RS61469B1 - Kompozicija koja sadrži nepeptidni antibiotik i cisteamin - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na proizvode, kompozicije, postupke i upotrebe koji su korisni u odnosu na prevenciju i lečenje bakterijskih infekcija kao što je definisano u patentnim zahtevima.

Osnov pronalaska

[0002] Antibiotici imaju raširenu upotrebu, i u humanoj i u veterinarskoj medicini, kao i u poljoprivredi, i ovo je dovelo do rastućeg problema otpornosti na lek na trenutno dostupne antibiotike. Ovo je posebno relevantno za infektivna stanja ili bolesti koje se leče samo jednom vrstom antibiotika (drugačije poznato kao monoterapija). S obzirom na to, postoji značajna potreba ne samo za efikasnim i sigurnim novim terapijama, već i za onim koje imaju način delovanja koji smanjuje ili otklanja rizik od eventualnog razvoja otpornosti na lek kod ciljnih populacija patogena, i za terapijama koje mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim tretmanima, kako bi se svela na minimum mogućnost razvoja rezistencije i proširila korisnost trenutno dostupnih antimikrobnih lekova.

[0003] Bakterijske infekcije sredina bogatih sluzi, kao što su pluća, su česte kod bolesti kao što je cistična fibroza (CF). Međutim, standardni antibiotici nemaju tendenciju da dobro deluju u takvim sredinama i njihova antibakterijska efikasnost se u velikoj meri smanjuje kada se koriste u takvim sredinama.

[0004] Mikrobni biofilm je zajednica mikrobnih ćelija okruženih vanćelijskom matricom polimernih supstanci i pričvršćenih za biološku ili nebiotičku površinu. U ovim biofilmovima nalazi se spektar mikroorganizama (bakterija, gljiva, i/ili protozoa, sa povezanim bakteriofagima i drugim virusima). Biofilmovi su široko rasprostranjeni u prirodi, često se mogu naći u veoma različitim sredinama. U naučnoj i medicinskoj zajednici se sve više prepoznaje uloga biofilmova u brojnim infekcijama, a posebno njihov doprinos otpornosti na lečenje infekcije.

[0005] Biofilmovi su etiološki agensi za brojna stanja bolesti kod sisara i uključeni su u 80% infekcija kod ljudi. Primeri obuhvataju infekcije kože i rana, infekcije srednjeg uha, infekcije gastrointestinalnog trakta, infekcije peritonealne membrane, infekcije urogenitalnog trakta, infekcije mekog tkiva usne dublje, formiranje zubnog plaka, infekcije oka (uključujući kontaminaciju kontaktnih sočiva), endokarditis, infekcije kod cistične fibroze i infekcije implantiranih medicinskih uređaja kao što su proteze zglobova, zubni implantati, kateteri i srčani implantati.

[0006] Planktonski mikrobi (tj., mikroorganizmi koji su suspendovani ili rastu u tečnoj podlozi) se najčešće koriste kao modeli za istraživanje antimikrobne osetljivosti kako je opisao Institut za kliničke i laboratorijske standarde (CLSI) i Evropski komitet za ispitivanje antimikrobne osetljivosti (EUCAST). Mikrobi u biofilmovima su značajno otporniji na antimikrobni tretman nego njihovi planktonski ekvivalenti. Međutim, nema standardizovanog postupka za ispitivanje osetljivosti mikroba biofilma na antibiotike.

[0007] Formiranje biofilma nije ograničeno samo na sposobnost mikroba da se pričvrste na površinu. Mikrobi koji rastu u biofilmu mogu međusobno da interaguju u većoj meri nego sa trenutnom fizičkom podlogom na kojoj se inicijalno razvio biofilm. Na primer, ovaj fenomen daje prednost konjugativnom transferu gena, koji se odvija većom brzinom između ćelija u biofilmovima nego između planktonskih ćelija. Ovo predstavlja povećanu mogućnost za horizontalni prenos gena između bakterija, i važno je zbog toga što to može da olakša prenos gena za otpornost na antibiotike ili gena koji određuju virulenciju od otpornih na osetljive mikrobe. Bakterije mogu međusobno da komuniciraju pomoću sistema poznatog kao detekcija kvoruma (quorum sensing – eng.), putem kog se signalni molekuli otpuštaju u sredinu i okolni mikrobi mogu da detektuju njihovu koncentraciju. Detekcija kvoruma omogućava bakterijama da koordiniraju svoje ponašanje, čime se povećava njihova sposobnost da prežive. Odgovori na detekciju kvoruma obuhvataju prilagođavanje na dostupnost hranljivih sastojaka, odbranu od drugih mikroorganizama koji mogu da kompetiraju za iste hranljive sastojke i izbegavanje toksičnih jedinjenja potencijalno opasnih za bakterije. Veoma je važno da patogene bakterije tokom infekcije domaćina (npr. ljudi, drugih životinja ili biljaka) koordiniraju svoju virulenciju da bi izbegle odgovor imunog sistema domaćina, kako bi mogle da uspostave uspešnu infekciju.

[0008] Formiranje biofilma ima ključnu ulogu u brojnim infektivnim bolestima, kao što su cistična fibroza i periodontitis, kod infekcija krvotoka i urinarnog trakta i kao posledica prisustva implantiranih medicinskih uređaja. Predloženi mehanizmi kojima mikroorganizmi povezani sa biofilmom izazivaju bolesti u domaćinu obuhvataju sledeće: (i) odloženo prodiranje antimikrobnog agensa kroz matricu biofilma, (ii) odvajanje ćelija ili agregata ćelija sa biofilmova na implantiranim medicinskim uređajima, (iii) proizvodnja endotoksina, (iv) otpornost na imuni sistem domaćina, (v) obezbeđivanje niše za stvaranje otpornih organizama kroz horizontalni transfer gena koji određuju antimikrobnu rezistenciju i/ili virulenciju, i (vi) izmenjenu brzinu rasta (tj. metaboličku uspavanost) (Donlan and Costerton, Clin Microbiol Rev 15: 167-193, 2002; Parsek and Singh, Annu Rev Microbiol 57: 677-701, 2003; Costerton JW, Resistance of biofilms to stress. U ’The biofilm primer’. (Springer Berlin Heidelberg). pp. 56-64.2007).

[0009] Nedavni eksperimentalni dokaz ukazao je na postojanje male subpopulacije specijalizovanih nemetabolišućih (dormantnih) ćelija - perzistera u okviru biofilmova. Smatra se da ove ćelije mogu da budu odgovorne za visoku otpornost/toleranciju biofilma na antimikrobne agense. Perzisteri tolerantni na više lekova su prisutni i u planktonskim populacijama i u populacijama biofilma i čini se da su kvasci i bakterije razvili analogne strategije koje ovoj subpopulaciji daju funkciju opstanka. Zaštita koju pruža polimerna matrica omogućava ćelijama - perzisterima da izbegnu eliminisanje i služi kao polazna tačka za ponovno naseljavanje. Postoji dokaz da perzisteri mogu da budu u velikoj meri odgovorni za toleranciju mikrobnih biofilmova na više lekova (LaFleur et al., Antimicrob Agents Chemother. 50: 3839-46,2006; Lewis, Nature Reviews Microbiology 5,48-56 2007). WO2010/112848 opisuje inhibiciju organizama biofilma. WO2007/050565 opisuje ugradnju antimikrobnih kombinacija na uređaje za smanjenje infekcije.

