RS54815B1 - Supstanca koja sadrži antibiotik i disperzant - Google Patents

Abstract

Proizvod koji obuhvata sinergistički delotvornu količinu antibiotskog agensa i drugi agens koji je disperzant; pri čemu je antibiotik Tobramicin, Kolistin, Gentamicin ili Ciprofloksacin i pri čemu je drugi agens cisteamin.Prijava sadrži još 13 patentnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

[0001]Ovaj se pronalazak odnosi na proizvode, jedinjenja, postupke i upotrebe koji su korisni u vezi sa sprečavanjem i lečenjem bakterijskih infekcija.

Prethodno stanje tehnike

[0002]Antibiotici imaju raširenu upotrebu, i u ljudskoj i u veterinarskoj medicini a takođe i u poljoprivredi, i ovo vodi do sve većeg problema otpornosti leka na trenutno dostupne antibiotike. Ovo je posebno relevantno za infektivna stanja ili bolesti koji se leče samo jednom vrstom antibiotika (drugačije poznati kao monoterapija). Kao takva, postoji začajna potreba ne samo za efektivnim i sigurnim novim terapijama već onim koje imaju režim aktivnosti koji smanjuje ili negira rizik od eventualnog razvoja otpornosti na lek kod ciljnih patogenih populacija i za terapije koje se mogu koristiti u kombinacij sa drugim terapijama kako bi se svela na minimum mogućnost za stvaranje otpora i proširenje korisnosti trenutno dostupnih antimikrobnih lekova.

[0003]Bakterijske infekcije u sluzom bogatim sredinama kao što su pluća su česte kod bolesti kao što je cistična fibroza (CF). Međutim, uobičajeni antibiotici nemaju tendenciju da dobro deluju u takvim okolinama i njihova antibakterijska delotvornost se u velikoj meri smanjuje kada se koristi u takvim okruženjima.

[0004]Mikrobni biofilm je jedinica mikrobnih ćelija umetnutih u vanćelijsku matricu polimernih supstanci i slepljenih na biološku ili nebiotsku površinu. U ovim biofilmovima je moguće pronaći jedan spektar mikroorganizama (bakterija, gljivica, i/ili protozoa, sa povezanim bakteriofagima i drugim virusima). Biofilmovi su jedinstveni po prirodi, često se mogu naći u širokom rasponu sredina. Biofilmovi se sve više prepoznaju u naučnoj i medicinskoj zajednici kao implikatori brojnih infekcija, i posebno njihovom doprinosu prema otpornosti na lečenje infekcije

[0005]Biofilmovi su etiološki agensi za jedan broj stanja bolesti kod sisara i uključeni su u 80% infekcija kod ljudi. Primeri obuhvataju infekcije kože i rana, infekcije srednjeg uha, infekcije gastrointestinalnog trakta, infekcije membrane peritoneuma (trbuha), infekcije urogenitalnog trakta, infekcije mekog tkiva usne dublje, formiranje zubnog plaka, infekcija oka (uključujući kontaminaciju kontaktnih sočiva), endokarditisa. infekcije cistične fibroze, i infekcije unutrašnjih medicinskih uređaja kao što su proteze zglobova, zubni implanti, kateteri i implanti za srce.

[0006]Planktonski mikrobi (t.j., mikroorganizmi smešteni u suspenziju ili koji rastu u tečnoj podlozi) se najčešće koriste kao modeli za istraživanje o antimikrobnoj sklonosti kako je opisao Institut za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI) i Evropski komitet za testiranje antimikrobne sklonosti (EUCAST). Mikrobi i biofilmovi su značajno otporniji na antimikrobno lečenje nego njihovi planktonski dvojnici. Međutim, nema standardizovnog postupka za studiju antimikrobne sklonosti mikroba biofilma.

[0007]Formiranje biofilma se ne ograničava samo na sposobnost mikroba da se spoje na površinu. Rast mikroba u biofilmu može da reaguje više međusobno nego sa stvarnom fizičkom podlogom na koju je početno razvijen biofilm. Na primer, ovaj fenomen daje prednost konjugativnom transferu gena, koji se odvija većom brzinom između ćelija u biofilmovima nego između planktonskih ćelija. Ovo predstavlja veću mogućnost za horizontalni prenos gena između bakterija, i važno je zbog toga što ovo olakšava prenos antibiotski otpornih gena ili virulencijom determinisanih gena od otpornih do na mikrobe podložnih. Bakterija može da komunicira jedna sa drugom putem sistema pogodnog kao raspoznavanje kvoruma, putem kog se molekuli signaliziranja otpuštaju u okolinu i njihova koncentracija može da se detektuje pomoću okolnih mikroba. Raspoznavanje mikroba omogućava bakerijama da koordiniraju svoje ponašanje, čime se povećava njihova mogućnost da prežive. Odgovori na raspoznavanje kvoruma obuhvataju prilagođavanje dostupnosti hranljivih sredstava, njihovu odbranu protiv drugih mikroorganizama koji mogu da se takmiče za iste hranljive sastojke i izbegavanje toksičnih jedinjenja potencijalno opasnih za bakterije. Veoma je važno da patogene bakterije tokom infekcije domaćina (npr. ljudi, drugih životinja ili biljaka) koordiniraju svoju virulenciju da bi izbegle odgovor imunog sistema domaćina kako bi mogle da uspostave uspešnu infekciju.

[0008]Formiranje biofilma igra ključnu ulogu u brojnim infektivnim bolestima, kao što je cistična fibroza i periodontitis, kod infekcija krvotoka i urinarnog trakta i kao posledica prisustva unutašnjih medicinskih uređaja. Predloženi mehanizmi kojima mikroorganizmi povezani sa biofilmom izazivaju bolesti u njihovom domaćinu obuhvataju sledeće: (i) odloženi prodor antimikrobnog agensa kroz matricu biofilma, (ii) odvajanje ćelija ili agregata ćelija od biofilmova unutrašnjeg medicinskog uređaja, (iii) proizvodnja endotoksina, (iv) otpornost na imuni sistem domaćina, (v) obezbeđivanje niše za stvaranje otpornih organizama kroz horizontalni transfer gena antimikrobni otpornih gena i/ili virulencijom određenih gena, i (vi) izmenjenu brzinu rasta (t.j. metaboličku uspavanost) (Donlan and Costerton, Clin Microbiol Rev 15: 157-193, 2002; Parsek and Singh, Annu Rev Microbiol 57: 677-701, 2003; Costerton JW, Resistance of biofilms to stress. In 'The biofilm primer'. (Springer Berlin Heidelberg) pp 56-64 2007).

[0009]Nedavni eksperimentalni dokaz o postojanju u okviru biofilmova male podpopulacije specijalizovanih nemetabolizirajućih ćelija koje se odupiru (dormant ćelije). Smatra se da ove ćelije mogu da budu odgovorne za visoku otpornost/toleranciju biofilma na antimikrobne agense. Ćelije tolerantne na više lekova koje se odupiru i planktonskim populacijama i populacijama biofilma i čini se da su kvasci i bakterije razvili analogne strategije koje ovoj podpopulaciji dodeljuju funkciju opstanka Zaštita koju je ponudila polimerna matrica omogućava otpornim ćelijama da izbegnu eliminisanje i služe kao izvor za ponovno naseljavanje. Postoji dokaz da ćelije koje se odupiru mogu da budu u većoj meri odgovorne za toleranciju mikrobnih biofilmova na više lekova (LaFleur et al., Antirnicrob Agents Chemother. 50: 3839-46,2006, Lewis, Nature Reviews Microbiologv 5,48-56 2007).

