透皮地、经舌下地、经直肠地、经阴道地、经眼睛地或者局部给予。局部和全身性给予都是考虑到的。
为了进行经肠道外给予（在本文中使用的“肠道外”是指这样的给予方式，包括静脉内、肌肉内、肠内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注，并且其中静脉内（包括连续静脉内给予）是最优选的），可以采用丙二醇水溶液，以及对应的水溶性盐的无菌水溶液。这样的水溶液如果有必要的话可以是适当地经缓冲的，并且首先使用足量的盐水或者葡萄糖来使液体稀释液成为等渗的。这些水溶液尤其地适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射的目的。在这方面，根据本领域技术人员所公知的标准技术，所采用的无菌水性介质都是能够容易地得到的。
本发明的产品还可以经鼻内或者通过吸入来给予，并且便利地以干燥粉末吸入器或者气雾喷雾器的形式来进行递送，所述的干燥粉末吸入器或者气雾剂喷雾表现为加压的容器、泵、喷雾器（spray）、雾化器（atomiser）、喷洒器（nebuliser），使用或者不使用适用的推进剂。
供选择地，本发明的产品可以按照栓剂或者阴道栓的形式来给予，或者其可以局部地以凝胶、水凝胶、乳液、溶液、乳膏、软膏或者粉末的形式来施用。本发明的产品可以是经皮肤或者透皮给予的，例如通过使用皮肤贴剂、长效贴剂或者皮下注射来给予。其还可以通过肺或者直肠途径来给予。
对于口服给予，药物组合物可以是如下的形式：例如为片剂、胶囊剂、混悬剂或者液体。所述的药物组合物优选地制备成剂量单位的形式，所述的剂量单位包含特定量的活性成分。该剂量单位的实例是胶囊剂、片剂、粉末剂、颗粒剂或者混悬剂；其具有传统的添加剂如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或者马铃薯淀粉；其具有粘合剂如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；其具有崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或者羧甲基纤维素钠；以及其具有润滑剂如滑石粉或者硬脂酸镁。活性成分还可以作为组合物通过注射来给予，其中例如，可以使用盐水、右旋糖或者水来作为适用的载体。
本发明的产品还可以用作口腔制剂或者在口腔制剂中使用，其中所述的产品配制在载体中，所述的载体例如选自膜、带、凝胶、微球、锭剂、口香糖、牙膏和漱口水。
给予的治疗活性化合物的量以及使用本发明的化合物和/或组合物来治疗疾病病症的给药方案取决于多种因素，所述的因素包括受试者的年龄、体重、性别和医学状态，疾病的严重性，给予的途径和频率以及所采用的具体化合物，以及所治疗的个体的药代动力学特征，因此其可能在大范围内变化。如果化合物局部给予而不是全身给予，以及用于预防而不是用于治疗的话，剂量一般地会更低。这样的治疗在必要时可以经常给予，并且在治疗医师判断必要的时期中给予。本领域技术人员能够认识到的是，所给予的抑制剂的给药方案或者治疗有效量可以需要针对每个个体进行优化。药物组合物可以包含约0.1到2000mg的活性组分，优选地约0.5到500mg，以及最优选地约1到200mg。合适的每日剂量是约0.01到100mg/kg体重，优选地约0.1到约50mg/kg体重，以及最优选地约1到20mg/kg体重。可以将每日的剂量按照每天一次到四次给药来给予。
本发明的产品优选地给予到呼吸道。因此，本发明还提供了包括本发明的产品的气雾剂的药物制剂。还提供了包括本发明的产品的雾化器或者吸入器。
除此之外，本发明的产品适用于配制成缓释剂型等。所述的制剂的构成可以使其释放活性成分，例如在肠或者呼吸道的特定部分释放，可能地在一段时间内释放。可以例如由聚合物制备涂层、包封和保护性的基质，所述的聚合物为例如聚乳酸-羟基乙酸酯、脂质体、微乳液、微粒、纳米颗粒或者蜡。所述的涂层、包封和保护性基质用于涂布留置设备，例如支架，导管，腹膜透析管，排液装置等等。