[0010] Ostaje potreba za boljim terapijama za lečenje i prevenciju bakterijskih infekcija, posebno onih povezanih sa mukolitičkim sredinama kao što su pluća osoba obolelih od cistične fibroze (CF). Pored toga, ostaje potreba da se ograniči količina ili doze korišćenih antibiotika uvođenjem novih, zamenskih terapija ili pomoćnih tretmana koji mogu da poboljšaju efikasnost trenutno raspoloživih tretmana za lečenje ili prevenciju bakterijskih infekcija, posebno u okruženju biofilma.

Izlaganje suštine pronalaska

[0011] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži antibiotski agens i cisteamin, pri čemu je antibiotski agens nepeptidni antibiotik.

[0012] Pronalazak uključuje farmaceutske proizvode koji sadrže proizvod za koji se traži zaštita.

[0013] Takođe je obezbeđen gore opisani proizvod za terapijsku upotrebu.

[0014] Prema sledećem aspektu ovog pronalaska, obezbeđen je proizvod za upotrebu u lečenju ili prevenciji bakterijske infekcije.

[0015] Bakterijska infekcija može biti diseminirana planktonska bakterijska infekcija ili, naročito, bakterijski biofilm.

[0016] Takođe je obezbeđen postupak za prevenciju ili lečenje bakterijske infekcije koji obuhvata korake primene terapeutski efikasne količine proizvoda prema pronalasku kod pacijenta kome je to potrebno. Proizvod za koji se traži zaštita može da se primenjuje na kombinovani ili sekvencijalni način.

Detaljan opis

Proizvod

[0017] Proizvodi prema ovom pronalasku su efikasni u lečenju i prevenciji bakterijskih infekcija, uključujući bakterijske infekcije u mukoznih sredina. Takvi uslovi su često veoma teški za lečenje jer su standardni antibiotici manje efikasni u takvim sredinama. Pored toga, agensi proizvoda prema ovom pronalasku se uopšteno sinergistički kombinuju kako bi obezbedili iznenađujuće visoku antibakterijsku aktivnost. Količina potrebnog antibiotika se time svodi na minimum. Alternativno, agensi proizvoda prema ovom pronalasku mogu da se kombinuju aditivno.

[0018] Proizvodi imaju prednost u tome što pokazuju antibakterijsku aktivnost protiv uspostavljenih bakterijskih kolonija, uključujući ćelije - perzistere prisutne u bakterijskim kolonijama, kao što su bakterijski biofilmovi, što je ključan korak prema eradikaciji biofilmova.

Sinergističko dejstvo

[0019] Iznenađujuće, nađeno je da se antibakterijsko dejstvo nepeptidnog antibiotika i cisteamina uglavnom povećava sinergistički pri kombinovanju.

[0020] Frakciona inhibitorna koncentracija (FIC) odgovara koeficijentu interakcije koji ukazuje na to da li je kombinacija antimikrobnih agenasa sinergistička, aditivna, antagonistička ili neutralna. FIC se određuje poređenjem aktivnosti agensa u kombinaciji (MIC agensa A agensa B) sa aktivnošću samog agensa (MIC agensa A ili agensa B) kao što sledi (Singh et al., 2000):

FIC=MICA[kombinacija]/MICA[pojedinačno]+MICB[kombinacija]/MICB[pojedinačno]

[0021] Aditivne kombinacije dva antimikrobna agensa su označene FIC indeksom od 1, dok FIC indeks < 1 označava sinergističke kombinacije. Neutralne kombinacije bi dale FIC između 1 i 4, FIC indeks viši od 4 ukazuje na antagonistička dejstva između dva antimikrobna agensa.

[0022] Uopšteno, FIC indeks kombinacije komponenata proizvoda predmetnog pronalaska je manji od 1, najčešće manji od 0,9, pogodno manji od 0,8, povoljno manji od, ili oko 0,75, na primer manji od, ili oko 0,5.

[0023] Alternativno, FIC indeks kombinacije komponenata proizvoda prema ovom pronalasku može da bude veći od 1; uglavnom između 1 i 2; najčešće između 1 i 1,5, pogodno između 1 i 1,2.

[0024] Standardni antibiotici kao što su tobramicin, gentamicin ili ciprofloksacin u mukolitičkim sredinama ne ispoljavaju isti nivo antibakterijske aktivnosti kao kada su u nemukolitičkim sredinama. Iznenađujuće je da se antibakterijska aktivnost takvih standardnih antibiotika povećava posle primene disperzanta ili antiadhezivnog agensa kao što je cisteamin. Antibiotici i antiadhezivni agens ili disperzant deluju sinergistički, i kada se primenjuju zajedno ili sekvencijalno, antibakterijska aktivnost aktivnih agenasa je daleko veća nego kada se primenjuju odvojeno.

[0025] Uopšteno, antibakterijska aktivnost proizvoda prema ovom pronalasku je bar dva puta veća od antibakterijske aktivnosti samog antibiotskog agensa, najčešće je antibakterijska aktivnost proizvoda prema ovom pronalasku bar četiri puta veća od aktivnosti samog antibiotskog agensa, pogodno najmanje osam puta veća, uopšteno najmanje, ili oko, deset puta veća.

[0026] Uopšteno, minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) proizvoda prema ovom pronalasku je bar dva puta niža od MIC samog antibiotskog agensa u odnosu na isti bakterijski patogen, pogodno najmanje četiri puta niža, najčešće bar osam puta niža, povoljno najmanje, ili oko deset puta niža.

[0027] Da bi se dobilo sinergističko dejstvo, agensi proizvoda prema ovom pronalasku mogu da se primene zajedno ili sekvencijalno, poželjno u razmaku ne većem od 10 minuta.

Antibiotski agens

[0028] Pojam "antibiotik" se koristi da označi antibakterijske agense koji mogu da potiču iz bakterijskih izvora. Antibiotski agensi mogu da budu baktericidni i/ili bakteriostatski.

[0029] Uopšteno, antibiotski agens je iz grupe koja se sastoji od aminoglikozida, ansamicina, karbacefema, karbapenema, cefalosporina (uključujući prvu, drugu, treću, četvrtu i petu generaciju cefalosporina), linkozamida, makrolida, monobaktama, nitrofurana, hinolona, penicilina, sulfonamida i tetraciklina. Alternativno ili dodatno antibiotski agens može da bude efikasan protiv mikobakterija.

[0030] Prema jednom primeru izvođenja, antibiotski agens može da bude aminoglikozid kao što je amikacin, gentamicin, kanamicin, neomicin, netilmicin, tobramicin ili paromomicin.

[0031] Prema jednom primeru izvođenja, antibiotski agens može da bude i geldanamicin i herbimicin.

[0032] Alternativno, antibiotski agens može da bude karbacefem kao što je lorakarbef.

[0033] Prema još jednom primeru izvođenja, antibiotski agens je karbapenem kao što je ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatin ili meropenem.

