CN102887948B - 一种抗菌及免疫调节多肽类药物 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种抗菌及免疫调节的载脂蛋白E模拟肽类药物。所述载脂蛋白E模拟肽ApoE23具有序列1的结构。本发明经体内及体外实验，结果表明，所述载脂蛋白E模拟肽可下调LPS诱导的THP-1细胞及人外周血单个核细胞的TNF-α、IL-6、IL-10表达；能明显降低脓毒血症小鼠死亡率，降低脓毒血症小鼠血浆TNF-α、IL-6及LPS浓度，改善脓毒血症小鼠肺脏、肝脏、小肠及脾脏的炎性损害；能杀灭大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、泛耐药的鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌，该载脂蛋白E模拟肽可进一步制备抗革兰阴性杆菌及抗泛耐药革兰阴性杆菌多肽类药物和制备免疫调节的多肽类药物以及抗脓毒血症的药物。

Description

一种抗菌及免疫调节多肽类药物

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种抗菌及免疫调节多肽类药物，具体涉及一种具有抗革兰阴性菌作用及免疫调节作用的载脂蛋白E模拟肽。

背景技术

感染性疾病是常见病及多发病，尤以儿童容易罹患；有数据显示，仅在2008年全球就有880万5岁以下儿童死亡，其中由于感染导致死亡人数为579万，占总死亡人数68%。有研究发现，细菌是感染性疾病最常见的致病微生物[Black R.E.et al.Lancet,375(2010),1969-1987]。

目前，临床治疗中，选择敏感的抗菌药物是治疗细菌感染成败的关键。随着细菌耐药性的不断增加[Yang C.et al.中华预防医学杂志.45:727-731;2011.;Zhang R.Braz J Infect Dis.15:505-506;2011.]，临床治疗耐药菌引起的感染将越来越困难；临床已分离到泛耐药或全耐药的革兰阴性细菌（如鲍曼不动杆菌）[Zhang R.Braz JInfect Dis.15:505-506;2011.]，因此，研究开发针对耐药菌的新型抗菌药物是当前亟需解决的任务之一。

抗菌肽是指广泛存在于生物体内具有抵御外来入侵病原体侵害、清除体内突变细胞的小分子多肽。研究报道，已相继从细菌、真菌、两栖类、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有类似性质的活性多肽，其中，某些抗菌肽对部分真菌、原虫和病毒具有明显杀伤作用（张晓巩,等。抗菌肽作用机制的研究进展,生理科学进展，42：11-15；2011。）。由于抗菌肽具有理化性质稳定、抗菌谱广，不易产生耐药性等特点，已渐成为抗生素的最佳替代品。研究表明，抗菌肽与传统抗生素在抗菌机制、作用方式上存在明显不同，由于抗菌肽发挥抗菌作用时不涉及特定的受体，主要是离子的物理作用，所以不产生耐药性，是抗耐药菌药物的重要来源；但抗菌肽天然资源有限,而可大量获得产量的化学合成和基因工程手段有望成为获取抗菌肽的替代方法。

有研究表明，严重侵袭性细菌感染如脓毒血症其致病机制中除细菌本身对人体造成损害外，细菌成分或代谢产物所诱发的人体过度炎症反应是重要致病机制之一；其中，脂多糖（LPS）是革兰阴性杆菌细胞壁的主要成分，LPS与单核-巨噬细胞膜表面的可溶性白细胞分化抗原（SCD14）、Toll样受体4/髓样蛋白2（TLR4/MD-2）结合，能激活细胞内炎症介质表达的信号转导系统，激活单核-巨噬细胞、内皮细胞等，释放促炎症介质，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）、白介素6（IL-6）等，诱发全身炎症反应综合症（SRIS）、脓毒症性休克（septic shock）甚至多器官功能衰竭综合症（MODS）[Shi DW.et al.Inflamm Res.60:841-849;2011.Di Sole F.et al.Am J PhysiolCell Physiol.301:C1290-C1292;2011.]；因此，阻断由LPS所诱发的炎症反应是治疗革兰阴性杆菌感染引起的脓毒血症的关键之一；而传统的激素治疗由于其单纯的免疫抑制存在使感染扩散风险，因此有必要寻找对抗LPS诱导的炎症因子表达的免疫调节剂。

载脂蛋白E（ApoE）模拟肽是源于ApoE受体结合部位氨基酸残基序列的多肽，目前已报道的ApoE模拟肽主要有二种：具有抗微生物作用的ApoE模拟肽和具有免疫调节作用的ApoE模拟肽。具有抗微生物作用ApoE模拟肽目前报道较少，如ApoE133-162模拟肽被证实有体外抗菌活性[Azuma M.et al.Peptides.21:327-330;2000.]，另一种ApoE模拟肽ApoEdp的体外研究证明其具有更为广泛的抗微生物作用，对细菌、病毒均有杀灭效果[Dobson CB.et al.J Infect Dis.193:442-450;2006.]；但上述二种ApoE模拟肽的50%最低抑菌浓度（MIC₅₀）偏高，其体内抗菌活性及对耐药菌的抗菌作用尚未确定。