本发明的产品可以包含协同有效量的在本文中定义的各个活性剂。因此，本发明包括了包含协同有效量的以下试剂的产品：（i）抗生素剂（其可以是非肽的抗生素剂），（ii）第二试剂，其一般地是半胱胺。所述的产品可以在生产药物中使用，从而在治疗微生物感染，例如细菌感染时将所述的试剂同时地、分别地或者序贯地给予。如本文所使用的，“协同地”可以用于描述本发明的产品的两种或更多种试剂共同起作用以产生比所述的试剂分别地使用时预期的组合效果更好的效果。
在本发明的又一个方面中，提供了本发明的产品施加或者附着到的基质。优选地，所述的基质适用于应用在伤口或者递送到伤口的位置。优选地，所述的基质使得能够将本发明产品的活性剂从基质转移到伤口床，以实现其抗细菌的效果。所述的基质可以是敷料，例如伤口敷料。所述的敷料可以包括织物材料或者其可以是胶原蛋白样材料。所述的基质可以是任意适合用于伤口的形式，一般地所述的基质可以是水凝胶、胶体、软膏、乳膏、凝胶、泡沫或者喷雾的形式。
本发明的产品还可以作为消毒剂或者杀微生物剂使用，或者用在消毒剂或者杀微生物剂中。在这种情况下，可以将本发明的药物组合物单独地或者与其他的消毒剂组合施加到所处理的表面上。如本文中所使用的，“所处理的表面”可以是在本文中定义的基质，并且可以包括医疗设备和留置设备，例如支架，导管，腹膜透析管，排液设备，关节假体，牙科植入物等等。
方法及用途
本发明提供了治疗或者预防细菌感染的方法。所述的的细菌感染可以一般地为播散性感染或者特别地位于富含黏液的环境中，例如在肺中，例如患有CF或者细菌相关的慢性阻塞性肺病（COPD）的患者的肺。本发明的方法包括了将根据本发明的产品给予到环境中的步骤。所述的方法可以是体内的或者离体的。
在富含黏液的环境中，传统的抗生素如妥布霉素、粘菌素、庆大霉素或者环丙沙星显示与当其在低黏液环境中时不同水平的抗菌活性。出人意料的是，当给予分散剂或者抗粘结剂如半胱胺时，抗生素的抗菌活性提高。有利地，所述的方法包括给予以下试剂的步骤：
抗生素剂；和
第二试剂，所述的第二试剂是分散剂或者抗粘结剂，优选地为半胱胺。
其中本发明的方法用于治疗与CF相关的细菌感染，所述的抗生素剂优选地为妥布霉素、粘菌素、庆大霉素或者环丙沙星。
环境可以包括任意的细菌感染，包括由一种以上微生物所导致的感染，所述的微生物为例如细菌和选自真菌、酵母、病毒和原生动物的任意一种。
所述的细菌可以是革兰氏阳性或者革兰氏阴性细菌。细菌病原体可以来自选自以下的细菌种类：葡萄球菌属（Staphylococcus spp.），例如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；肠球菌属（Enterococcus spp.），例如粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）；李斯特菌属（Listeria spp.）；假单胞菌属（Pseudomonasspp.）；分枝杆菌属（Mycobacterium spp.），例如结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）；肠杆菌属（Enterobacter spp.）；弯曲杆菌属（Campylobacter spp.）；沙门氏菌属（Salmonella spp.）；链球菌属（Streptococcus spp.），如A群或B群链球菌，肺炎链球菌（Streptoccocus pneumoniae）;螺旋杆菌属（Helicobacter spp.），如幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）；奈瑟氏菌属（Neisseria spp.），例如淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhea），脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）；伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）；志贺菌属（Shigella spp.），如弗氏志贺菌（Shigellaflexneri）；大肠杆菌（Escherichia coli）；嗜血杆菌属（Haemophilus spp.），如流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）；衣原体属（Chlamydia