[0034] Alternativno, antibiotski agens mogu da budu cefalosporini (prva generacija) kao što je cefadroksil, cefazolin, cefaleksin, cefalotin ili cefalothin, ili alternativno cefalosporini (druga generacija) kao što je cefaklor, cefamandol, cefoksitin, cefprozil ili cefuroksim. Alternativno, antibiotski agens mogu da budu cefalosporini (treća generacija) kao što je cefiksim, cefdinir, cefditoren, cefoperazon, cefotaksim, cefpodoksim, ceftibuten, ceftizoksim i ceftriakson ili cefalosporini (četvrta generacija) kao što je cefepim i ceftobiprol.

[0035] Antibiotski agens mogu da budu linkozamidi kao što je klindamicin i azitromicin, ili makrolid kao što je azitromicin, klaritromicin, diritromicin, eritromicin, roksitromicin, troleandomicin, telitromicin i spektinomicin.

[0036] Alternativno antibiotski agens mogu da budu monobaktami kao što je aztreonam, ili nitrofuran kao što je furazolidon ili nitrofurantoin.

[0037] Antibiotski agens može da bude penicilin kao što je amoksicilin, ampicilin, azlocilin, karbenicilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukloksacilin, mezlocilin, nafcilin, oksacilin, penicilin G ili V, piperacilin, temocilin i tikarcilin.

[0038] Antibiotski agens može da bude sulfonamid kao što je mafenid, sulfonamidohrizoidin, sulfacetamid, sulfadiazin, srebro sulfadiazin, sulfametizol, sulfametoksazol, sulfanilimid, sulfasalazin, sulfisoksazol, trimetoprim, i trimetoprim-sulfametoksazol (ko-trimoksazol) (TMP-SMX).

[0039] Antibiotski agens može da bude hinolon kao što je ciprofloksacin, enoksacin, gatifloksacin, levofloksacin, lomefloksacin, moksifloksacin, nalidiksična kiselina, norfloksacin, ofloksacin, trovafloksacin, grepafloksacin, sparfloksacin i temafloksacin.

[0040] Alternativno, antibiotski agens može da bude tetraciklin kao što je demeklociklin, doksiciklin, minociklin i oksitetraciklin.

[0041] Alternativno ili dodatno, antibiotski agens može da bude efikasan protiv mikobakterija. Preciznije antibiotski agens može da bude klofazimin, lampren, dapson, kapreomicin, cikloserin, etambutol, etionamid, izoniazid, pirazinamid, rifampicin, rifabutin, rifapentin ili streptomicin.

[0042] Uopšteno, antibiotski agens je aktivan u lečenju ili profilaksi infekcija prouzrokovanih gram-negativnim ili gram-pozitivnim bakterijama, kao što su Escherichia coli i Klebsiella, posebno Pseudomonas aeruginosa.

Drugi agens

[0043] Drugi agens je cisteamin, mukolitički disperzant i mukolitički antiadhezivni agens koji inhibira formiranje bakterijske kolonije, posebno koji inhibira formiranje biofilma. Primera radi, drugi agens može da inhibira adheziju bakterija za podlogu, hidrofobičnost ili proizvodnju sluzi.

[0044] Pojam "disperzant" podrazumeva sredstvo koje može da disperguje bakterijske čestice, čime se inhibira formiranje bakterijske kolonije. Preciznije, disperzant može da disperguje čestice bakterijskog biofilma. Disperzant može da poboljša disperziju sluzi koju su proizveli bakterijski mikrobi, sluzi koja čini deo biofilma, na primer sluzi koju su proizvele ćelije na koje mikrobi biofilma adheriraju, i bakterije biofilma.

[0045] Pojam "antiadhezivni agens" podrazumeva sredstvo koje može da inhibira adheziju među ćelijama, proteinima i organizmima, npr. mikrobima, sprečavajući tako formiranje bakterijske kolonije, posebno formiranje bakterijskog biofilma, ili da podstiče samouništenje biofilma. Konkretno, antiadhezivni agens može da spreči adheziju na površinu ili podlogu svih tipova ćelija koji se sreću u mikrobnim biofilmovima, posebno slobodnoživućih mikroba tj. planktonskih ćelija. Antiadhezivni agensi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, hijaluronan, heparin ili Karbopol 934.

Farmaceutski proizvod

[0046] Gorepomenuti aktivni agensi mogu da se primene kao slobodne ili fiksne kombinacije. Slobodne kombinacije mogu da se obezbede kao kombinovani paketi koji sadrže sve aktivne agense u slobodnim kombinacijama. Fiksne kombinacije su često tablete ili kapsule.

[0047] Agens prema ovom pronalasku može da se primeni u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Farmaceutski prihvatljive soli ovog pronalaska mogu biti sintetizovane iz parentalnih jedinjenja koja sadrže bazni ili kiseli fragment konvencionalnim hemijskim metodama. Uopšteno, takve soli mogu da se pripreme reagovanjem ovih jedinjenja u obliku slobodne kiseline ili baze sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u mešavini ova dva; uglavnom, poželjni su nevodeni medijumi kao etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril. Spiskovi odgovarajućih soli mogu da se nađu u delu Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., US, 1985, p.1418; videti takođe Stahl et al, Eds, "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use ", Verlag Helvetica Chimica Acta and Wiley-VCH, 2002. Izraz "farmaceutski prihvatljiv" se ovde koristi da označi ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike koji su, u okviru meritornog medicinskog mišljenja, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića ili, kao što može biti slučaj, životinje, bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika.

[0048] Ovaj pronalazak dakle obuhvata farmaceutski prihvatljive soli opisanih jedinjenja pri čemu se parentalno jedinjenje modifikuje pravljenjem njegovih kiselih ili baznih soli, na primer standardnih netoksičnih soli ili kvaternarnih amonijumovih soli koje se formiraju, npr. iz neorganskih ili organskih kiselina ili baza. Primeri takvih kiselih adicionih soli obuhvataju acetat, adipat, alginat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, butirat, citrat, kamforat, kamforsulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecilsulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftalensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, tartrat, tiocijanat, tozilat i undekanoat. Bazne soli obuhvataju amonijumove soli, soli alkalnih metala kao što su soli natrijuma i kalijuma, soli zemnoalkalnih metala kao što su soli kalcijuma i soli magnezijuma, soli organskih baza kao što su soli dicikloheksilamina, N-metil-D-glukamin, i soli aminokiselina kao što su arginin, lizin, i tako dalje. Takođe, bazne grupe koje sadrže azot mogu da budu kvaternizovane sa takvim agensima kao što su halidi nižih alkila, kao što je metil, etil, propi i butil hlorid, bromidi i jodidi; dialkil sulfati kao dimetil, dietil, dibutil; i diamil sulfati, halidi dugog lanca kao decil, lauril, miristil i stearil hloridi, bromidi i jodidi, aralkil halidi kao benzil fenetil bromidi i drugi.

Proizvodi pronalaska

[0049] Pogodno, proizvod prema ovom pronalasku ne sadrži peptide.

