JPH04500954A - 創傷治癒のためのコラーゲンマトリックスおよびその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 倉１　治　のためのコラーゲンマトリックスおよびその立広 は■ １五分立 本発明は、コラーゲン化学および創傷移植片の分野に関する。特に、創傷治癒移 植片および生物活性剤を投与するための徐放性貯蔵剤として有用であるコラーゲ ンの固体マトリックスおよびその生産方法に関する。

１景 創傷治癒移植片は、創傷部分に付着し、適合する能力を有していなければならな い。理想的には、治癒を速めるために、表皮の再生、繊維芽細胞、内皮細胞およ び創傷治癒調節細胞の創傷部分への蓄積（例えば、結合組織の沈着および血管形 成の促進）を容易にしなければならない。所定の移植片がこれらの目的と一致し 得るか否かは、化学組成物および移植片の物理的特性を反映する。

結合組織の主要なタンパクであるコラーゲンは、以前から、治療材料に使用され てきた。外因性コラーゲンを実質的に非免疫性にするための方法が得られる。米 国特許第４．４１２．９４７号は、弱酸性有機水溶液中で、天然コラーゲンの分 散液を凍結乾燥することによって生産されたｏ、　ｏｏｓがら０．００６５　ｇ ／ｃ１１’の密度を有する吸収性治療材料を開示している。酸性溶液から生産さ れたこのような治療材＃Ｊは、典型的に低い吸収性および細胞の内増殖（ｉｎｇ ｒｏｖｔｈ）を最適にしない孔サイズを有する、しっかりと編み込まれた繊維か らなる。

ＰＣＴ出願第８５１０４４１３号は、架橋剤を加えることによってコラーゲンが 架橋される前後に脱水されるコラーゲンの分散液または溶液から形成される、カ ルボジイミドまたはサクシイミジルエステルで架橋されたコラーゲンスポンジを 開示スる。

このように形成されたコラーゲンスポンジは、凍結乾燥された酸性溶液から形成 されるものと同様の欠点を有する。

コラーゲンスポンジを開示する他の参考文献は、米国特許第３．７４２．９５５ 号、第３．７４３．２９５号、第３．８１０．４７３号、第４．５１５．６３７ 号および第４，５７８．０６７号である。

本発明は、生体適合性、生分解性であり、結合組織沈着、血管形成、表皮の再生 および繊維増殖を促進できるコラーゲン移植片を提供することに向けられている 。本発明の他の局面は、生物活性剤の徐放性放出に有用なコラーゲンマトリック スを提供することに向けられている。

＆ユ匁澗ユ 本発明は、創傷治癒マトリックスとして有用な新しいコラーゲン移植片およびこ の移植片を生産する方法を包含する。

これらのコラーゲン移植片は、コラーゲンが生体適合性、生分解性であり、実質 的に非発熱性で、繊維状をなし、化学的に架橋されず、ならびに０．０１から０ ．３ｇ／ｃ罵３までの密度および約８０％の孔が細胞の内増殖をさせるのに十分 なサイズである孔群を有することに特徴付けられる。

創傷治癒移植片はまた、ヘパリンまたは他のグリコサミノグリカン、細胞外マト リックスタンパク、抗生物質および表皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖因子由来の血 小板（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、結合組織活性化ペプチド（ ＣＴＡＰ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）等の増殖因子のような生物活性添加物 を徐放的に放出する有効な媒体としても作用する。創傷治癒の現在好適な実施態 様は、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ −Ｂ）を、効果的に共力するような量で含む。このような生物活性因子を有効的 に放出するために、本発明の移植片はまた、腫瘍細胞増殖阻止（ｏｎｃｏｓ　ｔ ａｓｉｓ）、免疫調節、骨形成および造血においても有用である。

予防剤、抗生微生物または染料のような非生物活性剤を、移植片に組み込むこと も可能である。

以下の工程を包含する移植片を生産するための方法：ａ）コラーゲンの酸性水溶 液を提供すること；ｂ）該溶液のｐＨを高めることによって該溶液からコラーゲ ンを沈澱させ、沈澱Ｉ７たコラーゲンの繊維の均一な分散液を形成すること； Ｃ）該分散液を所望の厚さにキャストすること；ｄ）該キャストした分散液を、 −２Ｏ６Ｃ未満の温度でフラッシュ凍結すること；および Ｃ）該凍結したキャスト分散液を凍結乾燥させて実質的に湿気を含まないコラー ゲンのマトリックスを形成すること。

