JP2001503747A

JP2001503747A - 増殖因子様活性を有するペプチド組成物

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Publication number: JP2001503747A
Application number: JP52050098A
Authority: JP
Inventors: バトナガー、ラジェンドラ、エス．; キアン、ジン、ジン
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1997-10-10
Publication date: 2001-03-21
Also published as: EP0951472A1; CA2269655A1; CA2269655C; DE69736487T2; US5780436A; DE69736487D1; AU4753297A; AU734940B2; ES2270453T3; ATE335758T1; WO1998018816A1; EP0951472B1

Abstract

(57)【要約】一般的な配列ＡＡ_j-ＡＡ_j+1-ＡＡ_j+2を有し、そのすぐ後にＡＡ_j+nが続いているＴＧＦ-βの小さなペプチド模擬体を調製した。この配列では、ＡＡ_jはアラニン、アスパラギン又はロイシンであり、ＡＡ_j+1はバリン又はイソロイシンであり、ＡＡ_j+2はアラニンであり、ｎは３、４又は５であり、そのためＡＡ_j+2とＡＡ_j+nとの間にｎ−３個のアミノ酸残基が存在し、かつＡＡ_j+nはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである。ＴＧＦ-β活性の必須要件はペプチドが生理的条件下で安定なβ屈曲構造を形成できることであるので、本発明のペプチドは集合的にβ屈曲ペプチドと称される。生物適合性マトリックスを含んでいる組織修復のような適用用の組成物も提供され、その際、生物適合性マトリックスが該マトリックスと混合されるか又はこれに保持されたサイトモジュリン又はサイトモジュリン類似体を有している。

Description

【発明の詳細な説明】増殖因子様活性を有するペプチド組成物発明の分野本発明は一般的に、増殖因子及び神経栄養因子に関し、更に詳細には、ＴＧＦ -β活性を有する（又は模擬する）小さな合成ペプチド、並びにこれらの小さなペプチド模擬体を含むマトリックス及び組成物に関する。本願は、米国特許出願番号第08/431,954号（出願日1995年５月１日）（これは現在、1997年８月26日に発行された米国特許第5,661,127号である）の一部継続出願である。発明の背景増殖因子は、インビボ又はインビトロで動物細胞の特定の集団の成長に影響を与えるが栄養物質ではないポリペプチドホルモンのような物質である。組織の成長及び分化に関与するタンパク質は成長を促進するか又は阻止し、かつ分化を促進するか又は阻止し、そのため、一般的な用語「増殖因子」にはサイトカインや栄養因子が含まれる。増殖因子は典型的には、5000から50,000ダルトンまでの範囲の分子量のポリペプチドである。構造類似性に基づいて、増殖因子は複数のファミリーに分類され、これらファミリーにはインスリン様増殖因子（ＩＧＦｓ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦｓ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、上皮増殖因子（ＥＧＦｓ）、神経増殖因子（ＮＧＦｓ）及びトランスフォーミング増殖因子β型（ＴＧＦ -βｓ）が含まれる。トランスフォーミング増殖因子-βｓは元々、正常な線維芽細胞を足場非依存的に（anchorage-independent）増殖し得る細胞に形質転換する能力に対して命名された。しかしながら、この名称にも拘わらず、ＴＧＦ-βＳは種々の上皮、内皮及び間葉細胞の正常な発育、成長及び分化に必要な多機能増殖因子である。他のサイトカインと同様に、ＴＧＦ-βｓの特異的な効果は特定の細胞型及びその周囲環境に依存している。細胞に対するＴＧＦ-βｓの効果は一般的に、増殖的及び非増殖的効果として分類される。線維芽細胞に関する最初の実験で元々確立されているように、ＴＧＦ-βｓは真正の(bona fide)増殖因子である。ＴＧＦ-βによって増殖が高められる２つの重要な細胞型は骨芽細胞と末梢神経系のシュワン細胞である。しかしながら、多くの細胞で、ＴＧＦ-βsは細胞増殖の強力なインヒビターである。このような負の増殖制御は或る種の組織の再生を抑制する調節メカニズムであって、発癌の初期においてある役割を果たす可能性がある。ＴＧＦ-βｓの最も重要な非増殖的機能は細胞外マトリックスの形成を高めることにある。これは主として、コラーゲンとフィブロネクチンの両方の転写の増加によって達成されるが、プロテアーゼでマトリックスが分解されるのを阻止することもその安定性に寄与している。細胞外マトリックスの分解はプロテアーゼ自体の分泌の減少と同時にプロテアーゼインヒビター値の上昇によって阻止される。細胞外マトリックスに与えるＴＧＦ-βの顕著で且つ普遍化された効果は組織修復過程や或る種の線維症疾病の病因で主要な役割を果たしているように思われる。ＴＧＦ-βの幾つかの異なるレセプターをコードするＤＮＡはリン（Lin）等のＰＣＴ出願公開ＷＯ93/09228号（1993年５月13日公開）によって最近記載されている。ＴＧＦ-βレセプターを利用できることでＴＧＦ-β機能の更なる評価が促進されるであろう。ＴＧＦ-βスーパーファミリーの多くのメンバーが特徴付けられている。例えば、バスラー（Basler）等はＴＧＦ-βスーパーファミリーのメンバー間の配列の関係を図面で示している。Cell、73、687〜702頁（1993年）。マサーゲ（Mass ague）、Annu．Rev．Cell Biol.、6、597〜641頁（1990年）も、ＴＧＦ-β作用のメカニズムの考察を含めてトランスフォーミング増殖因子-βファミリーを総説している。ＴＧＦ-β１の二次構造に関するＮＭＲ特徴分析が報告されており、かつＴＧＦ-β２の精製結晶の三次元構造がダオピン（Daopin）等、Proteins 、17、176〜192頁（1993年）によって記載されている。ＴＧＦ-β２のモノマーは、手の４本の指（フィンガー）を形成する２つの逆平行βシートを有する僅かに湾曲した左手に似た折りたたみ構造を取っている。これらの４本のフィンガーの領域は保存ジスルフィドと一緒になってＴＧＦ-βスーパーファミリーの折りたたみ構造を特定している。ＴＧＦ-βメンバーの中には骨誘導因子（bone morphogenetic protein）（ＢＭＰ）もある。ＢＭＰｓは創傷治癒、組織修復に有用であり、軟骨及び／又は骨成長を誘導することが示されている。例えば、ＰＣＴ出願第9309229号（1993年５月13日公開）、発明者イスラエル（Israel）及びウルフマン（Wolfman）は、骨折の治癒及び多分歯周病の治療並びに歯の他の修復過程のような骨刺激化活性を有するタンパク質の用途を記載している。Ｃ＆ＥＮ、ハッベル（Hubbell）及びランガー（Langer）、42〜54頁（1995年３月13日）による最近の特別論文は、ＢＭＰがポリマー粒子内に取り込まれ、その結果、ポリマーが分解するときにこのタンパク質が周囲組織に徐々に放出され、そこでこのタンパク質が多孔性マトリックスへの細胞の移動を刺激し、且つ最終的に、新しい骨の合成を刺激することを報告している。この論文はまた、ＴＧＦ-βを徐々に放出することによって骨が生成されたことにも言及している。ＴＧＦ-βｓは臨床的な治療法において、広範囲に適用できるため、それらは多くの研究の焦点になっている。これら研究の多くはインビトロ用途に係わっていたが、最近のインビボ研究によりさらに有望なインビトロ効果が幾つか確認されている。その結果、ＴＧＦ-βｓの考えられる幾つかの臨床的な用途には脈管形成の刺激、創傷治癒に関連した肉芽組織の形成並びに骨及び軟骨の形成が含まれる。