spp.），例如沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis），肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae），鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）;土拉热弗朗西斯氏菌（Francisella fularensis）；芽孢杆菌属（Bacillus spp.），如炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）；梭状芽胞杆菌属（Clostridia spp.），例如肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）；耶尔森氏菌属（Yersinia spp.），例如鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis）；密螺旋体菌属（Treponema spp.）；伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia spp.），例如鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）和类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B pseudomallei）。
特别地，所述的细菌可以包括假单胞菌属，例如铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）；葡萄球菌属例如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌；嗜血杆菌属，例如流感嗜血菌；伯克霍尔德氏菌属，例如洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderiacepacia）；链球菌属，丙酸菌属（Propionibacterium spp.），例如疮疱丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）。优选地，所述的细菌选自假单胞菌属和葡萄球菌属，所述的假单胞菌属例如铜绿假单胞菌，所述的葡萄球菌属例如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。
本发明的方法可以用于在多种环境中使细菌聚落，特别是细菌生物膜的形成最小化，以及优选地预防其的形成，所述的环境包括但不限于家庭、工作场所、实验室、工业环境、水环境（例如管道系统）、医疗设备（包括留置设备，例如本文中所限定的）、牙科设备或者牙科植入物、动物体例如人体。
因此，本发明的方法可以用于口腔中，来防止人牙齿或者牙科植入物例如义齿上菌斑或者龋齿的形成。
本发明的方法可以用于防止或者限制细菌聚落的形成。本发明的方法可以用于预防或者治疗细菌感染，所述的细菌感染包括了局部感染、口腔感染和全身性感染。局部感染可以包括伤口、溃疡和损伤，例如皮肤的伤口例如切伤或者烧伤，以及与其相关的症状。
口腔感染可以包括牙龈炎、牙周炎和口腔粘膜炎。
全身性的感染可以包括囊胞性纤维症、COPD和其他与粘膜感染相关的病症，例如胃肠道、泌尿生殖器或者其他呼吸道感染。
本发明的另一个方面在于在哺乳动物中，尤其是人中通过将有效量的本发明的产品给予哺乳动物，来治疗、预防细菌感染或者延缓细菌感染的进展的方法。
“有效”量或者“治疗上有效量”意思是在可靠的医学判断的范围内，足以在没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或者其他问题或并发症的情况下，按照合理的收益/风险比提供希望的效果的一种或多种活性物质的量。
因此，本发明的产品可以用于选自以下的疾病或病症的预防、延缓进展或者治疗：皮肤和伤口感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、牙菌斑的形成、眼部感染（包括隐形眼镜污染）、心内膜炎、囊胞性纤维症中的感染和留置医疗设备的感染，所述留置医疗设备例如在本文中所描述的。