必要に応じて、この均一な分散液に対して、生物活性添加物が、上記工程（ｂ） においてまたは工程（ｂ）の直後に、加えられ得る。また、乾燥した移植片を生 物活性剤を含む溶液中に浸漬するか、あるいは滅菌ピペットまたはドロッパを使 用して、乾燥した移植片に生物活性剤を含む溶液を滴下することが可能である。

本発明のその他の局面は、上記工程に加えて、移植片を圧縮して上記範囲内で高 密度を有する移植片を形成、および／または移植片を加熱処理（硬化）してその 引っ張り強度を増加させるような工程を更に含む。

［立ｉ！呈皿ユ 第１図は、本発明のコラーゲン移植片の特徴構造を示す走査型電子顕微鏡写真で ある。

第２図は、本発明の繊維構造を示す透過走査型電子顕微鏡写真である。

第３図は、実施例９に開示される結果を示す。

日を　るためのン Ａ、コラーゲン　の一 本発明は、開始剤として溶液（ＣＩＳ）中のコラーゲンを好適に使用する。ウシ の皮膚由来のアテロペプチド型コラーゲンの酸性溶液は、ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから、 商品名Ｖｉｔｒｏｇｅｎ’　１００で、商業上入手可能である。

この物質は、約２．０のＰＨで、約３　ｍｇ／ｒａＬのコラーゲンを含む溶液で ある。以下に示すように、Ｖｉｔｒｏｇｅｎ＠ｔｏｏ溶液を濃縮して本発明に使 用することが好ましい。痛論、ウシの旋コラーゲン、ヒトコラーゲン等を含む可 溶性のコラーゲンであれば、いずれのコラーゲンでも開始剤として使用され得る 。

使用されるコラーゲンは、このコラーゲンと反応して共有結合を形成する、例え ばアルデヒドまたは他の化学添加物を加えることによっても、化学的に架橋され ない。所望されるなら、コラーゲンマトリックスは、以下の説明のように加熱さ れて、共有結合の形成に影響を及ぼし得るが、化学架橋剤の添加を必要としない 。本発明から除外される化学架橋剤はまた、ヘパリン等のグリコサミノグリカン のようなコラーゲンに対して非共有親和性を有し得る生物性分子とは区別される 。溶液中で共有結合しない、このような分子は、本発明の範囲内である。

開始溶液中のコラーゲンの濃度は、約２から約７５■ｇ／ｍＬである。この濃度 は、コラーゲン移植片生産物の特性に役割を果たしている。この範囲内において 低濃度であると、水様環境でより迅速に分解する、比較的低い引き裂き強度を有 する生産物が提供される。この範囲内において高濃度であると、水様環境でゆっ くりと分解する、密度が高く、より強力な移植片が提供される。好適な濃度は、 約４から２０　ｍｇ／ｍＬの範囲である。

コラーゲンの濃度は、必要に応じて、単純な希釈によって低濃度に調整され得る 。高濃度への調整は、コラーゲンの沈澱および高濃度におけるコラーゲンの再分 解等による、コラーゲンを破壊しない方法を使用することによってなされ得る。

上記工程において、溶液中のコラーゲンは、アルカリ緩衝剤等を加えて、再構成 した繊維状コラーゲンの相同な分散液を形成する等、溶液のｐＨをほぼ中和ｐＨ またはそれ以上に高めることによって沈澱する。通常の緩衝剤は、無機（例えば 、燐酸塩）および有機（例えば、酢酸塩）緩衝剤を含む。

生産された均一な分散液は、シート状にキャストされる。

濃度の低いコラーゲン分散液については、分散液をキャスティング領域に注入す るだけでキャスティングがなされ得る。

濃度の高い物質については、均一な層を得るために、ブレードまたは同様の道具 を使用して物質を平たく延ばすことが有用であり、必要である。キャストされた 分散液の層の厚さは、一般に約１から約２０　ｍｍの厚さであり、約２から８１ ＋１の厚さが好ましい。

次いで、キャスト層は、迅速または「フラッシュ凍結」の冷却条件の下で凍結さ れる。この凍結がゆっくりと段階的に行われると、層中に形成された氷の結晶の サイズは大きく、生産した最終生産物の孔のサイズは一定でない。１つの典型的 なフラッシュ凍結方法は、金属表面のような熱伝導率の高い表面上でキャストし 、次いで、キャスト層から迅速に熱を取り除くために、この熱伝導率の高い表面 を大量の冷却液または他の冷却金属表面と密着させることを含む。この冷却に使 用される温度は、一般に一４０’Ｃ未満であり、好ましくは一３０１１Ｃ未満、 更に好ましくは一６５’Ｃから一１１０’Ｃの範囲である。