[0010]Ostaje potreba za boljim terapijama za lečenje i sprečavanje bakterijskih infekcija, posebno onim povezanim sa sluzom bogatim sredinama kao što je cistična fibroza (CF) pluća. Pored toga ostaje potreba da se ograniči količina ili doze antibiotika korišćenih pri uvođenju novih, zamenskih terapija ili dodatnih lečenja koja mogu da poboljšaju delotvornost trenutno raspoloživih terapija za lečenje ili sprečavanje bakterijskih infekcija, posebno u postavci biofilma.

Kratak opis pronalaska

[0011]Prema prvom varijantnom rešenju ovog pronalaska dati proizvod obuhvata antibiotski agens i drugi agens koji je disperzant ili antiadhezivni agens, a posebno mikolitički disperzant ili mikolitički antiadhezivni agens.

[0012]Prema jednom izvođenju, drugi agens može da ima antimikrobnu aktivnost. Alternativno, drugi agens ne mora da ima urođenu direktnu antimikrobnu aktivnost

[0013]Ovaj pronalazak obuhvata farmaceutske proizvode koji sadrže najmanje jedan antibiotski agens i najmanje jedan disperzant iii najmanje jedan antiadhezivan agens, posebno mikolitički disperzant ili mikolitički antiadhezivni agens.

[0014]Takođe je obezbeđeno da je gore opisan proizvod za terapijsku upotrebu.

[0015]Prema još jednom varijantnom rešenju ovog pronalaska obezbeđen je proizvod za upotrebu u lečenju ili sprečavanju bakterijske infekcije.

[0016]Bakterijska infekcija može da bude disemenirana planktonska bakterijska infekcija ili preciznije, bakterijski biofilm.

[0017]Obezbeđen je postupak za sprečavanje ili lečenje bakterijske infekcije koja obuhvata korake primene leka u vidu terapijski delotvorne količine proizvoda prema ovom pronalasku pacijentu kom je potrebna. Antibiotski agens i disperzant ili antiadhezivni agens može da se primeni na kombinovan ili sekvencijalni način.

Detaljanopis

[0018]Ovaj pronalazak definišu zahtevi u kojima se traži zaštita patentom

Proizvod

[0019]Prema prvom varijantnom rešenju ovog pronalaska obezbeđen je proizvod koji sadrži antibiotski agens prema patentnom zahtevu 1 sa cisteaminom

[0020]Prema jednom primeru, antibiotik je nepeptidni antibiotik. Preporučljivo, proizvod prema ovom pronalasku ne sadrži peptide.

[0021]Proizvodi prema ovom pronalasku su delotvorni za lečenje i sprečavanje bakterijskih infekcija, uključujući bakterijske infekcije u sluzavom okruženju. Takvi uslovi su često veoma teški za lečenje jer su standardni antibiotici manje delotvorni u takvim sredinama. Pored toga, agensi proizvoda prema ovom pronalasku se generalno kombinuju sinergijski da obezbede iznenađujuće visoku antibakterijsku aktivnost. Količina potrebnog antibiotika se zbog toga svodi na minimum. Alternativno, agensi proizvoda prema ovom pronalasku mogu da se kombinuju dodavanjem.

[0022]Proizvodi imaju prednost u tome što pokazuju antibakterijsku aktivnost protiv ustaljenih kolonija bakterija, uključujući uporne ćelije koje su prisutne u kolonijama bakterija, kao što su bakterijski mikrofilmovi, što je ključan korak prema iskorenjivanju biofilmova

Sinergijsko dejstvo

[0023]Iznenađuje činjenica da se utvrđena antibakterijska aktivnosti antibiotskog agensa i disperzanta ili antiadhezivnog agensa generalno povećava sinergijski posle kombinovanja.

[0024]Frakciona inhibitorna koncentracija (FIC) odgovara koeficijentu interakcije koji ukazuje na to da li je kombinacija antimikrobnog agensa sinergistik. aditiv, antagonist ili neutralni agens Frakciona inhibitorna koncentracija (FiC) se određuje poređenjem aktivnosti agensa u kombinaciji (MIC, agens A + agens B) uz aktivnost samog agensa (MIC agensa A ili agensa 8) kao što je u nastavku (Singh ef a/., 2000):

FIC=IVItCA[|(0mbinaCija]JMICA[sam]+W'ICB[(,ombjl1aCjja]/iVI1CB[S3m]

[0025]Kombinacije dodavanja dva antimikrobna agensa su navedene pomoću FIC indeksa (indeks frakcione inhibitorne koncentracije) 1, pri čemu FIC indeks < 1 označava kombinacije sinergistika. Neutralne kombinacije bi dale frakcionu inhibitornu koncentraciju (FIC) između 1 i 4, FIC indeks viši od 4 označava dejstva antagonista između dva antimikrobna agensa

[0026]Generalno indeks frakcione inhibitorne koncentracije (FIC) u kombinaciji komponenata proizvoda prema ovom pronalasku je manji od 1, najčešće manje od 0,9, pogodno manje od 0,8. preporučljivo manje od ili oko 0,75, na primer manje od ili oko 0,5 Alternativno, FIC indeks kombinovanja komponenata proizvoda prema ovom pronalasku može da bude veći od 1; generalno između 1 i 2; najčešće između 1 i 1,5, pogodno između 1 i 1,2.

[0027]Standardni antibiotici kao što je Tobramicin, Kotistin, Gentamicin ili Ciprofloksacin u sluzavim sredinama ne ispoljavaju isti nivo antibakterijske aktivnosti kao kada su u nesluzavim sredinama. Iznenađujuće je da se antibakterijska aktivnost kao standardni antibiotici povećava posle primene disperzanta ili antiadhezivnog agensa kao što je cisteamin. Antibioici i antiadherant ili disperzant deluju sinergistično i kada se primenjuju zajedno ili sekvencijalno antibakterijska aktivnost aktivnih sastojaka je daleko viša nego kada se primenjuju odvojeno.

[0028]Generalno, antibakterijska aktivnost proizvoda prema ovom pronalasku je barem dva puta veća nego antibakterijska aktivnost samog antibiotskog agensa, najčešće je antibakterijska aktivnost proizvoda prema ovom pronalasku barem četiri puta viša od samog antibiotskog agensa , pogodno najmanje osam pua viša, generalno najmanje, ili oko, deset puta viša.

[0029]Generalno minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) proizvoda prema ovom pronalasku je barem dva puta niža od MIC samog antibiotskog agensa u vezi sa istim bakterijskim patogenom, pogodno najmanje četiri puta niža, najčešće barem osam puta niža a posebno barem ili oko deset puta niža.

[0030]Da bi se dobilo sinergijsko dejstvo agensi proizvoda prema ovom pronalasku moraju se primeniti zajedno ili sekvencijalno, poželjno u razmaku ne većem od 10 minuta.

Antibiotski agens

[0031]Pojam "antibiotik" se koristi da se odnosi na antibakterijske agense koji mogu biti izvedeni iz bakterijskih izvora. Antibiotski agensi mogu biti baktericidni i/ili bakteriostatski.

[0032]Generalno antibiotski agens je iz grupe koja se sastoji od aminoglikozida. ansamicina, karbacefema, karbapenema, cefalosporina (uključujući prvu, drugu, treću, četvrtu i petu generaciju cefalosporina), linkozamida, makrolida, monobaktama, nitrofurana, hinolona, penicilina, sulfonamida, polipeptida i tetraciklina. Alternativno ili dodatno antibiotski agens može biti delotvoran naspram mikobakterija.