[0050] Odnos antibiotskog agensa prema drugom agensu u proizvodima prema ovom pronalasku može da bude od 1:10 do 10:1; uopšteno najmanje 2:1, na primer najmanje 3:1 ili 4:1. Alternativno, odnos antibiotskog agensa prema drugom agensu u proizvodima prema ovom pronalasku može da bude od 1:100 do 1:2000, na primer od 1:500 ili 1:1000. Prema jednom primeru izvođenja, odnos antibiotskog agensa prema drugom agensu je približno 1:1. Poželjno, nepeptidni antibiotik i cisteamin sadrži ove komponente u odnosu od 2:1 do 4:1. Prema još jednom primeru izvođenja odnos može da bude približno 1:1.

[0051] Aktivne agense je moguće primeniti istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno. Aktivne agense je moguće obezbediti kao kombinovani paket. Kombinovani paket može da sadrži proizvod prema ovom pronalasku zajedno sa uputstvima za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu svakog od ovih aktivnih agenasa. Kod sekvencijalne primene, aktivne agense je moguće primeniti bilo kojim redosledom.

[0052] Aktivni agensi proizvoda prema ovom pronalasku mogu da budu obezbeđeni kao farmaceutske kompozicije koje dodatno sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, ekscipijenasa i/ili nosača. Ovo važi i za fiksne i za slobodne kombinacije.

[0053] Aktivne agense prema ovom pronalasku moguće je primeniti bilo kojim pogodnim putem poznatim stručnjaku u ovoj oblasti, poželjno u obliku farmaceutske kompozicije prilagođene takvom putu, i u dozi efikasnoj za predviđeno lečenje. Aktivna jedinjenja i kompozicija mogu, na primer da se primene parenteralno, oralno, intranazalno, intrabronhijalno, enteralno, transdermalno, sublingvalno, rektalno, vaginalno, okularno, ili topikalno. Predviđena je i lokalna i sistemska primena leka.

[0054] Za potrebe parenteralne primene ("parenteralno", kako se ovde koristi, odnosi se na načine primene leka koji obuhvataju intravensku, intramuskularnu, enteralnu, intraperitonealnu, intrasternalnu, potkožnu i intraartikularnu injekciju i infuziju, od kojih je intravenska (uključujući kontinualnu intravensku primenu) najpoželjnija) mogu da se koriste rastvori u vodenom propilen glikolu, kao i sterilni vodeni rastvori odgovarajućih soli rastvorljivih u vodi. Takvi vodeni rastvori mogu da budu pogodno puferisani, ako je potrebno, a tečni razblaživač prvo učinjen izotoničnim pomoću dovoljne količine fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensko, intramuskularno, potkožno i intraperitonealno ubrizgavanje. U vezi sa ovim, korišćeni sterilni vodeni medijumi mogu lako da se dobiju standardnim tehnikama dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti.

[0055] Proizvode prema ovom pronalasku takođe je moguće primeniti intranazalno ili inhalacijom i oni se pogodno dostavljaju u obliku inhalatornog suvog praha ili aerosolnog spreja iz posude pod pritiskom, pumpe, spreja, atomizera, nebulizera, sa ili bez upotrebe odgovarajućeg potiskivača.

[0056] Alternativno, proizvodi prema ovom pronalasku mogu biti primenjeni u obliku supozitorija ili pesarija, ili mogu biti primenjeni topikalno u obliku gela, hidrogela, losiona, rastvora, kreme, masti ili praha. Proizvodi prema ovom pronalasku mogu biti primenjeni dermalno ili transdermalno, na primer, upotrebom flastera za kožu, depoa ili potkožne injekcije. Moguće ih je takođe primeniti plućnim ili rektalnim putem.

[0057] Za oralnu primenu, farmaceutska kompozicija može da bude u obliku; na primer, tablete, kapsule, suspenzije ili tečnosti. Farmaceutska kompozicija se poželjno pravi u obliku jedinične doze koja sadrži određenu količinu aktivnog sastojka. Primeri takvih jediničnih doza su kapsule, tablete, praškovi, granule ili suspenzija, sa standardnim aditivima kao što je laktoza;

1

manitol, kukuruzni skrob ili skrob krompira; sa vezivnim sredstvima kao što je kristalna celuloza, derivati celuloze, akacija, kukuruzni skrob ili želatini; sa razgrađivačima kao što je kukuruzni skrob, skrob krompira ili natrijum karboksimetilceluloza; i sa lubrikantima kao što je talk ili magnezijum stearat. Aktivni sastojak može takođe da se primeni ubrizgavanjem kao kompozicija u kojoj, na primer, fiziološki rastvor, dekstroza ili voda mogu da se koriste kao pogodan nosač.

[0058] Proizvodi prema ovom pronalasku mogu takođe da nađu primenu kao/u oralnoj formulaciji pri čemu se proizvod formuliše na nosaču, na primer odabranom od filmova, traka, gelova, mikrosfera, lozengi, guma za žvakanje, sredstva za čišćenje zuba i sredstva za ispiranje usta.

[0059] Količina terapijski aktivnog jedinjenja koja se primenjuje i režimi doziranja za lečenje bolesti jedinjenjima i/ili kompozicijama prema ovom pronalasku zavise od raznih faktora, uključujući starost, težinu, pol i medicinsko stanje subjekta, ozbiljnost bolesti, put i učestalost primene, i od konkretnog jedinjenja koje se koristi, kao i od farmakokinetičkih svojstava osobe koja se leči, i zbog toga mogu da budu veoma različiti. Doza će uopšteno biti niža ako se jedinjenja primenjuju lokalno, a ne sistematski, i za prevenciju, a ne za lečenje. Takve tretmane je moguće primeniti koliko god često je potrebno, i tokom perioda vremena koji je neophodan na osnovu mišljenja nadležnog lekara. Stručnjak u ovoj oblasti će uvideti da će možda biti potrebna optimizacija režima doziranja ili terapijski efikasne količine inhibitora koju treba primeniti kod svakog pojedinca. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže aktivni sastojak u opsegu od oko 0,1 do 2000 mg, poželjno u opsegu od oko 0,5 do 500 mg i najpoželjnije između oko 1 i 200 mg. Dnevna doza koja može biti prikladna je od oko 0,01 do 100 mg/kg telesne težine, poželjno između oko 0,1 i oko 50 mg/kg telesne težine i najpoželjnije od oko 1 do 20 mg/kg telesne težine. Dnevna doza može da se primeni u jednoj do četiri doze dnevno.

[0060] Proizvodi prema ovom pronalasku se poželjno primenjuju u respiratorni trakt. Dakle, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje aerosolne farmaceutske formulacije koje sadrže proizvod prema pronalasku. Takođe je obezbeđen nebulizer ili inhalator koji sadrži proizvod prema pronalasku.