本发明还包括了治疗的方法，其中将本发明的产品与一种或多种其他的抗菌剂例如抗生素给予哺乳动物。一般来说，本发明的产品和本发明的任意组合物不包括任何肽。
在本文本中所提到的活性剂能以不同的形式存在，例如游离酸、游离碱、醚和其他前药、盐和互变异构体，例如，本发明包括试剂的全部变化形式。
在本文本的说明书和权利要求中，除非上下文另外要求，单数涵盖了复数。具体地，当使用不定冠词时，除非内容另外要求，文本应当理解为考虑了复数以及单数。
结合本发明的具体方面、实施方案或者实施例进行描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或者基团应当理解为可应用于任意其他的在本文中描述的方面、实施方案或者实施例中，除非与其不相容。
在本文本的整个说明书和权利要求中，词语“包括（comprise）”和“包含（contain）”和所述词语的变化，例如“包括（comprising）”和“包括（comprises）”意思是“包括（including）但是不限于”，并且不意图（也不）排除其他的部分、添加物、组分、整数或者步骤。
一般地，术语“大约”旨在包括其所使用的任意数值的10%或者更少的范围。
本发明的其他方面和实施方案在下文的说明书和权利要求书中给出。
在此参照下图，以实施例的方式对本发明进行描述，其中：
图1a和1b：提供了妥布霉素和半胱胺（NM001）当分开地给予，以及以组合的形式给予时对假单胞菌浮游细胞的抗菌活性的比较。NM001使得妥布霉素对浮游细胞的MIC降低至少4倍（图1b）。
图2：针对在复制CF肺中发现的环境的粘液环境下培养的铜绿假单胞菌细胞，提供了妥布霉素和环丙沙星单独以及与半胱胺组合时抗细菌活性的对比。
图3：针对在无粘液环境下培养的铜绿假单胞菌细胞，和在复制CF肺中发现的环境的粘液环境下培养的铜绿假单胞菌细胞（在NaCl和/或粘蛋白的存在下），提供了单独的妥布霉素和当其和半胱胺（NM001）组合时活性的对比。NM001在粘液环境下恢复了传统抗生素的抗生素活性。
图4：显示了针对建立的铜绿假单胞菌PAO1生物膜，单独的半胱胺和半胱胺与妥布霉素组合的抗生物膜活性比较的柱状图：剂量响应研究允许确定半胱胺对建立的铜绿假单胞菌PAO1生物膜的最低生物膜消除浓度（MBEC）以及允许定量与妥布霉素的加和活性化。单独的半胱胺的MBEC是1000μg/ml，以及妥布霉素显示出4μg/ml的MBEC。然而，当组合时，使用500μg/ml半胱胺和1μg/ml妥布霉素得到了完全的生物膜清除。因此，这样的组合的部分抑菌浓度（FIC）为0.75，显示两种抗微生物剂之间的加和性。因此，黏液溶解/抗微生物剂半胱胺具有增强传统抗生素的抗生物膜活性的潜力，这可以影响到降低抗微生物耐受性的传播和治疗的成本。
图5：显示了半胱胺（NM001）与妥布霉素（TOB）组合针对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的抗微生物后效应的图表。
图6：显示了证明针对多药耐药的洋葱伯克霍尔德菌NCTC10743时，半胱胺（NM001）提高妥布霉素的抗微生物活性的图表。还确定了半胱胺和妥布霉素对多药耐药株洋葱伯克霍尔德菌NCTC10743的加和抗微生物活性。妥布霉素的MIC100高于16μg/ml，而半胱胺显示出500μg/ml的MIC100值。当组合时，半胱胺能够提高妥布霉素的活性，并且当与250μg/ml半胱胺组合时的MIC100值是0.25μg/ml。这导致FIC指数小于0.51，这表明这两种化合物至少有加和的抗微生物活性，以及可能是协同的。
