CN110573143A - 用于抑制病原体和/或改性粘液的化合物、组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供用于改性粘液的化合物、组合物和方法，所述方法包括使用释放一氧化氮的生物聚合物(例如，释放NO的壳聚糖寡糖)来改性粘液。在一些实施例中，本发明的化合物、组合物和/或方法改变粘液的一种或多种特性以提高个体的粘液清除率和/或防止个体粘液中存在的一种或多种病原体生长或杀死个体粘液中存在的一种或多种病原体。

Description

用于抑制病原体和/或改性粘液的化合物、组合物和方法

相关申请信息

本申请要求2017年4月10日提交的美国临时专利申请序列号62/483,655的权益和优先权，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

政府利益

本发明是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的AI112029和HL108808下进行。政府享有本发明的一定权利。

技术领域

本发明所公开的主题提供用于改性粘液的化合物、组合物和方法，所述方法包括使用释放一氧化氮的生物聚合物(例如释放一氧化氮的壳聚糖寡糖)改性粘液。

背景技术

一氧化氮(NO)在生物学、生理学和病理生理学中的多方面作用的发现，参见Marietta,M.A.,等人,《生物因子(BioFactors)》,2,219-225(1990)，已引起对能够控制一氧化氮释放的一氧化氮供体的搜索。参见Keefer,L.K.,《化学工艺学(Chemtech)》,28,30-35(1998)。研究人员已发现，NO调节心血管系统、胃肠道系统、泌尿生殖系统、呼吸系统以及中枢和周围神经系统的一系列生物过程。参见Ignarro,L.J.,《一氧化氮：生物学和病理学(Nitric Oxide:Biology and Pathobiology)》；学术出版社：圣地亚哥(Academic Press:San Diego),2000；和Ignarro,L.J.等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.)》,84,9265-9269(1987)。此外，NO作为血管舒张剂的发现和其作为抗生素和肿瘤杀伤因子两者的识别使得NO成为具有吸引力的医药学上候选物。参见例如Radomski,M.W.,等人,《英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)》,92,639-646(1987)；Albina,J.E.,和Reichner,J.S.；《癌症与转移综述(Canc.Metas.Rev.)》,17,19-53(1998)；Nablo,B.J.,等人,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,123,9712-9713(2001)；Cobbs,C.S.,等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,55,727-730(1995)；Jenkins,D.C.,等人,《美国国家科学院院刊》,92,4392-4396(1995)；和Thomsen,L.L.,等人,《英国癌症杂志(Br.J.Cancer.)》,72,41-44(1995)。

已报道几种一氧化氮供体，最值得注意的是N-二醇二氮烯鎓。一般来说，N-二醇二氮烯鎓NO供体是通过使胺与NO在高压下反应而合成的小分子，并且已例如用于在水溶液中自发产生NO。参见Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.,《化学评论(Chem.Rev.)》,102,1135-1154(2002)。

囊性纤维化(CF)是生活限制性基因遗传性病症，其影响美国(US)大约30,000人和全世界70,000人(N.《BMC医学(BMC Med.)》,9,32-39(2011)；Treggiari,M.M.,等人,《儿童肺脏学(Pediatric Pulmonology)》,42,751-756(2007))。CF跨膜传导调控蛋白中的缺陷导致粘液在肺、肝、胰脏、胃肠道和生殖系统中堆积并且阻碍肺、肝、胰脏、胃肠道和生殖系统的正常功能(Ehre,C.,等人,《生物化学和细胞生物学的国际杂志(TheInternational Journal of Biochemistry&Cell Biology)》,52,136-145(2014))。因为粘液在CF肺中堆积并且稠化，所以气道清除受损，促进细菌群落化(Matsui,H.,等人,P.N.A.S.,103,18131-18136(2006))。这一增稠粘液层产生保护细菌免受免疫细胞影响并且促进生物膜形成的环境(Hassett,D.J.,等人,《药物递送进展综述(Adv.Drug DeliveryRev.)》,54,1425-1443(2002))。慢性感染伴有持续性发炎和肺功能的最终下降(Hassett,D.J.,等人,《药物递送进展综述》,54,1425-1443(2002))。因此，涉及慢性细菌感染的呼吸道并发症是CF患者死亡的主要病因(Lyczak,J.B.,等人,《临床微生物学评论(ClinicalMicrobiology Reviews)》,15,194-222(2002))。

部分地因为所属领域中已知的一氧化氮递送系统无差别地释放或供给一氧化氮，所以探究一氧化氮供体活性的治疗策略存在问题。

发明内容

本发明的各方面包括使用释放一氧化氮(NO)的生物聚合物(例如如本文中所述的释放NO的聚葡糖胺)改变粘液的一个或多个特性的方法。

本发明的一个方面涉及一种改性有需要的个体的粘液的方法，所述方法包含：向个体施用如本文所述的释放NO的生物聚合物，其中释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的并且以粘液溶解和抗微生物的量向个体施用，从而改性个体的粘液。

本发明的另一个方面涉及一种改性粘液的方法，所述方法包含：使如本文中所述的释放NO的生物聚合物与粘液接触，其中释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的，并且呈粘液溶解和抗微生物的量，从而改性粘液。

本发明的另一方面涉及一种提高个体的粘液清除率的方法，所述方法包含向个体施用如本文所述的释放NO的生物聚合物。

本发明的另一个方面涉及一种降低个体的粘液粘度和/或弹性的方法，所述方法包含向个体施用如本文所述的释放NO的生物聚合物。

本发明的另一个方面涉及一种降低粘液粘度和/或弹性的方法，所述方法包含使粘液与如本文所述的释放NO的生物聚合物接触。

本发明的另一方面涉及一种抑制或杀死粘液中的病原体的方法，所述方法包含使粘液与如本文所述的释放NO的生物聚合物接触。一些实施方案包括向个体施用如本文所述的释放NO的生物聚合物以抑制或杀死个体粘液中的病原体。

本发明的另一个方面涉及一种抑制或杀死粘液中的病原体的方法，所述方法包含向个体施用如本文所述的释放NO的生物聚合物。

在一些实施方案中，本文中所公开的主题涉及一种释放NO的生物聚合物(例如，聚葡糖胺)，其含有共价结合的一氧化氮释放部分，即，NO供体。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物包含聚葡糖胺，其任选地在具有式I的结构的聚葡糖胺主链中包含至少一个结构单元。任选地，聚葡糖胺的至少一个结构单元进一步包含式II的结构。在一些实施方案中，如本文所述的释放NO的生物聚合物充当抗微生物剂和/或降解粘蛋白，例如，来自人类支气管上皮细胞培养物和/或从患有囊性纤维化的患者收集的临床痰样品的粘蛋白。

在一些实施方案中，本文中所公开的主题涉及治疗个体的疾病状态的方法，所述方法包含施用如本文中所述的释放NO的生物聚合物。在一些实施方案中，向个体施用包含至少一个式I的结构单元并且任选地进一步包含至少一个式II的结构单元的释放NO的聚葡糖胺。在其它实施方案中，释放NO的生物聚合物充当广泛范围的抗生素和/或降低粘液和/或CF痰的粘弹性。

在一些实施方案中，本文中所公开的主题涉及包含如本文所述的释放NO的生物聚合物和医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂的医药组合物。在一些实施方案中，本发明的医药组合物包含如本文所述的释放NO的聚葡糖胺以及一种医药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。释放NO的聚葡糖胺可包含至少一个式I的结构单元和任选的至少一个式II的结构单元。

在一些实施方案中，本文中所公开的主题涉及制备如本文所述的释放NO的生物聚合物的方法，所述释放NO的生物聚合物例如包含至少一个式I结构单元和/或任选地至少一个式II结构单元。

应注意，关于一个实施方案描述的本发明的方面可并入于不同实施方案中，尽管不关于其进行具体描述。也就是说，所有实施方案和/或任何实施方案的特点可以任何方式和/或组合进行组合。申请人保留对改变任何最初申请的权利要求或相应地申请任何新权利要求的权利，包括能够修正任何最初申请的权利要求和/或并入任何其它权利要求(虽然最初不以所述方式主张)的任何特点的权利。在下文阐述的说明书中详细解释本发明的这些和其它目标和/或方面。所属领域的一般技术人员将在阅读图式和随后的实施方案的详细描述后了解本发明的进一步特点、优点和细节，这类描述仅是对本发明的说明。

附图说明

图1展示用改性的壳聚糖寡糖对胃猪粘蛋白(GPM)进行浊度滴定。

图2展示在将壳聚糖寡糖添加到粘蛋白溶液(1mg/mL于10mM PB中，pH 6.5)后形成的胃猪粘蛋白(GPM)壳聚糖聚集体的ζ电位测量值。

图3是来自HBE培养物洗涤液的MUC5AC和MUC5B粘蛋白的代表性蛋白质印迹，所述HBE培养物洗涤液来自患有囊性纤维化的供体，其在25℃下以0-20mg/mL的范围内的浓度用COS、COS-NO、COS-SPA和COS-SPA-NO处理2小时。

图4A和4B描绘在室温下用改性壳聚糖寡糖处理1小时之后来自CF-HBE培养物洗涤液的(图4A)MUC5AC和(图4B)MUC5B粘蛋白的迁移距离。用等体积PBS处理的粘蛋白的迁移距离用虚线水平线表示。所有值均表示为3次或更多次合并实验的平均值±标准偏差。星号(*)指示相对于用PBS(0mg/mL)处理的显著性差异(p<0.05)。

图5是来自在25℃下以0-20mg/mL范围内的浓度用COS、COS-NO、COS-SPA和COS-SPA-NO处理1个小时的CF痰的MUC5AC粘蛋白的代表性蛋白印迹。对于MUC5B观察到类似的趋势。

图6A和6B描绘在室温下用改性的壳聚糖寡糖处理1小时之后来自CF痰的(图6A)MUC5AC和(图6B)MUC5B粘蛋白的相对迁移距离。将迁移距离标准化为用等体积PBS处理的CF痰样品。所有值均表示为n＝3或更多合并实验的平均值±标准偏差。

图7A-7T展示在25℃下用PBS(图7A-7D)或20mg/mL COS(图7E-7H)、COS-NO(图7I-7L)、COS-SPA(图7M-7P)或COS-SPA-NO(图7Q-7T)处理1小时的CF痰的共聚焦显微镜图像。箭头指示未经处理的样品中的长链粘蛋白(图7A)，其在用COS处理后聚集并且形成凝集块(图7E)。

图8A和8B展示在25℃下用COS-NO处理1个小时的CF痰的(图8A)弹性和(图8B)粘性模量。数值表示为n＝3成一式三份测量的平均值的平均值±标准误差。星号(*)指示相对于用PBS(0mg/mL)处理的显著性差异(p<0.05)。

图9A-9D描绘在通过暴露在高压的NO气体中形成N-二醇二氮烯鎓之前和之后的(图9A)COS、(图9B)COS-EA、(图9C)COS-TBuA和(图9D)COS-SPA的UV Vis光谱。

图10A-10D描绘改性壳聚糖寡糖的FT-IR光谱。

针对(图10A)COS、(图10B)COS-EA、(图10C)COS-TBuA和(图10D)COS-SPA，改性壳聚糖寡糖的光谱用FT-IR取以进一步表征丙烯酸酯基团成功加入COS主链中。

图11展示COS-NO的FT-IR光谱，其说明壳聚糖主链的羟基在N-二醇二氮烯鎓形成后保留。

图12A-12D展示(图12A)COS、(图12B)COS-EA、(图12C)COS-TBuA和(图12D)COS-SPA在磷酸盐缓冲液(pH 6.5)和磷酸盐缓冲盐水(pH 6.5，140mM NaCl)中的浊度滴定。

具体实施方式

现在参考附图更加完整地描述本发明，在所述附图中展示本发明的实施方案。然而，本发明可以不同形式实施，且不应被理解为限于本文中所阐述的实施方案。确切地说，提供这些实施方案是为了使得本公开将是透彻并且完整的，并且这些实施方案将把本发明的范围完整地传达给所属领域的技术人员。举例来说，关于一个实施方案所说明的特点可以并入其它实施方案中，并且可以从所述实施方案中删除关于特定实施方案所说明的特点。另外，鉴于本公开，对本文中建议的实施方案的多种变化和添加将对所属领域的技术人员是显而易见的，所述变化和添加不脱离本发明。

除非另外定义，否则本文所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)将具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文中对本发明的描述中所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且并不旨在是对本发明的限制。

本文提及的所有公开案、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入本文中。

如本文所用，“一个(a/an)”或“所述”可以表示一个或超过一个。举例来说，“一个”释放NO的部分可以表示单个或多个。

同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合，以及当在替代方案(“或”)中解释时缺乏组合。

此外，当提及例如当前本发明的化合物或药剂的量、剂量、时间、温度和其类似物的可测量值时，如本文所用的术语“约”意指涵盖指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文所提供的可测量值的范围可包括其中的任何其它范围和/或个别值。

术语“基本上由……组成”(和语法变化形式)在应用于本发明的组合物时意指组合物可含有额外组分，只要额外组分不实质上改变组合物即可。

如本文所用，术语“增加(increase/increases/increased/increasing)”、“改善”、“增强”和类似术语指示指定参数升高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。

如本文所用，术语“减少(reduce/reduces/reduced/reduction)”、“抑制”和类似术语是指特定参数减少至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。

除非另外指示，否则用于描述本文所用的化学基团或部分的命名法遵循惯例，其中从左到右阅读名称，与分子其余部分的连接点位于名称的右侧。举例来说，基团“(C_1-3烷氧基)C_1-3烷基”在烷基末端与分子的其余部分连接。其它实例包括：甲氧基乙基，其中连接点在乙基末端；和甲氨基，其中连接点在胺末端。

除非另外指示，否则当单价或二价基团通过其化学式描述时，包括由“-”表示的一个或两个末端键部分，应理解连接从左到右阅读。

除非另外陈述，否则本文中所描绘的结构也意指包括所述结构的所有对映异构、非对映异构以及几何异构(或构象异构)形式；例如，对每个不对称中心的R和S构型、(Z)和(E)双键异构体、以及(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构、非对映异构和几何异构(或构象异构)混合物都在本发明的范围内。除非另外陈述，否则本发明化合物的所有互变异构形式都在本发明的范围内。

另外，除非另外陈述，否则本文中所描绘的结构也意指包括仅在存在一个或多个同位素增浓原子方面不同的化合物。举例来说，除了氢被氘或氚置换或碳被¹³C或¹⁴C增浓的碳置换之外具有本发明结构的化合物在本发明的范围内。这类化合物适用作例如生物检定中的分析工具或探针。

如本文所用的“粘膜粘附”是指化合物与个体个粘蛋白、粘液和/或粘膜表面的粘附。如本文所用，关于化合物的“粘膜粘附”意指可以粘附于个体的粘蛋白、粘液和/或粘膜表面的化合物。化合物可以使用任何类型的键(例如共价键、离子键和/或氢键)粘附于粘蛋白、粘液和/或粘膜表面。在一些实施方案中，本发明的化合物(即，释放NO的生物聚合物)是粘膜粘附的。

在一些实施方案中，与对照(例如，未改性的生物聚合物和/或不释放NO的生物聚合物，例如不包含NO供体的壳聚糖)相比，本发明的化合物具有改善的粘膜粘附。在一些实施方案中，对照可以是壳聚糖(例如，在以1重量％的量存在于1％乙酸溶液中并且在25℃下测量时粘度为约200-800厘泊的中等分子量壳聚糖)和/或无NO供体的改性壳聚糖(例如，不含NO供体的2-甲基氮丙啶改性的壳聚糖)。化合物的粘膜粘附的量或程度可以通过所属领域技术人员已知的方法测量，例如通过测量包含所述化合物的粘蛋白溶液的浊度，任选地通过测量校正的吸光度，和/或通过测量粘蛋白溶液的浊度。举例来说，化合物的粘膜粘附的量或程度可以用含有本发明化合物的粘蛋白溶液测量。任选地在pH 6.5下，可以通过在4℃下在250mL无菌磷酸盐缓冲液(PB)中将960mg胃猪粘蛋白组合18小时并且去除(例如，通过在1,500×g，4℃下离心0.5小时)不溶性组分来制备粘蛋白溶液。粘蛋白溶液可以与含有本发明化合物的溶液组合以形成组合溶液。含有本发明化合物的溶液可以是无菌PB，其以约0.1mg/mL到约60mg/mL的浓度包括化合物。可以通过将236μL粘蛋白溶液与34μL含有本发明化合物的溶液组合来制备组合溶液。可以在540nm下读取组合溶液的吸光度。在一些实施方案中，组合溶液可以在37℃下培育1小时，任选地轻轻摇晃(例如，100rpm)，并且然后可以在540nm下读取吸光度。通过从组合溶液吸光度中减去含有化合物的溶液(即，没有粘蛋白)的吸光度，可以获得校正的吸光度。在一些实施方案中，与对照溶液相比，含有本发明化合物和粘蛋白的溶液的浊度增加指示改善的粘膜粘附。对照溶液可以是含有粘蛋白和较低浓度的化合物的溶液，或者可以是包含未改性的和/或不释放NO的生物聚合物(例如，不释放NO的壳聚糖)的溶液。

在一些实施方案中，本发明化合物的粘膜粘附的量或程度可以通过在向粘蛋白溶液中加入氯化钠时包含化合物的粘蛋白溶液的浊度降低来测量。任选地在pH 6.5下，可以达到约140mM NaCl的量将氯化钠添加到含有化合物的粘蛋白溶液中。在向包含第一化合物的粘蛋白溶液中加入氯化钠后浊度的较大降低可指示在向包含第二化合物的粘蛋白溶液中加入氯化钠后浊度的较小降低的第二化合物，第一化合物对粘蛋白的粘膜粘附程度较低。

在一些实施方案中，化合物的粘膜粘附的量或程度可以通过含有化合物的粘蛋白溶液(任选pH 6.5的粘蛋白溶液)的ζ电位来测量和/或定量。举例来说，用于测量ζ电位的粘蛋白溶液可以如上所述，或者可以通过在4℃下在10mL无菌PB中将10mg胃猪粘蛋白组合18小时并且去除不溶性组分(例如在1,500×g，4℃下通过离心0.5小时)来制备。可以任选地在搅拌下将本发明的化合物添加到粘蛋白溶液中，并且可以任选地在37℃下培育1小时后测量ζ电位。与对照粘蛋白溶液(例如，无化合物的粘蛋白溶液)的ζ电位相比，包含本发明化合物并且具有增加的ζ电位的粘蛋白溶液可指示化合物的粘膜粘附的量或程度。在一些实施方案中，与对照粘蛋白溶液(例如，无化合物的粘蛋白溶液)的ζ电位相比，包含本发明化合物的粘蛋白溶液具有增加至少1、2或3mV的ζ电位。