[0061] Pored toga, proizvodi prema ovom pronalasku mogu da budu prilagođeni za formulaciju u vidu oblika doze sa produženim oslobađanjem i slično. Sastav formulacija može da bude takav da one otpuštaju aktivne agense, na primer, u određenom delu intestinalnog ili respiratornog trakta, po mogućstvu tokom određenog vremenskog perioda. Obloge, omotači i zaštitne matrice mogu da budu napravljene, na primer, od polimernih supstanci, kao što su polilaktid-glikolati, lipozomi, mikroemulzije, mikročestice, nanočestice, ili voskovi. Ove obloge, omotači i zaštitne matrice su korisni za oblaganje implantiranih medicinskih uređaja, npr. stentova, katetera, cevčica za peritonealnu dijalizu, uređaja za dreniranje, i slično.

[0062] Proizvodi prema ovom pronalasku mogu da sadrže sinergistički efikasne količine svakog ovde definisanog aktivnog agensa. Ovaj pronalazak dakle obuhvata proizvode koji sadrže sinergistički efikasnu količinu (i) antibiotskog agensa koji je nepeptidni antibiotski agens (ii) drugog agensa koji je cisteamin. Proizvod može da bude za upotrebu u proizvodnji leka, za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu pomenutih agenasa u lečenju mikrobne infekcije, na primer bakterijske infekcije. "Sinergistički", kako se ovde koristi, može da opiše dejstvo dva ili više agensa proizvoda prema ovom pronalasku koji deluju zajedno proizvodeći dejstvo veće od očekivanog kombinovanog dejstva zasebno korišćenih agenasa.

[0063] U sledećem aspektu ovog pronalaska obezbeđen je supstrat na koji se nanosi, ili na koji se pričvršćuje proizvod prema ovom pronalasku. Poželjno, supstrat je pogodan za nanošenje na rane ili isporuku na ranom zahvaćena mesta. Poželjno, supstrat omogućava transfer aktivnih agenasa proizvoda prema ovom pronalasku iz supstrata na ležište rane, kako bi se postiglo njihovo antibakterijsko dejstvo. Supstrat može da bude zavoj, na primer, zavoj za ranu. Zavoj može da sadrži tkaninu ili može da bude materijal sličan kolagenu. Supstrat može da bude u bilo kom pogodnom obliku za primenu na ranu, najčešće supstrat može da bude u obliku hidrogela, koloida, masti, kreme, gela, pene ili spreja.

[0064] Proizvodi prema ovom pronalasku mogu takođe da nađu primenu kao/u dezinfekcionom sredstvu ili biocidu. U ovom kontekstu, farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu da se nanesu, bilo same ili u kombinaciji sa drugim dezinfekcionim agensima, na površinu koju treba obraditi. Kako se ovde koristi "površina koju treba obraditi" može da bude supstrat, kako je ovde definisano, i može da obuhvata medicinske uređaje i implantirane uređaje, npr. stentove, katetere, cevčice za peritonealnu dijalizu, uređaje za dreniranje, proteze zglobova, zubne implantate i slično.

Postupci i upotreba

[0065] Ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju bakterijske infekcije. Obično bakterijska infekcija može da predstavlja diseminovanu infekciju ili, naročito, infekcija u sredini bogatoj sluzi, kao što su pluća, na primer, pluća pacijenta koji pati od CF ili bakterijske hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD). Postupak prema ovom pronalasku obuhvata korak primene u takvoj sredini proizvoda prema ovom pronalasku. Postupak može da bude in vivo ili ex vivo.

[0066] U sredinama bogatim sluzi standardni antibiotici kao što je tobramicin, gentamicin ili ciprofloksacin ne ispoljavaju isti nivo antibakterijske aktivnosti kao kada su u sredinama sa niskim sadržajem sluzi. Iznenađujuće je da se antibakterijska aktivnost antibiotika povećava posle primene cisteamina.

[0067] Pogodno postupak obuhvata korak primene

• antibiotskog agensa; i

• drugog agensa koji je cisteamin, pri čemu je antibiotski agens nepeptidni antibiotik.

[0068] Kada se postupak prema ovom pronalasku koristi za lečenje bakterijskih infekcija povezanih sa CF, antibiotski agens je poželjno tobramicin, gentamicin ili ciprofloksacin.

[0069] Sredina može da sadrži bilo koju bakterijsku infekciju, uključujući infekciju koju prouzrokuje više od jednog mikroorganizma, na primer bakterije i bilo koji agens od gljiva, kvasaca, virusa i protozoa.

[0070] Bakterija može da bude Gram-pozitivna ili Gram-negativna bakterija. Bakterijski patogen može da potiče od bakterijskih vrsta odabranih iz grupe koja se sastoji od: Staphylococcus spp., npr. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis; Enterococcus spp., npr. Enterococcus faecalis; Streptococcus pyogenes; Listeria spp.; Pseudomonas spp.; Mycobacterium spp., npr. Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.; Salmonella spp.; Streptococcus spp., npr. Streptococcus grupe A ili B, Streptoccocus pneumoniae; Helicobacter spp., npr. Helicobacter pylori; Neisseria spp., npr. Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis; Borrelia burgdorferi; Shigella spp., npr. Shigella flexneri; Escherichia coli; Haemophilus spp., npr. Haemophilus influenzae; Chlamydia spp., npr. Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci; Francisella fularensis; Bacillus spp., npr. Bacillus anthracis; Clostridia spp., npr. Clostridium botulinum; Yersinia spp., npr. Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; npr. Burkholderia mallei i B. pseudomallei.

[0071] Naročito, bakterija može da uključuje Pseudomonas spp., na primer Pseudomonas aeruginosa; Staphylococcus spp., na primer Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis; Haemophilus spp., na primer Haemophilus influenza; Burkholderia spp., na primer Burkholderia cepacia; Streptococcus spp., Propionibacterium spp., na primer Propionibacterium acnes. Poželjno, bakterija je odabrana od Pseudomonas spp., na primer Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus spp., na primer Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis.

[0072] Postupak prema ovom pronalasku može da se koristi da svede na minimum i, po mogućstvu spreči formiranje bakterijskih kolonija, posebno bakterijskih biofilmova u raznim sredinama uključujući, ali ne ograničavajući se na, domaćinstvo, radno mesto, laboratoriju,

1

industrijsku sredinu, vodenu sredinu (npr. cevovode), medicinske uređaje uključujući implantirane uređaje kao što je ovde definisano, zubne uređaje ili zubne implantate, telo životinja, na primer, ljudsko telo.

[0073] Postupak prema ovom pronalasku može dakle da se koristi u ustima da bi se sprečilo formiranje plaka ili karijesa na ljudskom zubu ili zubnom implantatu, na primer, zubnoj protezi.

[0074] Postupak prema ovom pronalasku može da se koristi da spreči ili ograniči formiranje bakterijske kolonije. Postupak prema ovom pronalasku može da se koristi za prevenciju ili lečenje bakterijskih infekcija uključujući topikalne infekcije, oralne infekcije i sistemske infekcije. Topikalne infekcije mogu da obuhvate rane, čireve i lezije, na primer, rane na koži kao što su posekotine ili opekotine, i sa ovim povezana stanja.

[0075] Oralne infekcije mogu da obuhvate gingivitis, periodontitis i mukozitis.

[0076] Sistemske infekcije mogu da obuhvate cističnu fibrozu, COPD i druga stanja povezana sa infekcijama sluzokože, na primer, gastrointestinalne, urogenitalne ili druge respiratorne infekcije.