ＴＧＦ-βをコードする核酸及びＴＧＦ-βの多様な用途は、発明者デリンク（ Derynk）及びゲッデル（Goeddel）の米国特許第5,284,763号（1994年２月８日発行）に記載されている。発明者チュウ（Chu）等の米国特許第5,258,029号（1993 年11月２日に発行）は、コラーゲン組成物又はセラミックスによって保持されたＴＧＦ-βを含有するプロテーゼ（prothesis）であって移植後に骨内方成長（bo ny ingrowth）が生じる応力-ベアリングプロテーゼ（stress-bearing prothesis ）の調製物を記載している。発明者ハンジカー（Hunziker）の米国特許第5,368, 858号（1994年11月29日発行）は、増殖作用剤、化学走化性剤及びトランスフォーミング因子としてＴＧＦ-βｓを含む生物分解性マトリックスの調製物を記載している。発明者パラジノ（Palladino）等の米国特許第5,055,447号（1991年10月８日発行）は、菌血症感染(bacteremic injection)で生じる敗血症性ショックを治療又は予防するための方法及び組成物を記載している。それ故、例えば、この特許はトランスフォーミング増殖因子-βの投与による、敗血症性ショックを患っているか又はその危険性のある患者の治療法を教示している。最近、「敗血症」の概念は、炎症状態であるという、より広範囲に考えられており、ある研究者グループは「敗血症」（血流中の細菌の存在による感染）並びに他の（非敗血症性）炎症状態の両方を表現する名称「全身性炎症応答症候群」を提案している。Chest 、101、1644〜1655頁（1992年）。かくして、増殖因子は多数の治療、臨床、研究、診断及び医薬品設計適用において有用である。しかしながら、上述したように、増殖因子は典型的には大きい。トランスフォーミング増殖因子-βファミリーの天然のメンバーは分子量が25K D ａ以上に及んでいる。ＴＧＦ-βｓを含む増殖因子の臨床的な用途は、これら因子の大きさのため、例えば、免疫応答を引き起こすため、制限されることがある。例えば、ヒトＴＧＦ-β１は25,000ダルトンのホモ二量体タンパク質である。考え得る不利な免疫学的応答に加えて、大きなタンパク質はしばしば、投与や送達が困難であるため、医薬品の最良の候補ではない。従って、天然増殖因子の小さなペプチド模擬体は上記問題の大部分を回避するので、ＴＧＦ-βが用いられているか又は提案されている適用を含む適用に望ましいであろう。大きな天然メンバーの生物学的活性を模擬する小さなペプチドを有することは、モル対モルに基づいて小さなペプチドは正味投与量がはるかに少なくて済み、且つ局所施用が一層実現可能であると思われるため、有利であろう。更に、かなり小さなペプチドは不利な免疫学的応答を殆ど又は全く有していない傾向があり、かつ単純なペプチド化学的方法を使用して容易に合成することができよう。発明の要約本発明はＴＧＦ-βを模擬するペプチドの特徴、特性及び用途を記載する。ＴＧＦ-β活性に決定的に重要な特徴は、生理的条件下でこのペプチドが安定なβ 屈曲構造を維持し得ることであるので、本発明のペプチドは集合的にβ屈曲ペプチドと称される。 β屈曲ペプチドは次の初期アミノ酸配列、ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2を有する。ここで、ＡＡ_iはアラニン、アスパラギン又はロイシンであり、ＡＡ_i+1はバリン又はイソロイシンであり、ＡＡ_i+2はアラニンである。この配列は直後に又は近位に、カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸を有している。カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸残基は必ずしも直後に続いている必要はない、即ちＡＡ_i+2に隣接している必要はないので、これはＡＡ_i+n（式中、ｎは３と等しいか又はそれより大きい整数である）として示される。ｎが３より大きい場合には、ｎ−３（「ｎマイナス３」）個のアミノ酸残基が上記ペプチド配列中のＡＡ_i+2とＡＡ_i _+n の間にあろう。例えば、新規なβ屈曲ペプチドは配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3を含んでいることができ、この式において、ＡＡ_iからＡＡ_i+2までは上記のとおりであり、そしてＡＡ_i+3はカルボニル含有側鎖を有するアミノ酸残基である（且つグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである）。もう１つの例は、配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3-ＡＡ_i+4である。ここで、カルボニル含有側鎖を有する残基は上記初期配列に直接隣接しておらず、その代わりに初期配列の近位にある。この場合には、ＡＡ_iからＡＡ_i+2までは上記したとおりであり、ＡＡ_i+3は任意の適切なアミノ酸であり、ＡＡ_i+4はグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである。更にもう１つの例は、配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3-ＡＡ_i+4-ＡＡ_i+5である。ここで、ＡＡ_iからＡＡ_i+2 までは上記したとおりであり、ＡＡ_i+3及びＡＡ_i+4は適当なアミノ酸であり、そしてＡＡ_i+5はグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである。ＴＧＦ-β活性を有していることが見出された最初のペプチドは、「サイトモジュリン（cytomodulin）」と命名されている。本発明の特に好ましい態様、サイトモジュリンは、10^-9〜10^-6Ｍ（1.4pg/mil〜1400pg/mil）の濃度範囲で培養中の細胞に添加したとき、幾つかの異なる細胞型である非常に特異的なＴＧＦ- β効果を誘発する。例えば、観察された効果のなかには、Ｍｖ−１−Ｌｕミンク肺上皮細胞でのＤＮＡ合成の阻止、軟寒天中のＮＲＫ-49Ｆ線維芽細胞による成長及びコロニー形成、並びに新生児ヒト皮膚線維芽細胞の初期培養物中のＩ型コラーゲンの増大した発現誘導がある。更に、ヒト骨原性肉腫（ＨＯＳ）細胞系での初期結果によって、サイトモジュリンはまた、骨芽細胞表現型に特徴的なマーカー（アルカリホスファターゼやオステオネクチン）を特異的に刺激し得ることで証明されているように、ＴＧＦ-βスーパーファミリーの他のメンバー、例えば、骨誘導因子（ＢＭＰｓ）や骨形成タンパク質（ＯＰｓ）の模擬体である可能性が示されている。新規なβ屈曲ペプチドは当該技術分野に知られている技術で容易に合成される。かくして、本発明の１つの特徴において、ＴＧＦ-βによって誘発される応答に特徴的な応答を誘発する生物学的に活性なペプチドが提供される。本発明のもう１つの特徴において、組織修復用組成物は少なくとも１つの新規なβ屈曲ペプチドと組み合わせた生物適合性マトリックスを含有する。この生物適合性マトリックスは生物分解性又は生物非分解性であることができる。このペプチド（単数又は複数）は細胞成長を促進するのに有効な量でマトリックスと混合されるか又はマトリックスに保持される。このようなマトリックスは軟組織及び硬組織修復用、喪失組織の迅速な置換用、並びに再構築及び形成外科用の鋳型を構築するのに有用である。このような複合体（composite）は、細胞再生を提供及び維持し、かつ他の増殖因子と組み合わせて使用できるが、驚いたことに、本発明の特に好ましい態様のペプチドであるサイトモジュリンは、上皮増殖因子や血小板由来増殖因子のような更なる増殖因子が存在しなくても線維芽細胞コロニー形成を誘導する。本発明のさらにもう１つの特徴において、少なくとも１つの新規なβ屈曲ペプチド、及び生理学的に適合する担体を含有する医薬製剤が提供される。本発明の新規なβ屈曲ペプチドは、ＴＧＦ-βｓの少なくとも１つの生物学的活性を模擬している生物学的活性、例えば、Ｍｖ−１−Ｌｕミンク肺上皮細胞におけるＤＮＡ合成の阻止、ＮＲＫ-49Ｆ線維芽細胞による成長及びコロニー形成の促進、Ｉ型コラーゲンの増大した発現の誘導、及び／又はＴＧＦ-β発現の誘導を有している。