根据本发明的实施方案提供改性粘液的化合物、组合物和/或方法。在一些实施方案中，本发明的化合物、组合物和/或方法可以改变粘液的一种或多种物理和/或生物物理特性和/或可以增加(例如，约10％或更多)个体的粘液的粘膜纤毛清除率和/或肺功能。在一些实施方案中，本发明的化合物、组合物和/或方法可以减少(例如，约10％或更多)或消除粘液和/或个体中的病原体。因此，根据一些实施方案，本发明的化合物、组合物和/或方法可以改变粘液的一种或多种物理和/或生物物理特性，并且可以减少或杀死粘液和/或个体中的一种或多种病原体。粘液和/或个体中粘液和/或病原体的量的改性可在向个体施用本发明的释放NO的生物聚合物和/或使本发明的释放NO的生物聚合物与粘液接触的约24小时内(例如，在约20、18、12、10、8、6、4或2小时内)测定。

在本发明的一些实施方案中，提供用于增加个体的粘液清除和/或降解和减少个体中的一种或多种病原体，例如，个体的粘液中的一种或多种病原体的单一疗法。如本文所用，术语“单一疗法”是指用于治疗两种或更多种病况，例如，细菌感染和囊性纤维化的单一药剂。可以在治疗期间将单一疗法向个体施用一次或多次(例如，1、2、3、4、5、6或更多次)。在一些实施方案中，本发明的方法包含施用释放NO的生物聚合物作为单一疗法，并且响应于单一疗法，个体的粘液清除增加，个体的粘液中存在的至少一种病原体被抑制或杀死，个体的粘液降解增加，和/或个体的粘液粘度和/或弹性降低。

本发明的方法可包含向个体施用本发明的释放NO的生物聚合物和/或使粘液与本发明的释放NO的生物聚合物接触，例如本发明的释放NO的聚葡糖胺。如本文所用的“生物聚合物”是指可由活生物体或其衍生物产生的聚合物。例示性生物聚合物包括但不限于蛋白质、肽、寡核苷酸、寡糖和/或多糖。如所属领域普通技术人员将理解，生物聚合物可以合成方式获得(例如，通过实验室合成)和/或从自然界(例如，从活的或先前存活的生物体)获得和/或衍生。因此，生物聚合物可以与天然发现的聚合物(即天然生物聚合物)相同或可以是其衍生物。举例来说，本发明的生物聚合物可以是由活生物体产生的聚合物的衍生物，所述衍生物由用于从自然界获得或分离生物聚合物的合成方法产生。在一些实施方案中，生物聚合物具有可用的氮(例如，其主链中和/或与其侧接的可用的氮)，其可以例如根据本文所述的方法用NO供体衍生化以形成释放NO的聚葡糖胺。在一些实施方案中，生物聚合物包含一种或多种仲胺，其中的一种或多种可以衍生化和/或转化为NO供体，例如通过在强碱和气态一氧化氮存在下将仲胺转化为NO供体。

其它例示性生物聚合物包括但不限于壳聚糖、淀粉(包括直链淀粉和/或支链淀粉)、半纤维素、木质素、纤维素、甲壳素、藻酸盐、葡聚糖、pullane、聚羟基烷酸酯、纤维蛋白、环糊精、蛋白质(例如大豆蛋白)、其它多糖(例如果胶)和/或聚乳酸。

用于本发明方法的生物聚合物的分子量可为约20,000道尔顿或更低，例如约10,000道尔顿或更低。在一些实施方案中，生物聚合物的分子量可为约20,000、19,000、18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000、10,000、9,000、8,000、7,000、6,000、5,000、4,000、3,000、2,000或1,000道尔顿。在一些实施方案中，生物聚合物的分子量可为约1,000道尔顿到约20,000道尔顿、约1,000道尔顿到约10,000道尔顿、或约1,000道尔顿到约10,000道尔顿。在一些实施方案中，生物聚合物可以是多分散的。在一些实施方案中，生物聚合物可以是水溶性的或可以官能化为水溶性的。

本发明的释放NO的生物聚合物是包含一个或多个NO供体(例如，1、2、5、10、50、100、200个或更多)的生物聚合物。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物具有至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的用NO供体官能化的聚合物主链的单体单元。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物具有至少约1％到约20％的用NO供体官能化的聚合物主链的单体单元。在一些实施方案中，按生物聚合物的重量计，本发明的释放NO的生物聚合物具有至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％或5％的NO。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物是本发明的释放NO的聚葡糖胺。本发明的释放NO的聚葡糖胺在本文中可互换地称为释放NO的壳聚糖寡糖。在一些实施方案中，本发明的释放NO的聚葡糖胺由中等分子量壳聚糖制备和/或包含中等分子量壳聚糖。在一些实施方案中，本发明的释放NO的聚葡糖胺由中等分子量壳聚糖制备和/或包含中等分子量壳聚糖，所述壳聚糖在以1重量％的量存在于1％乙酸溶液中并且在25℃下测量时粘度为约200到约800厘泊。在一些实施方案中，本发明的释放NO的聚葡糖胺由去乙酰化壳聚糖制备和/或包含去乙酰化壳聚糖，例如，约5％到约100％、约10％到约50％、约75％到约85％、约70％到约95％、约95％到约98％、约50％到约80％、约90％到约98％或约80％到约90％去乙酰化的壳聚糖。在一些实施方案中，本发明的释放NO的聚葡糖胺由壳聚糖(例如，在以1重量％的量存在于1％乙酸溶液中并且在25℃下测量时粘度视情况为约200到约800厘泊的中等分子量壳聚糖)制备和/或包含壳聚糖，其被约50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％去乙酰化。

在一些实施方案中，本发明的聚葡糖胺包含至少一个式I的结构单元：

和任选的至少一个式II的结构单元：

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄在存在时各自独立地选自由氢、-(C＝O)C_1-5烷基和C_1-5烷基组成的群组；

在每种情况下是单键或双键，

其中在其为双键的每种情况下，不存在与双键-O连接的R₁、R₂、R₃或R₄；当R₁不存在时，R₅为氢、羟基、C_1-5烷基或C_1-5烷氧基；当R₃不存在时，R₆为氢、羟基、C_1-5烷基或C_1-5烷氧基；

其中在其为单键的每种情况下，存在与双键-O连接的R₁、R₂、R₃或R₄；当R₁存在时，R₅是氢；当R₃存在时，R₆是氢；

W是-(Q-A)_p-B、-Q-A-B或-C_1-20烷基-AB；

Q是-(CR_cR_d)_v-；

其中R_c和R_d在每种情况下独立地为氢或C_1-5烷基；并且v是2到6的整数；

p是1到100的整数；

A是

其中，L是S、O或N；并且

G在每种情况下独立地为氢，或与L一起形成一氧化氮供体，或不存在；

X是氢、C_1-5烷基或与N一起形成一氧化氮供体；

B不存在或选自由氢、羟基、C_1-5烷基或-Y-Z组成的群组，其中Y是间隔基，并且Z是聚合物、末端或C_1-20烷基；

D是-NR_aR_b，其中R_a和R_b独立地选自由氢、甲酰基、-(C＝O)C_1-5烷基、C_1-5烷基和C_1-5烷基酯组成的群组；

或D是

其中所述聚葡糖胺包含至少一个一氧化氮供体；并且

其中G与L一起形成至少一个一氧化氮供体，或X与N一起形成至少一个一氧化氮供体。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)是粘膜粘附的。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的,并且比壳聚糖(例如，在以1重量％的量存在于1％乙酸溶液中并且在25℃下测量时粘度为约200-800厘泊的中等分子量壳聚糖)和/或无NO供体的改性壳聚糖(例如，不含NO供体的2-甲基氮丙啶改性的壳聚糖)更具粘膜粘附性。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的并且比不释放NO的生物聚合物(例如，壳聚糖(例如，在以1重量％的量存在于1％乙酸溶液中并且在25℃下测量时粘度为约200-800厘泊的中等分子量壳聚糖))的粘膜粘附性高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、250％、300％或更多。

本发明的释放NO的生物聚合物可带正电和/或具有总正电荷。本发明的释放NO的生物聚合物与粘蛋白之间的静电相互作用可以促进和/或帮助释放NO的生物聚合物与个体的粘蛋白、粘液和/或粘膜表面的粘膜粘附。

在一些实施方案中，与对照化合物相比，本发明的释放NO的生物聚合物可以较低剂量向个体施用。对照化合物可以是非粘膜粘附的生物聚合物，例如不粘膜粘附的释放NO的生物聚合物，并且其任选地可以递送与本发明的粘膜粘附的释放NO的生物聚合物相同的量和/或速率的NO。在一些实施方案中，对照化合物可以是释放NO的小分子(例如，分子量小于500道尔顿并且包含至少一个NO供体的有机和/或无机化合物)。本发明的释放NO的生物聚合物的剂量可以低于对照化合物的剂量，任选地达到相同或类似的结果，低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。举例来说，在一些实施方案中，与不粘膜粘附的释放NO的生物聚合物相比，所述不粘膜粘附的释放NO的生物聚合物任选地可以递送与本发明的粘膜粘附的释放NO的生物聚合物相同的量和/或速率的NO，和/或与释放NO的小分子相比，本发明的释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的，并且可以较低的剂量向个体施用。在一些实施方案中，本发明的粘膜粘附的释放NO的生物聚合物(例如释放NO的聚葡糖胺)可以改变粘液的一种或多种特性的量施用，并且这一量低于不粘膜粘附的释放NO的生物聚合物的量以实现与粘液相同或类似的修饰，任选地其中不粘膜粘附的生物聚合物递送与粘膜粘附的释放NO的生物聚合物相同的量和/或速率的NO，和/或低于释放NO的小分子的量。

在一些实施方案中，本发明的粘膜粘附的释放NO的生物聚合物可以治疗有效量(therapeutically effective amount/treatment effective amount)向个体施用，并且这一量低于对照化合物(例如不粘膜粘附的生物聚合物)的量，所述对照化合物任选地递送与粘膜粘附的释放NO的生物聚合物相同的量和/或速率的NO，和/或低于释放NO的小分子，以实现相同或类似的治疗结果。本发明的释放NO的生物聚合物的治疗有效量(therapeutically effective amount/treatment effective amount)可以比对照化合物的量低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，施用本发明的释放NO的生物聚合物不会由于例如以治疗有效量施用一氧化氮而产生全身效应。

在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物以粘液溶解的剂量施用。如本文所用，关于化合物(例如，本发明的释放NO的生物聚合物)的“粘液溶解”意指化合物以能够分解粘液和/或降低粘液粘度和/或弹性的剂量施用。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可降低粘液粘度和/或弹性。与不存在本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法和/或在本发明的方法之前的情况下的粘液粘度和/或弹性相比，粘液粘度和/或弹性可降低至少约10％。在一些实施方案中，与不存在本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法和/或在本发明的方法之前的情况下的粘液粘度和/或弹性相比，粘液粘度和/或弹性降低约10％、15％、20％、25％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％或包含其中任何两个个别值的任何范围。举例来说，在一些实施方案中，粘液粘度和/或弹性可降低约65％到约95％、约75％到约95％、或约65％到约90％的范围内的量。在一些实施方案中，粘度和/或弹性可以降低统计学上大于适当对照(例如，如本文所述的对照化合物)的量。粘液粘度和/或弹性可以在体外测定。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以比常规粘液溶解疗法(例如，施用N-乙酰半胱氨酸或阿法链道酶(dornase alfa))更高(例如至少5％、10％、15％或20％更高)的量减少粘液粘度和/或弹性。在一些实施方案中，与在施用常规粘液溶解疗法(例如，施用N-乙酰半胱氨酸或阿法链道酶)后实现相同的粘液粘度和/或弹性降低的时间量相比，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以在施用释放NO的生物聚合物之后的较短时间内降低粘液粘度和/或弹性。

如本文所用，关于粘液的“弹性”是指在经历由于外力(例如，固体行为)引起的形变之后粘液恢复到原始形状的能力。如本文所用，关于粘液的“粘度”是指在施加力(例如剪切应力或拉伸应力)时粘液对形变(例如，液体行为)的抵抗力的量度。较高的粘液粘度意指粘液较不易发生形变。如本文所用，关于粘液的“粘弹性”是指粘液的特征，其在经历形变时呈现出粘性和弹性特征。

在使释放NO的生物聚合物与粘液和/或个体接触和/或向粘液和/或个体施用释放NO的生物聚合物后约15、30、45、60或90分钟、或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更久，本发明的释放NO的生物聚合物(例如释放NO的聚葡糖胺和/或方法)可将粘液粘度和/或弹性降低至少约10％。在一些实施方案中，在使释放NO的生物聚合物与粘液和/或个体接触和/或向粘液和/或个体施用释放NO的生物聚合物后约1、6、12或24小时，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可将粘液粘度和/或弹性降低至少约50％、75％、80％或90％。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)和/或方法可减少个体中的粘液堆积，例如个体中的气道、肺、支气管和/或气管中的粘液堆积。与在本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法不存在下和/或在本发明的方法之前的粘液堆积相比，释放NO的生物聚合物和/或方法可将个体中的粘液堆积减少约10％、15％、20％、25％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。在一些实施方案中，粘液堆积可以减少统计学上高于适当对照(例如，如本文所述的对照化合物)的量。可以在体外确定粘液堆积。

本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)和/或方法可减小(例如约10％或更多)粘蛋白和/或粘蛋白多聚物的尺寸，其任选地例如使用所属领域技术人员已知的方法(例如通过视情况使用凝胶电泳测量粘蛋白迁移距离)在体外测定。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以改变粘蛋白和/或粘蛋白多聚物上的电荷，其任选地例如使用所属领域技术人员已知的方法(例如通过任选地使用凝胶电泳测量粘蛋白溶液的ζ电位和/或粘蛋白迁移距离)在体外测定。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以改性和/或破坏粘蛋白的三维网络，其任选地例如使用所属领域技术人员已知的方法(例如，免疫组织化学检测和/或任选地使用凝胶电泳测量粘蛋白迁移距离)在体外测定。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以减少(例如，约10％或更多)粘液中粘蛋白长丝的数量和/或长度，其任选地例如使用所属领域技术人员已知的方法(例如，免疫组织化学检测和/或任选地使用凝胶电泳测量粘蛋白迁移距离)在体外测定。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以改变粘液中存在的DNA，其任选地例如使用所属领域技术人员已知的方法(例如，免疫组织化学检测和/或任选地使用凝胶电泳测量粘蛋白迁移距离)在体外测定。举例来说，释放NO的生物聚合物和/或方法可以例如通过NO介导的DNA裂解来裂解粘液中存在的DNA。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以降低(例如，约10％或更多)粘液中存在的一种或多种粘蛋白(例如，MUC5AC和/或MUC5B)的浓度，其任选地例如使用所属领域技术人员已知的方法(例如，免疫组织化学检测和/或凝胶电泳)在体外测定。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)和/或方法可以提高个体的粘液清除率。与在本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法不存在下和/或在本发明的方法之前的粘液清除率相比，粘液清除率可提高至少约10％。在一些实施方案中，与在本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法不存在下和/或在本发明的方法之前的粘液清除率相比，粘液清除率提高约10％、15％、20％、25％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、200％、300％、400％或更多。

与常规粘液溶解疗法(例如，施用N-乙酰半胱氨酸或阿法链道酶)相比，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以更高(例如，高至少5％、10％、15％或20％)的量提高个体的粘液清除率在一些实施方案中，与在施用常规粘液溶解疗法(例如，施用N-乙酰半胱氨酸或阿法链道酶)后实现相同的个体的粘液清除率提高的时间量相比，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以在施用释放NO的生物聚合物之后的较短时间内提高个体的粘液清除率。

根据一些实施方案，本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)是抗微生物剂，和/或本发明的方法可以抗微生物的剂量施用本发明的释放NO的生物聚合物。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物以可有效抑制病原体(例如细菌)生长和/或杀死病原体的剂量向个体施用和/或与粘液接触。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法以可有效抑制病原体生长和/或杀死病原体的量向个体和/或粘液提供和/或递送一氧化氮。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法以等于或低于(例如，低至少5％、10％、15％或20％)可有效抑制病原体生长和/或杀死仅用于一氧化氮(例如，气态NO)的病原体的浓度的量向个体和/或粘液提供和/或递送一氧化氮。

本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)和/或方法可以抑制一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或更多种)病原体生长和/或杀死一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11种或更多种)病原体。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以是广泛范围抗微生物剂。本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以抑制一种或多种好氧和/或厌氧病原体生长和/或杀死一种或多种好氧和/或厌氧病原体和/或可以在好氧和/或厌氧条件下抑制一种或多种病原体生长和/或杀死一种或多种病原体。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以抑制一种或多种革兰氏(gram)阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌生长和/或杀死一种或多种革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以在好氧和厌氧条件下抑制革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌生长和/或杀死革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。

在一些实施方案中，本发明的方法包含以等于或高于可有效预防病原体的直观生长的量的量向个体和/或粘液施用本发明的释放NO的生物聚合物和/或使本发明的释放NO的生物聚合物与个体和/或粘液接触。在一些实施方案中，本发明的方法包含以等于或高于可有效杀死病原体的量的量向个体和/或粘液施用本发明的释放NO的生物聚合物和/或使本发明的释放NO的生物聚合物与个体和/或粘液接触。如本文所用，术语“接触(contact/contacting)”和其类似术语是指紧密接近的两种或更多种物质，从而可以发生作用。举例来说，在实施方案中，个体的粘液可以与释放NO的生物聚合物接触，使得可以发生粘液的改性，例如个体中粘液清除率提高。