图7：显示了证明妥布霉素和半胱胺针对单独的铜绿假单胞菌PAO1浮游细胞，和所述的浮游细胞与囊胞性纤维症（CF）患者中发现的生理相关的浓缩物（concentration）组合的抗微生物活性的柱状图。将半胱胺的抗微生物活性（MIC100）在正常条件下（如CLSI M7-A7方法所述—参见附录1）、和在150mM氯化钠（NaCl）、1.7mM氯化钙（CaCl2）、1mg/ml DNA或者1%(w/v)猪胃粘蛋白的存在下在96孔板中进行三次重复比较。随后使细菌生长24小时，并且使用BioTek微滴定读板仪在625nm下读取吸收度。完全细菌生长抑制在NaCl、CaCl2或者DNA的存在下保持，在粘蛋白的存在下是正常MIC100的两倍。在二价阳离子Ca2+的存在下，以及在阴离子聚合物DNA的存在下，妥布霉素的活性被抑制。当与半胱胺组合时，妥布霉素的活性在所有的测试条件下都得到保持，所述的测试在高达其正常MIC的四倍的浓度下进行。
图8：是显示了半胱胺与其他的二硫键的破坏剂和黏液溶解剂相比的黏液溶解活性的柱状图。通过测量处理后粘蛋白溶液的粘度，将半胱胺的黏液溶解活性和其他的黏液溶解剂，例如N-乙酰基半胱氨酸
Figure BDA00003455796400151
DNA酶I
Figure BDA00003455796400152
Figure BDA00003455796400153
海藻酸裂解酶和半胱胺盐酸盐进行比较。猪胃的粘蛋白（Sigma-Aldrich,Gillingham,UK）在无菌的纯水中按照20%（w/v）进行制备。将黏液溶解剂在20%（w/v）的粘蛋白溶液中按照10mg/ml进行制备。在暴露于黏液溶解剂约5分钟后，测量粘蛋白的流速。数据显示了独立的重复试验的平均值和标准偏差值。
图9：是显示了半胱胺（NM001）与妥布霉素组合对铜绿假单胞菌PAO1的生物膜的抗微生物后效应的图表。这显示了半胱胺与妥布霉素的组合在两个不同的浓度下的抗生物膜活性，同时在处理生物膜之后，通过跟踪细菌生长来测定这些化合物的抗微生物后效应（PAE）。
图10：显示了证明在使用半胱胺（NM001）与妥布霉素组合处理铜绿假单胞菌PAO1的生物膜之后，微生物代谢活性受抑制的图表。这显示了生物膜在经处理之后的代谢活性。数据证实，半胱胺当单独或者与妥布霉素组合时抗生物膜的活性具有显著的PAE，这一点被细菌生长的延迟和生物膜代谢活性降低所证实。
实施例
抗微生物剂对细菌聚落的活性
材料和方法
1.1菌株
在本研究中使用铜绿假单胞菌ATCC27853和洋葱伯克霍尔德菌NCTC10743。如表1和2中显示的，使用了铜绿假单胞菌的其他菌株。
1.2抗微生物化合物的制备
在本研究中试验的抗微生物剂是半胱胺（NM001）、妥布霉素、环丙沙星、粘菌素和庆大霉素。所述的试剂得自Sigma-Aldrich（Gillingham,UK），储备液按照20mg/ml在14-18MΩ.cm的纯水（Purite HP40水纯化系统，Oxon，UK）中进行制备。一旦溶解之后，将制备物使用0.22μm的滤器（Millipore,Watford,England）进行过滤除菌并且在-20°C下进行储存。
1.3细菌接种液的制备
通过将在Mueller-Hinton（MH）肉汤中活性生长的培养物的稀释方法来建立细菌接种液，并且按照CLSI方法M26-A所述的使用0.5McFarland浊度标准进行标准化。
1.4最小抑制浓度（MIC）的测定
将细菌接种液和抗微生物剂两者，包括在结构上与半胱胺相关的化合物同时加到板中。将所述的板在37°C下孵育24小时，并且在微滴定读板仪（BioTekPowerwave XS,Winooski,USA）上于625nm下读取其光密度。将对细菌生长显示出完全抑制的抗微生物剂的最低浓度作为MIC。
半胱胺衍生物对铜绿假单胞菌的抗微生物效果
研究了在化学结构上与半胱胺相关的大量化合物的抗微生物活性：胱胺（二盐酸盐）、牛磺酸和2,3-二巯基丁二酸。其他在化学上与半胱胺相关的化合物是已知的，但是有毒性，因此在这种性质的药物中没有实用性。
半胱胺:
Figure BDA00003455796400161
胱胺:
Figure BDA00003455796400162
牛磺酸:
Figure BDA00003455796400163
2,3-二巯基丁二酸:
Figure BDA00003455796400171
1.5在生理相关的离子浓度下测定MIC
使用如上所述的（1.4）类似的方法来测定半胱胺
Figure BDA00003455796400172