国外研究报道，用ApoE模拟肽（COG，acetyl-133-149-amide）治疗多发性硬化症模型小鼠，小鼠巨噬细胞释放一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-6受阻，小鼠临床症状改善[Li FQ.et al.J Pharmacol Exp Ther.318:956-965;2006.]。ApoE模拟肽COG112可抑制枸橼酸杆菌诱导的成年小鼠结肠细胞（YAMC）炎症反应[Stephens TA.et al.JImmunol，181:6859-6871;2008.]。所述ApoE模拟肽COG1410具有体外抑制小鼠腹腔巨噬细胞及神经胶质细胞株（BV2）TNF-α表达的作用[Wang H.et al.Anaesth IntensiveCare.37:38-45;2009.]，但迄今为止，尚未见具有抗脓毒血症ApoE模拟肽的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗菌及免疫调节多肽类药物，具体涉及一种具有抗革兰阴性菌作用及免疫调节作用的载脂蛋白E模拟肽。

本发明基于现有的ApoE模拟肽抗感染及免疫调节作用的研究现状，设计了一种新型ApoE模拟肽（ApoE23），并通过体内及体外实验，验证其抗菌作用及对LPS诱导的细胞因子表达的调节作用；并通过对B组鼠伤寒沙门菌脓毒血症小鼠静脉注射ApoE23，观察其对细菌性脓毒血症的治疗作用；结果表明，所述的ApoE模拟肽（ApoE23）具有抗革兰阴性菌作用及免疫调节作用，可进一步用于制备抗革兰阴性杆菌及抗泛耐药革兰阴性杆菌多肽类药物，以及制备具有免疫调节作用多肽类药物。

本发明遵循以下原则设计合成肽序列：

（1）序列来源为ApoE N端低密度脂蛋白受体（LDLR）结合位点序列；

（2）氨基酸数量不低于9个；

（3）选择富含碱性氨基酸残基片段；

（4）选择有形成a螺旋偏好的氨基酸残基；

（5）以呈现两亲性螺旋为优选。

更具体的，本发明提供一条ApoE模拟肽（ApoE23），其序列为（如SEQ ID NO:1所示）LRKLRKRLVRLASHLRKLRKRLL。

本发明中，所述ApoE23采用固相合成法合成，高效液相色谱法（HPLC）纯化，质谱及电喷雾质谱对合成肽纯度、氨基酸残基组成及分子量进行测定证实合成产物是目的肽，采用圆二色谱技术结合K2D3软件进行合成肽二级结构分析证实ApoE23α螺旋结构占21.61%，β折叠结构占7.32%；通过a螺旋轮法检测其亲水氨基酸残基及疏水氨基酸残基分布特点，结果表明，ApoE23的α螺旋为两亲性α螺旋；

本发明中，采用体外试验检测ApoE23对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、泛耐药鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌及念珠菌的抗菌活性；结果表明，ApoE23有明显的体外抗大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及泛耐药鲍曼不动杆菌作用；ApoE23抗金黄色葡萄球菌的MIC₅₀值大于抗大肠埃希菌、铜绿假单胞菌及泛耐药鲍曼不动杆菌的MIC₅₀值；结果显示，在研究使用的ApoE23浓度范围内，对屎肠球菌及念珠菌无抗菌作用；

本发明进行了ApoE23下调LPS诱导免疫细胞TNF-α、IL-10、IL-6表达实验，结果表明，ApoE23下调LPS诱导的THP-1细胞（人单核细胞株）及人外周血单个核细胞（PBMC）的TNF-α、IL-6、IL-10表达；

本发明进一步进行了ApoE23对细菌性脓毒血症小鼠治疗作用实验，实验采用ApoE23治疗B组鼠伤寒沙门菌脓毒血症模型小鼠，结果表明，所述ApoE23能明显降低脓毒血症小鼠死亡率，降低脓毒血症小鼠血浆TNF-α、IL-6及LPS浓度，改善脓毒血症小鼠肺脏、肝脏、小肠及脾脏的炎性损害。