凍結層は、次いで当該技術分野に既知の方法によって凍結乾燥される。凍結乾燥 温度は、層を溶融させない程度で、できるだけ高い温度が好ましい。分解された コラーゲンおよびそれに付随する液体中の塩および緩衝剤を考慮すると、一般に 一５’Ｃが最も高い非溶融温度であり、約−２５°Ｃから約−１０’Ｃの温度が 好ましい。一般に、約−５００Ｃ未満の温度では、凍結乾燥が非常にゆっくりと 行われる。凍結乾燥に使用される真空度は様々である。超高度な真空度は必要で ないが、約０．０１）ルから約０．ｌトルの範囲の絶対圧力が一般に使用される 。層を凍結乾燥させるのに必要な時間は、層の厚さに依存するが、一般に約４時 間から約３０時間の範囲の時間が使用される。実際に使用される時間は、使用さ れる温度および真空度に依存する。

凍結乾燥後、層は、通常実質的に水を含まない（すなわち、重量で約２５％未満 の湿気を含み、重量で約１０％未満の湿気が好ましい）。必要に応じて、すべて の水を除去するために、凍結乾燥後、移植片は乾燥され得る。

必要に応じて、生産したコラーゲン移植片の特性を変化させる方法に、更に工程 を加えることも可能である。１つの選択において、この方法は、不活性ガスがキ ャスティング前にコラーゲン分散液と混合される工程を更に含む。この更に加え られた工程において、不活性ガスは、ガスを含む半固形の分散液を生産するため に粘着性コラーゲン分散液中で懸濁される。使用される不活性ガスのタイプは限 定されない。空気は、通常選択されるガスであるが、コラーゲンと反応せず、最 終生産物中に薬理学上受は入れられない残基を残さないアルゴン、窒素またはそ の他のガスも使用され得る。コラーゲン分散液に導入されたガスの体積は、分散 液の１容量部当り、約０．３３から約３容量部の範囲である。好ましくは、ガス の体積は、分散液のｉｇｚ部当り、約０．５から約２容量部である。

ガスを分散液に導入する方法は、低せん新方法（ｌｏｗ　５ｂｅａｒ　ｍｅｔｈ ｏｄ）でなければならない。高速ブレンダーまたはミキサーは、コラーゲンの構 造を物理的に低下させるため、使用されない。適切な混合方法は、ガスを分散液 に吹き込む、散布するまたはボンピングし、２つの相を共に振り動かし、この２ つの相をパドルミキサーでゆるやかに混合する等を含む。

次いで、上記の導入によって得られたガスを含む半固体の分散液は、上記のよう にキャストされ、処理される。

もう１つの選択において、移植片は、密度を高めるために圧縮される。圧縮され た移植ハは、通常Ｏ，ＯＳから０．３　ｇ／ｃｍ、３の範囲内の密度を有し、一 方圧縮されていない移植片は、通常０、Ｏｌから０．０５　ｇ／ｃｍ’の密度を 有する。圧縮は、シート状の生産物をプレスまたはローラー等に通過させること によって成し遂げられ、それによ−）で所望の圧縮度が得られる。圧縮はまた、 移植片の厚さを減少させる。

土、記方法の他の変形（、−おいて、複数の層を連続的にキャストし、フラッシ ュ凍結した後、凍結乾燥および乾燥によって、多層の生産物が形成されＩＪる。

この変形は、層を共にラミネートすることなく、１％のコラーゲン、すなわち「 皮膚」由来のコラーゲンを移植片の片側または両側に沈着するのに有用であり得 る。このような皮膚は、通常、０．１ｍｍがら約ｏ、７５■１こ至るような約１ ミリメータ未満の厚さである。典型的な実施態様において、ガスを加える前の主 要な工程において使用される分散液の特性を有する、厚さ１■冒のコラーゲン分 散液の層は、キャストされ、フラッシュ凍結される。その後、懸濁されたガスを 含むまたは含まない繊維状コラーゲンの分散液は、キャストされ、フラッシュ凍 結される。この多層複合体は、次いで凍結乾燥される。