[0033]Prema jednom primeru, antibiotski agens može biti aminoglikozid kao što je Amikacin, Gentamicin, Kanarnicin, Neomicin, Netilmicin, Tobramicin ili Paromomicin.

[0034]Prema jednom primeru, antibiotski agens može da bude i Geldanamicin i Herbimicin.

[0035] Alternativno antibiotski agens može da bude karbacefem kao što je Lorakarbef

[0036]Prema još jednom primeru, antibiotski agens je karbapenem kao stoje ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatin ili meropenem.

[0037] Alternativno antibiotski agens mogu da budu cefalosporini (prva generacija) kao što je cefadroksil, cefazolin, cefaleksin, cefalotin ili cefalothin, ili alternativno cefalosporini (druga generacija) kao što je cefaklor, cefamandol, cefoksitin, cefprozil ili cefuroksim. Druga mogućnost je da antibiotski agens mogu da budu cefalosporini (treća generacija) kao što je cefiksim, cefdinir, cefditoren, cefoperazon, cefotaksim, cefpodoksim, ceftibuten, ceftizoksim i ceftriakson ili cefalosporini (četvrta generacija) kao što je cefepim i ceftobiprol.

[0038]Antibiotski agens mogu da budu linkozamidi kao što je klindamicin i azitromicin, ili makrolid kao što je azitromicin, klaritromicin, diritromicin, eritromicin, rcksitromicin, troleandomicin. telitromicin i spektinomicin.

[0039]Alternativno antibiotski agens mogu da budu monobaktami kao što je aztreonam, ili nitrofuran kao što je furazolidon ili nitrofurantoin.

[0040]Antibiotski agens može da bude i neki penicilin kao što je amoksicilin, ampicilin, azlocilin, karbenicilin, kloksacilin, diklolksacilin, flukloksacilin, mezlocilin, nafcilin, oksacilin, penicilin G ili V, piperacilin, temocilin i tikarcilin.

[0041]Antibiotski agens može da bude sulfonamid kao što je mafenid, sulfonamidohrizoidin, sulfacetamid, sulfadiazin, srebro sulfadiazin, sulfametizol, sulfametoksazol, sulfamlimid, sulfasalazin, sulfisoksazol, trimetoprim, i trimetoprim-siilfametoksazol (kotrimoksazol) (TMP-SMX).

[0042]Antibiotski agens može da bude hinolon kao što je ciprofloksacin, enoksacin, gatifloksacin, levofloksacin, lomefloksacin, moksifloksacin, nalidiksična kiselina, norfloksacin, ofloksacin, trovafloksacin, grepafloksacin, sparfloksacm i temafloksacin.

[0043]Prema jednom primeru, antibiotski agens može da bude polipeptid kao što je bacitracin, kolistin i polimiksin B.

[0044]Alternativno, antibiotski agens može da bude tetraciklin kao što je demeklociklin, doksiciklin, minociklin i oksitetraciklin

[0045]Alternativno ili dodatno antibiotski agens može biti delotvoran protiv mikobakterija. Preciznije antibiotski agens može da bude klofazimin, lampren, dapson. kapreomicin, ciklosenn, etambutol, etionamid, izoniazid, pirazinamid, rifampicin, rifabutin, rifapentine ili streptomicin.

[0046]Generalno antibiotski agens je aktivan za lečenje ili profilaksu infekcija prouzrokovanih gram negativnim ili gram pozitivnim bakterijama, kao što jeEscherichia coliiKlebsiellaposebno

Pseudomonas aeruginosa.

Drugi agens

[0047]Drugi agens je disperzant. Preciznije, drugi agens se bira iz sluzavog disperzanta. Drugi agens može da bude agens koji inhibira formiranje bakterijske kolonije, posebno bilo kog agensa koji inhibira formiranje biofilma. Primera radi, drugi agens može da inhibira lepljenje bakterija, hidrofobičnost ili proizvodnju sluzi.[0048]Prema jednom primeru ovog pronalaska drugi agens nije peptid.

[0049]Pojam "disperzant" je predviđen da obuhvati agens koji može da disperguje bakterijske čestice, čime se inhibira formiranje bakterijske kolonije. Preciznije, disperzant može da disperguje čestice bakterijskog biofilma. Disperzant može da poboljša disperziju sluzi proizvedene bakterijskim mikrobima, sluz koja formira deo biofilma na primer sluz proizvedena ćelijama na koje se lepe mikrobi biofilma, i bakterije biofilma.

[0050]Disperzant može da bude mikolitički agens. Mikolitički agens može da bude enzim na primer DNaza, alginaza, proteaza ili karobohidraza. Alternativno mikolitički agens može da bude mali moiekul na primer amin kao što je aminotiol iii kiselina kao što je etilen diamin tetra sirćetna kiselina (EDTA). Amin može biti izabran iz acetilcisteina i cisteamina, poželjno cisteamina.

[0051]Drugi antibiofilm agens može da bude antibakterijski agens Antibakterijski agens može da bude sluzavi agens na primer sluzavi agens koji ima sluzavu i antibakterijsku aktivnost. Preporučljivo antibakterijski agens je cisteamin.

Farmaceutski proizvod

[0052]Gorepomenuti aktivni agensi mogu da se primene kao slobodne ili fiksne kombinacije Slobodne kombinacije mogu da se obezbede kao kombinacije paketa koji sadrže sve aktivne agense u slobodnim kombinacijama. Fiksne kombinacije su često tablete ili kapsule.

[0053]Agens prema ovom pronalasku može da se primeni u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Farmaceutski prihvatljive soli ovog pronalaska mogu biti sintetizovane iz roditeljskih jedinjenja koja sadrže bazni deo ili kiseli deo konvencionalnim hemijskim metodama. Generalno, takve soli mogu da se pripreme reagovanjem slobodne kiselih ili baznih formi ovih jedinjenja sa stoihiometijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u mešavini ova dva; generalno, preporučuju se nevodeni medij kao etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril. Spiskovi odgovarajućih soli se nalaze u farmaceutskom priručniku kompanije Remmgton (Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company. Easton, Pa., US, 1985, p. 1418), čiji je opis ovde uključen u vidu reference; videti takođe (Stahl et al, Eds, "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use ", Verlag Helvetica Chimica Acta and Wiley-VCH, 2002). Fraza "farmaceutski prihvatljiv" se ovde koristi da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, supstance, i/ili dozne oblike koji su, u obimu meritornog medicinskog mišljenja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića ili, kao što može biti slučaj, životinje bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, što odgovara zdravorazumskom odnosu prednosti/rizika.

[0054]Ovaj pronalazak dakle obuhvata farmaceutski prihvatljive soli opisanih jedinjenja pri čemu se roditeljsko jedinjenje modifikuje pravljenjem kiseline ili njene bazne soli na primer standardnih netoksičnih soli ili četvorovalentnih soli amonijaka koje se formiraju, npr iz neorganskih ili organskih kiselina ili baza. Primeri takvih kiselih adicionih soli obuhvataju acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, citrat, karnforat, kamforsulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etanesulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietanesulfonat, laktat, maleat, metanesulfonal, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat. pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, tartrat, tiocijanat, tosilat, i undekanoat. Bazne soli obihvataju soli amonijaka, soli alkalnog metala kao što su soli natrijuma i kalijuma, soli alkalnog zemnog metala kao što je kalcijum so i so magnezijuma. soli sa organskim bazama kao što su soli dicikloheksilamina, N-metil-D-glukamin, i soli sa amino kiselinama kao što je arginin, lizin, i tako dalje. Takođe, bazne grupe koje sadrže nitrogen mogu da budu kvaternizovane sa takvim agensima kao što su halidi nižeg alkila, kao što je metil, etil. propi, i butil htorid, bromidi i jodidi; dialkil sulfati kao što je dimetil, dietil, dibutil; i diamil sulfati, dug lanac halida kao što je decil, lauril, miristil i stearil hloridi, bromidi i jodidi. aralkil halidi kao što je benzil fenetil bromidi i drugi.