实验结果表明，本发明的载脂蛋白E模拟肽ApoE23具有抗革兰阴性菌作用及免疫调节作用，可下调LPS诱导的THP-1细胞（人单核细胞株）及人外周血单个核细胞（PBMC）的TNF-α、IL-6、IL-10表达；能明显降低脓毒血症小鼠死亡率，降低脓毒血症小鼠血浆TNF-α、IL-6及LPS浓度，改善脓毒血症小鼠肺脏、肝脏、小肠及脾脏的炎性损害；能杀灭大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、泛耐药的鲍曼不动杆菌（对碳青霉烯类、喹诺酮类、头孢类耐药）和金黄色葡萄球菌，可用于制备抗革兰阴性杆菌及抗泛耐药革兰阴性杆菌多肽类药物，以及可用于制备具有免疫调节作用多肽类药物。

本发明的载脂蛋白E模拟肽ApoE23的优点有：

（1）抗菌肽与传统抗生素在抗菌机制、作用方式存在明显不同，由于抗菌肽作用不涉及特定的受体,主要是离子的物理作用,因此不产生耐药性，是抗耐药菌药物重要来源；所述ApoE23作为一种抗菌肽具有较强的抗革兰阴性杆菌包括耐药菌活性，其序列来源于人来ApoE，不易诱导机体产生抗体，因此可进一步制备优质抗菌药物；

（2）细胞因子表达失衡是炎症性疾病如动脉粥样硬化、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）及感染诱发的系统性炎症反应综合征（SIRS）的病理基础，调节不同类型细胞因子表达可纠正免疫紊乱状态；本发明经体外实验结果表明，所述ApoE23对LPS诱导的免疫细胞TNF-α、IL-6、IL-10表达均有调节作用，可进一步制备治疗炎症性疾病及自身免疫性疾病的免疫调节药物；

（3）所述的ApoE23具有的抗菌及免疫调节双重功能，可显著降低细菌性脓毒血症小鼠死亡率，可进一步制备治疗脓毒血症的药物。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的载脂蛋白E模拟肽ApoE23进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为ApoE23的α螺旋轮图。

图2为ApoE23的二级结构分析图。

具体实施方式

实施例1  ApoE23二级结构、亲水性及疏水性分析

α螺旋的每一圈具有3.6个残基，相当于每个残基旋转100°，因此其侧链是以100°的间隔从螺旋轴上向外伸出；如图1所示，图中出现了一个亲水面和一个疏水面，显示ApoE23形成的α螺旋为两亲性α螺旋。

所述ApoE23合成采用固相合成法，经HPLC纯化后得到单一吸收峰，纯度均超过95%，达到药用纯度；经脱盐处理含盐量不超过28%；采用电喷雾质谱（ESI-MS）测量样品组分的质量电荷比（M/Z）来计算样品的分子量，通过质谱及氨基酸分析对合成肽进行定性、定量分析；对合成产品检测结果与理论值相符。

采用多肽的圆二色性及不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结构分析，将190-240nm波长范围内连续测得的ApoE23吸光度数据平均抽取51个数值输入K2D3[Louis-Jeune C.,et al.Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics.80:374-381;2012]蛋白质二级结构分析软件得到ApoE23的K2D3分析图及预测的α螺旋、β-折叠比例；结果显示，ApoE23的α螺旋结构占21.61%，β折叠结构占7.32%（如图2所示）。

实施例2  ApoE23的体外抗菌作用

试验在96孔细胞培养板进行，分对照组、5种不同浓度的ApoE23干预组及空白对照组；对照组仅加100μL的LB细菌混悬液，ApoE23干预组设5种ApoE23浓度(0.5μmol/L、1μmol/L、1.5μmol/L、2μmol/L及2.5μmol/L)；每组设2个平行孔，每孔细菌终浓度5×10⁴CFU/ml，终体积100μl，空白对照组不加任何溶液；将试验板放入湿盒，37℃培养过夜，混匀后在酶标仪上比色测各孔吸光度，波长630nm；试验细菌分别为大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）及泛耐药鲍曼不动杆菌（临床分离株，对头孢类、碳青霉烯类、喹诺酮类抗菌药物耐药）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、屎肠球菌（临床分离株）及白色念珠菌（临床分离株）；

体外抗菌试验结果表明，ApoE23对三种致病菌有明显抗菌活性，MIC₅₀值均为1～1.25μmol/L；所述ApoE23对金黄色葡萄球菌有抗菌活性，MIC₅₀值为4.0-4.5μmol/L，ApoE23对革兰阳性的屎肠球菌、酵母样真菌如白色念珠菌在2-5μmol/L的浓度范围内无抗菌作用。