例示性病原体包括但不限于：包括抗二甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)和二甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(例如，粘液和非粘液绿脓杆菌)洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、氧化木糖无色杆菌(AchromobacterXylosoxidans)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophillia)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、无色杆菌(Achromobacter xylosidans)、尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)和包括鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracelullare)的分枝杆菌。如本文所用，术语“分枝杆菌”是指具有超过150种识别的物种并且为放线菌属的细菌的家族。分枝杆菌包括但不限于已知引起例如肺结核和麻风病的疾病的病原体。分枝杆菌的其它非限制性实例为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)和无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)以及溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)。在一些实施方案中，病原体是分枝杆菌。在一些实施方案中，病原体是非结核分枝杆菌，例如但不限于非结核脓肿分枝杆菌和非结核鸟型分枝杆菌。在一些实施方案中，病原体是抗生素抗性病原体和/或超级细菌(super bug)。如本文所用，术语“超级细菌”是指病原体(例如，细菌)，其是多药抗性的并且不能使用两种或更多种抗微生物剂(例如抗生素)杀死。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)和/或方法可以抑制一种或多种病原体生长和/或杀死一种或多种病原体，其对一种或更多抗生素具有抗性，例如但不限于对常规CF抗生素具有抗性的病原体。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以抑制粘液和/或非粘液铜绿假单胞菌生长和/或杀死粘液和/或非粘液铜绿假单胞菌。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以抑制对常规CF抗生素具有抗性的病原体、粘液和/或非粘液铜绿假单胞菌、洋葱伯克氏菌群物种、抗二甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌、非结核脓肿分枝杆菌、非结核鸟型分枝杆菌、无色杆菌和/或尖端赛多孢子菌生长和/或将其杀死。

在一些实施方案中，本发明的方法包含以抗微生物的并且降低粘液的粘度和/或弹性的量使本发明的释放NO的生物聚合物与粘液和/或个体接触和/或向粘液和/或个体施用本发明的释放NO的生物聚合物。释放NO的生物聚合物的量可以低于仅一氧化氮(例如气态NO)的量的量递送和/或施用一氧化氮以实现相同或类似的抗微生物活性和/或粘液的粘度和/或弹性的降低。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物的量可低于对照化合物的量以实现相同或类似的抗微生物活性和/或粘液的粘度和/或弹性的降低。

在一些实施方案中，本发明的方法包含向个体施用治疗有效量的释放NO的生物聚合物。如本文所用，术语“治疗有效量”是指本发明的释放NO的生物聚合物的量，其在个体中引发治疗上有用的反应。所属领域技术人员将理解，治疗效果不需要是完整的或治愈的，只要向个体提供一些益处即可。

如本文所用的“治疗(treat/treating/treatment of)”(和其语法变化形式)是指赋予个体益处的任何类型的治疗，并且可以意指个体的病况的严重程度降低、至少部分好转或改善和/或实现至少一种临床症状的一些缓解、减轻或减少和/或症状恶化有所延迟。

在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)可以治疗有效量施用。如本文所用的“治疗有效”量是足以治疗(如本文所定义)个体的量。所属领域技术人员将理解，治疗效果不需要是完整的或治愈的，只要向个体提供一些益处即可。

本发明可用于兽医和医学应用。适合用本发明方法治疗的个体包括但不限于哺乳动物个体。本发明的哺乳动物包括但不限于犬、猫、牛、山羊、马、绵羊、猪、啮齿动物(例如大鼠和小鼠)、兔类动物、灵长类动物(例如猿猴和人)、非人类灵长类动物(例如，猴子、狒狒、黑猩猩、大猩猩)和其类似动物以及胚胎哺乳动物。需要根据本发明治疗的任何哺乳动物个体都是合适的。可以根据本发明治疗两种性别和任何发育阶段(即新生儿、婴儿、幼年、青少年、成人)的人类个体。在本发明的一些实施方案中，个体是哺乳动物，并且在某些实施方案中，个体是人。人类个体包括所有年龄的男性和女性，包括胎儿、新生儿、婴儿、幼年、青少年、成人和老年个体以及怀孕个体。在本发明的具体实施方案中，个体是人类青少年和/或成年人。

出于兽医学目的和/或出于药物筛选和药物研发目的，本发明的方法也可以对动物个体，特别是哺乳动物个体(例如小鼠，大鼠，狗，猫，牲畜和马)进行。

在一些实施方案中，个体“需要”或“有需要”本发明的方法，例如，个体具有通常与感染和/或囊性纤维化相关的发现、疑似患有感染和/或囊性纤维化，和/或个体患有感染和/或囊性纤维化。在一些实施方案中，“需要”本文中所公开的方法的个体可以是正在经历疾病状态和/或预期经历疾病状态的个体，并且本发明的方法、化合物和/或组合物用于治疗和/或预防性治疗疾病状态。

本发明的方法可以向个体的气道、肺、支气管和/或气管中存在的粘液递送和/或施用本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)。在一些实施方案中，本发明的方法向个体中存在的粘液栓递送和/或施用本发明的释放NO的生物聚合物。

本发明的方法可以将本发明的释放NO的生物聚合物和/或一氧化氮直接递送到所关注部位(即，局部递送)。在一些实施方案中，本发明的方法向个体递送本发明的释放NO的生物聚合物和/或一氧化氮，并且不会由于施用一氧化氮而产生全身作用。一些实施方案包括向个体(例如，向个体中的区域靶向递送)局部递送本发明的释放NO的生物聚合物和/或一氧化氮，而不向非靶向的个体的其它区域提供全身暴露和/或毒性作用。

本发明的方法可以低于仅一氧化氮和/或对照化合物的治疗剂量的治疗剂量施用一氧化氮。因此，通过施用本发明的释放NO的生物聚合物，可以治疗有效的和低于仅一氧化氮和/或对照化合物的剂量的剂量递送和/或施用一氧化氮以实现相同或类似的治疗效果。在一些实施方案中，本发明的方法可以一定剂量施用和/或递送一氧化氮以实现治疗效果，所述治疗效果比仅一氧化氮和/或对照化合物的剂量低至少10％以实现相同或类似的治疗效果。

本发明的方法可以每天一次或多次(例如，1、2、3、4或更多次)、每天、每隔一天、每3、4、5或6天或一周一次向个体和/或粘液施用本发明的释放NO的生物聚合物。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以每天1、2或3次向个体和/或粘液施用维持1、2、3或4周。本发明的方法在治疗期期间向个体和/或粘液施用本发明的释放NO的生物聚合物1次或更多次。如本文所用的“治疗期”是指从第一次施用和/或给药本发明的释放NO的生物聚合物到最后一次施用和/或给药本发明的释放NO的生物聚合物的时间段。治疗期可以是1天或更多天或一周或几周。

在一些实施方案中，可以每天至少一次向个体和/或粘液施用本发明的释放NO的生物聚合物维持1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多天或周或其中任何范围和/或个别值的治疗期在一些实施方案中，可以每天至少一次向个体和/或粘液施用本发明的释放NO的生物聚合物维持少于50天或周，例如少于48、45、40、35、30、25、20、15、12、10、6、4、3或2天或周或其中任何范围和/或个别值的治疗期。在一些实施方案中，在向个体和/或粘液施用和/或给药释放NO的生物聚合物一次或多次之后，可以实现粘液的一种或多种物理和/或生物物理特性的改变，和/或一种或多种病原体可能被杀死和/或其生长受到抑制。在一些实施方案中，单次施用和/或给药实现粘液的物理和/或生物物理特性的一种或多种改变，和/或一种或多种病原体可以被杀死和/或其生长受到抑制。在一些实施方案中，两次或更多次(例如，2、3、4、5或更多次)施用和/或给药实现粘液的物理和/或生物物理特性的一种或多种改变，和/或一种或多种病原体可以被杀死和/或其生长受到抑制。在一些实施方案中，本发明的方法实现粘液的物理和/或生物物理特性的一种或多种改变，和/或一种或多种病原体在治疗期结束时(例如，在最后一次施用和/或给药释放NO的生物聚合物的约24小时内)可以被杀死和/或其生长受到抑制。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)以每毫升粘液约0.1mg到约100mg的释放NO的生物聚合物的浓度与粘液接触。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以使得释放NO的生物聚合物以每毫升粘液约0.1mg到约100mg的释放NO的生物聚合物的浓度存在的剂量施用。释放NO的生物聚合物可以每毫升粘液约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg或包含其中任何两个个别值的任何范围的释放NO的生物聚合物的浓度与粘液接触和/或向个体施用。

在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以可有效杀死病原体的浓度与粘液接触和/或向个体施用。本发明的方法可以提供病原体数量的一个、两个或三个对数下降的量施用本发明的释放NO的生物聚合物和/或递送一氧化氮。一个对数下降表示数量下降10倍(即10¹)或10％。两个对数下降表示数量下降100倍(即10²)或99％。三个对数下降表示数量下降1000倍(即10³)或99.9％。病原体数量的减少可以一次或多次(例如，1、2、3、4、5或更多次)施用释放NO的生物聚合物后的时间点(例如，在治疗期结束时)测量。

在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以每毫升溶液约0.1mg到约20或40mg的释放NO的生物聚合物的浓度与粘液接触和/或向个体施用，在所述释放NO的生物聚合物中病原体存在，并且所述释放NO的生物聚合物提供病原体数量的至少一个、两个或三个对数下降。本发明的方法可以抗生素提供病原体数量的一个、两个或三个对数下降所需的量的量施用本发明的释放NO的生物聚合物和/或递送一氧化氮。

释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)可以约1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1或7:1(释放NO的生物聚合物:粘蛋白)的重量比向个体施用和/或与粘液接触。粘蛋白可以约6.5mg/mL的粘液的量存在，并且释放NO的生物聚合物可以10mg/mL的粘液的量施用，使得释放NO的生物聚合物以约2:1到约1:1的范围内的重量比向个体施用。在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物以约4:1到约2:1、或约7:1到约1:3的重量比向个体施用。

本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)可以每毫克释放NO的生物聚合物至少约0.1μmol的一氧化氮的量释放一氧化氮，如在37℃下利用含1.0mg的释放NO的生物聚合物的30mL去氧磷酸盐缓冲盐水(pH 6.5或7.4)经由化学发光在体外测量，其中当NO浓度低于10ppb NO/毫克释放NO的生物聚合物时分析终止。在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物可以每毫克释放NO的生物聚合物约0.1μmol到约1或2μmol的一氧化氮的量释放一氧化氮，如在37℃下利用含1.0mg的释放NO的生物聚合物的30mL去氧磷酸盐缓冲盐水(pH 6.5或7.4)经由化学发光在体外测量，其中当NO浓度低于10ppb NO/毫克释放NO的生物聚合物时分析终止。在一些实施方案中，如经由如本文所述的化学发光在体外测量，本发明的释放NO的生物聚合物可以每毫克释放NO的生物聚合物约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2μmol的一氧化氮或包含其中任何两个个别值的任何范围的量释放一氧化氮。

如经由如本文所述的化学发光在体外测量，本发明的释放NO的生物聚合物的半衰期可为约15分钟到约8小时，例如，约15分钟到约45分钟、约1小时到约8小时、或4小时到约6小时。在一些实施方案中，如经由如本文所述的化学发光在体外测量，本发明的释放NO的生物聚合物的半衰期可为约15、30、45或60分钟、或约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8小时。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物可以高于10ppb NO/毫克释放NO的生物聚合物的浓度释放一氧化氮，如经由如本文所述的化学发光在体外测量，维持至少约4小时，例如，如经由如本文所述的化学发光在体外测量，维持至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时。在一些实施方案中，如经由如本文所述的化学发光在体外测量，本发明的释放NO的生物聚合物可以高于10ppb NO/毫克释放NO的生物聚合物的浓度释放一氧化氮维持约4小时到约24小时、约10小时到约22小时、约6小时到约15小时、约12小时到约20小时、或约19小时到约20小时。

本发明的释放NO的生物聚合物的分子量可为约10kDa或更低，例如约10、9.5、9、8.5、8、7.5、7、6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1或0.5kDa。

在一些实施方案中，本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可提供抗微生物特性，和/或可降低CF痰的粘弹性，这类影响不限于但可包括减小粘蛋白尺寸和/或破坏三维粘蛋白网络。尽管先前已提出吸入NO气体作为粘液溶解疗法，但本文中所公开的主题确定从本发明的释放NO的生物聚合物释放NO的益处，例如，用于直接递送到粘液栓中。在一些实施方案中，释放NO的壳聚糖寡糖骨架的粘膜粘附特性可以增强NO的效能。靶向NO释放到粘液(例如CF粘液)的能力可降低治疗作用所需的NO剂量，同时减少对其它NO介导的过程的任何潜在影响。在一些实施方案中，本文所述的壳聚糖寡糖可具有释放NO的壳聚糖寡糖作为抗菌剂和粘液溶解剂的双重作用潜力，并且可用于例如治疗呼吸道疾病和/或感染。

在一些实施方案中，本发明的方法可以治疗CF.本发明的释放NO的生物聚合物和/或方法可以降解由人支气管上皮细胞产生和/或存在于临床痰样品中的粘蛋白，例如从患有囊性纤维化(CF)的患者收集的样品。

本发明所公开的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)可以是水溶性的和/或可调的。这些特性可有助于本发明所公开的释放NO的生物聚合物的有效性，例如，可用于治疗剂和/或水溶性治疗剂是有利的疾病状态，例如，可用于囊性纤维化的治疗。本发明的释放NO的生物聚合物是如美国专利申请公开案第2015/0225488号中所述的聚葡糖胺，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以容易地渗透和根除生物膜。术语“破坏”和“根除”是指本发明所公开的释放NO的生物聚合物对抗生物膜的能力。生物膜可以被部分根除或破坏，这意味着细胞不再彼此附着或附着到表面。生物膜可以被完全根除，这意味着生物膜在很大程度上不再是相互连接的、粘性的或连续的细胞网络。

在一些实施方案中，是破坏、根除或预防生物膜的方法，例如个体的生物膜。所述方法包含使含有生物膜或易受形成或占据一些或全部表面或区域的生物膜影响的表面或区域与本发明的释放NO的生物聚合物盐接触。术语“生物膜”旨在意味一种或多种微生物的聚集体，其中细胞通常在表面上彼此粘附。大多数任何自由漂浮的微生物都可以形成生物膜和/或附着到表面上。微生物可以通过范德华力(van der Waals force)通过弱的可逆粘附力粘附到表面或彼此上。微生物可以使用细胞粘附或例如菌毛的结构更永久地锚定。

如本文所用，关于本发明的释放NO的生物聚合物的术语“水溶性”意指释放NO的生物聚合物在室温下以高于约50、75、100、150或200mg/ml的浓度可溶于水。在一些实施方案中，本文中所公开的水溶性生物聚合物(例如，聚葡糖胺)是可溶的，使得在室温下每毫升水溶解高于50mg的生物聚合物。在一些实施方案中，本文中所公开的水溶性生物聚合物(例如，聚葡糖胺)是可溶的，使得在室温下每毫升水溶解高于75mg的生物聚合物。在一些实施方案中，本文中所公开的水溶性生物聚合物(例如，聚葡糖胺)是可溶的，使得在室温下每毫升水溶解高于100mg的生物聚合物。在一些实施方案中，本文中所公开的水溶性生物聚合物(例如，聚葡糖胺)是可溶的，使得在室温下每毫升水溶解高于150mg的生物聚合物。在一些实施方案中，本文中所公开的水溶性生物聚合物(例如，聚葡糖胺)是可溶的，使得在室温下每毫升水溶解高于200mg的生物聚合物。

术语“一氧化氮供体”或“NO供体”是指供给、释放和/或直接或间接转移一氧化氮物种和/或刺激体内内源性一氧化氮生成和/或提高体内内源性一氧化氮含量的物种，其使得一氧化氮物种的生物活性在预期的作用位点表达。

术语“一氧化氮释放”或“一氧化氮供给”是指供给、释放和/或直接或间接转移三种氧化还原形式的一氧化氮(NO+、NO^-、NO)中的任何一种的方法。在一些情况下，完成一氧化氮释放或供给，使得一氧化氮物种的生物活性在预期的作用位点处表达。

在一些实施方案中，本文描述的寡糖是聚葡糖胺。聚葡糖胺和其衍生物已知为去壳多糖和其衍生物。特别有用的聚葡糖胺是尺寸在1000g/mol到20,000g/mol的范围内的聚合物。还涵盖分子量低于1000g/mol的较小聚葡糖胺和分子量高于20,000g/mol的较大聚葡糖胺。分子量高于20,000g/mol的壳聚糖可能需要进一步官能化为水溶性的。有用的聚葡糖胺的一个重要特点是碳水化合物主链上和/或与其侧接的可用的氮，其根据本文所述的方法衍生化以形成释放NO的聚葡糖胺。有利地，本文中所公开的聚葡糖胺是水溶性的。

壳聚糖是线性多糖，其包含无规分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(去乙酰化单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)。其为聚葡糖胺。壳聚糖衍生自甲壳素，一种在贝类(例如虾、龙虾、螃蟹)的外骨骼中发现或来自真菌来源的多糖。其具有以下结构：

壳聚糖是可生物降解的并且是生物相容的。高分子量壳聚糖具有有限的溶解度并且在酸性条件下更易溶解。分子量高于约20,000g/mol的壳聚糖多糖在生理条件下呈现出有限的水溶性。另外，高分子量壳聚糖可能呈现出有限的NO储存(约0.2μmol/mg)，这可能是由于多糖在NO供体形成所必需的碱性溶液中的溶解性差。Valmikinathan,C.M.；Mukhatyar,V.J.；Jain,A.；Karumbaiah,L.；Dasari,M.；Bellamkonda,R.V.《用于神经组织工程的基于光可交联壳聚糖的水凝胶(Photocrosslinkable chitosan based hydrogelsfor neural tissue engineering.)》《软物质(Soft Matter)》2012,8,1964-1976；Zhang,J.L.；Xia,W.S.；Liu,P.；Cheng,Q.Y.；Tahirou,T.；Gu,W.X.；Li,B.《壳聚糖改性和医药学/生物医学应用(Chitosan Modification and Pharmaceutical/BiomedicalApplications.)》《海洋药物(Mar.Drugs)》2010,8,1962-1987；Wan,A.；Gao,Q.；Li,H.L.《分子量和乙酰化程度对从壳聚糖-一氧化氮加合物中释放一氧化氮的影响(Effects ofmolecular weight and degree of acetylation on the release of nitric oxidefrom chitosan-nitric oxide adducts.)》《应用聚合物科学杂志(J.Appl.Polym.)》Sci.2010,117,2183-2188。为了合成具有改善的NO储存的N-二醇二氮烯鎓官能化的壳聚糖衍生物，我们通过在过氧化氢中降解壳聚糖多糖来制备水溶性壳聚糖寡糖。本文所述的壳聚糖寡糖的益处是相对低分子量为1000至20,000g/mol，特别是约10,000g/mol或更低；或约8000g/mol或更低；或约5000g/mol或更低；或约2,500g/mol或更低，以及其容易渗透生物膜的能力。Maghami,G.G.；Roberts,G.A.F.《针对壳聚糖的粘弹性常量的评估(Evaluationof the viscometric constants for chitosan.)》《大分子化学(Makromol.Chem.)》1988,189,195-200；Porporatto,C.；Bianco,I.D.；Riera,C.M.；Correa,S.G.,《壳聚糖在静置和发炎性巨噬细胞中诱导不同L-精氨酸代谢路径(Chitosan induces different L-arginine metabolic pathways in resting and inflammatory macrophages.)》《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophy.Res.Comm.)》2003,304,266-272。本文所述的壳聚糖寡糖具有高达约8.7μmol/mg的更大NO储存，并且在中性和碱性条件下也是可溶的。