図面の簡単な説明図１は、サイトモジュリンによるＭｖ−１−Ｌｕミンク肺上皮細胞のＤＮＡ合成の阻止をグラフで示しており；図２は、ＮＲＫ-49Ｆ正常ラット腎臓線維芽細胞を有する軟寒天中、全５日間の顕徽鏡写真（倍率500倍）であり、パネル（Ａ）はコントロールであり、パネル（Ｂ）は100ｎＭサイトモジュリンであり、パネル（Ｃ）は100ｎＭサイトモジュリン＋ＥＧＦ及びＰＤＧＦであり；図３は、サイトモジュリンによるＨＯＳ細胞における遺伝子発現の調節をグラフで示しており、パネル（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）は発現の増加を示す一方、パネル（Ｃ）は濃度に依存して調節された活性を示しているが、これはまさに細胞内のＴＧＦ-βの特徴である；図４は、パネル（Ａ）〜（Ｄ）を有しており、これらは図３やその各パネル（Ａ）〜（Ｄ）にグラフで示したデータに対応するノーザンブロットであり；図５は、本発明の態様のサイトモジュリンの原子の番号１〜101の原子座標を示し；図６はサイトモジュリン類似体、Leu-Ile-Ala-Pro-Glu-Ala（配列番号:３又は "L1"）及びLeu-Ile-Ala-Glu-Ala-Lys（配列番号:２又は"L2"）によるＭＶ−１− Ｌｕ細胞の増殖阻止曲線を示し；かつ図７は、新生児ヒト皮膚線維芽細胞におけるサイトモジュリン類似体、L1及び L2、並びにＴＧＦ-βによるコラーゲンα１（Ｉ）の誘導を示す。好ましい態様の説明ＴＧＦ-βの小さなペプチド模擬体を調製した。ＴＧＦ-β活性に決定的に重要な特徴は、ペプチドが生理的条件下で安定なβ屈曲構造を維持できることであるので、本発明のペプチドは集合的にβ屈曲ペプチドと称される。本発明のペプチドは次の初期アミノ酸配列、ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2を有する。ここで、ＡＡ_iはアラニン、アスパラギン又はロイシンであり、ＡＡ_i+1はバリン又はイソロイシンであり、ＡＡ_i+2はアラニンである。この配列は直後に又は近位に、カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸を有している。カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸残基は必ずしも直後に続く必要はない、即ちＡＡ_i+2に隣接している必要はないので、これはＡＡ_i+n（式中、ｎは３と等しいか又はそれより大きい整数である）として示される。ｎが３より大きい場合には、ｎ−３（「ｎマイナス３」）個のアミノ酸残基が上記ペプチド配列中のＡＡ_i+2とＡＡ_i+n の間にあろう。本発明の１つの態様において、ｎは３であり、それ故上記カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸残基はＡＡ_i+3である。この結果、次の配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3を有するペプチドが得られる。ここで、ＡＡ_i、ＡＡ_i+1及びＡＡ_i ₊₂ は上記した通りであり、ＡＡ_i+3はグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである。ＴＧＦ-β活性を有する元のペプチドであって本発明の特に好ましい態様であるサイトモジュリン、Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala （配列番号：１）はこのクラスのものである。ここで、ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2- ＡＡ_i+3はサイトモジュリンのＮ末端の２番目から５番目までの残基、-Asn-Val- Ala-Glu-、に相当する。他の好ましい態様はペプチド、Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Ly s（配列番号:２）及びLeu-Ile-Ala-Glu-Ala-Ala（配列番号:１１）である。これらの例において、ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3は上記ペプチドの最初の４個の残基、Leu-Ile-Ala-Glu-に相当する。もう１つの態様では、ｎは４であり、それ故上記カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸残基はＡＡ_i+4である。このクラスのペプチドの配列はＡＡ_i-ＡＡ_i+1- ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3-ＡＡ_i+4である。このシリーズでは、ＡＡ_i、ＡＡ_i+1及びＡＡ_i ₊₂ は上記した通りであり、ＡＡ_i+3はプロリンか又はグリシンであり、かつＡＡ_i ₊₄ はグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである。このクラスの好ましい態様は、Leu-Ile-Ala-Gly-Glu-Gly（配列番号:１４）である。特に好ましい態様はペプチド、Leu-Ile-Ala-Pro-Glu-Ala（配列番号:３）である。上記の２つの例においては、最初の５個のＮ末端アミノ酸がＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3-ＡＡ_i+4に相当する。本発明のさらにもう１つの態様では、ｎは５であり、それ故上記カルボニル含有側鎖を有するアミノ酸残基はＡＡ_i+5である。このクラスのペプチドの配列は、ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3-ＡＡ_i+4-ＡＡ_i+5である。このシリーズでは、ＡＡ_i、ＡＡ_i+1及びＡＡ_i+2は上記した通りであり、ＡＡ_i+3及びＡＡ_i+4はグリシンであり、ＡＡ_i+5はグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンである。このシリーズの特に好ましいメンバーはペプチド、Leu-Ile-Al a-Gly-Gly-Glu（配列番号:13）である。この特別の例においては、配列番号:３と配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2-ＡＡ_i+3-ＡＡ_i+4-ＡＡ_i+5間が一対一で対応している。本発明のペプチドは当該技術分野で良く知られている種々の適切な方法、好ましくはメリフィールド（Merrifield）によって最初に開発され且つスチュワート（Stewart）等のSolid Phase Peptide Synthesis（1984年）に記載されている手動又は自動固相合成で合成することができる。化学的合成はＣ末端から始まる予め定められた配列内にアミノ酸を結合させる。基本的な固相法にはＣ末端保護α -アミノ酸を適当な不溶性樹脂支持体とカップリングさせることが必要である。合成するためのアミノ酸は、先行する残基（又は樹脂支持体）と適切なペプチド結合を確実に形成させるために、α-アミノ基を保護しなければならない。カルボニル末端での縮合反応の完了後、α-アミノ保護基を除去してその次の残基を加える。α-保護基の幾つかのクラスは記載されており（スチュワート等、Solid Phase Peptide Synthesis（1984年）参照）、酸に不安定な、ウレタンに基づく第三級ブチロキシカルボニル(Boc)が歴史的に好ましい。塩基に不安定な９-フルオレニルメチロキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を含む他の保護基や関連する化学的方策を使用することができる。更に、反応性のアミノ酸側鎖官能基も合成が完了するまでブロックしなければならない。