实施例3  ApoE23下调LPS诱导免疫细胞TNF-α、IL-10、IL-6表达

试验在96孔细胞培养板进行，分对照组（仅加DMEM细胞悬液）、LPS诱导组（细胞悬液+LPS）、ApoE23干预组（细胞悬液+ApoE23）、LPS+ApoE23干预组（细胞悬液+LPS+ApoE23，LPS加入后30分钟加入ApoE23）；试验用细胞分别为人单个核细胞株（THP-1）组及采用淋巴细胞分离液分离得到的健康人外周血单个核细胞（PBMC）组；每组终体积100μL，细胞数5×10⁵，LPS最终浓度1μg/mL，ApoE23最终浓度为5μmol/L；反应板放入细胞培养箱中分别培养6小时、24小时及48小时后收集培养细胞上清液及细胞；采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定不同组上清液中TNF-α、IL-6、IL-10浓度，采用定量PCR法检测不同组THP-1人PBMC的TNF-α、IL-6、IL-10mRNA表达；

结果表明，ApoE23具有显著下调LPS诱导的人PBMC及THP-1细胞TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白表达作用，下调THP-1细胞IL-10 mRNA及蛋白表达作用、下调人PBMC IL-10蛋白表达。

实施例4  ApoE23对细菌性脓毒血症小鼠治疗作用

细菌性脓毒血症小鼠死亡率观察试验：将15只C57BL小鼠（断奶后2周，体重10-12g）随机分为感染对照组（5只）、脓毒血症ApoE23治疗组（5只）、脓毒血症生理盐水治疗组（5只）；脓毒血症ApoE23治疗组每只小鼠腹腔注射0.5ml B组鼠伤寒沙门菌菌悬液（1.8×10⁶CFU）后立即尾静脉注射0.1ml ApoE23注射液（1.5mg/kg）；脓毒血症生理盐水治疗组每只小鼠腹腔注射0.5ml B组鼠伤寒沙门菌菌悬液（1.8×10⁶CFU）后立即尾静脉注射0.1ml医用无菌生理盐水；感染对照组小鼠仅腹腔注射0.5ml医用无菌生理盐水；将三组小鼠放置无菌层流室观察48小时，期间喂养按照常规进行，记录每组小鼠的死亡数量及死亡时间。

ApoE23治疗作用机制试验：将小鼠分为三组（同死亡率观察试验），每组15只小鼠，采用同死亡率观察试验相同处理后再将每组小鼠分为1h组、3h组及24h组,每小组各5只；分别于试验后1h、3h及24h收集不同时间点分组小鼠的抗凝血、肺脏、肝脏、脾脏、小肠；采用免疫比浊法测定不同组小鼠血浆LPS浓度，采用ELISA法测定不同组小鼠血浆TNF-a、IL-6浓度，采用细菌培养法对不同组小鼠脾脏进行细菌培养及菌落计数；肺脏、肝脏及小肠制作病例切片，HE染色后显微镜下观察炎性改变。

结果表明，脓毒血症ApoE23治疗组24小时死亡率为0，48小时小鼠死亡为40%；脓毒血症生理盐水治疗组C57BL小鼠24小时死亡率60%，48小时死亡率为100%；非感染组5只小鼠在试验24小时、48小时及72小时均无异常表现，死亡率为0。

对不同组小鼠血浆LPS、TNF-α、IL-6、脾脏细菌菌落进行测定，结果表明，ApoE23明显降低B组鼠伤寒沙门菌感染小鼠血浆LPS、IL-6、TNF-α浓度及脾脏细菌数量；所述ApoE23治疗改善感染小鼠脾脏、肺脏、小肠、肝脏炎性损伤。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学附属儿科医院 

<120>  一种抗菌及免疫调节多肽类药物

 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  PRT

<213>  Artificial

 

<220>

<223> 

 

<400>  1

 

Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu

            20             

 

Claims (7)

1.一种载脂蛋白E模拟肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列1所示，为LRKLRKRLVRLASHLRKLRKRLL。

2.按权利要求1所述的载脂蛋白E模拟肽，其特征在于，所述的模拟肽采用固相合成法合成，高效液相色谱法纯化，通过质谱及电喷雾质谱测定证实合成肽的纯度、氨基酸残基组成及分子量；所述模拟肽的合成肽二级结构中：α螺旋结构占21.61%，β折叠结构占7.32%；α螺旋为两亲性α螺旋。

3.权利要求1的载脂蛋白E模拟肽在制备杀灭大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、泛耐药的鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌及免疫调节多肽类药物中的用途。

4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的免疫调节多肽类药物下调LPS诱导的THP-1细胞及人外周血单个核细胞的TNF-α、IL-6、IL-10表达。

5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的泛耐药的鲍曼不动杆菌是对碳青霉烯类、喹诺酮类或头孢类耐药的鲍曼不动杆菌。

6.权利要求1所述的载脂蛋白E模拟肽在制备治疗细菌性脓毒血症药物中的用途。

7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的药物降低脓毒血症死亡率，降低脓毒血症血浆TNF-α、IL-6及LPS浓度，改善脓毒血症肺脏、肝脏、小肠及脾脏的炎性损害。

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