壳多糖主链上的伯氨基是用于制备本文中所公开的释放NO的寡糖的化学手柄(chemical handle)。如以下方案中所示，仲氨基由伯氨基制备。

可用于形成仲氨基的一种例示性药剂是氮丙啶，例如2-甲基氮丙啶。除了现在已知的或所属领域已知的其它合成方案之外，还可以使用硫杂环丙烷(thiirane)和其类似物。

如本文所述，聚葡糖胺包含至少一个式I的结构单元。在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄在存在时各自独立地选自由氢和C_1-5烷基组成的群组。当R₁、R₂、R₃和R₄中的一个或多个是C_1-5烷基时，其可以选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄在存在时是氢或甲基。在一些实施方案中，R₁、R₂、R₃和R₄在存在时是氢。

在一些实施方案中，在所有情况下都是单键。

在一些实施方案中，W是-(Q-A)_p-B并且Q是-(CR_cR_d)_v-；其中R_c和R_d在每种情况下独立地为氢或C_1-5烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基、异丁基和戊基。在一些实施方案中，R_c和R_d在每种情况下独立地为氢、甲基或乙基。在一些实施方案中，v为1或2。

p的有用值包括1到100的任何整数。在一些实施方案中，p是1到50的整数。在一些实施方案中，p是1到25的整数。在一些实施方案中，p是1到10的整数，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。

在一些实施方案中，W是-Q-A-B。在一些实施方案中，W是-C_1-20烷基-A-B。C_1-20烷基可以指含有1到20个碳原子的直链或支链烃。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基和其类似基团。在一些实施方案中，C_1-20烷基可包括重复烷基单元，例如但不限于-(CH₂CH₂)_1-10-、-(CH(CH₃)CH₂)_1-9-或-(CH₂CH(CH₃))_1-9-。

在一些实施方案中，L是N或S。在G出现的每种情况下，其独立地是氢或一氧化氮供体。在一些实施方案中，G是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少30％的G是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少50％的G是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少90％的G是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少95％的G是一氧化氮供体。

在一些实施方案中，X是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少30％的X是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少50％的X是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少90％的X是一氧化氮供体。在一些实施方案中，存在于聚葡糖胺上的至少95％的X是一氧化氮供体。

在一些实施方案中，B为氢或-Y-Z，其中Y为间隔基，并且Z为单体或聚合物或末端基团。在一些实施方案中，B不存在，例如当L是O或S时。如本文所用，末端基团是聚合物或单体末端的任何封端基团。这些基团在所属领域中是已知的。在一些实施方案中，当B是末端基团时，其为氢、羟基或C_1-5烷基。

在一些实施方案中，B是如所述的C_1-20烷基。在一些实施方案中，B为C_1-20烷基。

在一些实施方案中，Z是所属领域已知的单体或聚合物，尤其是用于活性医药成分的那些。在一些实施方案中，Z为如所述的C_1-20烷基。在一些实施方案中，Z具有以下结构之一：

其中j在每种情况下是1到100的整数。

在一些实施方案中，Y是所属领域已知的间隔基或连接基团，尤其是用于活性医药成分的那些。在一些实施方案中，Y是C_1-6烷基或具有以下结构之一：

其中R_p、R_q、R_s和R_t在每种情况下独立地为氢或羟基；并且k是1到20的整数。

使用本文中所公开的策略，可以如本文所述改性存在于聚葡糖胺上的任何仲氨基以形成释放NO的聚葡糖胺。直接连接到主链糖部分上的的仲氨基或糖主链部分上侧接的仲氨基可以用释放NO的部分官能化。如本文在合成途径中完全公开，将伯胺改性为仲胺。氮丙啶、硫杂环丙烷和其类似物可以促进这种改性。

有用的释放NO的部分包括所属领域已知的任何NO释放基团。特别有用的是NO释放基团的残基，即NO供体，其与聚葡糖胺上的N共价结合。NO供体与聚葡糖胺上的与其结合的原子一起形成选自由二醇二氮烯鎓、-NO组成的群组的部分作为亚硝基硫醇基，例如亚硝胺、羟基亚硝胺、羟基胺、羟基脲和其组合。在一些实施方案中，释放NO的部分是二醇二氮烯鎓。这些基团可以盐的形式存在。

在一些实施方案中，NO供体是N-二醇二氮烯鎓(亦即，1-氨基取代的二氮-1-鎓-1,2-二醇)，N-二醇二氮烯鎓作为NO供体由于其在生物条件下自发产生NO的能力而特别有吸引力。参见Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.,《化学评论》,102,1135-1154(2002)；和Napoli,C.和Lanarro,L.J.,《药理学和毒理学年鉴(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.)》,43,97-123(2003)。已经使用一系列亲核残基合成几种N-二醇二氮烯鎓化合物，所述亲核残基涵盖伯胺和仲胺、多胺和仲氨基酸，参见Hrabie,J.A.,和Keefer L.K.,《化学评论》,102,1135-1154(2002)。在N-二醇二氮烯鎓的形成中，一当量的胺在高压下与两当量的一氧化氮反应。碱(例如，醇盐如甲醇盐)从胺氮中去除质子以形成阴离子，稳定的[N(O)NO]基团。在环境条件下稳定的同时，N-二醇二氮烯鎓在水性介质中自发分解以产生NO，其速率取决于pH、温度和/或胺部分的结构。举例来说，已发展N-二醇二氮烯鎓改性的脯氨酸(PROLI/NO)、2-(二甲基氨基)-乙基腐胺(DMAEP/NO)、N,N-二甲基己二胺(DMHD/NO)和二亚乙基三胺(DETA/NO)作为在pH 7.4和37℃下具有2秒到20小时的范围内的不同NO释放半衰期的小分子NO供体。参见Hrabie,J.A.,和Keefer,L.K.,《化学评论》,102,1135-1154(2002)；和Keefer,L.K.,《药理学和毒理学年鉴》43,585-607(2003)。

在强碱和气态一氧化氮存在下，聚葡糖胺的仲胺官能团以高产率转化为一氧化氮供体。溶剂系统可以影响聚葡糖胺与NO的带电。

术语“氨基”和“胺”是指例如NR₃、NH₃、NHR₂和NH₂R的含氮基团，其中R可以如本文其它地方所描述的那样。因此，如本文所用，“氨基”可以指伯胺、仲胺或叔胺。在一些实施方案中，氨基中的一个R可以是二醇二氮烯鎓(即，NONO)。

术语“阳离子胺”和“季胺”是指具有额外(即，第四)基团，例如氢或与氮键合的烷基的氨基。因此，阳离子胺和季胺带有正电荷。

术语“烷基”表示含有1-24个碳原子(例如1-12个碳原子)的直链或支链烃链。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和其类似基团。

除非链长限于此，与氧原子键合，否则术语“烷氧基”在本文中用于意味如上文所定义的直链或支链烷基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和其类似基团。在一些实施方案中，烷氧基链的长度为1到5个碳原子或长度为1-3个碳原子。

对于覆盖带电物种的主题，带电物种可以具有反离子。反离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，带电物种在其结构中可具有超过一个带电原子。在多个带电原子是带电物种的一部分的情况下，所述盐可具有多个反离子。因此，带电物种可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个反离子。无机反离子的非限制性实例是Na离子、K离子、Cs离子、Mg离子、Ca离子和其类似离子。

在所有实施方案中，取代基和/或变量的组合仅在这样的组合产生符合每个原子的已知价数的化合物时是允许的。

根据本发明的一些实施方案中是向个体递送一氧化氮的方法，所述方法包含向个体施用本发明的释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)。

在一些实施方案中，提供治疗疾病状态的方法，所述方法包含向有需要的个体施用有效量的本发明的释放NO的生物聚合物。如本文所用，术语“疾病状态”是指用生理过程干扰的任何异常情况。本文列出非限制性疾病状态，并且同时可以在个体中存在超过一种疾病状态(即，多种疾病状态)。在一些实施方案中，多种疾病状态的治疗可以伴随的方式发生，使得同时治疗多种疾病状态。举例来说，疾病状态包括但不限于癌症、心血管疾病、微生物感染；由血液暴露于医疗器械引起的血小板聚集和血小板粘附；细胞增殖异常导致的病理病况；移植排斥、自身免疫性疾病、炎症、血管疾病；疤痕组织；伤口收缩、再狭窄、疼痛、发烧、胃肠道疾病、呼吸疾病、性功能障碍、性传播疾病和其组合。

如本文所用的术语“微生物感染”是指细菌、真菌、病毒和/或酵母菌感染。

如本文所用，术语“呼吸病症”是指与呼吸或呼吸系统有关的任何病况或疾病，并且包括但不限于气道炎症、哮喘、肺气肿、支气管炎、COPD、鼻窦炎、鼻炎、咳嗽、支气管痉挛、气流阻塞、运动引起的支气管痉挛、病情恶化、支气管收缩、呼吸抑制、反应性气道功能障碍综合征(RADS)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、刺激引起的哮喘、职业性哮喘、感觉高反应性、多种化学敏感性以及囊性纤维化。

在一些实施方案中，疾病状态是囊性纤维化。在一些实施方案中，疾病状态是微生物感染。在一些实施方案中，疾病状态是囊性纤维化和微生物感染。

根据本发明的一些实施方案，提供一种医药配制物，其包含：本发明的释放NO的生物聚合物和医药学上可接受的载剂。

如本文所用，“医药学上可接受的”意指不是生物学上或其它方面不期望的材料，即，所述材料可以与本主题的组合物一起向个体施用，而不会引起显著的有害生物学效应或与其所含组合物的任何其它组分以有害的方式相互作用。自然地选择所述材料以使活性成分的任何降解降到最低并且使个体中的任何不良副作用降到最低，如所属领域的技术人员所熟知(参见，例如，雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Science)；第20版.2005)。用于本发明的组合物的例示性医药学上可接受的赋形剂包括但不限于无菌无热原水和无菌无热原生理盐水溶液。

本发明的组合物可包含本发明的释放NO的的生物聚合物和医药学上可接受的载剂。合适的组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素和使配制物与预期接受者的体液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。

本发明所公开的方法中使用的组合物可以采取例如油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，其用于在使用前用合适的媒剂(例如无菌无热原水)复原。

所述组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻或冷冻干燥(冻干)情况下储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体载剂。

对于口服施用，所述组合物可以采取例如通过常规技术用医药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，赋形剂例如粘合剂(例如，预胶凝化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过所属领域已知的方法包衣。举例来说，治疗剂可以与氢氯噻嗪组合配制，并且作为pH稳定的核心，其具有肠溶或延迟释放包衣，包衣保护治疗剂直到其到达目标器官。

用于经口施用的液体制剂可呈例如溶液、糖浆或悬浮液形式，或其可以干燥产物形式呈现，在使用之前用水或其它合适的媒剂复原。这类液体制剂可以通过常规技术用医药学上可接受的添加剂制备，例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒剂(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述制剂也可以视需要适当地含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于口服施用的制剂可以适当配制以提供活性化合物的控制释放。对于经颊施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。

所述化合物也可以配制成用于植入或注射的制剂。因此，例如，化合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳液)和/或离子交换树脂和/或作为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)配制。化合物还可以配制成直肠组合物(例如，含有常规栓剂基质(例如可可脂或其它甘油酯)的栓剂或保留灌肠剂)、乳膏或洗剂或透皮贴剂。

还提供医药配制物，其适于通过吸入作为气雾剂施用。在一些实施方案中，本文所述的释放NO的生物聚合物以溶液和/或气雾剂的形式配制。这些制剂包含本文所述的释放NO的生物聚合物的溶液或悬浮液。可将期望配制物置于小室中并且雾化。雾化可以通过压缩空气或通过超声能量来完成，以形成包含释放NO的生物聚合物的多个液滴或固体颗粒。举例来说，本发明所公开的释放NO的生物聚合物可以通过吸入施用以治疗与囊性纤维化相关的细菌感染。囊性纤维化相关的细菌感染包括但不限于寡养单胞菌(stenotrophomonis)、胞内鸟型分枝杆菌(mybacterium avium intracellulaire)和脓肿分枝杆菌(m.abcessus)、洋葱伯克霍尔德菌(burkhoderia cepacia)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)感染。

术语“有效量”在本文中用于指足以产生可测量的生物反应的本发明的释放NO的生物聚合物和/或组合物的量。可以改变本发明所公开主题的活性组合物中的活性成分的实际剂量含量，以便施用对实现特定个体和/或施加的期望反应有效的量的活性化合物。所选择的剂量含量将取决于多种因素，包括组合物的活性、配制物、施用途径、与其它药物或治疗的组合、所治疗病况的严重程度以及所治疗个体的身体情况和既往病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在没有剂量限制性毒性的情况下将剂量递增到最低有效量。所属药品领域的普通技术人员已知对有效剂量的确定和调整以及对何时和如何进行这种调整的评估。

对于施用如本文中所公开的组合物，可以使用用于将小鼠剂量转化为人类剂量的转化因子进行基于施用于鼠类动物模型的剂量外推人类剂量的常规方法：每千克人类剂量＝每千克小鼠剂量×12。(Freireich等人,《癌症化疗报告(Cancer Chemother Rep.)》50,219-244(1966))。药物剂量也可以毫克/平方米体表面积给出，因为这一方法而不是体重实现与某些代谢和排泄功能的良好相关性。此外，体表面积可用作成人和儿童以及不同动物物种中药物剂量的共同标准。(Freireich等人,《癌症化疗报告》50,219-244(1966))。简而言之，在任何给定物种中表示mg/kg剂量作为等效mg/sq m剂量，将所述剂量乘以适当的km因子。在成年人中，100mg/kg相当于100mg/kg×37kg/sq m＝3700mg/m²。

对于关于配制物和剂量的额外指导，参见美国专利第5,326,902号；第5,234,933号；PCT国际公开案第WO 93/25521号；Berkow等人,《医疗信息的墨克手册(The MerckManual of Medical Information)》,Home编,Merck Research Laboratories:WhitehouseStation,N.J.(1997)；Goodman等人,《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics)》,第9版.《麦格劳-希尔健康状况专业分裂(McGraw-Hill Health Professions Division)》:New York(1996)；Ebadi,《临床药理学的CRC桌子参考(CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology)》,CRCPress,Boca Raton,Fla.(1998)；Katzunq,《基本和临床药理学(Basic&ClinicalPharmacology)》,第8版.《兰格医学书/麦格劳-希尔医学出版划分(Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division)》:New York(2001)；Remington等人,《雷明顿氏医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第15版.Mack Pub.Co.:Easton,Pa.(1975)；和Speight等人,《Avery药物治疗：在疾病管理中药物的特性、选择、治疗用途和经济价值的指南(Avery's Drug Treatment:A Guide to the Properties,Choice,Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management)》,第4版.Adis International:Auckland/Philadelphia(1997)；Dutch等人,《毒理学快报(Toxicol.Leu.)》,100-101,255-263(1998)。

用于向个体施用本发明公开主题的组合物的合适方法包括但不限于全身施用、肠胃外施用(包括血管内、肌肉内、动脉内施用)、口服递送、经颊递送、皮下施用、吸入、气管内安装、手术植入、透皮递送、局部注射和高速注射/轰击。在适用的情况下，连续输注可以增强目标位点处的药物堆积(参见例如美国专利第6,180,082号)。

根据本发明所公开的主题的方法使用的具体药物施用方式取决于各种因素，包括但不限于所用的药剂和/或载剂、待治疗病况的严重程度以及代谢的机制或在施用后活性剂的去除。

在一些实施方案中，一种或多种额外治疗剂可以与释放NO的生物聚合物组合使用。这类额外药剂可以是包含释放NO的生物聚合物的配制物的一部分，或者在作为包括释放NO的生物聚合物的配制物之前、之后或同时(并行)作为单独的配制物给药。这类额外治疗剂特别包括抗癌治疗剂、抗微生物剂、止痛剂、抗炎剂、血管扩张剂和免疫抑制剂，以及可以增强被治疗的疾病或病况的缓解的任何其它已知治疗剂。“并行地”意味着同时或足够接近以产生组合效果(即，并行地可以是同时地，或者其可以是在彼此之前或之后的短时间段内发生的两个或更多个事件)。在一些实施方案中，“并行地”施用两种或更多种化合物意指两种化合物在时间上足够紧密地施用，使得一种化合物的存在改变另一种的生物学效应。两种化合物可以相同或不同的配制物或顺序施用。并行施用可以通过在施用之前混合化合物，或通过以两种不同的配制物施用化合物来进行，例如，在相同的时间点但在不同的解剖部位或使用不同的施用途径。

与释放NO的生物聚合物组合使用的额外治疗剂的选择将取决于各种因素，包括但不限于疾病的类型、个体的年龄和一般健康状况、疾病恶化的侵略性以及个体耐受包含所述组合的药剂的能力。

多种化学化合物，也描述为“抗肿瘤”剂或“化学治疗剂”可以与本发明所公开的用于治疗癌症的释放NO的生物聚合物组合使用。此类化学治疗化合物包括但不限于烷基化剂、DNA嵌入剂、蛋白质合成抑制剂、DNA或RNA合成抑制剂、DNA碱基类似物、拓扑异构酶抑制剂、抗血管生成剂和端粒酶抑制剂或端粒DNA结合化合物。举例来说，合适的烷基化剂包括烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如苯佐替派(benzodizepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，例如六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(iphosphamide)、双氯乙基甲胺、双氯乙基甲胺氧化物盐酸盐、美法仑(melphalan)、novembichine、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)。曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)。