Proizvodi prema opisu koji obuhvata ovaj pronalazak

[0055]Prema jednom primeru, antibiotski agens proizvoda prema ovom pronalasku ne obuhvata peptide. Pogodno, proizvod prema ovom pronalasku ne sadrži peptide.

[0056]Preporučeni proizvod obuhvata nepeptidni antibiotik i disperzant, i posebno sluzavi disperzant kao što je cisteamin.

[0057]Odnos antibiotskog agensa prema drugom agensu u proizvodima prema ovom pronalasku može da bude od 1:10 do 10:1; generalno barem 2:1 na primer barem 3:1 ili 4:1 Odnos antibiotskog agensa prema drugom agensu u proizvodima prema ovom pronalasku može da bude od 1:100 do 1:2000, na primer od 1:500 ili 1:1000 Prema jednom izvođenju, odnos antibiotskog agensa prema drugom agensu je približno 1:1. Preporučljivo prvi antibiotski agens je nepeptidni antibiotik i drugi agens je cisteamin i proizvod sadrži ove komponente u odnosu od 2:1 do 4:1. Prema još jednom izvođenju odnos može biti približno 1:1

[0058]Aktivne sastojke je moguće primeniti istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno. Aktivne agense je moguće obezbediti kao kombmovani paket Kombinovani paket može da sadrži proizvod prema ovom pronalasku zajedno sa uputstvima za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu svakog od ovih aktivnih agenasa. Za sekvencijalnu primenu. aktivne agense je moguće primeniti bilo kojim redosledom.

[0059]Aktivni agensi proizvoda prema ovom pronalasku mogu da se dobiju kao farmaceutska jedinjenja dodatno sadrže jedan ili više farmaceutski pnhvatljivh razblaživača, ekscipijenata i/ili nosača. Ovo važi i za fiksne i za slobodne kombinacije.

[0060]Aktivne agense prema ovom pronalasku moguće je primeniti bilo kojim pogodnim putem poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, poželjno u obliku farmaceutskog jedinjenja prilagođenog takvoj ruti, i u dozi delotvornoj za predviđeno lečenje Aktivna jedinjenja i supstanca mogu, na primer da se primene parenteralno, oralno, intranazalno, intrabronhijalno, enteralno, transdermalno. sublingvalno, rektalno, vaginalno, okularno, ili topikalno Razmatra se i lokalna i sistemska primena leka.

[0061]Za potrebe parenteralne primene ("parenteralna" kako se ovde koristi, pogledati režime primene leka koji obuhvataju intravenski, intramišićni, enteralni, intraperitonealni, intrasternalni, potkožni i intraartikularni način ubrizgavanja i infuzije od kojih je intravenski (uključujući kontmualnu intravensku primenu leka) najpreporučljiviji) rastvora u vodenom propilen glikolu mogu da se koriste, kao i sterilna vodena rešenja odgovarajućih soli rastvorljivih u vodi. Takva vodena rešenja mogu puferom da se obrađuju po potrebi, ako je neophodno, i tečni razblaživač prvog datog izotonika sa dovoljnom količinom slanog rastvora ili glukoze. Ova rešenja u vodi su posebno pogodna u svrhu intravenskog, intramuskularnog, potkožnog i intraperitonealnog ubrizgavanja U vezi sa ovim korišćene sterilne vodene podloge se lako dobiju standardnim tehnikama dobro poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.

[0062]Proizvode prema ovom pronalasku takođe je moguće primeniti intranazalno ili inhalacijom i prikladno isporučiti u obliku inhalatornog suvog praha ili aerosolnog spreja iz posude pod pritiskom, pumpe, spreja, atomizera, nebulizera, sa ili bez upotrebe odgovarajućeg potiskivača,

[0063]Alternativno proizvodi prema ovom pronalasku mogu biti primenjeni u obliku supozitorija ili pesarija, ili mogu biti primenjeni topikalno u obliku gela, hidrogela, losiona, rastvora, kreme, masti ili praha Proizvodi prema ovom pronalasku mogu biti primenjeni dermalno ili transdermalno, na primer, upotrebom flastera za kožu, depoa ili potkožne injekcije Moguće ih je takođe primeniti plućnim ili rektalnim putem.

[0064]Za oralnu primenu, farmaceutsko jedinjenje može da bude u obliku; na primer, tablete, kapsule, suspenzije ili tečnosti. Farmaceutsko jedinjenje se preporučljivo pravi u obliku jedinične doze koja sadrži posebnu količinu aktivnog sastojka. Primeri takvih jediničnih doza su kapsule, tablete, praškovi, granule ili suspenzija, sa standardnim aditivima kao što je laktoza; manitol, kukuruzni škrob ili krompirni škrob; sa vezivačima kao što je kristalna celuloza, derivati celuloze, akacija, kukuruzni škrob ili želatini; sa razgrađivačima kao što je kukuruzni škrob, krompirni škrob ili natrijum karboksimetilceluloza, i sa lubrikantima kao što je talk ili magnezijum stearat. Aktivni sastojak može takođe da se da ubrizgavanjem kao supstanca pri čemu, na primer, slani rastvor, dekstroza ili voda mogu da se koriste kao pogodan nosač.

[0065]Proizvodi prema ovom pronalasku mogu takođe da pronađu primenu kao/u oralnoj formulaciji pri čemu se proizvod formuliše u vidu nosača, na primer izabran iz filmova, traka, gelova, mikrosfera, lozengi, guma za žvakanje, paste ili praha za žvakanje i sredstva za ispiranje usta.

[0066]Količina terapijski aktivnog jedinjenja koje se primeni kao lek i režimi doziranja za lečenje bolesti jedinjenjima i/ili supstancama prema ovom pronalasku zavise od raznih faktora, uključujući starosnu dob, težinu, pol i medicinsko stanje subjekta, ozbiljnost bolesti, putanju i učestalost primene. i posebno korišćeno jedinjenje, kao i farmakokinetička svojstva pojedinca koji se leći. i zbog toga mogu biti i prilično različiti. Doza će generalno biti niža kod jedinjenja koja se primenjuju lokalno pre nego sistematski, i za sprečavanje pre nego za lečenje. Takve terapije je moguće primeniti koliko god često da je potrebno i za period vremena koji je neophodan a na osnovu mišljenja lekara koji određuje lečenje. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da režim doze ili terapijski delotvorna količina inhibitora koji treba primeniti može da iziskuje optimalno prilagođeno rešenje za svakog pojedinca Farmaceutske supstance mogu da sadrže aktivni sastojak u opsegu od oko 0,1 do 2000 mg, preporučljivo u opsegu od oko 0,5 do 500 mg i najpreporučljiviije između oko 1 i 200 mg. Dnevna doza koja može biti prikladna je od oko 0,01 do 100 mg/kg telesne težine, preporučljivo između oko 0.1 i oko 50 mg/kg telesne težine i najpreporučljivije od oko 1 do 20 mg/kg telesne težine. Dnevnu dozu

moguće je primeniti u jednoj do četiri doze dnevno.