複雑な一連の官能ブロック基は、これらの使用に対する方策や制限と共に、ボダンスキィ（Bodansky）のPeptide Synthe sis（1976年）及びスチュワート等のSolid Phase Peptide Synthesis（1984年）中で総説されている。固相合成は上記したＣ末端のα-保護アミノ酸残基のカップリングによって開始される。カップリングには、１-ヒドロキシベンゾ-トリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＩＰＣ）又はエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）と共にか又はこれら無しにジシクロヘキシカルボジイミド（ＤＣＣ）のような活性化剤が必要である。Ｃ末端残基のカップリング後、α-アミノ保護基は、酸に不安定な第三級ブチロキシカルボニル(Boc)基の場合には、ジクロロメタン中トリフルオロ酢酸（25％以上）で除去する。ジクロロメタン中トリエチルアミン（10％）による中和段階で遊離アミン（塩に対する）が回収される。Ｃ末端残基を樹脂に付加した後、保護されたペプチド鎖を延長するために、脱保護、中和及びカップリングのサイクルを、中間に洗浄段階を入れて繰り返す。保護された各アミノ酸は、適切な溶媒中等モル量のカップリング試薬と共に、過剰に（３〜５倍）導入する。最後に、完全にブロックされたペプチドを樹脂支持体上に組み立てた後、試薬を適用して樹脂からペプチドを開裂させ、側鎖ブロック基を除去する。無水フッ化水素（ＨＦ）は酸に不安定な第三級ブチロキシカルボル(Boc)化学基を開裂する。ジメチルスルフィドやアニソールのような幾つかの親核スカベンジャーを加えて、特に側鎖官能基の副反応を回避する。 β屈曲ペプチド配列のアミノ酸を僅かに修飾しても、安定なβ屈曲構造を形成するペプチドの能力に影響を与えないと考えられている。これらの修飾には、Ｎ及びＣ末端残基の両方にブロック基を付加するような、酵素分解に対して抵抗性を付与する技術が含まれる。腎臓系による分解及び早期クリアランス（prematur e clearance）を防止するもう１つの方法は、ペプチド配列内に非天然アミノ酸置換基を使用することである。例えば、Ｎ-メチル-アラニンがアラニンの代わリにしばしば使用され、α-アミノイソ酪酸及びα-アミノ酪酸が嵩高な疎水性アミノ酸の代わりに使用される。尚もう１つの技術はペプチド配列中のＬ-アミノ酸残基をＤ-アミノ酸対応物で置換することである。例えば、アラニンをＤ-アラニンで置換することができる。新規なβ屈曲ペプチドは、生存を高めるか又は神経及び筋細胞の成長を誘導する作用剤としての用途が見出されていると考えられる。β屈曲ペプチドは、勿論、神経細胞のインビトロ培養に使用される培養培地の新規成分として有用である。本発明のペプチドはまた、多数の分野で天然サイトカインの代替品としての有用性も有している。多数の分野には、外科での創傷治癒及び再生を促進する作用剤として;整形外科での骨修復及び移植片取り込みの促進において;歯科医学での骨欠損の修復及び移植片取り込みにおいて;癌化学療法及び放射線治療での細胞周期に特異的な方法に対して正常な幹細胞を保護する細胞分裂抑制剤として;リウマチ様関節炎の治療において;眼科学での斑性損傷の修復用に;眼科学でのブドウ膜炎の治療用に;内臓動脈閉塞再潅流損傷用の保護剤として;並びに増殖因子の生物学における研究用試薬として、が含まれる。本発明の治療用組成物には、必要な有効投与量や使用される投与様式に左右される濃度の新規なβ屈曲ペプチドが含まれよう。少なくとも１つのβ屈曲ペプチドを含む組成物の種々の治療的な適用は容易に想起されるであろう。１つの適用は、創傷治癒を促進するために切開又は暴露組織に対する局所施用である。処置できる創傷又は他の外傷のタイプには;第１度、第２度及び第３度の火傷（特に第２度及び第３度）;美容外科を含む表皮及び内部外科切開;裂傷、切り傷及び穿通を含む創傷;並びに褥瘡（床擦れ）、糖尿病、歯科、血友病者及び静脈瘤を含む表皮潰瘍、が含まれる（が、これらに限定されない）。全身投与、局所施用、静脈内投与、皮下投与、腹腔内注射、骨膜下注射、気管内投与、ポリマー若しくはポンプからの放出、移植片、又はリポソームからの放出のような多様な方法で使用することができる。適切な移植片（埋め込みデバイスを使用する場合）には、例えば、ゲル泡状物、ワックス又は微粒子に基づく移植片が含まれる。使用する投与量は、有効成分の有効な循環血漿濃度を達成するのに十分でなければならない。有効投与量は、インビトロ又は動物モデル試験系から誘導される投与量−応答曲線から外挿することができる。本発明のペプチドはまた、骨の成長を誘導するためにも有用である。それ故、医薬上許容可能な担体又は賦形剤に、骨形成に有効な量の少なくとも１つのβ屈曲ペプチドを、その部位の骨の沈着及び成熟を誘導するために投与することができる。更に、このペプチド（単数又は複数）は、米国特許第5,158,934号（1992 年10月27日発行）、米国特許第5,208,219号（1993年５月４日発行）に記載されているような方法や米国特許第5,178,845号（1993年１月12日発行）に記載されているような組成物によって、骨生成又は修復適用のためのヒドロキシアパタイトのような生物材料と混合するか又はこのような生物材料によって保持されていることができる（上記特許は全て本明細書に参照として含まれる）。このような骨修復組成物は典型的には、例えばシントグラフト（Syntograft）、トリカルシウムホスフェート（Tricalcium Phosphate）又はペリオグラス（Pe riogras）の名称で市販入手可能なヒドロキシアパタイトのような種々のリン酸カルシウムミネラル成分物質を含んでいる。ヒドロキシアパタイト（又はリン酸トリカルシウム）は市販で購入するというよりはむしろ、テルミン（Termine）等、Arch．Biochem．Biophys.、140、TP307〜325（1970年）によって開示されているような既知の方法で製造することができる。このような物質は、典型的には約100〜2000μの範囲の好ましい粒径を有する粉末として供給することができる。少なくとも１つのβ屈曲ペプチドを含む組成物のもう１つの治療的な適用ではマトリックス形成材料と一緒に使用される。好ましくは、これらの製剤は、骨及び軟骨発生用の構造を提供し得るマトリックスを含んでいる。使用できるマトリックスは生物分解性又は生物非分解性であることができ、そして化学的に又は生物学的に特定することができる。１つの例として、上記マトリックスは、細胞培養用容器として知られており且つ現在使用されているような、不活性で、固形で且つ非多孔性であることができる。本発明のマトリックスが採り得るもう１つの形態は、可溶性ポリマーの形態である。本発明の実施に適する他のマトリックスには種々のポリマーやヒドロゲルが含まれる。このような複合体は軟組織の修復、喪失組織の迅速な、置換並びに再構築及び形成外科用の鋳型構築に有用である。かくして、本発明の複合体は、ポリマー材料の格子で保持されているか又はこのような格子上に埋め込まれたペプチドを有する種々の種類の再吸収性ポリマーを使用して製造することができる。勿論、再吸収特性で限定されるポリマー支持体、例えば２、３の例としては、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリメチルメタクリレート及びＮ-ビニルピロリドンメチルメタクリレートも実施可能である。次いで、これら複合体を組織欠損部に埋め込むことができる。既知であり且つ適切な再吸収性ヒドロゲルのなかにはポリラクテート（polyla ctacte）とポリグリコレートの組合せがある。本発明の化合物はポリマー自体の合成中に上記の材料と共有結合させることができるか、又はポリマーを加水分解し、その結果ポリマーを照射するか若しくは化学的に活性化して遊離基を生成させることによって結合部位を利用できるようにすることができる。次に、ペプチドをポリマー支持体上にグラフト化するか又は固定化する慣用の技術を使用して本発明の複合体を調製することができる。このようにして調製した再吸収性ヒドロゲル又はポリマーは軟組織の再構築に特に有用である。