用于治疗癌症的抗生素包括放线菌素、道诺霉素(daunorubicin)、小红莓(doxorubicin)、艾达霉素(idarubicin)、硫酸博莱霉素(bleomycin sulfate)、丝裂霉素(mytomycin)、普卡霉素(plicamycin)和链脲菌素(streptozocin)。化学治疗抗代谢物包括巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、阿糖胞苷(cytarabine)、喷司他汀(pentostatin)、甲胺喋呤(methotrexate)和硫唑嘌呤(azathioprine)、阿昔洛韦(acyclovir)、腺嘌呤β-1-D-阿拉伯糖苷、氨甲蝶呤(amethopterin)、氨基喋呤(aminopterin)、2-氨基嘌呤、阿非迪霉素(aphidicolin)、8-氮鸟嘌呤、氮杂丝氨酸(azaserine)、6-氮尿嘧啶、2′-叠氮基-2′-脱氧核苷、5-溴脱氧胞苷、胞嘧啶β-1-D-阿拉伯糖苷、重氮氧基正亮氨酸、双脱氧核苷、5-氟脱氧胞苷、5-氟脱氧尿苷和羟基脲。

化学治疗蛋白质合成抑制剂包括相思子毒素(abrin)、金精三羧酸(aurintricarboxylic acid)、氯霉素(chloramphenicol)、大肠杆菌素(colicin)E3、环己酰亚胺(cycloheximide)、白喉毒素(diphtheria toxin)、伊短菌素(edeine)A、吐根素(emetine)、红霉素(erythromycin)、乙硫氨酸(ethionine)、氟化物、5-氟色氨酸、梭链孢酸(fusidic acid)、亚甲基二膦酸鸟苷酰酯和亚氨二磷酸鸟苷酰酯、卡那霉素(kanamycin)、春日霉素(kasugamycin)、黄色霉素(kirromycin)和O-甲基苏氨酸。额外蛋白质合成抑制剂包括莫迪素(modeccin)、新霉素(neomycin)、正缬氨酸(norvaline)、密旋霉素(pactamycin)、巴龙霉素(paromomycine)、嘌呤霉素(puromycin)、蓖麻毒素(ricin)、志贺样毒素(shiga toxin)、焦土霉素(showdomycin)、司帕霉素(sparsomycin)、大观霉素(spectinomycin)、链霉素(streptomycin)、四环素(tetracycline)、硫链丝菌(thiostrepton)和甲氧苄啶(trimethoprim)。DNA合成的抑制剂，包括烷基化剂，例如硫酸二甲酯、丝裂霉素C、氮和硫芥；嵌入剂，例如吖啶染料、放线菌素、阿霉素(adriamycin)、蒽、安息香比林(benzopyrene)、溴化乙锭、二碘化丙啶交织；以及药剂，例如偏端霉素(distamycin)和纺锤菌素(netropsin)可用作本发明所公开的癌症治疗的一部分。拓扑异构酶抑制剂，例如库马霉素(coumermycin)、萘啶酸(nalidixic acid)、新生霉素(novobiocin)和欧索林酸(oxolinic acid)；细胞分裂抑制剂，包括秋水仙胺(colcemide)、秋水仙碱(colchicine)、长春碱(vinblastine)和长春新碱(vincristine)；和RNA合成抑制剂，包括放线菌素D、a-鹅膏蕈碱(amanitine)和其它真菌毒伞毒素(amatoxins)、虫草素(cordycepin)(3′-脱氧腺苷)、二氯呋喃核糖基苯并咪唑、利福平(rifampicine)、曲线链菌素(streptovaricin)和利链菌素(streptolydigin)也可与释放NO的生物聚合物组合以提供合适的癌症治疗。

因此，可以与本发明描述的释放NO的生物聚合物组合使用的当前化学治疗剂包括阿霉素(adrimycin)、5-氟尿嘧啶(5FU)、依托泊苷(etoposide)、喜树碱(camptothecin)、放线菌素-D、丝裂霉素、顺铂(cisplatin)、过氧化氢、卡铂(carboplatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、双氯乙基甲胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、瘤克宁锭(chlorambucil)、白消安、亚硝基脲、放线菌素、柔红霉素、小红莓、博莱霉素、普卡霉素(pilcamycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、transplatimun、长春碱和甲胺喋呤和其类似物。

如本文所用，术语“抗微生物剂”是指杀死、抑制细菌、真菌、酵母或病毒生长或阻止细菌、真菌、酵母或病毒生长的任何药剂。可以并入本发明所公开的释放NO的生物聚合物中以帮助治疗或预防微生物感染的合适的抗微生物剂包括但不限于抗生素，例如万古霉素、博来霉素、喷司他汀、米托蒽醌、丝裂霉素、放线菌素、普卡霉素和阿米卡星(amikacin)。其它抗微生物剂包括抗菌剂，如2-对磺酰基苯胺基乙醇、4,4'-亚磺酰基二苯胺、4-磺酰胺基水杨酸、醋地砜(acediasulfone)、乙酰砜、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、阿帕西林、阿哌环素(apicycline)、阿普拉霉素、阿贝卡星、阿扑西林(aspoxicillin)、叠氮氯霉素(azidamfenicol)、阿奇霉素、氨曲南、杆菌肽、巴姆霉素、比阿培南、布罗霉素、丁酰苷菌素(butirosin)、卷曲霉素、羧苄青霉素、碳霉素、卡芦莫南(carumonam)、头孢羟氨苄、头孢羟唑(cefamandole)、头孢曲嗪(cefatrizine)、头孢拉宗(cefbuperazone)、头孢克定(cefclidin)、头孢地尼、头孢地嗪、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、cefininox、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替坦、头孢替安、头孢唑兰、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢丙烯、头孢沙定(cefroxadine)、头孢他啶、头孢特仑、头孢布烯、头孢三嗪、头孢唑喃、头孢氨苄、头孢、头孢菌素C、头孢拉定、氯霉素、金霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林沙星、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯米可林、粘菌素、环青霉素、氨苯砜、去甲环素、全膜壳素、达苄霉素、双氢链霉素、地红霉素、多西环素、依诺沙星、恩维霉素、epichlin、红霉素、氟氧头孢、阿司米星、庆大霉素、葡胺苯砜、苯丙砜、短杆菌肽S、短杆菌肽、格列帕沙星、愈创木霉素、海他西林、亚胺培南、异帕米星、交沙霉素、卡那霉素、亮霉素、林可霉素、洛美沙星、卢森霉素、淋巴环素、美乐霉素、美罗培南、美罗培南、美环素、微胶素、米地霉素、莫莫莫莫克林、莫匹罗星、纳替沙星、纳坦霉素、新霉素、奈替米星、诺氟沙星、竹桃霉素、土霉素、对磺胺基苄胺、帕尼培南、巴西霉素、帕米沙星、青霉素N、匹哌环素、吡哌酸、多粘菌素、伯霉素、喹辛西林、核糖霉素、利福胺、利福平、利福霉素SV、利福喷汀、利福昔明、瑞斯托菌素、利培南、六合霉素、劳力特霉素、罗红霉素、罗红霉素、沙拉唑磺胺嘧啶、三环素、西索米星、司帕沙星、大观霉素、螺旋霉素、链霉素、疏枝霉素、磺胺黄曲霉素、磺胺甲霜霉素、磺胺苯丙酸、磺胺苯丙酸、磺胺苯丙酸、磺胺苯丙酸、替考拉宁、替马沙星、替莫西林、四环素、四氢氧苄啶、噻苯尼考、噻唑砜、硫链菌素、替卡西林、提格莫南、妥布霉素、妥舒沙星、甲氧苄啶、红霉素、曲伐沙星、放线菌素和万古霉素。抗微生物剂还可包括抗真菌剂，例如两性霉素B、重氮丝氨酸、杀蝇素、氯苄青霉素、抑制素、菲律宾、真菌素、美帕曲霉素、制霉菌素、寡霉素、表霉素A、结核菌素、咪唑、三唑和灰黄霉素。

在一些实施方案中，释放NO的生物聚合物可以并入聚合物膜中。这种并入可以通过将释放NO的生物聚合物物理嵌入聚合物表面，通过将释放NO的生物聚合物静电结合到聚合物表面上，或通过将释放NO的生物聚合物共价连接到聚合物表面上的反应性基团上。或者，释放NO的生物聚合物可以混合到液体聚合物前体的溶液中，当聚合物固化时，其被包埋在聚合物基质中。可聚合基团也可用于进一步官能化释放NO的生物聚合物，因此，释放NO的生物聚合物可在聚合过程中共聚合成聚合物。可以并入释放NO的生物聚合物的合适聚合物包括聚烯烃，例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯和聚偏二乙烯，以及聚酯、聚醚、聚氨酯和其类似物。特别地，聚氨酯可包括医学上分段的聚氨酯。医学上分段的聚氨酯还可以包括一个或多个膨胀剂部分，例如亚烷基链，其为聚合物增加额外的长度或重量。这类聚氨酯通常也是无毒的。医学上分段的聚氨酯的一个实例是

含有释放NO的生物聚合物的聚合物膜可用于涂布各种制品，特别是手术工具、生物传感器和医用植入物，以防止血小板粘附、防止细菌感染、起到血管扩张剂的作用。这些制品可用于血管医疗装置、泌尿科医疗装置、胆道医疗装置、胃肠道医疗装置、适于放置在手术部位的医疗装置、以及适于放置在皮肤伤口或开口上的医疗装置。因此，聚合物可用于涂布动脉支架、导丝、导管、套管针、骨锚、骨螺钉、保护性镀层、髋关节和关节置换物、电引线、生物传感器、探针、缝合线、手术单、伤口敷料和绷带。

在一些实施方案中，被涂布的装置可具有金属表面，例如不锈钢、镍、钛、铝、铜、金、银、铂和其组合。在一些实施方案中，含有释放NO的生物聚合物的膜或聚合物可用于涂布非金属表面，例如玻璃或纤维(例如布或纸)。

另外，含有释放NO的生物聚合物的聚合物可用于形成装置本身。举例来说，聚合物可以制成用于血液或组织的储存袋或作为伤口敷料。

可以与释放NO的生物聚合物接触以防止或破坏生物膜的表面包括选自由医疗装置、管道配件、冷凝盘管、光学表面、船体和飞机组成的群组的那些。其它非限制性实例包括台面、窗户、电器、硬地板、地毯、浴盆、淋浴、镜子、厕所、坐浴盆、浴室配件、水槽、冰箱、微波炉、小厨房用具、桌子、椅子、橱柜、抽屉、沙发、双人沙发、长凳、床、凳子、衣橱、箱子、梳妆台、展示柜、钟表、饮食柜台、灯罩、百叶窗、娱乐中心、扶手、灯、栏杆、图书馆、橱柜、书桌、门、架子、沙发、推车、钢琴、雕像和其它艺术品、架子、风扇、灯具、台球桌、乒乓球桌、足球桌、牌桌、工具(例如手动和/或手持工具、电动工具、气动工具等)、电话、收音机、电视、立体声设备、CD和DVD播放器、模拟和数字声音设备、掌上电脑、笔记本电脑、台式和塔式电脑、电脑显示器、MP3播放器、记忆存储设备、照相机、便携式摄像机、车辆表面(例如挡风玻璃；轮胎；金属、玻璃纤维、复合材料和/或塑料外表面；织物和/或乙烯基树脂外表面；织物、乙烯基树脂和/或皮革内表面；金属、塑料、木材和/或复合材料内表面、玻璃内表面等)、自行车、雪地车、摩托车、越野车、庭院设备、农场设备、洗涤设备(例如电动洗衣机等)、涂装设备(例如电动和气动涂装设备等)、医疗和/或牙科设备、船用设备(例如帆船、动力艇、筏、帆板、独木舟、划艇等)、玩具、书写工具、手表、加框架图片或绘制物、书籍和/或类似物。希望使一种或多种类型的液体从表面流出、不被吸收到表面中和/或不使表面染色的任何表面都可以是基材。举例来说，所述表面可为暴露于环境条件的表面。在其它实施方案中，表面可以成为微生物粘附的位置，例如与身体组织或流体接触的医疗装置的表面。

适于通过血管或其它体腔移动的例如导管的医疗装置通常设置有低摩擦外表面。如果医疗装置的表面不是低摩擦表面，则将装置插入体腔和从体腔移除装置变得更加困难，并且可能发生身体组织的损伤或炎症。低摩擦表面还有益于减少由于某些长期装置(例如，长期导管)与周围组织之间的移动而可能产生的不适和损伤，例如，由于患者活动。医疗装置包括各种可植入和可插入的医疗装置(在本文中也称为“内部医疗装置”)。这类医疗装置的实例包括涉及输送或移除流体的装置(例如，含有药物的流体、加压流体、例如膨胀流体、体液、造影剂、热或冷介质等)以及用于插入和/或通过各种体腔的装置，包括心血管系统的管腔，例如心脏、动脉(例如冠状动脉、股动脉、主动脉、髂动脉、颈动脉和椎-基底动脉)和静脉、泌尿生殖系统的管腔，例如尿道(包括前列腺尿道)、膀胱、输尿管、阴道、子宫、精索和输卵管、鼻泪管、咽鼓管、呼吸道的管腔，如气管、支气管、鼻腔和鼻窦，胃肠道的管腔，例如食道、肠、十二指肠、小肠、大肠、直肠、胆管和胰管系统、淋巴系统的管腔、主要的体腔(腹膜、胸膜、心包)等等。内部医疗装置的非限制性具体实例包括血管装置，例如血管导管(例如球囊导管)，包括用于其的球囊和充气管、水解器导管、导丝、回拉护套、过滤器(例如腔静脉过滤器)、左心室辅助装置、全人工心脏、注射针、给药管、引流管、胃肠和结肠镜管、内窥镜装置、气管导管等气管内装置、泌尿道导尿管和输尿管骨架等用于泌尿道的装置以及用于神经区域的装置，例如导管和导线、套管针、骨锚、骨螺钉、保护性镀层、关节置换物、电导线、生物传感器、探针、缝合线、手术单、伤口敷料和绷带。根据本发明的许多装置具有一个或多个圆柱形的部分，包括实心和中空圆柱形状。

实心基材材料可包括有机材料(例如，含有50重量％或更多有机物质的材料)，例如聚合物材料；和无机材料(例如，含有50重量％或更多无机物质的材料)，例如金属材料(例如，金属和金属合金)和非金属材料(例如，包括碳、半导体、玻璃和陶瓷，其可包含各种金属和非金属氧化物、各种金属和非金属氮化物、各种金属和非金属金属碳化物、各种金属和非金属硼化物、各种金属和非金属磷酸盐以及各种金属和非金属硫化物等)。非金属无机材料的具体实例可以是含有以下的一种或多种的材料：金属氧化物，包括氧化铝和过渡金属氧化物(例如，钛、锆、铪、钽、钼、钨、铼和铱的氧化物)；硅；硅基陶瓷，例如含有氮化硅、碳化硅和氧化硅的硅基陶瓷(有时称为玻璃陶瓷)；磷酸钙陶瓷(如羟基磷灰石)；碳；和碳基陶瓷类材料，例如碳氮化物。

此外，释放NO的生物聚合物可以并入洗涤剂中，例如但不限于抗微生物皂。在一些实施方案中，嵌入皂条中的聚葡糖胺的NO释放可以通过在使用时与水接触和/或pH下降来触发。在一些实施方案中，当条的外表面被侵蚀或溶解时，条表面内的额外聚葡糖胺变得暴露以用于条的后续使用。释放NO的生物聚合物也可以悬浮在液体肥皂中。这类肥皂或洗涤剂可用于个人卫生或为纤维提供抗微生物处理。这类肥皂或洗涤剂也可用于处理家具表面或医院或其它医疗环境中可能暴露于微生物(例如细菌、真菌或病毒)的任何表面。

术语“生物相容性”在本文中是指当以一定量施用于患者时不诱导毒性或不需要的副作用的有机溶剂。

配制物包括其所有医药学上可接受的盐形式。这类盐的实例包括衍生自医药学上可接受的无机和有机酸和碱的盐。合适的酸式盐的实例包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、羟基萘酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。其它酸，例如草酸，虽然本身不是医药学上可接受的，但可用于制备可用作中间体的盐，以获得本发明的化合物和其医药学上可接受的酸加成盐。

衍生自适当碱的盐包括但不限于碱金属(例如钠、钾)、碱土金属(例如镁和钙)、铵和N-(烷基)₄ ⁺盐。

释放NO的生物聚合物(例如，释放NO的聚葡糖胺)也包括在其中的任何碱性含氮基团的具有季铵化的那些。

为简单起见，本文的讨论是在不提及立体异构的情况下提供的。所属领域的普通技术人员应了解，本文所述的生物聚合物可含有一个或多个不对称中心，并且因此以外消旋体和外消旋混合物、单一光学异构体、单独的非对映异构体和非对映异构体混合物形式存在。这些化合物的所有这类异构形式明确地包括在本发明中。