[0077] Još jedan aspekt ovog pronalaska zasniva se na postupcima za lečenje, prevenciju ili odlaganje progresije bakterijske infekcije kod sisara, posebno čoveka, primenom terapijski efikasne količine proizvoda prema ovom pronalasku kod tog sisara.

[0078] Pod "efikasna" količina ili "terapijski efikasna količina" podrazumeva se količina jedne ili više aktivnih supstanci koja je, u okviru meritorne medicinske procene, dovoljna da obezbedi željeno dejstvo bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu korist/rizik.

[0079] Dakle proizvod prema ovom pronalasku može da bude koristan za prevenciju, odlaganje progresije, ili lečenje bolesti ili stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od infekcija kože i rana, infekcija srednjeg uha, infekcija gastrointesinalnog trakta, infekcija peritonealne membrane, infekcija urogenitalnog trakta, infekcije mekog tkiva usne duplje, formiranja zubnog plaka, infekcija oka (uključujući kontaminaciju kontaktnog sočiva), endokarditisa, infekcija kod cistične fibroze i infekcija implantiranih medicinskih uređaja, kao što je ovde opisano.

[0080] Pronalazak takođe obuhvata postupke za lečenje kod kojih se proizvod prema ovom pronalasku primenjuje kod sisara zajedno sa jednim ili više drugih antibakterijskih agenasa, na primer, sa antibiotikom. Uopšteno, proizvod prema ovom pronalasku, i bilo koja kompozicija prema ovom pronalasku uopšte ne sadrže peptide.

[0081] Aktivni agensi pomenuti u ovoj specifikaciji mogu da postoje u različitim oblicima, kao što su slobodne kiseline, slobodne baze, estri i drugi prolekovi, soli i tautomeri, na primer, i ovaj pronalazak obuhvata sve varijantne oblike ovih agenasa.

[0082] U opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, jednina obuhvata množinu osim ako kontekst ne zahteva drugačije. Preciznije, gde se koristi neodređeni član, specifikaciju treba razumeti tako da se odnosi na množinu kao i jedninu, osim ako kontekst ne zahteva drugačije.

[0083] Podrazumeva se da svojstva, celi brojevi, karakteristike, jedinjenja, hemijski fragmenti ili grupe opisane u vezi sa određenim aspektom, primerom izvođenja ili primerom ovog pronalaska mogu da se primene na bilo koji drugi ovde opisani aspekt, primer izvođenja ili primer, osim ako su nekompatibilni sa njim.

[0084] U opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, reči "sadrže" i "obuhvataju" i varijacije ovih reči, na primer "koji sadrži" i "sadrži", znače "uključujući, ali bez ograničavanja na", i nisu predviđene da (i ne) isključuju druge fragmente, aditive, komponente, cele brojeve ili korake.

[0085] Pojam "približno" je uopšteno predviđen da obuhvata opseg od 10% ili manje od bilo koje numeričke vrednosti na koju se odnosi.

[0086] Pronalazak će sada biti opisan putem primera, uz pozivanje na sledeće slike, na kojima:

Slike 1a i 1b: predstavljaju poređenje antibakterijske aktivnosti tobramicina i cisteamina (NM001) protiv planktonskih ćelija Pseudomonas kada se primene odvojeno, i u kombinovanom obliku. NM001 smanjuje MIC tobramicina prema planktonskim ćelijama i to najmanje 4-struko (Sl.1b).

Slika 2: predstavlja poređenje antibakterijske aktivnosti tobramicina i ciprofloksacina protiv ćelija Pseudomonas aeruginosa kultivisanih u sredini bogatoj sluzi koja reprodukuje sredinu koja se javlja u plućima kod cistične fibroze, kada se primenjuju pojedinačno i u kombinaciji sa cisteaminom.

Slika 3: predstavlja poređenje aktivnosti samog tobramicina i kada je u kombinaciji sa cisteaminom (NM001) protiv ćelija Pseudomonas aeruginosa kultivisanih u sredini koja nije bogata sluzi, i kada su kultivisane u sredini bogatoj sluzi koja reprodukuje sredinu koja se javlja u plućima kod cistične fibroze (u prisustvu NaCl i/ili mucina). NM001 obnavlja antibiotsku aktivnost konvencionalnih antibiotika u sredini bogatoj sluzi.

1

Slika 4: prikazuje histogram na kome se poredi aktivnost protiv biofilma cisteamina primenjenog pojedinačno i u kombinaciji sa tobramicinom protiv uspostavljenog biofilma P. aeruginosa PAO1: studija odgovora na dozu je omogućila identifikaciju minimalne koncentracije za eradikaciju biofilma (MBEC) cisteamina protiv uspostavljenih biofilmova P. aeruginosa PAO1 i kvantifikaciju aditivne aktivnosti sa tobramicinom. MBEC samog cisteamina bila je 1000 µg/ml, a tobramicin je pokazao MBEC od 4 µg/ml. Kada su kombinovani, međutim, potpuna eradikacija biofilma je postignuta sa 500 µg/ml cisteamina i 1 µg/ml tobramicina. Prema tome, frakciona inhibitorna koncentracija (FIC) takve kombinacije je 0,75, što ukazuje na aditivnu aktivnost između dva antimikrobna agensa. Zbog toga, mukolitički/antimikrobni agens cisteamin ima potencijal da pospeši aktivnost protiv biofilma konvencionalnih antibiotika, što može imati implikacije na smanjenje širenja antimikrobne rezistencije i troškova lečenja.

Slika 5: prikazuje grafikon post-antimikrobnog dejstva cisteamina (NM001) u kombinaciji sa tobramicinom (TOB) protiv biofilmova P. aeruginosa PAO1.

Slika 6: predstavlja grafikon koji prikazuje da cisteamin (NM001) pospešuje antimikrobnu aktivnost tobramicina protiv Burkholderia cepacia NCTC10743 otporne na više lekova. Aditivna antimikrobna aktivnost cisteamina i tobramicina je takođe identifikovana protiv soja Burkholderia cepacia NCTC10743 otpornog na više lekova. MIC100tobramicina bio je viši od 16 µg/ml dok je cisteamin pokazao MIC100od 500 µg/ml. Kada su kombinovani zajedno, cisteamin je mogao da pospeši aktivnost tobramicina i njegov MIC100je bio 0,25 µg/ml u kombinaciji sa 250 µg/ml cisteamina. Ovo vodi do FIC indeksa manjeg od 0,51, koji ukazuje na najmanje aditivnu antimikrobnu aktivnost, i moguće sinergiju između ta dva jedinjenja.