硬組織の再構築又は修復（例えば、骨修復）には、このような水溶性又は再吸収性ポリマー種を、例えばバイオガラス（bioglass）、酸化アルミニウム、アルミン酸カルシウム、リン酸トリカルシウム及びヒドトキシアパタイトのようなバイオセラミックスと組み合わせることが望ましい。 β屈曲ペプチドを生理学上許容可能な担体、即ち使用される投与量及び濃度で受容者に毒素でない担体、と混合して投与用に調製するとき、これには通常、本発明のペプチド（単数又は複数）を緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約10個未満の残基）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース又はデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート化剤及び他の賦形剤と組み合わせることが包含されよう。治療投与で使用される本発明のペプチドは無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過（0.22ミクロン）膜でろ過することによって容易に達成される。上記の新規なβ屈曲ペプチドは任意の薬理学上許容可能な担体中で投与することができ、所望の投与様式に依存して、液体担体と一緒にリポソーム、マイクロカプセル、ポリマー若しくはワックスに基づく製剤及び放出制御製剤に処方するか又は錠剤、ピル若しくはカプセル形態に処方することができる。上記ペプチドは、有機酸及び無機酸と医薬上許容可能な塩を形成し、塩の形態で投与することができるか、又はこの新規なβ屈曲ペプチドをアミド化することができる。医薬上許容可能な塩を形成するのに適する酸の例は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、グルコン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベンゼンスルフォン酸、メタン-及びエタン-スルフォン酸、ヒドロキシメタン-及びヒドロキシエタン-スルフォン酸である。塩はまた、医薬上許容可能な適当な有機塩基付加塩を使用して形成することもできる。これらの有機塩基は１つのクラスを形成し、その限界は当該技術分野の熟練者に容易に理解される。単なる説明だけの目的では、上記のクラスには、モノ-、ジ-及びトリ-アルキルアミン、例えばメチルアミン、ジメチルアミン及びトリエチルアミン;モノ-、ジ-又はトリ-ヒドロキシアルキルアミン、例えばモノ -、ジ-及びトリ-エタノールアミン;アルギニンやリジンのようなアミノ酸;グアニジン;Ｎ-メチル-グルコサミン;Ｎ-メチル-グルカミン;Ｌ-グルタミン;Ｎ-メチルピペラジン;モルホリン;エチレンジアミン;Ｎ-ベンジルフェネチルアミン;トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等が含まれると言うことができる。（例えば、"Pharmaceutical Salts"、J．Pharm．Sci.、66(1)、1〜19（1977年）参照）。骨細胞の成長を促進させるためのような、少なくとも１つのβ屈曲ペプチドを含む治療用製剤は、所望の純度を有する上記の新規なペプチドのうちの少なくとも１つを生理学上許容可能な任意の担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で貯蔵用に調製することができる。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、投与時に使用される投与量及び濃度で受容者にとって非毒性であり、そしてリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び他の有機酸緩衝液のような緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量（約10個未満の残基）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンを含む。他の成分にはグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン; 単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;ＥＤＴＡのようなキレート化剤;マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール;ナトリウムのような塩形成対イオン;及び／又はトゥイーン（TWEEN）、プルロニックス（PLURONICS）又はＰＥＧのような非イオン界面活性剤を含めることができる。望ましくはサイトモジュリンの治療用製剤に含められる更に別の有用な成分は、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のような１つ又はそれより多い他の増殖因子である。創傷治癒のような局所施用用の新規なβ屈曲ペプチドの初期投与量は、約50〜 500ng/mlの濃度で治療部位に送達され、その後臨床的経験に沿って調節されるであろう。本発明の組成物は細胞再生をもたらして持続するので、これら組成物の継続的な適用又は定期的な再適用が指示される。臨床医には臨床経験に従って投与量を修正することが期待されよう。組成物は、無菌潅注液の形態で、好ましくは生理的食塩水と組み合わせて、又は軟膏若しくは懸濁液の形態で、好ましくは上記したような他の増殖因子と、さらにそれに加えてコラーゲン、コラーゲン類似体、又は例えば発明者バトナガー（Bhatnagar）の米国特許第5,354,736号（1994年10月11日発行）（これは本明細書に参照として含まれる）に記載されているようなコラーゲン模擬体と組み合わせて、使用することができる。これらの組成物はまた、好ましくは液体又は半液体の形態で経皮パッチ、プラスター及び包帯に含浸させることもできる。銀スルファジアジンのような抗菌剤（Automicrobial）が上記物品又は組成物中に含められよう。 β屈曲ペプチドはまた、創傷や類似の外傷を治療するために全身に投与することもできる。全身投与は、癌患者で新生物の細胞成長を刺激するような望ましくない副作用が全くないか又は限定されている場合には、有用である。全身投与用の組成物は、好ましくは無菌で等張な非経口注射剤又は注入剤として処方される。上記したように、β屈曲ペプチドだけを有しているか又は他の増殖因子、コラーゲン、上記した生理学上許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と組み合わせた本発明の組成物は、生物学的に適合可能なマトリックスで保持する（又は該マトリックスと混合する）ことができる。本発明のマトリックスは多孔性であり且つビーズ、微粒子又は繊維性の形態であることができる。例えば、アパタイトベースのセラミックスのようなリン酸カルシウム材料が、多孔性組織移植片又は組織を結合させるのに十分な微小孔を有するプロテーゼ材料の製造用に提案されている。かくして、本発明の組成物が治療的に適用されるのは、マトリックス形成物質が生物分解性であり、例えば軟骨修復に使用できる場合である。軟骨の欠損を充填するか又はそうでない場合、被覆するのに有用なマトリックス材料には、例えば、フィブリノゲン（トロンビンで活性化されて欠損部又は病変でフィブリンを形成する）、コラーゲン、ゼラチン又は修復細胞のマトリックス内での定着及び増殖を可能にする程十分大きな孔を有するマトリックスを形成し且つ修復過程中に分解されて軟骨で置換され得る任意の他の生物分解性材料が含まれる。本発明の組成物及び方法において有用なマトリックスは予め形成するか、又は例えばフィブリノゲンのような化合物や組成物を重合化してフィブリンマトリックスを形成させることによってその場で（in situ）形成することができる。予め形成することができるマトリックスにはコラーゲン、コラーゲン類似体又はコラーゲン模擬体（例えば、コラーゲンスポンジ及び羊毛状コラーゲン）、化学修飾されたコラーゲン、ゼラチンビーズ若しくはスポンジ、ゲル形成物質、組織若しくは骨欠損部を充填しかつ修復細胞がマトリックスに定着するのを可能にする生物分解性マトリックス材料で構成される任意の他のゲル形成若しくは複合物質、或いは上記の混合物を含めることができる。