[0067]Preporučuje se prmena proizvoda prema ovom pronalasku u respiratorni trakt. Dakle, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje aerosolne farmaceutske formulacije koje obuhvataju proizvod prema ovom pronalasku. Takođe je obezbeđen nebulizer ili inhalator koji sadrži proizvod prema ovom pronalasku.

[0068] Pored toga, proizvodi prema ovom pronalasku mogu biti prilagođeni formulaciji kao što su oblici doze sa zadržanim otpuštanjem i slični. Sastav formulacija može biti trakav da one otpuštaju aktivne agense, na primer, u određenom delu intestinalnog ili respiratornog trakta, po mogućstvu tokom nekog vremenskog perioda. Obloga, omoti, i zaštitne matrice mogu da budu napravljeni, na primer, od polimernih supstanci, kao što je polilaktid-glikolati, lipozomi, mikroemulzije, mikročestice, nanočestice, ili voskovi. Ove obloge, omoti i zaštitne matrice su korisni za oblaganje unutrašnjih medicinskih uređaja, npr. stentova, katetera, cevčica (katetera) za peritonealnu dijalizu, uređaja za odvod i slično.

[0069]Proizvodi prema ovom pronalasku mogu da obuhvate sinergistično delotvorne količine svakog ovde definisanog aktivnog agensa. Ovaj pronalazak dakle obuhvata proizvode koji sadrže sinergistično delotvornu količinu (i) antibiotskog agensa (koji može da bude nepeptidni antibiotski agens) (ii) drugi agens koji je obično cisteamin. Ovaj proizvod može da bude za upotrebu u proizvodnji leka, za istovremeno, odvojenu ili sekvencijalnu primenu pomenutih agenasa u lečenju mikrobnih infekcija na primer bakterijske infekcije. "Sinergistilčno", kako se ovde koristi, može da opiše aktivnost dva ili više agensa proizvoda prema ovom pronalasku koji rade zajedno da se proizvede dejstvo veće od očekivanog kombinovanog dejstva zasebno korišćenih agenasa.

[0070]U još jednom varijantnom rešenju ovog pronalaska dat je supstrat na koji se nanosi ili sa kojim se spaja proizvod prema ovom pronalasku Preporučljivo, supstrat je pogodan za nanošenje na rane ili isporuku na ranom zahvaćena mesta. Preporučljivo, supstrat omogućava transfer aktivnih agenasa proizvoda prema ovom pronalasku iz supstrata na fundament rane da se postigne njihovo antibakterijsko dejstvo. Supstrat može da bude zavoj, na primer, zavoj za ranu. Zavoj može da sadrži tkaninu ili može da bude materijal sličan kolagenu. Supstrat može da bude u bilo kom pogodnom obliku za primenu na ranu, najčešće supstrat može da bude u obliku hidrogela. koloida, masti, kreme, gela, pene ili spreja.

[0071]Proizvodi prema ovom pronalasku mogu takođe da nađu primenu kao/dezinfekciono sredstvo ili biocid. U ovom kontekstu, farmaceutska jedinjenja prema ovom pronalasku mogu da se nanesu, bilo sama ili u kombinaciji sa drugim dezinfikujućim agensima, na površinu koju treba lečiti. Kako se ovde koristi "površina koju treba lečiti" može da bude supstrat kako je ovde definisano i može da obuhvati medicinske uređaje i unutrašnje uređaje, npr stentove, katetere, cevčice za peritonealnu dijalizu, uređaje za odvod, proteze zglobova, zubne implante i slično.

Postupci i upotreba

[0072]Ovaj pronalazak obezbeđuje lečenje ili sprečavanje bakterijske infekcije Bakterijska infekcija može obično da bude diseminirana infekcija ili preciznije u sluzavoj sredini, kao što su pluća, na primer, pluća pacijenta koji pati od CF ili bakterijski povezana hronična opstruktivna bolest pluća (COPD). Lečenje prema ovom pronalasku obuhvata korak primene prema okolini

proizvoda prema ovom pronalasku. Lečenje može da budein vivo.

[0073] Standardni antibiotici kao što je Tobramicin, Kolistin, Gentamicin ili Ciprofloksacin ne ispoljavaju isti nivo antibakterijske aktivnosti kao kada su u niskosluzavim sredinama. Iznenađujuće je da se antibakterijska aktivnost povećava posle primene disperzanta ili antiadhezivnog agensa kao što je cisteamin

[0074] Prednost lečenja obuhvata korak primene obuhvata korak primene leka u skladu sa patentnim zahtevom 1

• Antibiotski agens; i

• Drugi agens je disperzant t j. cisteamin.

[0075] Kada se jedinjenje prema ovom pronalasku koristi za lečenje bakterijskih infekcija povezanih sa CF, antibiotski agens je tobramicin, kolistin, gentamicin ili ciprofloksacin

[0076] Sredina može da obuhvati bilo koju bakterijsku infekciju, uključujući infekciju prouzrokovanu više od jednim mikroorganizmom, na primer bakterijama i bilo kojim gljivicama, kvascem, virusima i protozoama,

[0077] Bakterijum može da bude gram pozitivan ili gram negativan bakterijum. Bakterijski patogen može da se izvede iz bakterijskih vrsta izabranih iz grupe koja se sastoji od:Staphyiococcusspp., n pr.Staphy! ococcus aureus. Staphylococcus epidermidis: Enterococcusspp., n.pr.Enterococcus faecatis, Streptococcus pyogenes; Listeriaspp.;Pseudomonasspp.;Mycobacteriumspp., n.pr.Mycobactenum tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonellaspp.;Streptococcusspp., n.pr.StreptococcusGroup A ili B,Streptoccocus pneumoniae, Heticobacterspp., n prHelicobacter pyiori; Neisseriaspp., n.pr.Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis, Borrelia burgdorferi; Shigeliaspp., n.pr.Shigetla flexnert: Escherichia coli: Haemophilusspp., n.pr.HaemophHus influenzae. Chlamydiaspp., n.pr.

Chlamydia trachomatis. Chiamydia pneumoniae Chlamydia psittaci: Francisella fularensis;

Bacillusspp., n.pr.Baciiius anthracis; Ciostrtdiaspp., n.pr.Clostridium botulinum; Yersiniaspp., n.pr.Yersinia pestis; Treponemaspp.;Burkhoideriaspp.; n.pr.Burkholderia malleii B

pseudomallei.

[0078] Preciznije bakterijum može da obuhvatiPseudomonasspp., naprimerPseudomonas aeruginosa; Staphy- Sococcusspp., na primerStaphylococcus aureusiStaphylococcus epidermidis: Haemophilusspp., na primerHae/7io<p>Mus influenza;Burkholderiaspp., na primerBurkholderia cepacia; Streptococcusspp.,Propionibacteriumspp,, na primerPropionibacterium acnes.Preporučljivo bakterijum se bira izPseudomonasspp., na p ri merPseudom ona saeruginosaiStaphylococcusspp., napri merStaphylococcus aureusiStaphylococcus

epidermidis.

[0079] Jedinjenje prema ovom pronalasku može da se koristi da svede na minimum i po mogućstvu spreči formiranje kolonija bakterija, posebno bakterijskih biofilmova u raznoraznim sredinama uključujući, ali ne ogrnaičavajući se na, domaćinstvo, radno mesto laboratoriju, industrijsku sredinu, vodenu sredinu (npr. cevovode), medicinske uređaje uključujući unutrašnje uređaje kao što je ovde definisano. zubne uređaje ili zubne implante. telo životinja na primer ljudsko telo

[0080]Jedinjenje prema ovom pronalasku može dakle da se koristi u ustima da se spreći formiranje plaka ili karijesa na zubu kod ljudi ili zubnom implantu na primer zubnoj protezi.