壳聚糖可具有有利的特性，包括粘膜粘附性(Grenha,A.,等人,《药物递送科学和技术杂志(Journal of Drug Delivery Science and Technology)》,20,33-43(2010)；Dash,M.,等人,《聚合物科学进展(Progress in Polymer Science)》,36,981-1014(2011))、生物可降解性(Grenha,A.,等人,《药物递送科学和技术的杂志》,20,33-43(2010)；Kean,T.,等人,《药物递送进展综述》,62,3-11(2010))和低细胞毒性(Grenha,A.,等人,《药物递送科学和技术杂志》,20,33-43(2010))。认为壳多糖带正电胺与带负电的粘蛋白唾液酸残余物之间的静电相互作用(Grenha,A.,等人,《药物递送科学和技术杂志》,20,33-43(2010)；Menchicchi,B.,等人,《生物大分子(Biomacromolecules)》,15,3550-3558(2014)；Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008))增强气道中的壳聚糖滞留，并且因此增加作用时间(Grenha,A.,等人,《药物递送科学和技术杂志》,20,33-43(2010)；Klinger-Strobel,M.,等人,《药物递送的专家观点(Expert Opinion on DrugDelivery)》,1-24(2015))。已报告壳聚糖有助于向肺递送释放抗生素的颗粒和改善释放抗生素的颗粒的功效(Manca,M.-L.,等人,《胶体和表面B：生物界面(Colloids and SurfacesB:Biointerfaces,62)》,220-231(2008)；Park,J.-H.,等人,《药剂学国际杂志(International Journal of Pharmaceutics)》,441,562-569(2013)；Jain,D.和Banerjee,R.,《生物医学材料研究部分B杂志：应用生物材料(Journal of BiomedicalMaterials Research Part B:Applied Biomaterials)》,86,105-112(2008)；Osman,R.,等人,《药剂学国际杂志》,449,44-58(2013)；Ungaro,F.,等人,《控制释放杂志(Journal ofControlled Release)》,157,149-159(2012))。然而，粘膜粘附可能会影响药物渗透到粘液中。Klinger-Strobel等人描述用聚乙二醇(PEG)改性壳聚糖的益处(Klinger-Strobel,M.,等人,《药物递送的专家观点》,1-24(2015))以有助于更好的药物作用于人类子宫颈阴道粘液(Suk,J.S.,等人,《纳米医学(Nanomedicine)》,6,365-375(2011)；Tang,B.C.,等人,《美国国家科学院院刊》,106,19268-19273(2009))、细菌生物膜(Forier,K.,等人,《纳米医学》,8,935-949(2013))和CF痰(Suk,J.S.,等人,《纳米医学》,6,365-375(2011)；Tang,B.C.,等人,P.N.A.S.,106,19268-19273(2009)；Forier,K.,等人,《纳米医学》,8,935-949(2013)；Suk,J.S.,等人,《生物材料(Biomaterials)》,30,2591-2597(2009))。

因为NO也是有效抗菌剂(Reighard,K.P.和Schoenfisch,M.H.《抗微生物剂和化学疗法(Antimicrobial Agents and Chemotherapy)》,59,6506-6513(2015)；Reighard,K.P.,等人,《生物污染(Biofouling)》,31,775-787(2015)；Lu,Y.,等人,《生物材料》,35,1716-1724(2014)；Carpenter,A.W.和Schoenfisch,M.H.《化学学会评论(ChemicalSociety Reviews)》,41,3742-3752(2012)；Seabra,A.B.,等人,《生物技术进展(Biotechnology Advances)》,33(6),1370-1379(2015)；Jones,M.L.,等人,《应用微生物学和生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)》,88,401-407(2010)；Deppisch,C.,等人,《感染(Infection)》44(4),513-520(2016))，所以本文所述的壳聚糖寡糖可具有释放NO的壳聚糖寡糖作为治疗CF的抗菌剂和粘液溶解剂的双重作用潜力。已报告在浮游和生物膜类培养物中释放NO的壳聚糖寡糖抗CF相关铜绿假单胞菌的杀菌作用(Reighard,K.P.,等人,《抗微生物剂和化学疗法(Antimicrobial Agents andChemotherapy)》,59,6506-6513(2015)；Reighard,K.P.,等人,《生物污染》,31,775-787(2015))。在某些实施方案中，一氧化氮的广泛范围抗菌作用使得本文所述的主题成为许多细菌已经产生抗性的传统抗生素的替代物。

在一些实施方案中，本发明所公开的释放一氧化氮(NO)的生物聚合物具有抗生素特性，并且还通过减小粘蛋白尺寸和破坏三维粘蛋白网络来降低CF痰的粘弹性。在其它实施方案中，本文中所公开的主题确定从粘膜粘附骨架释放NO以直接递送到粘液栓中的益处。在一些实施方案中，如本文所述的壳聚糖寡糖骨架的粘膜粘附特性可显著增强NO的效能。在实施方案中，本文中所公开的主题可以降低治疗作用所需的NO剂量，同时减少对其它NO介导的过程的任何潜在影响。

在实施方案中，释放一氧化二氮(NO)的壳聚糖寡糖用丙烯酸酯官能团改性。在实施方案中，骨架的粘膜粘附性质影响NO从人类支气管上皮细胞培养物和从患有囊性纤维化(CF)的患者收集的临床痰样品中降解粘蛋白的能力。琼脂糖凝胶电泳实验表明，在某些实施方案中，粘膜粘附的释放NO的壳聚糖寡糖降解纯化的粘蛋白和痰，而对照骨架(没有释放NO或粘膜粘附的配体)对粘蛋白结构没有影响。用粘膜粘附释放NO的壳聚糖寡糖的某些实施方案处理的痰的显微镜观察证实粘蛋白和DNA网络的降解。在实施方案中，在用粘膜粘附的释放NO的壳聚糖处理后，痰的粘度和弹性降低，证明释放NO的骨架作为粘液溶解剂的效用。

在实施方案中，本发明所公开的释放一氧化氮(NO)的聚葡糖胺可以是水溶性的和可调的。这些特性可能有助于本发明所公开的聚葡糖胺在治疗和疾病状态中的有效性，其中水溶性治疗剂是有利的，例如，有利于囊性纤维化的治疗。本发明所公开的官能化释放NO的聚葡糖胺可具有的已知NO释放颗粒的其它优点包括：1。通过将含仲胺的侧链接枝到壳聚糖寡糖上，得到不同的合成途径和化学组成；2。NO储存和NO释放动力学的可调性是一个优点。通过调节氮丙啶侧链上的仲胺数量，可以控制NO储存。在实施方案中，通过具有不同疏水性/亲水性的化合物对所得材料上的胺进行官能化使得能够控制释放NO的动力学。在其它实施方案中，本发明所公开的官能化聚葡糖胺产生较大的NO储存；和3.与颗粒相反，本文所述的官能化聚葡糖胺可以是水溶性的，有助于更广泛的应用，包括期望水溶解度的生物医学应用。先前公开的释放NO的壳多糖(US 6,451,337)不是水溶性的。在其它实施方案中，本发明所公开的水溶性官能化寡糖可以渗透和根除生物膜。

在以下非限制性实施例中更详细地解释本发明。

实施例

实施例1

在这项研究中，壳聚糖寡糖用官能团改性，所述官能团将控制粘膜粘附特性，同时保持相当的NO释放特征，以理解骨架粘膜粘附对NO的粘液溶解作用的影响。

试验

材料和方法

中等分子量壳聚糖(粘度200-800厘泊)、2-甲基氮丙啶、丙烯酸乙酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸磺丙酯钾盐、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、牛血清白蛋白(BSA)和II型胃猪粘蛋白(GPM)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。一氧化氮气体购自Praxair(Sanford,NC)。氩气(Ar)、NO校准(26.85ppm，余量N₂)和氮气(N₂)购自Airgas NationalWelders(Durham,NC)。甲醇钠购自Acros Organics(Geel,Belgium)。

三乙酸酯-EDTA(TAE)缓冲液(10x)购自Mediatech,Inc.(Manassas,VA)并且在使用前在蒸馏水中以1:10稀释。盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液(20x)购自Promega Corporation(Madison,WI)并且以1:5稀释，得到4x SSC缓冲液。达尔伯克氏(Dulbecco)磷酸盐缓冲盐水(DPBS，1x)购自Life Technologies(Carlsbad,CA)。奶粉(Drink'n Mix)购自Walmart(Durham,NC)。中性缓冲福尔马林(NBF，10体积％)购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。使用常用的实验室盐和试剂在室内制备磷酸盐缓冲液(10mM，pH 6.5)和磷酸盐缓冲盐水(10mM，pH 6.5)。

抗MUC5B抗体(H-300)购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX)。抗MUC5AC抗体(45M1)购自Abcam(Cambridge,MA)。二级抗体(IRDye 800CW驴抗小鼠IgG和IRDye 680RD驴抗兔IgG)购自LI-COR Biosciences(Lincoln,NE)。4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)购自{Life Technologies(Carlsbad,CA)。

使用Millipore Milli-Q UV Gradient A-10系统(Bedford,MA)纯化蒸馏水。所有常用的实验室盐和试剂购自赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific)(Pittsburgh,PA)。除非另外规定，否则所有材料都不经进一步纯化即使用。

含有粘液的培养物洗涤液从来自患有如先前描述的CF的患者的初级人类支气管上皮(HBE)细胞培养物中收集(Hill,D.B.和Button,B.,“确立呼吸道空气-液体界面培养物和其在研究粘蛋白产生、分泌和功能中的用途(Establishment of respiratory air-liquid interface cultures and their use in studying mucin production,secretion,and function.)”《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》,胡马纳出版社(Humana Press),第15章,第245-258页(2012))。简单来说，由过量手术组织(UNC-ChapelHill Tissue Core Facility)获得的初级细胞在空气-液体界面介质(UNC Chapel HillTissue Core Facility)中在0.5mm孔隙大小的Millicell细胞培养物插入物(Millipore,Bedford,MA)上生长最少6周，直到培养物产生纤毛和轮廊分明的纤周液体(PCL)和粘液层。在粘液堆积2天后，通过每1cm²培养物面积添加150μL PBS来收集洗涤液。随后，立即用壳聚糖寡糖处理这些洗涤液用于分析。

通过自发咳痰从CF患者中收集痰样品。在-20℃下将样品储存于无菌容器中直到使用。

2-甲基氮丙啶改性的壳聚糖寡糖的合成

聚合物壳聚糖被氧化降解成如先前所述的壳聚糖寡糖(Lu,Y.,等人,《生物材料》,35,1716-1724(2014))。将中等分子量的壳聚糖(2.5g)溶解在15重量％过氧化氢(50mL)中并且在85℃下搅拌1小时。通过过滤去除不溶性未降解的壳聚糖。通过在丙酮中沉淀收集水溶性寡糖，用乙醇充分洗涤，并且在真空中干燥。使用乌氏(Ubbelohde)粘度计在25℃下测量氯化钠(0.20M)和乙酸(0.10M)溶液中壳聚糖寡糖的粘度。分子量使用典型Mark-Houwink方程式(η＝1.81×10^-3M^0.93)计算为4.41±0.04kD(Maghami,G.G.和Roberts,G.A.,《高分子化学与物理(Die Makromolekulare Chemie)》,189,195-200(2000))。

然后用2-甲基氮丙啶改性水溶性壳聚糖寡糖(方案1)。将壳聚糖寡糖(0.50g)溶解在搅拌的水(10.00mL)中。然后向这个溶液中加入盐酸(12.1M，27.5μL)、水(250μL)和2-甲基氮丙啶(178μL，与未改性的壳聚糖寡糖上的伯胺的摩尔比为1:1)，同时在25℃下连续搅拌5天和在85℃下搅拌24小时。将所得2-甲基氮丙啶改性的壳聚糖寡糖(COS)在丙酮中沉淀，用甲醇洗涤以去除过量的2-甲基氮丙啶，并且在真空中干燥。

方案1描述用2-甲基氮丙啶的壳聚糖寡糖修饰并且随后用丙烯酸酯的官能化。

壳聚糖寡糖的丙烯酸酯改性

通过将丙烯酸酯迈克尔加成到氨基上来改变COS的粘膜粘附特性(方案1)。在水(6.00mL)、甲醇(14.00mL)、氢氧化铵(1.00mL)溶液中将丙烯酸乙酯(EA，2.08mL)和丙烯酸叔丁酯(TBuA，2.78mL)添加到COS(500mg)中。从反应溶剂中排除甲醇以加入丙烯酸磺丙酯(SPA)，因为SPA是水溶性的。更具体地，在水(20.00mL)和氢氧化铵(1.00mL)溶液中将SPA(4.43g)添加到COS(500mg)中。将10倍摩尔过量的丙烯酸酯(相对于伯胺)用于所有反应以使丙烯酸酯的添加最大化。在室温下搅拌72小时后，用丙酮沉淀丙烯酸酯改性的COS，通过离心收集，并且用甲醇洗涤以去除过量的试剂。用乙醇充分洗涤SPA产物。将所得EA、TBuA和SPA改性的COS(分别为COS-EA、COS-TBuA和COS-SPA)在真空中干燥过夜，并且在室温下储存。通过¹H NMR光谱中乙烯基质子的消失验证从产物中去除未反应的丙烯酸酯。丙烯酸酯改性的COS由¹H NMR(Bruker 400MHz DRX光谱仪)表征，以确定取代和产物纯度的程度。

代表性¹H NMR峰如下：

COS:1H NMR(D₂O,400MHz):δ-0.8-1.1(br,3H),1.9(s,3H),2.3-2.9(br,4H),3.3-4.0(br,5H),4.4(s,1H)。

COS-EA:1H NMR(D₂O,400MHz):δ-0.8-1.1(br,6H),1.9(s,3H),2.3-2.9(br,4H),3.3-4.0(br,5H),4.1(s,2H),4.4(s,1H)。

COS-TBuA:1H NMR(D₂O,400MHz):δ-0.8-1.1(br,12H),1.9(s,3H),2.3-2.9(br,4H),3.3-4.0(br,5H),4.4(s,1H)。

COS-SPA:1H NMR(D₂O,400MHz):δ-0.8-1.1(br,6H),1.9(s,3H),2.3-2.9(br,4H),3.3-4.0(br,5H),4.1(s,2H),4.4(s,1H)。

用于确定去乙酰化和取代程度的计算以及FT-IR表征数据在实施例12和图10A-D中提供。

释放NO的壳聚糖寡糖的合成

为了赋予NO储存和释放，N-二醇二氮烯鎓NO供体分别在COS和丙烯酸酯改性的COS的仲胺上形成(Lu,Y.,等人,《生物材料》,35,1716-1724(2014))。将改性的壳聚糖寡糖(15mg)溶解于配备有搅拌棒的1打兰小瓶中的水(300μL)、甲醇(700μL)和5.4M甲醇钠(25μL)的溶液中。将开口小瓶置于160mL Parr通用不锈钢压力容器中并且剧烈搅拌。通过用氩气(10秒，8巴)吹扫三次，然后进行三次更长的氩气吹扫(10分钟，8巴)，从反应容器中去除氧气。然后在室温下将容器用氢氧化钾纯化的NO气体(10巴)填充72小时。然后，重复氩气吹扫程序以去除未反应的NO。将N-二醇二氮烯鎓化合物改性的壳聚糖寡糖(COS-NO、COS-EA-NO、COS-TBuA-NO和COS-SPA-NO)在丙酮中沉淀，通过离心收集，得到黄色粉末，在真空中干燥，并且在-20℃下储存直到进一步研究。

NO释放的化学发光检测

使用Sievers 280i化学发光一氧化氮分析仪(Boulder,Colorado)来定量NO释放。在分析之前，用通过NO零过滤器(0ppm NO)的空气和26.8ppm NO标准气体(余量N₂)来校准仪器。将N-二醇二氮烯鎓改性的壳聚糖寡糖(1.0mg)在37℃下浸入30mL脱氧的PBS(pH 6.5)中，随后通过N₂气体以80mL/min的流速将释放的NO运载到检测器中。以200mL/min向样品烧瓶中供应额外的N₂流量以匹配仪器的收集速率。一旦NO浓度降到10ppb NO/mg COS-NO以下，那么终止分析。另外，使用Perkin Elmer Lambda 40UV/Vis光谱仪获得所有化合物在50mM氢氧化钠中的0.1mg/mL溶液的UV-Vis光谱。使用这种碱性溶液以避免在中性pH下立即开始的不期望的N-二醇二氮烯鎓NO供体降解。

粘蛋白的浊度滴定

将胃猪粘蛋白(960mg)在4℃下溶解于250mL无菌磷酸盐缓冲液(PB)中18小时。将粘蛋白悬浮液离心(1,500×g，4℃，0.5小时)以去除不溶性组分。在使用前将所得粘蛋白溶液在4℃下储存于无菌容器中长达1周。通过将236μL纯化的粘蛋白溶液与34μL壳聚糖寡糖溶液(无菌PB中的3.6-54.5mg/mL)在96孔板中组合来制备粘蛋白和丙烯酸酯改性的壳聚糖寡糖的溶液。将粘蛋白和壳聚糖溶液在37℃下轻轻摇晃(100rpm)培育1小时，然后使用Thermoscientific Multiskan EX盘读取器在540nm下读取吸光度。从COS-粘蛋白吸光度中减去壳聚糖寡糖(即没有粘蛋白)的吸光度后，获得校正的吸光度。

粘蛋白-壳聚糖寡糖聚集体的ξ电位

将胃猪粘蛋白(10.0mg)在4℃下溶解于10.00mL无菌PB中18小时。将粘蛋白悬浮液离心(1,500×g，4℃，0.5小时)以去除不溶性组分。在使用前将所得粘蛋白溶液在4℃下储存于无菌容器中长达1周。将改性的壳聚糖寡糖固体添加到粘蛋白溶液中，涡旋直到溶解，并且在37℃下培育1小时。在这一检定中使用较低浓度的粘蛋白和壳聚糖寡糖以防止用于ζ电位测量的电化学电池的腐蚀。使用配备有10mW HeNe激光器(633nm)的MalvernZetasizer Nano-ZS和角度为173°的NIBS检测器测定粘蛋白-壳聚糖聚集体的ζ电位(即表面电荷)。

凝胶电泳

将浓缩的壳聚糖寡糖(COS和COS-SPA)和释放NO的壳聚糖寡糖(COS-NO和COS-SPA-NO)或DTT(20μL)原料添加到HBE粘液(40μL)中，轻轻搅拌，并且在室温下轻轻摇动地培育2小时。由于CF痰含有蛋白水解酶，所以培育时间减少到1小时以减少样品的酶促降解。

琼脂糖粘蛋白凝胶电泳

处理后，如先前所述通过电泳分离样品(Ramsey,K.A.,等人,《目测实验杂志(Journal of Visualized Experiments)》,112,e54153(2016))。简言之，将样品(40μL)负载到具有1重量％SDS的1×TAE缓冲液中的0.8重量％琼脂糖凝胶上，用于在80V下电泳粘蛋白分离90分钟。随后用10mM DTT将凝胶还原20分钟。将粘蛋白通过真空(45mbar，1.5小时)在4×SSC缓冲液中转移到孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜上(Optitran BA-S 85膜，GEHealthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)。在阻断与奶粉(在DPBS中3重量％)的非特异性相互作用1小时后，通过暴露于针对MUC5AC和MUC5B(在3％牛奶中的0.1μg/mL)产生的稀释的一级抗体过夜(3℃)来检测粘蛋白。将膜用DPBS洗涤三次(10分钟)并且用二级抗体荧光标记(在3重量％奶粉中0.2μg/mL，1小时，25℃)。随后再次在DPBS中洗涤凝胶，然后使用LI-COR Odyssey CLx红外成像系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)进行分析。使用Image J(美国国立卫生研究院(National Institute of Health),Bethesda,MD)定量迁移距离。对于CF痰样品，将迁移距离标准化为PBS处理的样品以解释较大程度的异质性。