Slika 7: predstavlja histogram koji pokazuje antimikrobnu aktivnost tobramicina i cisteamina protiv planktonskih ćelija P. aeruginosa PAO1 pojedinačno, i u kombinaciji, u fiziološki relevantnim koncentracijama kako je nađeno u plućima pacijenata sa cističnom fibrozom (CF). Antimikrobna aktivnost (MIC100) cisteamina je upoređena u normalnom stanju (kako je opisano u CLSI M7-A7 metodi - videti Dodatak 1) i u prisustvu 150 mM natrijum hlorida (NaCl), 1,7 mM kalcijum hlorida (CaCl2), 1 mg/ml DNK ili 1% (tež./zapr.) mucina želuca svinje u triplikatu, u pločama sa 96 bunarčića. Bakterijski rast je praćen tokom perioda od 24 sata i apsorbanca je očitana korišćenjem BioTek čitača mikrotitarskih ploča na 625 nm. Ukupna inhibicija

1

bakterijskog rasta se zadržala u prisustvu NaCl, CaCl2ili DNK i pri MIC100koja je dvostruko veća od normalne u prisustvu mucina. Aktivnost tobramicina je inhibirana u prisustvu dvovalentnog katjona Ca2+ i u prisustvu anjonske polimerne DNK. Kada je kombinovan sa cisteaminom, aktivnost tobramicina je očuvana u svim ispitivanim uslovima pri koncentracijama koje su do 4 puta veće od njegove normalne MIC.

Slika 8: predstavlja histogram koji prikazuje mukolitičku aktivnost cisteamina naspram drugih agenasa koji narušavaju disulfidnu vezu i mukolitičkih agenasa. Mukolitička aktivnost cisteamina je upoređena sa drugim mukolitičkim agensima kao što su N-acetil-cistein (Mucomyst<®>), DNaza I (Dornase Alfa<®>), alginatna lijaza i cisteamin hidrohlorid, merenjem viskoznosti rastvora mucina nakon tretmana. Mucin želuca svinje (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) je pripremljen u sterilnoj prečišćenoj vodi u težinsko-zapreminskom odnosu od 20%. Mukolitički agensi su pripremljeni u koncentraciji od 10 mg/ml u 20% (tež./zapr.) rastvoru mucina. Brzina toka mucina je izmerena posle otprilike 5 minuta izloženosti mukolitičkim agensima. Podaci pokazuju prosečne vrednosti i standardnu devijaciju nezavisnih eksperimenata u duplikatu.

Slika 9: je grafikon koji prikazuje post-antimikrobno dejstvo cisteamina (NM001) u kombinaciji sa tobramicinom protiv biofilmova P. aeruginosa PAO1. Ovo pokazuje aktivnost cisteamina protiv biofilma u kombinaciji sa tobramicinom na dve različite koncentracije, pri čemu je post-antimikrobno dejstvo (PAE) ovih jedinjenja takođe utvrđeno praćenjem bakterijskog rasta posle tretiranja biofilmova.

Slika 10: predstavlja grafikon koji prikazuje inhibiciju mikrobne metaboličke aktivnosti biofilmova P. aeruginosa PAO1 posle tretmana cisteaminom (NM001) u kombinaciji sa tobramicinom. Ovo pokazuje metaboličku aktivnost biofilmova posle tretmana. Ovi podaci pokazuju aktivnost cisteamina protiv biofilma, primenjenog pojedinačno, i u kombinaciji sa tobramicinom, sa značajnim PAE kako je pokazano odloženim bakterijskim rastom i smanjenom metaboličkom aktivnošću biofilma.

PRIMERI

Aktivnost antimikrobnih agenasa protiv bakterijskih kolonija

Materijali i metode

1.1 Bakterijski sojevi

1

[0087] U ovoj studiji korišćeni su Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 i Burkholderia cepacia NCTC10743. Dodatni sojevi Pseudomonas aeruginosa su upotrebljeni kao što je prikazano u tabelama 1 i 2.

1.2 Priprema antimikrobnih jedinjenja

[0088] Antimikrobni agensi ispitivani u ovoj studiji su bili cisteamin (NM001), tobramicin, ciprofloksacin, kolistin i gentamicin. Ovi agensi su dobijeni od kompanije Sigma-Aldrich (Gillingham, UK) i štok rastvori su pripremljeni na 20 mg/ml u čistoj vodi od 14-18 MΏ.cm (Purite HP40 sistem za prečišćavanje vode, Oxon, UK). Jednom kada se rastvore, preparati su bili sterilno filtrirani korišćenjem 0,22 µm filtera (Millipore, Watford, England) i skladišteni na -20°C.

1.3 Priprema bakterijskog inokuluma

[0089] Bakterijski inokulom je uspostavljen postupkom razblaženja iz kultura koje aktivno rastu u Mueller-Hinton (MH) medijumu, standardizovanom pomoću standarda zamućenosti McFarlanda 0,5, kako je opisano u CLSI metodi M26-A.

1.4 Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC)

[0090] Bakterijski inokulum i antimikrobni agensi, uključujući jedinjenja koja su strukturno srodna cisteaminu, dodati su istovremeno na ploče. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 24 sata i optička gustina je očitana na 625 nm na čitaču mikrotitarskih ploča (BioTek Powerwave XS, Winooski, USA). MIC je dobijena kao najmanja koncentracija antimikrobnog agensa koja pokazuje potpunu inhibiciju rasta bakterija.

Antimikrobna efikasnost derivata cisteamina protiv P. aeruginosa

[0091] Antimikrobna aktivnost je ispitana kod brojnih jedinjenja koja su srodna po hemijskoj strukturi sa cisteaminom; cistamina (dihidrohloridna so), taurina i 2,3-dimerkaptosukcinske kiseline. Druga jedinjenja hemijski srodna cisteaminu su poznata, ali su toksična, i zbog toga nisu korisna za lek ove prirode.

Cisteamin:

[0092]

1

Cistamin:

[0093]

Taurin:

[0094]

2,3-Dimerkaptosukcinska kiselina:

[0095]

1.5 Određivanje MIC u fiziološki-relevantnim jonskim koncentracijama

[0096] Za određivanje antimikrobne aktivnosti cisteamina (Lynovex<®>) u prisustvu visokih jonskih koncentracija korišćen je postupak sličan gore opisanom postupku (1.4). Antimikrobna aktivnost (MIC100) cisteamina je upoređena u normalnim uslovima (kako je opisano u CLSI M7-A7 metodi) i u prisustvu 150 mM natrijum hlorida (NaCl), 1,7 mM kalcijum hlorida (CaCl2), 1 mg/ml DNK ili 1% (tež./zapr.) mucina želuca svinje u triplikatu, u pločama sa 96 bunarčića. Bakterijski rast je praćen u periodu od 24 sata, a apsorbanca je očitana korišćenjem BioTek čitača mikrotitarskih ploča na 625 nm.

1

1.6 Određivanje aktivnosti protiv biofilma

[0097] Aktivnost protiv biofilma je procenjena korišćenjem mikrofluidnog BioFlux 800 sistema sa protočnom ćelijom (Fluxion, South San Francisco, USA). Mikrofluidni kanali BioFlux ploče sa 48 bunarčića su inokulisani inokulumom P. aeruginosa PAO1 u Mueller-Hinton medijumu ekvivalentnom standardu McFarland 0,5. Mikrobne ćelije su ostavljene da se pričvrste za podlogu i počnu formiranje mikrokolonija tokom otprilike 30 minuta na 37°C. Mukolitički agensi su pripremljeni u koncentraciji od 1 mg/ml u Mueller-Hinton medijumu i propuštani su kroz mikrofluidizator brzinom od 0,5 Dyn/cm<2>(ekvivalentno 53 µl/h) tokom 16 sati na 37°C. Mikroskopsko posmatranje i snimanje slika izvedeno je korišćenjem mikroskopa Axiovert 40 pri 100-strukom uvećanju (Carl Zeiss, Welwyn Garden City, UK).