多層物質を生産する際には、一般に層を個別にキャストし、凍結して、次いで複 合体全体を一度に凍結乾燥させることが好まれる。層を個別に凍結させる場合と 同様の条件が多層複合体にも使用され得る。凍結乾燥時間および条件は、通常、 複合体物質が適用されるごとに蓄積される。所望されるなら、移植片は、他の生 体適合性物質でラミネートされ得る。　上記方法の他の変形において、乾燥（重 量で１０％未満の湿気）コラーゲン移植片は、孔のサイズまたは吸収性に悪影響 を及ぼすことなくその強度を増加させるために熱硬化される。硬化は、通常、６ ０’Ｃから１２０’Ｃ，好ましくは７５０Ｃから９０’Ｃ（Ｄ範囲の温度で、大 気圧、真空下で行われる。硬化過程中の相対湿度は、約５５％未満に保たれる。

硬化は、通常、４時間から１週間の間で行われ、開放または閉塞コンテナー中で 実施され得る。

硬化された移植片の強度時間（以下、実施例４で定義される）は、移植片の厚さ に応じて、通常約２０秒より長く、更に典型的には約５０秒より長い。

更にもう１つの選択において、グリコサミノグリカン、生物活性剤および／また は非生物活性剤は、フラッシュ凍結および凍結乾燥の前にコラーゲン分散液に加 えられる。あるいは、乾燥した移植片は、好適な添加物を含む溶液中に浸漬され 得、あるいは滅菌ピペットまたはドロッパを使用して、乾燥した移植片に添加物 を含む溶液を滴下することが可能である。

生物活性剤またはタンパク因子を加えることによって、創傷治癒を促進する創傷 治癒マトリックスの能力が高められる。

１つまたはそれ以上の生物活性剤は、肉芽組織の沈着、血管形成、表皮の再生お よび繊維増殖を促進するために導入され得る。更に、これらの因子および他の因 子は、免疫調節剤（局部的にまたは組織的に）、造血調節剤、骨誘導剤および腫 瘍細胞増殖阻止剤（例えば、ＴＧＦ−βは、これらのすべての活性を有するもの として示されている）に有効であるとことが知られている。本願で使用される生 物活性添加物またはタンパク因子は、天然または合成（組換え）であり得、ヒト または他の哺乳類タイプであり得る。ヒトＦＧＦ（酸性または塩基性形帖を含む ）、ＰＤＧＦおよびＴＧＦ−βは好ましい。はぼ同等の量のＦＧＦおよびＴＧＦ −Ｂの導入は、肉芽組織の沈着、血管形成、表皮の再生および繊維増殖を著しく 高める。本願で使用される生物活性添加物またはタンパク因子は、天然または合 成（組換え）であり得、ヒトまたは他の哺乳類タイプであり得る。

天然源（例えば、下垂体、脳組織）からａＦＧＦを単離する方法は、Ｋ、Ａ、Ｔ ｈｏｍａｓら、Ｐｒｏ　Ｎａｔ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８４）　８ １：３５７−６１において開示されている。血小板からＰＤＧＦを単離する方法 は、Ｒａ１ｎｅｒら、Ｌ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８２）　２５７：５１５ ４によって開示されている。Ｘｅ１ｌｙら、ＥＭＢＯＪ　（１９８５）　ｊ：３ ３９９は、ＰＤＧＦの組換え形態を生産する方法を開示している。ヒト源（血小 板および胎盤）からＴＧＦ−Ｊを単離する方法は、ＥＰＯ１２８，８４９（１９ ８４年１２月１９日）におけるＦｒｏｌｉｋらによって開示されている。ウシ源 からＴＧＦ−βｌおよびＴＧＦ−β２を単離する方法は、本願で参考のために引 用したＥＰＯ１６９，０１６（１９８６年１月２２日）および米国特許第４．７ ７４．３２２号によって開示されている。本発明の範囲内の他の因子は、形質転 換増殖因子−α、β−トロンボグロブリン、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦｓ ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ　ｓ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ −２等）、コロニー刺激因子（例えば、Ｇ−Ｃ３Ｆ、　ＧＭ−Ｃ３Ｆ、エリスロ ボエチン等）、神経増殖因子（ＮＧＦ）およびインターフ：ＬＣｆｆン（例えば 、ＩＦＢ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等）を制限なしに含む。分子量の小さい ドメインを含む因子の合成類似体は、それらが天然の分子と実質的に同一タイプ の活性を示す場合には、使用され得る。このような類似体は、「生物活性剤」、 「生物活性物質」および「生物活性添加物」の用語の範囲内にあると同時に、ｒ ＦＧＦＪ、ｒＰＤＧＦＪおよびｒＴＧＦ−β」等の特定因子を示すのに使用され る特定用語の範囲内にあるものとされる。このような類似体は、合成遺伝子の発 現または部位特異性変異誘発によって変化する遺伝子の発現等の通常の遺伝子工 学技術によって生産され得る。場合によっては、例えばＰＤＧＦに関して、因子 は、その天然形態（すなわち、血小板で）あるいは純粋または部分的に精製され た放出物または抽出物として、組成物中に導入される。あるいは、因子は、他の 汚染物質を大量に含まない実質的に純粋な形態で導入され得る。