[0081]Jedinjenje prema ovom pronalasku može da se koristi da spreči ili ograniči formiranje bakterijske kolonije. Postupak prema ovom pronalasku može da se koristi za sprečavanje ili lečenje bakterijskih infekcija uključujući topikalne infekcije, oralne infekcije i sistemske infekcije Topikalne infekcije mogu da obuhvate rane. čireve i lezije na primer rane na koži kao što su posekotine ili opekotine, i sa ovim povezana stanja.

[0082]Oralne infekcije mogu da obuhvate gingivitis, periodontitis i mukozitis.

[0083] Sistemske infekcije mogu da obuhvate cističnu fibrozu, COPD i druga stanja povezana sa infekcijama sluzi, na primer, gastrointestinalne, urogenitalne ili druge respiratorne infekcije.

[0084]Još jedno varijantno rešenje ovog pronalaska se nalazi u kreiranju, sprečavanju ili odlaganju napredovanja bakterijske infekcije kod sisara, posebno čoveka, primenom terapijski delotvorne količine proizvoda prema ovom pronalasku tom sisaru.

[0085]Pod "delotvorna" količina ili "terapijski delotvorna količina" podrazumeva se količina jedne ili više aktivnih supstanci koja je, u okviru meritorne medicinske procene, dovoljna da obezbedi željeno dejstvo bez prekomerne toksičnosti, iritacija, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, koji odgovara razumnom odnosu prednost/rizik.

[0086]Dakle proizvod prema ovom pronalasku može biti koristan za sprečavanje, odlaganje daljeg razvoja, ili lečenje bolesti ili stanja izabranih iz grupe koja se sastoji od infekcija kože i rana, infekcija srednjeg uha, infekcija gastrointesinalnog trakta, infekcija peritonealne membrane, infekcija urogenitalnog trakta, infekcije mekog tkiva usne duplje, infekcije oka (uključujući kontaminaciju kontaktnog sočiva), endokarditis, infekcije cistične fibroze. i infekcije unutrašnjih medicinskih uređaja kao što je ovde opisano.

[0087]Pronalazak takođe obuhvata terapije kod kojih se proizvod prema ovom pronalasku primenjuje sisaru zajedno sa jednim ili više drugih antibakterijskih agenasa na primer antibiotikom. Generalno, proizvod prema ovom pronalasku, i bilo koja supstanca prema ovom pronalasu ne obuhvata nijedan od peptida

[0088]Aktivni sastojci pomenuti u ovom patentnom spisu mogu da postoje u različitim oblicima, kao što su slobodne kiseline, slobodne baze, estri i drugi prolekovi, soli i tautomeri, na primer, i ovaj pronalazak obuhvata sve varijantne oblike ovih agenasa

[0089]U ćelom opisu i patentnim zahtevima ovog patentnog spisa, jednina obuhvata množinu osim ako kontekst ne zahteva drugačije. Preciznije, gde se koristi neodređeni član, spis treba razumeti tako da se odnosi na množinu kao i jedninu, osim ako kontekst ne zahteva drugačije

[0090]Svojstva, celi brojevi, karakteristike, jedinjenja, hemijski delovi ili grupe opisane u vezi sa određenim varijantnim rešenjem, izvođenjem ih primer ovog pronalaska treba razumeti tako da važe za bilo koje drugo ovde opisano varijantno rešenje, izvođenje ili primer osim ako nisu sa njim nekompatibilni.

[0091]U ćelom opisu i patentnim zahtevima ovog spisa, reći "obuhvata' i "sadržati" i varijacije ovih reči, na primer "koji obuhvata" i "sadrži", znače "uključuje ali bez ograničavanja na", i nisu predviđene za (i ne) isključuju druge delove, aditive, komponente, cele brojeve ili korake.

[0092]Generalno pojam "približno" je predviđen da obuhvati opseg od 10% ili manje od bilo koje numeričke vrednosti na koju se odnosi

[0093]Pronalazak će sada biti opisan, putem primera, sa pozivom na sledeće slike nacrta, na kojima:Slike 1a i 1b:obezbeđuju poređenje antibakterijske aktivnosti Tobramicina i cisteamina (NM001) protiv ćelijaPseudomonasplanktonic kada se primene odvojeno, i u kombinovanom obliku. NM001 smanjuje MIC Tobramicina naspram planktonskih ćelija i to najmanje 4-struko (SI. 1b).

Slika2: daje poređenje antibakterijske aktivnosti Tobramicina i Ciprofloksacina protivPseudomonas aeruginosaćelija kultivisanih u sluzavoj okolini koja je replika onoga što je utvrđeno za cističnu fibrozu pluća kada se primenjuje sam i u kombinaciji sa cisteaminom.

Slika 3:daje poređenje aktivnosti samog Tobramicina i kada je u kombinaciji sa cisteaminom (NM001) protivPseudomonas aeruginosaćelija kultivisanih u nesluzavoj sredini i kada su kultivisane u sluzavoj sredini koja je replika onoga što je utvrđeno za cističnu fibrozu pluća (u prisustvu NaCI i/ili mucina). NM001 oporavlja antibiotsku aktivnost konvencionalnim antibioticima u sluzavoj sredini.

Slika 4:pokazuje histogram koji poredi aktivnost antibiofitma ili samog cisteamina u kombinaciji sa Tobramicinom naspram utvrđenogP. aeruginosaPAOI biofilma: studija odgovora na dozu je omogućila identifikaciju najmanje koncentracije iskorenjivanja biofilma (MBEC) cisteamina prema utvrđenimP. aeruginosaPA01 biofilmovima i kvantifikaciju aktivnosti aditiva sa Tobramicinom MBEC samog cisteamina je bio 1000 ug/ml i Tobramicin je pokazao MBEC od 4 ug/ml. Kada su kombinovani, međutim, ukupno iskorenjivanje je dobijeno sa 500 mg/ml cisteamina i 1 mg/ml Tobramicina. Zbog toga je, frakciona inhibitorna koncentracija (FIC) takve kombinacije 0.75, koja označava aktivnost između dva antimikrobna agensa Zbog toga, sluzavi/antimikrobni agens cisteamin ima potencijal da pospeši aktivnost antibiofilma konvencionalnh antibiotika, koji mogu imati implikacije za smanjenje širenja antimikrobnog otpora i troškova lečenja.

Slika 5:pokazuje grafikon post-antimikrobnog dejstva cisteamina (NM001) u kombinaciji sa Tobramicinom (TOB) naspramP. aeruginosaPA01 biofilmova.