1.7 Određivanje frakcione inhibitorne koncentracije (FIC)

[0098] FIC odgovara koeficijentu interakcije koji ukazuje na to da li je kombinacija antimikrobnih agenasa sinergistička, aditivna, antagonistička ili neutralna. FIC se određuje poređenjem aktivnosti agensa u kombinaciji (MIC, agens A agens B) sa aktivnošću samog agensa (MIC, agens A ili agens B) kao što sledi (Singh et al., 2000):

FIC=MICA[kombinacija]/MICA[pojedinačno]+MICB[kombinacija]/MICB[pojedinačno]

[0099] Aditivne kombinacije dva antimikrobna agensa su označene FIC indeksom od 1, dok FIC indeks < 1 označava sinergističke kombinacije. Neutralne kombinacije bi dale FIC između 1 i 4, FIC indeks viši od 4 ukazuje na antagonistička dejstva dva antimikrobna agensa.

[0100] FIC je takođe izračunat da bi se procenila interakcija dva antimikrobna agensa u kombinaciji protiv bakterijskih uzoraka.

1.8 Određivanje post-antimikrobnog dejstva (PAE) i metaboličke aktivnosti

[0101] PAE je određen prenošenjem 10 µl kultura biofilma u 90 µl sterilnog MH medijuma u triplikatu na mikrotitarske ploče posle tretmana. Rast bakterija je praćen na BioTek čitaču ploča tokom 24 sata na 37°C. Mikrobna metabolička aktivnost posle tretmana biofilmova je određena korišćenjem istog postupka kao za određivanje PAE i dodavanjem 10% (zapr./zapr.) fluorescentnog indikatora ćelijske vijabilnosti, resazurina (Alamar Blue, Serotec), kojim se detektuje rast mikrobne metaboličke aktivnosti putem povećanja

2

fluorescencije. Fluorescencija je merena tokom 24 sata na 37°C korišćenjem BioTek Synergy HT čitača mikroploča (BioTek, Winooski, USA) na 530/590 nm.

1.9 Određivanje mukolitičke aktivnosti

[0102] Mukolitička aktivnost cisteamina je upoređena sa drugim mukolitičkim agensima kao što su N-acetilcistein (Mucomyst®), DNaza I (Dornase Alfa®), alginat lijaza i cisteamin hidrohlorid, merenjem viskoznosti rastvora mucina posle tretmana. Mucin želuca svinje (Sigma-Aldrich, Gillingham, UK) je pripremljen u sterilnoj prečišćenoj vodi u težinsko-zapreminskom odnosu 20%. Mukolitički agensi su pripremljeni pri 10 mg/ml u 20% (tež./zapr.) rastvoru mucina. Brzina toka mucina je izmerena posle otprilike 5 minuta izloženosti mukolitičkim agensima.

2 Rezultati

2.1 Prevencija i lečenje bakterijske kolonizacije

[0103] Opseg koncentracija antimikrobnih agenasa je bio 0-10 µg/ml.

2.1.1 Aktivnost protiv P. aeruginosa ATCC 27853

[0104] MIC tobramicina i ciprofloksacina je u velikoj meri smanjena posle primene sa cisteaminom u poređenju sa primenom leka pojedinačno. Ovo dejstvo se ispoljavalo u sredinama koje su imitirale sredine karakteristične za pluća zahvaćena cističnom fibrozom.

[0105] Utvrđivanje FIC za ovu kombinaciju ukazuje na to da antimikrobni agensi imaju sinergistička dejstva (FIC = 0,75). Antimikrobni agensi prema ovom pronalasku deluju sinergistički obezbeđujući pojačano antibakterijsko dejstvo. Antimikrobno dejstvo standardnih antibiotika kao što su tobramicin i ciprofloksacin je očuvano kada su primenjeni u kombinaciji sa cisteaminom u mukolitičkoj sredini.

2.2 Tabela 1: Indeks frakcione inhibitorne koncentracije kombinacija cisteamina, cisteamin hidrohlorida i N-acetil cisteina i standardnih antibiotika kolistina (Col), ciprofloksacina (Cip), tobramicina (Tob) i gentamicina (Gent) protiv odabranih izolata Pseudomonas aeruginosa

[0106]

�

2.3 Tabela 2: Antimikrobna efikasnost cisteamina i strukturno srodnih jedinjenja protiv odabranih klinički relevantnih izolata Pseudomonas aeruginosa.

[0107]

[0108] U svim slučajevima cisteamin je pokazao veću antimikrobnu efikasnost nego srodna jedinjenja, što ukazuje na suštinsku prirodu kako sulfhidrilnih, tako i amino grupa u odnosu na značajnu antimikrobnu aktivnost.

2

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Proizvod koji sadrži antibiotski agens i cisteamin, naznačen time, što je antibiotski agens nepeptidni antibiotik.

2. Proizvod prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što je antibiotski agens odabran iz grupe koja se sastoji od aminoglikozida, ansamicina, karbacefema, karbapenema, cefalosporina, linkozamida, makrolida, monobaktama, nitrofurana, hinolona, penicilina, sulfonamida i tetraciklina.

3. Proizvod prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što je antibiotski agens odabran iz grupe koja se sastoji od aminoglikozida, linkozamida, makrolida, hinolona, sulfonamida i tetraciklina.

4. Proizvod prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži sinergistički efikasnu količinu (i) antibiotskog agensa, i (ii) cisteamina.

5. Proizvod prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva za upotrebu kao lek.

6. Supstrat na koji je proizvod prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva nanet ili pričvršćen.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži proizvod prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, ekscipijenasa i/ili nosača.

8. Proizvod prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili farmaceutski proizvod prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u lečenju ili prevenciji mikrobne infekcije.

9. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačen time, što je infekcija odabrana iz grupe koja se sastoji od infekcija kože i rane, infekcija srednjeg uha, infekcija gastrointestinalnog trakta, infekcija peritonealne membrane, infekcija urogenitalnog trakta, infekcija mekog tkiva usne duplje, infekcija oka, endokarditisa, infekcija kod cistične fibroze i infekcija implantiranih medicinskih uređaja.

10. Proizvod za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 ili 9, naznačen time, što infekcija predstavlja infekciju mukolitičke sredine.

11. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačen time, što je infekcija bakterijska infekcija povezana sa cističnom fibrozom.

12. Proizvod za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 11, naznačen time, što je infekcija prouzrokovana bakterijom izabranom iz grupe koja se sastoji od Pseudomonas spp.,

2

Staphylococcus spp., Haemophilus spp., Burkholderia spp., Streptococcus spp. i Propionibacterium spp.

13. Proizvod za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačen time, što je bakterija Pseudomonas spp., Burkholderia spp. ili Staphylococcus spp.

14. Proizvod za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 8 do 13, naznačen time, što se antibiotski agens i drugi agens primenjuju na kombinovani ili sekvencijalni način.