本発明のペプチドの生物学的活性を、ここで、以下の実施例によって更に説明する。これらの実施例は説明のためであって限定を意図したものではない。実施例１Ｍｖ−１−Ｌｕミンク肺上皮細胞のＤＮＡ合成の阻止ＴＧＦ-β及びサイトモジュリンの効果を、酸不溶性ＤＮＡ全体への［¹Ｈ］チミジン取り込み率及び細胞数を測定して評価した。一般的には、サンパス（Samp ath）等、Journal of Biological Chemistry、267、20352〜20362頁（1992年）を参照のこと。ＤＮＡ合成率は種々の濃度（10^-9Ｍ〜10^-6Ｍ）のＴＧＦ-β又はサイトモジュリン（これはMerrifield法で合成した）で24時間処理した後、培養終了６時間前に［メチル-³Ｈ］チミジン（２μＣｉ/ml、80Ｃｉ/mmol）を添加して、三重複培養物で測定した。培地を吸引して取り込みを終了させ、リン酸緩衝食塩液で３回洗浄した後、トリクロロ酢酸（10％）で沈殿させた放射性ＤＮＡを 1.0％（ｗ/ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、0.1M ＮａＯＨで抽出し、液体シンチレーション計数で定量した。細胞数測定では、１×10⁵個の細胞を10％ＦＢＳ含有ＭＥＭ中でフラスコに播き、24時間後、成長培地を種々の濃度(conceptions) のＴＧＦ-β及びサイトモジュリンを含む無血清培地で置換した。三重複培養物を７日の期間中24時間毎に採集し、細胞数を、固定量血球計中でトリプシン消化によって放出された細胞を計数して測定した。サイトモジュリンの成長阻止曲線は同じ濃度範囲のＴＧＦ-βで観察されたものと類似していた。実施例２軟寒天中でのＮＲＫ-49Ｆ線維芽細胞による成長及びコロニー形成ＴＧＦ-β活性、即ち正常な線維芽細胞の足場非依存性成長を促進する能力に関するオリジナルアッセイは依然としてＴＧＦ-β活性の品質証明の１つである。ＮＲＫ-49Ｆ線維芽細胞を、10％ウシ胎児血清を補充したＤＥＭ中37℃で成長させた。これらの実験は、培養培地、10ng/mg上皮増殖因子（ＥＧＦ）及び10ng/ ml血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を使用して実施したが、これら因子の不存在下ではコロニー形成を誘導しない（例えば、Massagu、J．Biol．Chem.、259、97 56〜9761頁（1984年）参照）ＴＧＦ-βとは異なって、サイトモジュリンはこれら２つの増殖因子が無くてもコロニー形成を誘導した。これに100nM ＴＧＦ-β （陽性コントロール）又は100ｎＭサイトモジュリンを添加した。ＮＲＫ-49Ｆ線維芽細胞（５×10⁴個の細胞／ml）を0.3％寒天と混合し、35mm培養皿の底部に播いた。コロニー形成は培養３日目に開始することが観察された。予想されたように、基本培地だけを含む培養物ではコロニーは形成されなかった。更に、予想されたように、ＴＧＦ-βを有するコロニーはコロニーが生育した。驚いたことに、サイトモジュリン培養物もＴＧＦ-β培養物とほぼ同程度にコロニーを形成した。期間中のコロニーの生育特徴はＴＧＦ-βとサイトモジュリン培養物間で類似していた。図２を参照すると、線維芽細胞培養５日目に撮影した顕微鏡写真が示されている。コロニー形成は実際には培養３日目に開始することが観察された。図２（Ａ）に見られるように、増殖因子が全く存在していない培養では細胞は殆ど生き残らなかった。図２のパネル（Ｂ）及びパネル（Ｃ）は、サイトモジュリンの存在下で小さなコロニー（矢印）が形成されることを示しており、ＥＧＦ及びＰＤＧＦも含むパネル（Ｃ）ははるかにより大きなコロニー（矢印）を誘導した。これは、ＴＧＦ-βでは上皮増殖因子（ＥＧＦ）と血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が同時に存在しなければならないことを除いて、ＴＧＦ-βによるコロニー形成の誘導と類似している。しかしながら、パネル（Ｂ）に見られるように、サイトモジュリンはそれ自体でコロニー形成を誘導した。実施例３ＲＮＡ単離とノーザン分析総細胞ＲＮＡを、本質的にマニアチス（Maniatis）によって記載された方法を用いて単離した。サムブルック（Sambrook）等、Molecular Cloning:A Laborato ry Mannual、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Ha rbor Laboratory Press、第２版（1989年）。0.5％ＳＤＳ及び0.1酢酸カリウムを使用して細胞を溶解した。この溶解物をフェノールで抽出し、5000rpmで15分間遠心した。水性相を0.1Ｍトリス、ｐＨ8.0及び0.2M ＮａＣｌ中２容量のエタノールで沈殿させた。このペレットを再懸濁し、260nmでの紫外線吸光度を測定して定量した。ＲＮＡの純度は260nmの紫外線吸光度を280nmの吸光度と比較して評価した。ＲＮＡ（10μg/レーン）を、2.2Ｍホルムアルデヒド変性の0.7％アガロースゲルを通して３〜４ｖ/cmで電気泳動にかけた。ＲＮＡは、毛細管移動によってナイロン膜に移動させた。ＲＮＡの無欠性、ゲル負荷及び移動効率はメチレンブルーで染色された28Ｓ及び18Ｓバンドによって評価した。これらのフィルターを80 ℃で２時間焼いてＲＮＡを固定化した。焼いた後、フィルターは、１mＭＥＤＴＡ、７％ドデシル硫酸ナトリウム及び１％ウシ血清アルブミンを含む0.5ＭＮａＰＯ₄緩衝液、ｐＨ7.0中、65℃でハイブリッドを形成させた。ｃＤＮＡプローブは、クレノウ（Klenow）酵素を使用してランダムプライマー法によってｄＤＩＧ（蛍光プローブ）で標識化した。65℃で18時間ハイブリッドを形成した後、洗浄を実施した。データは、製造者の手順（Boehringer Mannheim Biochemica、ＤＩＧＤＮＡ標識キット、カタログ番号1175033）に従ってジゴキシゲニン（digoxigenin）− ｄＶＴＰを走査して分析した。実施例４活性に必要な安定なβ屈曲図５は、サイトモジュリン（原子１〜101）の生物活性構造の原子座標を示す。それ故、図５で示される構造は、ＴＧＦ-β活性に必要と思われるβ屈曲を記載している。理論で限定されないが、構造−活性モデルが正しい場合、サイトモジュリンと実質的に同じ構造を有する類似体もＴＧＦ-β様活性を示すであろう。同様に、アロステリック結合メカニズムを利用して、サイトモジュリンに関して活性が上昇した又は低下した化合物を合成することができる。実施例５指標としてサイトモジュリンの三次元構造（図５）を使用して、２つの初期サイトモジュリン類似体を設計した。この構造の研究から、重要な特徴は、安定な β屈曲に関与する-Val-Ala-配列とそのすぐ後の負に荷電した側鎖であるように思われた。この点で、有効に機能する構造−活性プロフィールは、（１）ｉ位に疎水性又は中性アミノ酸; （２）ｉ＋１位に分枝疎水性; （３）ｉ＋２位に小さな脂肪族、その際ｉ＋１位とｉ＋２位は一緒になって決定的に重要なβ屈曲構造を形成する;及び（４）ｉ＋３がプロリンである場合、すぐ後のｉ＋３か又はｉ＋４のどちらかに負に荷電した側鎖、であった。この仮説を試験するために、２つのサイトモジュリン類似体、Leu-Ile-Ala-Gl u-Ala-Lys（配列番号:２即ちＬ２）及びLeu-Ile-Ala-Pro-Glu-Ala（配列番号:３即ちＬ１）を合成し試験した。これらの両ペプチドでは、-Val-Ala-は-Ile-Ala- で置換され、サイトモジュリンの最初の２つのＮ末端アミノ酸配列はロイシンで置換されていた。配列番号３では、グルタミン酸がβ屈曲構造後の最初の側鎖であるので、グルタミン酸はｉ＋３位にある。配列番号４では、プロリンがｉ＋３位にある。プロリンは「側鎖」を有していないので、グルタミン酸をｉ＋４位に配置した。サイトモジュリン類似体、Ｌ１及びＬ２は共に、サイトモジュリンと少なくとも同程度のＴＧＦ-β様活性を示した。