Slika 6:prikazuje grafikon koji prikazuje da cisteamin (NM001) pospešuje antimikrobnu aktivnost Tobramicina naspramBurkholderia cepaciaNCTC10743 otpornog na više lekova. Aditiv antimikrobnoj aktivnosti cisteamina i Tobramicina je takođe idenifikovan protiv na više lekova otpornog sojaBurkholderia cepaciaNCTC10743. MlC100Tobramicin je viši od 16 ug/ml dok je cisteamin pokazao MIC100na 500 ug/ml. Kada se zajedno kombinuju, cisteamin je mogao da pospeši aktivnost Tobramicina i njegov MIC100je bio 0.25mg/ml u kombinaciji sa 250 ug/ml cisteamina Ovo vodi do FIC indeksa manjeg od 0.51, koji označava barem antimikrobnu aktivnost aditiva i moguću sinergiju između ta dva jedinjenja

Slika7: pokazuje histogram koji pokazuje antimikrobnu aktivnost Tobramicina i cisteamina protiv P.aeruginosaPAOI planktonskih ćelija samih i u kombinaciji sa fiziološki relevantnim koncentracijama kako je pronađeno u plućima pacijenata sa cističnom fibrozom (CF). Antimikrobna aktivnost (MIC-0o) cisteamina je upoređena sa normalnim stanjem (kako je opisanou CLSI M7-A7 postupku - videti Dodatak 1) i u prisustvu 150 mM natrijum hlorida (NaCl), 1,7 mM kalcijum hiorida (CaCI?), 1 mg/ml DNK ili 1% (w/v) želudačne sluzi svinja utrostručene, u pločama sa 96 pregrada. Bakterijski rast je praćen u periodu dužem od 24 sata i apsorpcija je očitana korišćenjem BioTek čitača na mikrotitarskoj ploči na 625 nm. Ukupna inhibicija bakterijskog rasta je zadržana u prisustvu NaCl, CaC^ ili DNK i dvostruko veća od normalnog MIC100u prisustvu mucina. Aktivnost tobramicina je inhibirana u prisustvu divalentnog katjona ca^<*>i u prisustvu anjonski polimerne DNK Kada je kombinovana sa cisteaminom, aktivnost Tobramicina je zadržana u svim stanjima testiranim na koncentracijama i do 4-struko većim od normalnog MIC.

Slika8: je histogram koji pokazuje aktivnost sluzi cisteamina naspram drugih ometača i mikolitički agenasa. Mikolitička aktivnost cisteamina je upoređena sa drugim mikolitičkim agensima kao što je N-acetil- cistein (Mucomvst®), DNaza I (Dornase Alfa®}, alginatna lijaza i cisteamin hidrohloridna so merenjem viskoznosti rastvora mucina posle lečenja Mucin želuca svinje (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) je pripremljen u sterilnoj prečišćenoj vodi u težinsko-zapremtnskom odnosu 20%(w/v)Sluzavi agensi su pripremljeni 10 mg/ml u 20% (w/v) rastvora mucina Brzina mucina je izmerena posle otprilike 5 minuta izloženosti sluzavim agensima. Podaci pokazuju prosećne i standardne vrednosti odstupanja od nezavisnih eksperimenata dupliranja.

Slika9: je grafikon koji prikazuje postantimikrobno dejstvo cisteamina (NM001) u kombinaciji sa Tobramicinom naspram biofilmova P.aeruginosaPA01. Ovo pokazuje antibiofilm-aktivnost cisteamina u kombinaciji sa Tobramicinom na dve različite koncentracije, pri čemu je post-antimikrobno dejstvo (PAE) ovih jedinjenja takođe utvrđeno praćenjem bakterijskog rasta poste trerapije fiofilmova.

Slika10: pokazuje grafikon koji pokazuje mhibiranje mikrobne metaboličke aktivnosti P.aeruginosaPA01 biofilmova posle terapije sa cisteaminom (NM001) u kombinaciji sa Tobramicinom. Ovo pokazuje metaboličku aktivnost biofilmova posle terapije. Ovi podaci pokazuju antibiofilm-aktivnost cisteamina, samog i u kombinaciji sa Tobramicinom, sa značajnim PAE kako je prikazano odloženim bakterijskim rastom i smanjenom metaboličkom aktivnošću biofilma.

PRIMERI

Aktivnost antimikrobnih agenasa protiv bakterijskih kolonija

Materijali i postupci

1.1Bakterijskisojevi

[0094]Pseudomonas aeruginosaATCC27853 iBurkholderia cepaciaNCTC10743 su korišćeni u ovoj studiji. Dodatni sojeviPseudomonas aeruginosasu korišćeni kako je prikazano u Tabelama 1 i 2.

1.2. Priprema antimikrobnih jedinjenja

[0095]Antimikrobni agensi testirani u ovoj studiji su bili cisteamin (NM001), tobramicin, ciprofloksacin, kolistin i gentamicin. Ovi agensi su dobijeni od kompanije Sigma-Aldrich {Gillingham, UK) i zalihe rastvora su pripremljene na 20 mg/ml u 14-18 M'Clcm čiste vode (Purite HP40 sistem za prečišćavanje vode, Oxon, UK). Jednom kada se rastvore, preparati su bili filterom sterilisani korišćenjem 0,22 mm filtera (Millipore, VVatford, England) i skladišteni na -20,<J>C.

1.3 Priprema bakterijskog inokuluma

[0096]Bakterijski inokulom je utvrđen postupkom razblaženja iz kultura koje aktivno rastu u Mueller-Hinton (MH) medijumu, standardizovanom sa 0.5 McFarlandovog standarda zamućenosti kako je opisano u CLSI postupku M26-A

1.4Određivanjeminimalne inhibitorne koncentracije (MIC)

[0097] I bakterijski inokulum i antimikrobni agensi, uključujući jedinjenja strukturno povezana na cisteamin, su dodati istovremeno na ploče. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 24 sata i optička gustina je pročitana na 625 nm na čitaču mikrotitarske ploče (BioTek Powerwave XS, VVinooski, USA). MIC je dobijen kao najmanja koncentracija antimikroba koja pokazuje totalnu inhibiciju rasta bakterija.

Antimikrobna efikasnostderivata cisteamina VersusP aeruginosa

[0098]Broj jedinjenja koja se odnose u hemijskoj strukturi na cisteamin su ispitani za antimikrobnu aktivnost; cistamin (so dihidrohlorida), taurin i 2,3-đimerkaptosukcinska kiselina Druga jedinjenja hemijski srodna cisteaminu su poznata, ali su toksična, i zbog toga nisu korisna za lek koji ima ovakvu prirodu.

Cisteamin:

Cistamin:

Taurin: 2,3-Dimerkaptosukscinska kiselina:

OdređivanjeMIC u fiziološki relevantnim jonskim koncentracijama

[0099] Sličan postupak kako je gore opisan (14) je korišćen za određivanje antimikrobne aktivnosti cisteamina (Lynovex@) u prisustvu visokih jonskih koncentracija Antimikrobna aktivnost (MIC10o) cisteamina je upoređena sa normalnim stanjem (kako je opisanou CLSI M7-A7 postupku) i u prisustvu 150 mM natrijum hlorida (NaCl), 1,7 mM kalcijum hlorida (CaCI2), 1 mg/ml DNK ili 1% (w/v) želudačne sluzi svinja utrostručene, u pločama sa 96 pregrada Bakterijski rast je praćen u periodu dužem od 24 sata i apsorpcija je očitana korišćenjem BioTek čitača na mikrotitarskoj ploči na 625 nm.