在高离子浓度存在下的抗微生物活性。将半胱胺的抗微生物活性（MIC100）在正常条件下（如CLSI M7-A7方法中描述的）、和在150mM氯化钠（NaCl）、1.7mM氯化钙（CaCl2）、1mg/ml DNA或者1%（w/v）猪胃粘蛋白存在下，在96孔板中进行三次重复比较。随后使细菌生长24小时，并且使用BioTek微滴定读板仪在625nm下读取吸收度。
1.6抗生物膜活性的测定
使用微流体BioFlux800流式细胞系统（Fluxion,South San Francisco,USA）来评估抗生物膜活性。使用在Mueller-Hinton肉汤中的铜绿假单胞菌PAO1的0.5McFarland等价接种物对48-孔BioFlux板的微流体通道进行接种。在37°C下使得微生物细胞附着并且开始形成微聚落30分钟。将黏液溶解剂按照1mg/ml在Mueller-Hinton肉汤中制备，并且在37°C下按照0.5Dyn/cm2（等于53μl/h）的流速在16小时内流经微流体。使用倒置式Axiovert40显微镜（Carl Zeiss,WelwynGarden City,UK）在100倍的放大倍率下进行显微观察并记录照片。
1.7部分抑菌浓度（FIC）的测定
FIC相当于相互作用系数，表明抗微生物剂的组合是否是协同的、加和的、拮抗的或者中和的。通过将组合的试剂的活性（试剂A+试剂B的MIC）和单独的试剂的活性（试剂A或者试剂B的MIC）按照如下进行比较来测定FIC：
FIC=MICA[组合]/MICA[单独]+MICB[组合]/MICB[单独]
两种抗微生物剂的加和组合显示FIC指数为1，然而FIC指数<1表明了协同组合。中和的组合会给出1到4之间的FIC，高于4的FIC指数表明两种抗微生物剂之间的拮抗作用。
还通过计算FIC来评估两种抗微生物剂的组合在抗细菌样品中的相互作用。
1.8抗微生物后效应（PAE）和代谢活性的测定
通过在处理后一式三份地将10μl的生物膜培养物转移到微滴定板中的90μl的无菌MH肉汤中来测定PAE。随后在37°C下在BioTek读板仪上使细菌继续生长24小时。在处理生物膜之后，使用与测定PAE相同的方法，并且加入10%（v/v）的荧光细胞活力指示剂、刃天青（Alamar Blue,Serotec）来测定微生物的代谢活性，所述的方法通过荧光的升高来检测微生物代谢活性的提高。使用BioTekSynergy HT微型板读板仪（BioTek,Winooski,USA）在37°C和530/590nm下测量荧光24小时。
1.9黏液溶解活性的测定
通过测量处理之后的粘蛋白溶液的粘度来将半胱胺的黏液溶解活性和其他的黏液溶解剂如N-乙酰基半胱氨酸
Figure BDA00003455796400181
DNA酶I
Figure BDA00003455796400182
海藻酸裂解酶和半胱胺盐酸盐进行比较。将猪胃的粘蛋白（Sigma-Aldrich,Gillingham,UK）在无菌的纯水中按照20%（w/v）进行制备。黏液溶解剂在20%（w/v）的粘蛋白溶液中按照10mg/ml进行制备。粘蛋白的流速在暴露到黏液溶解剂大约5分钟之后进行测量。
2结果
2.1细菌定殖的预防和治疗
抗菌剂的浓度范围是0-10μg/ml。
2.1.1对铜绿假单胞菌ATCC27853的活性
与单独给予妥布霉素和环丙沙星相比，妥布霉素和环丙沙星与半胱胺给予时的MIC大大地降低。在模拟CF肺中发现的环境时显示出了这一效果。
对该组合FIC的测定表明，抗菌剂具有协同效果（FIC=0.75）。本发明的抗微生物剂协同地起作用，来提供增强的抗菌效果。传统的抗生素例如妥布霉素和环丙沙星当与半胱胺组合给予到黏液溶解环境时，其抗菌效果被保持。
2.2表1：半胱胺、半胱胺盐酸盐和N-乙酰基半胱氨酸和传统的抗生素粘菌素、环丙沙星、妥布霉素和庆大霉素的组合对选定的铜绿假单胞菌分离株的部分抑菌浓度指数
Figure BDA00003455796400191
Figure BDA00003455796400201
Figure BDA00003455796400211
2.3表2：半胱胺和结构上相关的化合物对选定的临床相关的铜绿假单 胞菌分离株的抗微生物效力
Figure BDA00003455796400221
Figure BDA00003455796400222
Figure BDA00003455796400223