共聚焦显微镜

在负载到琼脂糖凝胶上之前，将暴露于COS、COS-NO、COS-SPA或COS-SPA-NO的CF痰样品(5μL)小心地涂抹在玻璃显微镜载玻片上，以防止粘蛋白和DNA网络的机械破坏。将样品用NBF(10体积％)固定，用DPBS洗涤，并且在室温下用BSA(在DPBS中3重量％)阻断1小时。通过免疫组织化学检测目测粘蛋白网络。首先，通过暴露于一级抗体溶液(分别为小鼠抗MUC5AC和兔抗MUC5B的0.4和0.2μg/mL)鉴别出MUC5AC和MUC5B。将载玻片用DPBS洗涤三次(10分钟)，然后在25℃下暴露于二级抗体(分别为1μg/mL Alexa 488和594抗兔和小鼠)和DAPI(5μg/mL)1小时以有助于定量测量。然后用DPBS洗涤载玻片(10分钟)并且用Fluorsave(Calbiochem)固定。使用20x物镜用Olympus FV 1000(Olympus,Hamilton,Bermuda)获得共聚焦图像。

平行板流变学

在单个时间点收集的来自一名CF患者的自发咳出的痰被用于流变学测量。将浓缩的COS-NO(27.8μL)的溶液添加到250μL等分试样的痰液中，以达到最终的COS-NO浓度为0、5、10和20mg/mL。将痰样品在室温下缓慢旋转1小时。在具有设定间隙厚度为50mm的20mm直径平行板的Bohlin Gemini流变仪(Malvern Instruments,Worcestershire,UK)上，在单一频率(1Hz)下在0.025-50Pa的应力范围内通过振幅扫描实验测量处理样品的流变学特性。在23℃下进行流变学测量以最小化样品脱水。弹性模量(G')和粘性模量(G”)是从如先前报告的线性方案测定(Seagrave,J.,等人,《呼吸研究(Respiratory Research)》2012,13,98)。对于经处理的痰样品的至少三个单独评估的等分试样，将所有值报告为平均值±平均值的标准误差(SEM)。

统计分析

除非另外指出，否则所有值均报告为三次或更多次合并实验的平均值±标准偏差。使用双尾斯图登氏t检验(two-tailed student's t-test)确定统计学显著性。

去乙酰化和取代度计算

去乙酰化程度的计算

根据改编自Ishii(Ishii,D.,等人,《绿色化学(Green Chemistry)》,16(4),1764-1767(2014))的以下方程式确定过氧化氢降解之后壳聚糖寡糖的去乙酰化程度的计算。

其中I_甲基表示来自乙酰化单元(2.3ppm)和I_H2-H6(3.5-4.4)的质子是在乙酰化和去乙酰化单元上发现的质子。降解后，壳聚糖寡糖被75％去乙酰化。

COS-EA伯胺的改性％的计算

其中I_OCH2CH3是表示丙烯酸乙酯改性的4.1ppm处的单峰，I_OCH(CHNH2)O是所有单体的主链上发现的质子(s，4.4ppm)，并且DD是去乙酰化程度(0.75)。这个计算改编自Sashiwa(Sashiwa,H.,等人,《碳水化合物研究(Carbohydrate Research)》,338(6),557-561(2003))。

COS-TBuA伯胺的改性％的计算

其中I_OCC3H9是指示丙烯酸叔丁酯改性的1.3ppm处的宽峰值，I_OCH(CHNH2)O是所有单体的主链上发现的质子，并且DD是去乙酰化程度(0.75)。这个计算改编自Sashiwa。

COS-SPA伯胺的改性％计算

其中I_{OCH2CH2CH2SO3}是指示丙烯酸磺丙酯改性的4.4ppm处的单峰，I_OCH(CHNH2)O是所有单体的主链上发现的质子，并且DD是去乙酰化程度(0.75)。这个计算改编自Sashiwa。

UV-VIS分析

使用Perkin Elmer Lambda 40UV/Vis光谱仪获得改性的壳聚糖寡糖溶液(0.1mg/mL，PBS pH 6.5)的光谱。暴露于NO气体导致形成N-二醇二氮烯鎓，如253nm处的吸光度最大值指示(Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.,《化学评论(Chemical Reviews)》,102(4),1135-1154(2002))。

未检测到350nm处的吸光度峰，其指示亚硝胺形成(Wang,P.G.,等人.,《化学评论》,102(4),1091-1134(2002))。结果如图9A-9D所示。

GPM和壳聚糖寡糖在磷酸盐缓冲盐水中的浊度

为了确定静电对壳聚糖寡糖粘膜粘附的影响，在磷酸盐缓冲液(pH 6.5)和磷酸盐缓冲盐水(pH 6.5)中比较浊度测量值。除了向磷酸盐缓冲液中加入140mM氯化钠(NaCl)外，如上所述进行检定。在磷酸盐缓冲盐水中加入氯化钠使寡糖与粘蛋白之间的静电相互作用最小化。对于除COS-SPA之外的所有改性的壳聚糖寡糖，添加NaCl降低了壳聚糖寡糖聚集粘蛋白的能力。通过降低浊度来监测这种降低的粘蛋白聚集能力。值得注意的是，在浓度高于4.5mg/mL时，针对COS和COS-TBuA，观察到由于壳聚糖-粘蛋白复合物的解聚导致的浊度降低。这种高浓度的解聚是粘膜粘附聚合物的特征(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9(7),1837-1842(2008))。结果展示于图12A-12D中。

结果

释放NO的粘膜粘附壳聚糖寡糖

据信壳聚糖的粘膜粘附性质源自静电与疏水相互作用，以及壳聚糖与粘蛋白之间的氢键。在这些相互作用中，壳多糖上的带正电的伯胺与粘蛋白上的带负电荷的唾液酸和硫酸酯基团之间的静电引力占优势(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008))。Sogias和Mencchicchi已经证明，用乙酰基阻断壳聚糖上的伯胺(即，降低壳聚糖的去乙酰化作用)降低其在溶液中结合和聚集粘蛋白的能力。(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008)；Menchicchi,B.,等人,《生物大分子》,15,3550-3558(2014))。

为了确定壳聚糖粘膜粘附如何影响NO递送和功效，使用三种结构上不同的丙烯酸酯改性来在2-甲基氮丙啶改性的壳聚糖寡糖(COS)上空间阻断伯胺(方案1)。选择丙烯酸酯作为改性途径，因为丙烯酸酯在温和的合成条件下与壳聚糖共价结合。还基于其商业可用性选择特定的丙烯酸酯改性。比较丙烯酸乙酯和丙烯酸叔丁酯以确定是否增加从乙基到叔丁基的空间体积改变了COS的粘膜粘附性质。为了减少粘膜粘附，除了空间阻碍伯胺之外，还使用带负电丙烯酸酯(丙烯酸磺丙酯)静电排斥粘液。

改变丙烯酸酯向COS骨架的迈克尔加成的反应条件以影响改性效率。所有反应均在室温下进行，加热到50℃，在丙烯酸乙酯与壳聚糖主链之间产生副反应。COS上的伯胺(RNH₃ ⁺，pKa为约10)在碱性溶液(pH 12)中去质子化，从而增加对丙烯酸酯乙烯基的β-碳的反应性。以这种方式，用TBuA对COS的改性从pH 7的11±1％(即中性条件)提高到pH 12的83±15％。对于所有三种丙烯酸酯，这些反应条件产生类似的改性改善(约80-98％)(表1)。通过单向ANOVA(F(2,10)＝1.42，p＝0.31)测定，三种丙烯酸酯的改性效率之间的差异不显著。

表1.丙烯酸酯改性效率和含壳聚糖寡糖的PBS的NO释放特征(pH6.5，37℃).^a

^a所有值都报告为3次或更多次合并实验的平均值±标准偏差。^b与伯胺相关，^c总NO，^d最大NO流量，^e半衰期，^fNO释放持续时间

为了赋予NO储存和释放，N-二醇二氮烯鎓NO供体通过暴露于NO气体的高压在改性壳聚糖寡糖上的仲胺位点处形成(Lu,Y.,等人,《生物材料》,35,1716-1724(2014))。通过维持所有骨架的恒定溶剂比(3:7水:甲醇)和碱浓度来调节一氧化氮储存，产生未改性的COS和丙烯酸酯改性的骨架的类似的NO净负荷([NO]_总量为约0.4μmol/mg)和释放动力学(t_1/2为约30分钟)(表1)。虽然来自N-二醇二氮烯鎓的NO释放可通过从局部官能团赋予的电荷稳定或疏水性改变(Riccio,D.A.and Schoenfisch,M.H.《化学学会评论》,41,3731-3741(2012))，丙烯酸酯改性没有显著改变材料的疏水性并且提供相当的NO释放动力学。不受理论束缚，据信本文显示的类似的NO释放半衰期指示丙烯酸酯改性的壳聚糖寡糖的NO释放动力学通常更多地受到壳聚糖主链的疏水性而不是外部官能团的影响。

使用UV-Vis光谱法表征N-二醇二氮烯鎓NO供体的形成。对于所有化合物，UV-Vis光谱展示暴露于NO气体的高压之后253nm处的吸光度最大值，确认N-二醇二氮烯鎓NO供体形成(Hrabie,J.A.和Keefer,L.K.《化学评论》,102,1135-1154(2002))。未观察到350nm处或附近的吸收峰，这指示很少或不形成潜在的致癌的亚硝胺(Wang,P.G.,等人,《化学评论》,102,1091-1134(2002))。本文提供每种改性的壳聚糖寡糖的吸收光谱。

丙烯酸酯和2-甲基氮丙啶改性的壳聚糖寡糖的粘膜粘附

用丙烯酸酯改性的COS进行胃猪粘蛋白(GPM)的浊度滴定以确定壳聚糖寡糖骨架的粘膜粘附特性。在低浓度的粘膜粘附聚合物的存在下，粘蛋白形成光散射自组装复合物(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008)；Rossi,S.,等人,《医药学科学欧洲杂志(European Journal of Pharmaceutical Sciences)》,10,251-257(2000))。因此，预期粘蛋白溶液的浊度(如通过校正的吸光度测量)随着粘膜粘附骨架的添加而增加，导致吸光度测量增加。在较大浓度下，粘膜粘附聚合物已展示粘蛋白解聚的聚合物复合物(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008))。或者，在粘膜惰性骨架存在下，粘蛋白溶液的浊度(即吸光度)应保持恒定。在540nm监测浊度以最大化对GPM-壳聚糖复合物的敏感性，同时使游离壳聚糖寡糖在溶液中的吸光度最小化(_λmax＝375nm)。

在低浓度(≤3mg/mL)的COS、COS-EA和COS-TBuA骨架中，GPM溶液的浊度迅速增加(接近4倍)，指示溶液中粘蛋白具有显著的粘膜粘附(图1)。在浓度≥4.5mg/mL时，观察到COS和COS-TBuA的壳聚糖粘蛋白复合物的解聚。向GPM溶液中添加COS-SPA导致溶液在高浓度下的浊度略微增加。作为带正电荷的壳聚糖与带负电荷的粘蛋白之间的静电相互作用有助于粘膜粘附(Menchicchi,B.,等人,《生物大分子》,15,3550-3558(2014)；Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008)；Khutoryanskiy,V.V.《大分子生命科学(Macromolecular Bioscience)》,11,748-764(2011))，粘蛋白与COS-SPA的带负电荷的磺酸酯基之间的相应的静电斥力可能规避以低浓度形成壳聚糖-粘蛋白聚集体。在较大浓度(>3mg COS-SPA/mL)下，观察到浊度的小幅增加，并且归因于壳聚糖寡糖主链与粘蛋白颗粒之间的吸引力(例如疏水性或氢键)(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008))。

虽然预期TBuA和EA改性在空间上阻断COS骨架上的粘膜粘附性伯胺，但与未改性的COS骨架相比，任何空间位阻都不会显著改变粘膜粘附。不受理论束缚，据信保留的粘膜粘附特性是带正电荷的胺的空间阻断不足或改性基团与粘蛋白之间的疏水相互作用的结果。为了确定静电造成的粘膜粘附程度，在PBS中重复浊度检定。将氯化钠添加到溶液中最小化去乙酰化壳多糖与粘蛋白之间的静电相互作用(Sogias,I.A.,等人,《生物大分子》,9,1837-1842(2008))。对于所有改性的壳聚糖寡糖，氯化钠的加入降低了溶液的浊度，指示壳聚糖寡糖和粘蛋白之间的静电吸引力得以保留，即使在壳聚糖被改性以防止在粘蛋白上带正电的胺与带负电的基团之间的相互作用之后也是如此。

壳聚糖-粘蛋白聚集体的ζ电位测量证实了浊度滴定结果(图2)。在pH6.5下，空白GPM溶液展示-9.8±0.5mV的ζ电位。添加用中性官能团(COS、COS-TBuA和COS-EA)改性的壳聚糖寡糖稀释粘蛋白溶液产生增加的ζ电位。用带负电荷的COS-SPA处理GPM溶液不会改变测试浓度下测量的ζ电位，进一步证明COS-SPA的粘膜粘附特性降低。

用壳聚糖寡糖处理后纯化的粘液的电泳分离

为了确定NO对粘蛋白大小(即，分子量)的影响，在用增加浓度的对照壳聚糖骨架(即，非NO释放)和释放NO的壳聚糖寡糖处理后，通过琼脂糖凝胶电泳分离从CF HBE培养物收集的粘液。使用MUC5B和MUC5AC评估释放NO的壳聚糖寡糖的粘液溶解作用，所述MUC5B和MUC5AC是负责气道中凝胶形成的关键粘蛋白。这些粘蛋白的已知浓度的过程中CF(Henke,M.O.,等人,《呼吸和危急护理药品美国杂志(American Journal of Respiratory andCritical Care Medicine)》,175,816-821(2007))。使用强和弱粘膜粘附的壳聚糖寡糖(分别为COS和COS-SPA)来评估骨架粘膜粘附对粘蛋白迁移的影响。暴露于壳聚糖寡糖后粘蛋白迁移距离的任何增加反映粘蛋白多聚物的尺寸和/或电荷的变化，显示出在治疗CF粘液中的有益治疗效果。

与空白PBS处理相比，无论骨架的粘膜粘附特性如何，粘蛋白迁移都不受暴露于对照COS和COS-SPA骨架的影响(图3)。用弱粘膜粘附的释放NO的COS-SPA(COS-SPA-NO)骨架治疗类似地对粘蛋白迁移没有影响。然而，用强粘膜粘附COS-NO治疗相对于对照组(p≤0.05)以剂量依赖性方式以10mg/mL的增加MUC5AC和MUC5B粘蛋白的迁移距离(图4A和4B)。粘蛋白迁移的增加可归因于NO的药理学作用，因为单独用对照骨架处理不影响迁移。以这种方式，粘蛋白多聚物的尺寸减小导致更快的迁移。不受理论束缚，据信骨架粘膜粘附对于有效的NO递送是必需的，因为用COS-SPA-NO处理不改变MUC5AC或MUC5B的迁移。此外，与带负电荷的COS-SPA的不良骨架-粘蛋白结合不利于局部NO释放，因此需要更大剂量的等效治疗活性。已报告类似的观察细菌和NO释放二氧化硅和树枝状高分子骨架(Carpenter,A.W.和Schoenfisch,M.H.《化学学会评论》,41,3742-3752(2012))。事实上，树枝状聚合物(Lu,Y.,等人,《生物大分子》,14,3589-3598(2013)；Sun,B.,等人,《生物大分子》,13,3343-3354(2012)；Worley,B.V.,等人,Molecular Pharmaceutics,12,1573-1583(2015))和二氧化硅(Hetrick,E.M.,等人,《美国化学学会·纳米(ACS Nano)》,2,235-246(2008)；Carpenter,A.W.,等人,《美国化学学会·纳米》,5,7235-7244(2011)；Slomberg,D.L.,等人,《ACS应用材料和界面(ACS Applied Materials&Interfaces)》,5,9322-9329(2013)；Carpenter,A.W.,等人,《生物大分子》,13,3334-3342(2012))与细菌(膜)的结合通过更有针对性和局部的NO递送改善NO释放的抗微生物作用。粘膜粘附释放NO的骨架的设计将有利于确保靶接近和增加的治疗作用。

用壳聚糖寡糖处理后CF痰的电泳分离

虽然从COS-NO释放的NO增加了聚合物粘蛋白的迁移，但CF痰的复杂性(例如，高浓度的DNA、细菌、发炎性蛋白和细胞)可能影响NO递送和效能。通过琼脂糖凝胶电泳评估COS、COS-NO、COS-SPA和COS-SPA-NO对CF痰中粘蛋白的影响。与HBE粘液一样，用对照(不释放NO)壳聚糖骨架或COS-SPA-NO处理不影响粘蛋白迁移(图5)。相反，在用浓度≥10mg/mL的COS-NO处理MUC5AC和MUC5B粘蛋白后，粘蛋白迁移增加(图6A和6B)，进一步支持NO对这一NO释放骨架的粘液溶解活性。值得注意的是，这一检定中使用的壳聚糖寡糖的浓度高于浊度检定中使用的浓度。粘蛋白的浓度也在痰(约6.5mg/mL)(Henderson,A.G.,等人,《临床调查杂志(Journal of Clinical Investigation,124)》,3047-3060(2014))中比在浊度检定中使用的粘蛋白浓度(3.0mg/m)高；指示在两种检定中壳聚糖与粘蛋白的比例(mg/mg)类似。由Klinger-Strobel提出，由于粘液渗透性的改善，粘膜惰性骨架对于CF气道中的药物递送更有效(Klinger-Strobel,M.,等人,《药物递送的专家观点》,1-24(2015))。然而，许多这类药物的药理学目标不在于粘液层，而COS-NO靶向累积的粘附粘液本身。实际上，释放NO的壳聚糖寡糖的粘液溶解活性似乎取决于COS骨架对HBE粘液和CF痰的粘膜粘附特性，弱粘膜粘附COS-SPA-NO骨架证明没有有益的治疗效果。