これらは軟寒天中でＮＲＫ-49Ｆ細胞の成長を促進し、ＭＶ−１−Ｌｕ細胞の増殖を阻止した（図６参照）。これらはヒト皮膚線維芽細胞でＩ型コラーゲン及びＴＧＦ-βの発現を高め（図７参照）、コラーゲナーゼ発現を低下させた。更に、サイトモジュリンと同様に、Ｌ１及びＬ２もＨＯＳ細胞でＩ型コラーゲン、ＴＧＦ-β及びアルカリホスファターゼの発現を高めた。実施例６ＴＧＦ-β様活性の配列要件を更に精査するために、配列番号２及び配列番号３の類似体を作製した。上記の目的で、次のペプチドを作製した。 Leu-Aib-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:４） Leu-Ile-（Nme-Ala）-Glu-Ala-Lys （配列番号:５） Leu-Abu-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:６） Gly-Gly-Gln-Ile-Ala-Asn-Ile （配列番号:７） Glu-Gly-Ile-Ala-Gly-Lys （配列番号:８） Leu-Ile-Ala-Asp-Ala-Lys （配列番号:９） Leu-Ile-Ala-Asn-Ala-Lys （配列番号:10） Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Ala （配列番号:11） Leu-Ile-Ala-Gln-Ala-Lys （配列番号:12） Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Glu （配列番号:13） Leu-Ile-Ala-Gly-Glu-Gly （配列番号:14） Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Lys （配列番号:15） Leu-Ile-Ala-Lys-Gly-Lys （配列番号:16）標準的でないアミノ酸のうちで、Aibはα-アミノイソ酪酸であり、Nme-AlaはＮ- メチルアラニンであり、Abuはα-アミノ酪酸である。配列番号２の些細な改変体である配列番号４〜６は、Ｍｖ−１−Ｌｕ上皮細胞の増殖阻止で示されるＴＧＦ-β及びサイトモジュリンの生物学的活性を模擬しており、ＨＯＳ細胞でコラーゲンＩとＴＧＦ-βの発現を高めた。配列番号４〜６のサンプルチミジン取り込みデータを表１に示す。しかしながら、配列番号７〜８は顕著なＴＧＦ-β活性を示さなかった。これは、有効に機能するモデルを所与のものとすると、予期されないわけではなかった。負に荷電した側鎖を有するアミノ酸が配列番号:７には存在していない。グルタミン酸が配列番号８には存在しているが、これはβ屈曲のＮ末端側にあってサイトモジュリン、Ｌ１及びＬ２のようにＣ末端側にはない。配列番号９〜16の³Ｈ-チミジン取り込み阻止結果を表２に示す。種々の濃度で示されている数値は、同じ濃度のサイトモジュリン（配列番号１）の阻止率に対して試験したペプチドの阻止率の比である。サイトモジュリンはＭＶ−１−Ｌｕ細胞の増殖をＴＧＦ-βと少なくとも同程度に阻止するので、ＴＧＦ-βではなくてサイトモジュリンをコントロールとして使用した。表２に示されるように、配列番号９〜16で表される配列を有するペプチドは全て、少なくともある量のチミジン取り込みを阻止した。これらの結果から、ＴＧＦ-β活性を有するペプチドを調製する一般的なモデルは驚くほど良好に機能するように思われる。特に１つのペプチドが特に注目に値する。配列番号10、Leu-Ile-Ala-Asn-Ala- Lysは、試験したあらゆる濃度でサイトモジュリンより更に一層ＭＶ−１−Ｌｕ上皮細胞の増殖を阻止した。配列番号10は負に荷電した側鎖を含んでいないので、有効に機能するモデルは明らかに定義し直さなければならなかった。アスパラギン及びグルタミンがグルタミン酸に取って替わっている配列番号10及び12の両者の阻止活性に基づいて、必ずしもカルボン酸基全体（ＣＯＯ−）ではなくて、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）が決定的に重要な特徴であるように思われる。カルボニル基の位置要件が探査される興味あるもう１組のペプチドは配列番号 13〜14である。これらペプチドの活性はグリシンの主鎖の異常な柔軟性の結果であるように思われる。グリシンの主鎖は実質的に全ての許容されるねじれ角度の実例を示していると思われるので、β屈曲構造の近位に配置されているカルボニル含有側鎖は、顕著なエネルギーコストを招くことなく必要な形状を達成できるであろう。配列番号13は配列番号14より柔軟であると思われるので、配列番号13 が配列番号14よりチミジン取り込みを阻止することは驚くべきことではない。もう１つの注目に値する特徴には配列番号11が含まれている。このペプチドはサイトモジュリンと少なくとも同程度の活性を示すので、Ｌ１及びＬ２のＣ末端リジンは明らかに重要でない。その結果、ＴＧＦ-β活性に必要な構造活性関係は、（１）ｉ位に疎水性又は中性アミノ酸; （２）ｉ＋１位に分岐疎水性(即ち、Val、Ile); （３）ｉ＋２位に小さな脂肪族（即ち、Ala）、その際ｉ＋１位とｉ＋２位は一緒になって決定的に重要なβ屈曲構造を形成する;及び（４）そのすぐ後のカルボニル含有側鎖、であるように思われる。好ましい特定の態様に関連して本発明を上述したが、上記説明及び実施例は説明するためであって本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本発明の範囲は、添付の請求の範囲で特定されると理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者キアン、ジン、ジンアメリカ合衆国 94066 カリフォルニア州サンブルーノエルストンドライブ 3761

Claims

【特許請求の範囲】 1. Ｎ末端を特定する初期配列として配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2を有するか又はＮ末端としてのアラニンの後に上記配列を有するペプチドであって、該ペプチドがＣ末端方向で前記配列に隣接して又は近位にＡＡ_i+n（式中、ｎは３、４又は５であり、そのため前記ペプチドがＡＡ_i+2とＡＡ_i+nの間に更にｎ−３個のアミノ酸残基を含む）を有し、かつ前記配列において、ＡＡ_iがアラニン、アスパラギン又はロイシンであり、ＡＡ_i+1がバリンもしくはイソロイシン、α-アミノイソ酪酸、又は α-アミノ酪酸であり、ＡＡ_i+2がアラニン又はＮ-メチルアラニンであり、かつＡＡ_i+nがグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンであり、これによって前記ペプチドは、ＴＧＦ-βが安定なβ屈曲を有し且つＴＧＦ-βの少なくとも１つの生物学的活性を誘発する生理的条件下で安定なβ屈曲構造を形成する、上記ペプチド。 2. ｎが３であり、前記ペプチド配列がＡＡ_i+4-ＡＡ_i+5（式中、ＡＡ_i+4及びＡＡ_i+5はアラニンである）をさらに有する請求項１記載のペプチド。 3. ｎが４であり、ＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間のアミノ酸残基がプロリン又はグリシンである請求項１記載のペプチド。 4. ｎが５であり、ＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間の２個のアミノ酸残基がグリシンである請求項１記載のペプチド。 5. Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Lys（配列番号:２）、 Leu-Ile-Ala-Pro-Glu-Ala（配列番号：３）、 Leu-Aib-Ala-Glu-Ala-Lys（配列番号:４）、 Leu−Ile-（Ｎ-メチル-Ala）-Glu-Ala-Lys （配列番号：５）、 Leu-Abu-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:６）、 Leu-Ile-Ala-Asp-Ala-Lys （配列番号：９）、 Leu-Ile-Ala-Asn-Ala-Lys （配列番号:10）、 Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Ala （配列番号:11）、 Leu-Ile-Ala-Gln-Ala-Lys （配列番号:12）、 Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Glu （配列番号:13）、 Leu-Ile-Ala-Gly-Glu-Gly （配列番号:14）及び Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Lys （配列番号:15）からなる群から選択される生物学的に活性なペプチド。 6. 生物適合性マトリック;及びＮ末端を特定する初期配列として配列ＡＡ_i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2を有するか又はＮ末端としてのアラニンの後に前記配列を有するペプチド；を含有する組織修復に有用な組成物であって、前記ペプチドがＣ末端方向で前記配列に隣接して又は近位にＡＡ_i+n（式中、ｎは３、４又は５であり、そのため前記ペプチドがＡＡ_i+2とＡＡ_i+nの間に更にｎ−３個のアミノ酸残基を含む）をさらに有し、前記配列において、ＡＡ_iがアラニン、アスパラギン又はロイシンであり、ＡＡ_i+1がバリン、イソロイシン、α-アミノイソ酪酸又はα-アミノ酪酸であり、かつＡＡ_i+2がアラニンであり、ＡＡ_i+nがグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンであり、これによって前記ペプチドは、ＴＧＦ-βが安定なβ屈曲を有する生理的条件下で安定なβ屈曲構造を形成し、前記ペプチドが細胞成長を促進するのに有効な量でマトリックスと混合されるか又はマトリックスに保持され、かつ該マトリックスが任意にAla-Asn-Va l-Ala-Glu-Asn-Ala（配列番号１）を含む、上記組成物。 7. ｎが３であり、前記ペプチド配列がＡＡ_i+4-ＡＡ_i+5（式中、ＡＡ_i+4及びＡＡ_i+5はアラニンである）をさらに有する請求項６記載の組成物。 8. ｎが４であり、ＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間のアミノ酸残基がプロリン又はグリシンである請求項６記載の組成物。 9. ｎが５であり、ＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間の２個のアミノ酸残基がグリシンである請求項６記載の組成物。 10．前記生物適合性マトリックスが生物分解性である請求項６記載の組成物。 11．前記マトリックスが再吸収性ポリマーを含む請求項10記載の組成物。 12．前記生物適合性マトリックスが生物非分解性である請求項６記載の組成物。 13．前記マトリックスが多孔性である請求項12記載の組成物。 14．生物適合性マトリックス;及び Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:２）、 Leu-Ile-Ala-Pro-Glu-Ala （配列番号:３）、 Leu-Aib-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:４）、 Leu-Ile-（Ｎ-メチル-Ala）-Glu-Ala-Lys （配列番号:５）、 Leu-Abu-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:６）、 Leu-Ile-Ala-Asp-Ala-Lys （配列番号:９）、 Leu-Ile-Ala-Asn-Ala-Lys （配列番号:10）、 Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Ala （配列番号:11）、 Leu-Ile-Ala-Gln-Ala-Lys （配列番号:12)、 Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Glu （配列番号:13）、 Leu-Ile-Ala-Gly-Glu-Gly （配列番号:14）及び Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Lys （配列番号:15）からなる群から選択される生物学的に活性なペプチド；を含有する組織修復に有用な組成物であって、前記生学物的に活性なペプチドが細胞増殖を促進するのに有効な量でマトリックスと混合されるか又はマトリックスに保持されている、上記組成物。 15．前記生物適合性マトリックスが生物分解性である請求項14記載の組成物。 16．前記マトリックスが再吸収性ポリマーを含む請求項15記載の組成物。 17．前記生物適合性マトリックスが生物非分解性である請求項14記載の組成物。 18．前記マトリックスが多孔性である請求項17記載の組成物。 19．生理学的に許容可能な担体;及びＮ末端を特定する初期配列として配列ＡＡ _i-ＡＡ_i+1-ＡＡ_i+2を有するか又はＮ末端としてのアラニンの後に前記配列を有するペプチド；を含有する医薬製剤であって、前記ペプチドがＣ末端方向で前記配列に隣接して又は近位にＡＡ_i+n（式中、ｎは３、４又は５であり、そのため前記ペプチドがＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間に更にｎ−３個のアミノ酸残基を含む）を有し、前記配列において、ＡＡ_iがアラニン、アスパラギン又はロイシンであり、ＡＡ_i+1がバリン、イソロイシン、α-アミノイソ酪酸又はα-アミノ酪酸であり、ＡＡ_i+2がアラニン又はＮ-メチルアラニンであり、かつＡＡ_i+nがグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン又はアスパラギンであり、これによって前記ペプチドは、ＴＧＦ-βが安定なβ屈曲を有し且つＴＧＦ-βの少なくとも１つの生物学的活性を誘発する生理的条件下で安定なβ屈曲構造を形成する、上記製剤。 20．ｎが３であり、前記ペプチド配列がＡＡ_i+4-ＡＡ_i+5（式中、ＡＡ_i+4及びＡＡ_i+5はアラニンである）をさらに有する請求項19記載の製剤。 21．ｎが４であり、ＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間のアミノ酸残基がプロリン又はグリシンである請求項19記載の製剤。 22．ｎが５であり、ＡＡ_i+2とＡＡ_i+nとの間の２個のアミノ酸残基がグリシンである請求項19記載の製剤。 23．前記ペプチドが塩の形態である請求項19記載の製剤。 24．生理学上許容可能な担体;及び Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:２）、 Leu-Ile-Ala-Pro-Glu-Ala （配列番号:３）、 Leu-Aib-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:４）、 Leu-Ile-（Ｎ-メチル-Ala）-Glu-Ala-Lys （配列番号:５）、 Leu-Abu-Ala-Glu-Ala-Lys （配列番号:６）、 Leu-Ile-Ala-Asp-Ala-Lys （配列番号：９）、 Leu-Ile-Ala-Asn-Ala-Lys （配列番号:10）、 Leu-Ile-Ala-Glu-Ala-Ala （配列番号:11）、 Leu-Ile-Ala-Gln-Ala-Lys （配列番号:12）、 Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Glu （配列番号:13）、 Leu-Ile-Ala-Gly-Glu-Gly （配列番号:14）及び Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Lys （配列番号:15）からなる群から選択されるペプチド；を含有する医薬製剤。 25．前記ペプチドが塩の形態である請求項24記載の製剤。