Figure BDA00003455796400231
在所有的情况下，半胱胺显示比相关的化合物更强的抗微生物效力，这表明巯基和胺基两者对于显著的抗微生物活性的关键性质。

Claims (25)

1.一种产品，其包含抗生素剂和第二试剂，所述的第二试剂是分散剂或者抗粘结剂。 
2.根据权利要求1所述的产品，其中，不存在肽。 
3.根据权利要求1或2所述的产品，其中，所述抗生素剂是非肽抗生素。 
4.根据权利要求3所述的产品，其中，所述抗生素是妥布霉素、粘菌素、庆大霉素或者环丙沙星。 
5.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其中，所述第二试剂是半胱胺。 
6.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其含有协同有效量的（i）抗生素剂，和（ii）第二试剂，所述第二试剂是分散剂或者抗粘结剂。 
7.根据前述权利要求中任一项所述的产品，其用作药物。 
8.一种基质，所述的基质上施加或者附着有根据前述权利要求中任一项所述的产品。 
9.根据权利要求8所述的基质，其中，所述基质选自敷料、医疗设备和留置设备。 
10.根据权利要求9所述的基质，其中，所述留置设备选自支架、导管、腹膜透析管、排液设备、关节假体和牙科植入物。 
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-7中任一项所述的 产品和一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。 
12.根据权利要求1-7中任一项所述的产品在治疗或者预防微生物感染或者与其相关的疾病或者病症中的用途。 
13.根据权利要求12所述的用途，其中感染或与其相关的疾病或病症选自：皮肤和伤口感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、牙菌斑的形成、眼部感染、心内膜炎、囊胞性纤维症中的感染和留置医疗设备的感染。 
14.根据权利要求12和13中任一项所述的用途，其中，所述的感染是黏液溶解环境的感染。 
15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述的感染是与囊胞性纤维症相关的细菌感染。 
16.根据权利要求12-15中任一项所述的用途，其中，所述的感染是由选自以下的细菌引起的：假单胞菌属、葡萄球菌属、嗜血杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、链球菌属和丙酸杆菌属。 
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的细菌是假单胞菌属。 
18.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的细菌是伯克霍尔德氏菌属。 
19.根据权利要求16所述的用途，其中，所述的细菌是葡萄球菌属。 
20.一种通过预防或治疗来治疗微生物感染的方法，所述的方法包括序贯或联合给予治疗有效量的： 
抗生素剂；和 
第二试剂，所述的第二试剂是分散剂或者抗粘结剂。 
21.根据权利要求20所述的方法，所述的方法包括给予权利要求1-7中任一项所述的产品或者权利要求11所述的组合物。 
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述微生物感染是局部感染或者全身性感染。 
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述的全身性感染是粘膜感染。 
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述的粘膜感染是胃肠道、泌尿生殖道或呼吸道感染。 
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中，所述的粘膜感染是囊胞性纤维症或者是与慢性阻塞性肺病（COPD）相关的。 
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