CF痰的荧光显微镜检查

为了显示由CF痰中的粘蛋白和DNA形成的网络中NO介导的变化，用共聚焦激光扫描显微镜对处理过的样品成像。在PBS处理的样品中(图7A-7D)，MUC5AC(红色)和MUC5B(绿色)的网络交织在一起，形成以厚粘蛋白丝(图7A，白色箭头)和网状粘蛋白片为特征的三维架构。如通过强烈的DAPI(蓝色)染色检测，完整的嗜中性粒细胞也嵌入三维粘蛋白网络中。用COS或COS-SPA壳聚糖寡糖处理后，整个痰样品中的细胞外DNA含量(图7F、7J、7N和7R)增加，这是嗜中性白血球和发炎性细胞死亡增加的结果(Dou,J.,等人,《碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)》,75,119-124(2009))。用COS-SPA和COS-SPA-NO处理对CF痰架构没有其它可辨别的影响。

带正电荷的壳聚糖变体COS和COS-NO改变CF痰中粘蛋白网络的外观。通过信号增强和粘蛋白片的尺寸减小证明单独的COS对照诱导粘蛋白丛集(图7E，白色箭头)，指示COS-粘蛋白静电相互作用保持存在于CF痰的复杂粘弹性环境中。通过COS-NO的一氧化氮释放进一步降解粘蛋白网络，如较低的总粘蛋白信号和松弛的粘蛋白网络所描绘(图7K-7L)。用COS-NO处理的样品(图7K-7L)缺乏在PBS处理的样品中丰富的粘蛋白长丝(图7A，白色箭头)。这些显微镜观察表明COS-NO对粘蛋白网络的强烈破坏。NO介导的粘蛋白解缠结降低痰弹性，因为高的粘蛋白缠结与升高的痰弹性(Hassett,D.J.,等人,《药物递送进展综述》,54,1425-1443(2002))相关。

用COS-SPA-NO处理没有改变痰网络(图7Q-7T)。不受理论束缚，据信壳聚糖寡糖主链与带负电荷的粘蛋白之间的静电斥力阻止有效的壳聚糖寡糖渗透到最致密的粘蛋白基质中。以这种方式，COS-SPA-NO的NO释放在改变粘蛋白网络方面是无效的。

CF痰流变学

粘液溶解剂被设计成减少粘液的生物物理特性，由此提高粘膜纤毛清除率和肺功能(Henderson,A.G.,等人,《临床调查杂志》,124,3047-3060(2014)；Anderson,W.H.,等人,《呼吸和危急护理药品美国杂志》,192,182-190(2015))。

如本文所报高，平行板流变学用于测量弹性(G')和粘性(G")模量，并且评估用COS-NO处理如何影响CF痰的生物物理特性。在室温下用COS-NO处理1小时后，相对于对照观察到CF痰粘度和弹性的剂量依赖性降低(图8A和8B)。在测试的最低浓度(5mg/mL)下，与PBS处理的空白相比，COS-NO分别使痰弹性和粘度降低74.9±0.4和66.3±1.2％。用4倍浓度的COS-NO(20mg/mL)处理CF痰可使痰弹性和粘度分别降低93.4±0.7和87.0±2.0％。这些结果指示，COS-NO在短时间(1小时)暴露期间降低CF痰的粘弹性特性非常有效。

虽然很难在文献中比较流变数据由于广泛变化的暴露和测量参数(Lai,S.K.,等人,《药物递送进展综述》,61,86-100(2009))，如本文所公开，聚葡糖胺提供与用于治疗CF的常规粘液溶解疗法(例如，N-乙酰半胱氨酸、阿法链道酶)相当的痰粘弹性的实质和有益的变化，同时另外提供抗微生物活性，特别是抗分枝杆菌。用常规治疗，相对于对照组，Seagrave报告N-乙酰半胱氨酸治疗(30μM)24小时将HBE粘液的粘度和弹性降低一个数量级(Seagrave,J.,等人,《呼吸研究》,13,98(2012))。Shah观察到在用阿法链道酶治疗10天(2.5mg，每天两次)之后，患有CF的患者的吐出痰的粘度和弹性降低(分别为59和68％)(Shah,P.L.,等人,《胸廓(Thorax)》,51,119-125(1996))。相对于先前使用的N-乙酰半胱氨酸和阿法链道酶，仅需稍高浓度的COS-NO(例示性聚葡糖胺)来类似地改变痰流变学特性；然而，较长的暴露时间和/或较大的NO有效负荷会降低等效作用所需的治疗剂量。本文中证明与以前的报告相比更短的治疗暴露(与24小时相比1个小时)(Seagrave,J.,等人,《呼吸研究》,13,98(2012))或每日10次治疗(Shah,P.L.,等人,《胸廓》,51,119-125(1996))，并且实现类似的CF痰的粘度和弹性降低，证明COS-NO作为潜在的粘液溶解剂的效用。

CF痰的减小弹性和粘性模量可以归因于通过NO介导的DNA裂解改变DNA网络(Tamir,S.,等人,《毒理学化学研究(Chemical Research in Toxicology)》,9,821-827(1996)；Burney,S.,等人,《突变研究/基础和突变诱发的分子机制(Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis)》,424,37-49(1999)；Duan,J.和Kasper,D.L.《糖生物学(Glycobiology)》,21,401-409(2011))。电泳分离和共聚焦显微镜结果指示NO主动改变粘蛋白网络。因为NO可以是基因毒性的(Felley-Bosco,E.《癌症和癌转移评论(Cancer and Metastasis Reviews)》,17,25-37(1998))，在临床前研究或临床研究之前应表征本文中所公开的材料的细胞和基因毒性。

实施例2

抗微生物功效数据

表2和3中描绘针对许多病原体的COS-NO的体外测试。表2中MIC和MBC列出的值是COS-NO的浓度。

表2.对由FDA鉴别为严重公共卫生威胁的9种关键病原体的广泛范围易感性。

NR＝不可读

美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection；ATTC)

阿拉巴马大学(University of Alabama；UAB)

MIC＝最小抑制浓度并且MBC＝最小杀菌浓度至少3个对数下降(>99.9％)杀死

表3中MIC和MBC列出的值是COS-NO随时间释放的NO浓度，并且是实验过程中释放的NO的总和。如所属领域技术人员将理解NO是动态的，因此NO的量随时间变化。

表3.对由FDA鉴别为严重公共卫生威胁的9种关键病原体的广泛范围易感性

NR＝不可读

美国标准生物品收藏中心(ATTC)

阿拉巴马大学(UAB)

MIC＝最小抑制浓度并且MBC＝最小杀菌浓度至少3个对数下降(>99.9％)杀死

通过处理来自两个CF患者的痰(标记为AA和BB样品)并且计数所得菌落(计为CFU)来确定COS-NO对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的功效。结果如表4所示。

使AA样品与COS-NO接触，并且测定铜绿假单胞菌的含量。20mg/mL释放NO的壳聚糖剂量杀死三个AA样品中的两个(AA6和AA10)中的所有细菌。在另一个(AA4)中，NO释放能够使细菌计数减少10⁵个CFU。较大浓度导致所有三个样品中没有铜绿假单胞菌计数。

使BB样品与COS-NO接触，测定金黄色葡萄球菌的含量。所有金黄色葡萄球菌在20mg/mL和更高浓度下被杀死。

表4.对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌功效

ND＝未检测到

CFU＝菌落形成单位

表5展示额外病原体的抗微生物数据。New Delhi金属-β-内酰胺酶(NDM-1)和肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶(KPC)菌株分离株携带bla NDM-1和KPC基因，赋予对碳青霉烯(CR)抗生素的抗性。每种菌株都展示对多种药物种类中多达36种代表性抗生素的多药耐药性。

表5.COS-NO的抗微生物活性。

因此已描述本发明的实例实施方案，应理解由以上段落界定的本发明不限于以上描述中阐述的特定细节，因为在不脱离本发明的精神或范围的情况下其多种显而易见的变化形式是可能的。

Claims (40)

1.一种在有需要的个体中改性粘液的方法，所述方法包含：

向所述个体施用释放一氧化氮(NO)的生物聚合物，其中所述释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的，并且以粘液溶解和抗微生物的量向所述个体施用，从而改性所述个体的粘液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包含使存在于所述个体中的粘液与所述释放NO的生物聚合物接触。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中与对照相比，施用所述释放NO的生物聚合物使得所述个体的粘液清除率提高，其中所述对照是在不存在所述方法下的粘液清除或对对照化合物或常规粘液溶解疗法有反应的粘液清除。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述释放NO的生物聚合物使得抑制或杀死所述个体中存在的粘液中的病原体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物以减少一种或多种选自由以下组成的群组的病原体生长或杀死一种或多种选自由以下组成的群组的病原体的浓度施用：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、氧化木糖无色杆菌(Achromobacter Xylosoxidan)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophillia)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)和胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracelullare)。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述施用步骤之前所述个体中的粘液粘度和/或弹性相比和/或与对照粘液粘度和/或弹性相比，施用所述释放NO的生物聚合物使得所述个体中的粘液粘度和/或弹性降低至少10％。

7.根据权利要求6所述的方法，其中与所述施用步骤之前所述个体中的粘液粘度和/或弹性相比和/或与对照粘液粘度和/或弹性相比，所述粘液粘度和/或弹性降低至少75％。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述释放NO的生物聚合物使得所述释放NO的生物聚合物降解至少一部分所述个体中存在的粘液。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述释放NO的生物聚合物使得所述释放NO的生物聚合物减小粘蛋白尺寸和/或破坏至少一部分所述个体中存在的粘液的三维粘蛋白网络。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述释放NO的生物聚合物使得所述释放NO的生物聚合物改变所述粘液中存在的DNA。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用所述释放NO的生物聚合物使得从所述个体中清除所述个体的气道、肺、支气管和/或气管中存在的粘液。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体患有或疑似患有囊性纤维化。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以所述释放NO的生物聚合物与粘液的重量比在约1:3到约7:1(释放NO的生物聚合物:粘液)的范围内的浓度施用所述释放NO的生物聚合物。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物以每毫克所述释放NO的生物聚合物约0.1到约2μmol的一氧化氮的量释放一氧化氮，和/或具有约15分钟到约24小时的半衰期，其每一者如在37℃下利用含1.0mg的所述释放NO的生物聚合物的30mL去氧磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)经由化学发光在体外测量，其中当NO浓度低于10ppbNO/毫克的所述释放NO的生物聚合物时分析终止。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物释放一氧化氮至少约6小时，如在37℃下利用含1.0mg的所述释放NO的生物聚合物的30mL去氧磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)经由化学发光在体外测量，其中当NO浓度低于10ppb NO/毫克的所述释放NO的生物聚合物时分析终止。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物以单一疗法施用。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用包含在长达约14天或30天的时间段期间向所述个体施用一次剂量、两次剂量或更多次剂量的所述释放NO的生物聚合物。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与对照相比，施用所述释放NO的生物聚合物导致所述个体的粘液清除率提高，并且抑制或杀死所述个体中存在的粘液中的至少一种病原体。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物是水溶性的和/或具有约10kDa或更低的分子量。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物是释放NO的聚葡糖胺。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物包含至少一个式I的结构单元：

和任选的至少一个式II的结构单元：

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄在存在时各自独立地选自由氢、-(C＝O)C_1-5烷基和C_1-5烷基组成的群组；

在每种情况下是单键或双键，

其中在其为双键的每种情况下，不存在与双键-O连接的R₁、R₂、R₃或R₄；当R₁不存在时，R₅为氢、羟基、C_1-5烷基或C_1-5烷氧基；当R₃不存在时，R₆为氢、羟基、C_1-5烷基或C_1-5烷氧基；

其中在其为单键的每种情况下，存在与双键-O连接的R₁、R₂、R₃或R₄；当R₁存在时，R₅是氢；当R₃存在时，R₆是氢；

W是-(Q-A)_p-B、-Q-A-B或-C_1-20烷基-AB；

Q是-(CR_cR_d)_v-；

其中R_c和R_d在每种情况下独立地为氢或C_1-5烷基；并且v是2到6的整数；

p是1到100的整数；

A是

其中，L是S、O或N；并且

G在每种情况下独立地为氢，或与L一起形成一氧化氮供体，或不存在；

X是氢、C_1-5烷基或与N一起形成一氧化氮供体；

B不存在或选自由氢、羟基、C_1-5烷基或-Y-Z组成的群组，其中Y是间隔基，并且Z是聚合物、末端或C_1-20烷基；

D是-NR_aR_b，其中R_a和R_b独立地选自由氢、甲酰基、-(C＝O)C_1-5烷基、C_1-5烷基和C_1-5烷基酯组成的群组；

或D是

其中所述聚葡糖胺包含至少一个一氧化氮供体；并且

其中G与L一起形成所述至少一个一氧化氮供体，或X与N一起形成所述至少一个一氧化氮供体。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物包含至少一个为二醇二氮烯鎓的一氧化氮供体。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物以单一疗法施用，所述施用包含在长达约14天或30天的治疗期期间向所述个体施用一次剂量、两次剂量或更多次剂量的所述释放NO的生物聚合物，并且其中施用所述释放NO的生物聚合物使得在所述治疗期结束时实现存在于所述粘液中的病原体数量的至少一个对数下降。

24.一种改性粘液的方法，所述方法包含：

使释放一氧化氮(NO)的生物聚合物与粘液接触，其中所述释放NO的生物聚合物是粘膜粘附的并且呈粘液溶解和抗微生物的量，从而改性所述粘液。

25.根据权利要求24所述的方法，其中使粘液与所述释放NO的生物聚合物接触使得抑制或杀死所述粘液中的病原体。

26.根据权利要求24至25中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物以减少一种或多种选自由以下组成的群组的病原体生长或杀死一种或多种选自由以下组成的群组的病原体的浓度与所述粘液接触：金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、氧化木糖无色杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎克雷伯氏杆菌、鸟型分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和胞内分枝杆菌。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中与接触步骤之前的粘液粘度和/或弹性相比，和/或与对照粘液粘度和/或弹性相比，使所述粘液与所述释放NO的生物聚合物接触使得所述粘液中的粘液粘度和/或弹性降低。

28.根据权利要求27所述的方法，其中与接触步骤之前的粘液粘度和/或弹性相比，和/或与对照粘液粘度和/或弹性相比，所述粘液粘度和/或弹性降低至少10％。

29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中使所述粘液与所述释放NO的生物聚合物接触会使至少一部分所述粘液降解。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中使所述粘液与所述释放NO的生物聚合物接触减小粘蛋白尺寸和/或损害至少一部分所述粘液的三维粘蛋白网络。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中使所述粘液与所述释放NO的生物聚合物接触改变所述粘液中存在的DNA。

32.根据权利要求24至31中任一项所述的方法，其中所述粘液以所述释放NO的生物聚合物与粘液的重量比在约1:3到约7:1(释放NO的生物聚合物:粘液)范围内的浓度与所述释放NO的生物聚合物接触。

33.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物以每毫克的所述释放NO的生物聚合物约0.1到约2μmol一氧化氮的量释放一氧化氮，和/或具有约15分钟到约24小时的半衰期，其每一者如在37℃下利用含1.0mg的所述释放NO的生物聚合物的30mL去氧磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)经由化学发光在体外测量，其中当NO浓度低于10ppb NO/毫克的所述释放NO的生物聚合物时分析终止。

34.根据权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物释放一氧化氮至少约6小时，如在37℃下利用含1.0mg的所述释放NO的生物聚合物的30mL去氧磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)经由化学发光在体外测量，其中当NO浓度低于10ppb NO/毫克的所述释放NO的生物聚合物时分析终止。

35.根据权利要求24至34中任一项所述的方法，其中所述接触包含在长达约14天或30天的时间段期间使所述粘液与一次、两次或更多次剂量的所述释放NO的生物聚合物接触。

36.根据权利要求24至35中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物是水溶性的和/或具有约10kDa或更低的分子量。

37.根据权利要求24至36中任一项所述的方法，其中，所述释放NO的生物聚合物是释放NO的聚葡糖胺。

38.根据权利要求24至37中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物包含至少一个式I的结构单元：

和任选的至少一个式II的结构单元：

其中，

R₁、R₂、R₃和R₄在存在时各自独立地选自由氢、-(C＝O)C_1-5烷基和C_1-5烷基组成的群组；

在每种情况下是单键或双键，

其中在其为双键的每种情况下，不存在与双键-O连接的R₁、R₂、R₃或R₄；当R₁不存在时，R₅为氢、羟基、C_1-5烷基或C_1-5烷氧基；当R₃不存在时，R₆为氢、羟基、C_1-5烷基或C_1-5烷氧基；

其中在其为单键的每种情况下，存在与双键-O连接的R₁、R₂、R₃或R₄；当R₁存在时，R₅是氢；当R₃存在时，R₆是氢；

W是-(Q-A)_p-B、-Q-A-B或-C_1-20烷基-AB；

Q是-(CR_cR_d)_v-；

其中R_c和R_d在每种情况下独立地为氢或C_1-5烷基；并且v是2到6的整数；

p是1到100的整数；

A是

其中，L是S、O或N；并且

G在每种情况下独立地为氢，或与L一起形成一氧化氮供体，或不存在；

X是氢、C_1-5烷基或与N一起形成一氧化氮供体；

B不存在或选自由氢、羟基、C_1-5烷基或-Y-Z组成的群组，其中Y是间隔基，并且Z是聚合物、末端或C_1-20烷基；

D是-NR_aR_b，其中R_a和R_b独立地选自由氢、甲酰基、-(C＝O)C_1-5烷基、C_1-5烷基和C_1-5烷基酯组成的群组；

或D是

其中所述聚葡糖胺包含至少一个一氧化氮供体；并且

其中G与L一起形成所述至少一个一氧化氮供体或X与N一起形成所述至少一个一氧化氮供体。

39.根据权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述释放NO的生物聚合物包含至少一个为二醇二氮烯鎓的一氧化氮供体。

40.根据权利要求24至39中任一项所述的方法，其中使所述粘液与所述释放NO的生物聚合物接触导致存在于所述粘液中的病原体数量的至少一个对数下降。