本願で使用される用語ｒ　ＴＧＦ−ＢＪは、ＴＧＦ−Ｂｌ、　ＴＧＦ−Ｂ２、Ｔ ＧＦ−Ｂ活性を有しかつ少なくとも７０％の相同性を有するその他のタンパク因 子およびその混合物をさしていう。ＴＧＦ−Ｂは、天然源から得られるか、また は組換え方法によって調製され得る。

また、実質的なＴＧＦ−Ｂ活性が保持される限りにおいて、１つまたはそれ以上 のアミノ酸が置換または欠失される、ＴＧＦ−Ｂの変異タンパクを調製すること も可能である。ＴＧＦ−８２は、現在好適である。　用ｉ　ｒＦＧＦＪは、酸性 および塩基性繊維芽細胞増殖因子をさしていう。酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）はま た、当該技術分野において、内皮細胞増殖因子、眼球由来の増殖因子Ｉ＋、ヘパ リン結合増殖因子−α、網膜由来の増殖因子、アストログリア増殖因子ｌおよび プロスタトロピンとして知られる。塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）はまた、眼球由来 の増殖因子■、ヘパリン結合増殖因子β、アストログリア増殖因子２、軟骨由来 の増殖因子および軟骨肉腫由来の増殖因子として知られる。本願で使用されるよ うに、［ａＦＧＦＪは、適切な種がら得られるまたは組換え法によって生産され るａＦＧＦを含む。また、実質的なａＦＧＦ活性が保持される限りにおいて、１ つまたはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失される、ａＦＧＦの変異タンパク を調製することも可能である。組換えヒトａＦＧＦは、現在好ましい。ｂＦＧＦ に関連するタンパクもまた、ｂＦＧＰおよびａＦＧＦの混合物またはその誘導体 と同様に含まれる。

因子の「免疫を調節し得る量」とは、被検体の免疫組織に対する明示的な影響力 を示すのに十分な特定因子の量である。

通常、免疫調節は、臓器移植に次ぐ、または自己免疫病（例えば、狼瘉、自己免 疫関節炎、自己免疫糖尿病等）の治療のための免疫システムを抑制するために使 用される。例えば、臓器移植を行う場合に、免疫システムによる移植臓器の拒絶 を抑制するために、免疫調節可能な量の免疫抑制対生物性増殖因子を注入した本 発明のマトリックスを部位に配置し得た。

あるいは、免疫調節は、例えば、癌または重い感染の治療における免疫システム の効力を（例えば、ＴＮＦ、　ＩＰＮ等の投与によって）向上させ得る。

「腫瘍細胞増殖阻止に有効な量」とは、選択された因子に敏感な腫瘍細胞を有す る被検体において、腫瘍細胞増殖を阻止することができる増殖因子の量である。

例えば、多くの非骨髄性癌腫は、ＴＧＦ−β、特に本願で参考のために引用した 米国特許第４，８１６，４４２号に開示されるようなＴＧＦ−β２による治療に 敏感である。

「造血を調節する量」とは、血液細胞の生産および／または成熟を促進または阻 止する増殖因子の量である。例えば、エリスロポエチンは、既知の投薬で活性を 高めることが知られており、一方ＴＧＦ−βは、阻止効力を示す。

生物性増殖因子の「骨誘導量」とは、測定可能な骨の成長増加または骨の成長率 の原因となるかまたはそれらに貢献する量である。

組成物中に含まれる因子の量は、関連する特定因子、その特異活性、処理される 条件のタイプ、被検体の年齢および条件ならびに条件の厳密性に依存する。例え ば、腺癌を（例えば、腫瘍の手術切除後で縫い合わせる前の傷口に、ＴＧＦ−β を含むマトリックスを適用することによって）治療する場合には、単に（外傷ま たは手術工程による）傷口の治癒を促進させる場合に比べて、ＴＧＦ−βをより 多く投与する必要がある。