1.6 Određivanje aktivnosti antibofilma

[0100] Aktivnost antibiofilma je procenjena korišćenjem mikrofluidnog BioFlux 800 sistema protoka ćelije (Fluxion, South San Francisco, USA) Mikrofluidni kanali 48-pregrade BioFlux ploče su inokulisani sa 0.5 McFarlandovim ekvivalentnim inokulomom P.aeruginosaPA01 u Mueller-Hinton podlozi. Mikrobne ćelije su ostavljene da se spoje i počnu formiranje mikrokoionija tokom otprilike 30 minuta na 37°C. Mikolitički agensi su pripremljeni na 1 mg/ml u Mueller-Hinton podlozi i propuštani su kroz mikrofluidik pri brzini protoka od 0,5 Dyn/cm2 (ekvivalentno sa 53 ul/h) tokom 16 sati na 37°C. Mikroskopsko praćenje je izvedeno i slike su napravljene korišćenjem mikroskopa Axiovert40 pri 100-strukom uvećanju (Carl Zeiss Welwyn Garden City. UK)

1.7 Određivanje frakcione inhibitorne koncentracije (FIC)

[0101] Frakciona inhibitorna koncentracija (FIC) odgovara koeficijentu interakcije koji ukazuje na to da li je kombinacija antimikrobnih agenasa sinergistik, aditiv, antagonist ili neutralni agens. FIC se određuje poređenjem aktivnosti agensa u kombinaciji (MIC, agens A + agens B) uz aktivnost samog agensa (MIC, agens A ili agens B) kao što je u nastavku (Singh ef a/., 2000):

FIC<=>MICAtcombination] / MICA(atone]<+>MlCB[cc,mt)inauoriI / MICo^o!«;)

[0102] Kombinacije aditiva dva antimikrobna agensa su navedene pomoću FIC indeksa 1, pri čemu FIC indeks < 1 označava kombinacije sinergistika. Neutralne kombinacije bi dale FIC između 1 i 4, FIC indeks viši od 4 označava dejstva antagonista između dva antimikrobna agensa.

[0103] FIC je takođe izračunat da proceni interakciju dva antimikrobna agensa u kombinaciji protiv bakterijskih uzoraka.

1.8 Određivanje post-antimikrobnog dejstva (PAE) i metaboličke aktivnosti

[0104] PAE je određen prenosom 10 ul biofilm kultura u 90 ul sterilnu MH podlogu u trostrukoj vrednosti u mikrotitarskim pločama posle terapije Rast bakterija je praćen na BioTek čitaču ploče tokom 24 sata na 37°C. Mikrobna metabolička aktivnost posle terapije biofilmovima je određena korišćenjem istog postupka kao za PAE određivanje i dodavanje 10% (v/v) indikatora održivosti fluorescentne ćelije, resazurin (Alamar Blue, Serotec), koji je detektovao rast mikrobne metaboličke aktivnosti povećanjem u fluorescenciji. Fluorescencija je rnerena preko 24 sata na 37°C korišćenjem BioTek Synergy HT čitača mikroploče (BioTek. VVinooski, USA) na 530/590 nm.

1.9Određivanje mukolitičke aktivnosti

[0105] Mukolitička aktivnost cisteamina je upoređena sa drugim sluzavim agensima kao što je N-acettlcisteine (Mucotmyst®), DNaza I (Dornase Alfa®), alginat liaza i cisteamin hidrohlondna so merenjem viskoznosti rastvora mucina posle lečenja. Mucin želuca svinje (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) je pripremljen u sterilnoj prečišćenoj vodi u težinsko-zapreminskom odnosu 20% (w/v) Sluzavi agensi su pripremljeni 10 mg/ml u 20% (w/v) rastvora mucina. Brzina mucina je izmerena posle otprilike 5 minuta izloženosti sluzavim agensima

Rezultati

2.1 Sprečavanje i lečenje bakterijske kolonizacije

[0106] Opseg koncentracija antimikrobnih agenasa je bio 0-10 ug/rnl.

2.1.1 Aktivnost protiv P.aeruginosaATCC 27853

[0107] MIC Tobramicin i Ciprofloksacin je u velikoj meri smanjen posle primene sa cisteaminom u poređenju sa primenom leka samog za sebe. Ovo dejstvo je ispitano kada je stavljeno u okruženja koja su imitirala okruženja pronađena u plućima zahvaćenim cističnom fibrozom.

[0108]Određivanje FIC za ovu kombinaciju označava da antimikrobni agensi imaju sinergistička dejstva (FIC = 0,75). Antimikrobni agensi prema ovom pronalasku deluju sinergistički da obezbede pojačano antibakterijsko dejstvo. Antimikrobno dejstvo standardnih antibiotika kao što je Tobramicin i Ciprofloksacin je održavano kada su primenjeni u kombinaciji sa cisteaminom u sluzavom okruženju.

2.2. Tabela 1: Indeks frakcione inhhibitorne koncentracije cisteamina, soli cisteamin

hidrohlorida i N-acetil cisteina i standardnih antibiotika Kolistina, Ciprofloksacina,

Tobramicina i Gentamicina naspram izabranih izolataPseudomonasaeruginosa

[0109]

2. 3. Tabela 2: Antimikrobna efikasnost cisteamina i strukturno povezanih jedinjenja

naspram izabranih klinički relevantnih izolataPseudomonas aeruginosa .

[0110]U svakom slučaju, cisteamin je demonstrirao veću antimikrobnu efikasnost nego srodna jedinjenja, koja označavaju prirodu sulfhidrila i amina za značajnu antimikrobnu aktivnost

Claims (14)

1. Proizvod koji obuhvata sinergistički delotvomu količinu antibiotskog agensa i drugi agens koji je disperzant; pri čemu je antibiotik Tobramicin, Kolistin, Gentamicin ili Ciprofloksacin i pri čemu je drugi agens cisteamin.

2. Proizvod za koji se traži zaštitau patentnom zahtevu 1 za upotrebu kao lek.

3. Supstrat na koji se proizvod za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 1 nanosi ili spaja.

4. Supstrat za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 3 pri čemu je supstrat izabran iz grupe koja se sastoji od zavoja, medicinskih uređaja i unutrašnjih uređaja

5. Supstrat za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 4 pri čemu se unutrašnji uređaj bira iz grupe koja se sastoji od stentova, katetera, cevčica za peritonealnu dijalizu, uređaja za odvod, proteza zgloba i zubnih irnplantata.

6. Farmaceutsko jedinjenje koje sadrži proizvod za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 1 ijedno ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, ekscipijenata i/ili nosača

7. Proizvod za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 1 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju mikrobnih infekcija ili sa tim povezanih bolesti ili stanja.

8. Proizvod za upotrebu prema formulaciji za koju se traži zaštita u patentnom zahtevu 7 pri čemu se infekcija, ili sa tim povezana bolest ili stanje, bira iz grupe koja se sastoji od infekcija kože i rane. infekcija srednjeg uha, infekcija gastrointestinalnog trakta, infekcija membrane peritoneuma, infekcija urogenitalnog trakta, infekcija mekog tkiva usne duplje, fomulacije zubnog plaka, infekcije oka, endokarditisa, infekcije u cističnoj fibrozi, i infekcije unutrašnjih medicinskih uređaja.

9. Proizvod za upotrebu za koji se traži zaštita u jednom od patentnih zahteva 7 i 8 pri čemu je infekcija u sluzavoj sredini.

10. Proizvod za uporebu za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 9 pri čemu je infekcija bakterijska infekcija povezana sa cističnom fibrozom.

11. Proizvod za upotrebu za koji se traži zaštita u jednom od patentnih zahteva 7 do 10 pri čemu je infekcija prouzrokovana bakterijumom izabranim iz grupe koja se sastoji odPseudomonasspp.,Staphy! ococcusspp.,Haemophilusspp ,Burkholderiaspp ,Streptococcusspp. iPropionibacteriumspp.

12. Proizvod za upotrebu za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 11 gde je bakterijumPseudomonas spp.

13. Proizvod za upotrebu za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 11 gde je bakterijumBurkholderia spp.

14. Proizvod za upotrebu za koji se traži zaštita u patentnom zahtevu 11 gde je bakterijumStaphylococcus spp.