多くの場合、因子は、治療される表面積に基づいて０．０７から約２００μｇ／ ｃ■２の範囲内の量でそれぞれ存在する。より好ましい範囲は、約０．５から３ ０μｇ／Ｃ１２、特に約３．０から約１８μｓ／ｃ■２である。

分散液にヘパリンを加えることによって、移植片の孔のサイズが影響されること が発見されている。ヘノくリンを加えると、フラッシュ凍結前の分散液における へ／イリンの濃度は、通常５と３００μｇ／簡りの間である。［へ／ｆリンの有 効量」とは、最終生産物マトリックス内において所望の孔のサイズを提供する量 である。

Ｂ、コラーゲン　の。

本発明のコラーゲン移植片は、非常に密接で、繊細な繊維構造により、特性付け られるコラーゲン繊維の合着の不織体である。第２図は、典型的な繊維状の生産 物の透過型電子顕微鏡写真で、その繊維構造を示したものである。この構造は、 本質的には、一様な直径の環状横断面繊維である繊維から成ることにより、さら に、特性付けられる。これらの繊維の平均直径は、一般的には、約５０ｎ■から 約２００ｎｍまでであり、より一般的には、約１００ｎ■から約１５０ｎａ＋ま でである。この移植片の他の特性は、かさ密度を、　０．０１ｇ／ｃ■３から０ ．３ｇ／ｃ■３の範囲内に有することである。

この移植片のさらに他の特性は、移植片の孔の約８０％が。

細胞内薄を可能にするのに充分な大きさであることである。

この点については、孔集団の少なくとも約８０％が、直径３５ミクロン以上であ り、好ましくは、直径５０ミクロンから２５０ミクロンである。

熱処理された移植片の約１〜２％が、酸性溶液に可溶性であるのに対し、熱処理 されていない移植片の２５％以上が、可溶性である。

繊維状移植片は、一般的には、約２ｍｍから約８■までの厚さであり、かつ、創 傷治癒マトリックス、外科手術の包帯材。

および火傷の包帯材等として有用である。本発明の移植片は、結合組織の付着、 血管形成、再上皮形成、および組織の繊維増殖の治療あるいは促進を、増殖因子 を追加しなくても。

可能にし、かつ、促進するのに必要な特性を有するマトリックスを提供する。傷 の治療で使用される移植片の量は、典型的には、傷を十分に覆うように、移植物 質の厚さにより決定される厚さく典型的には、１〜８ｍｍ）で１選択される。移 植片は、ぴったりとふさぐように形作るように、容易に切断され得る。例えば、 腫瘍あるいはシストの切除により、空隙が作られる場合、移植片の材料は、湿ら され１作られた空隙に詰められ得る。

前に示したように、移植片は、生分解性であり、かつ、製薬的に活性（生物活性 ）の物質ための持続性導出賦形剤として、あるいは移植片への他の賦形剤として 役立つ。これらの添加剤は、移植片が形成されてから３例えば、凍結乾燥の後、 移植片に付加され得る。あるいは、キャスト液にとり込まれ得る。例えば、　Ｔ ＧＦ−β１．　ＴＧＦ−β２．　ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、　ＰＤＧＦ −ＢＢ、　ＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、　ＴＧＦ−α、結合組織活性ペ プチド、βトロンボグロブリン、インシュリン様成長因子。

腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリスロボエチン、神経 発育因子、およびインターフェロン等のような組織増殖因子を、有利に、取り込 み得る。とり込みのための、現在好ましい因子は、　ＴＧＦ−β（β１および／ またはβ２）および酸性ＦＧＦである。このような剤形でのコラーゲン移植片は 、取り込まれた添加剤を長期間に渡り、投与部位に放出する。

コラーゲン移植片が活性物質をある期間に渡り導出する能力は１本発明の重要な 局面である。活性物質を有する創傷治癒のマトリックスは、活性物質だけよりも 、より良好な創傷治癒の反応を引き起こす。この反応は、傷の肉芽組織の付着、 再上皮形成、および血管分布の持続性を含み、最終的には、創傷治癒を完成させ る。本発明のマトリックスは、活性物質だけをしばしば投与すること（繰り返し 注射することによるような）に対して、いくつかの有利な点を提供する。これら の有利な点は２次のことを含む。すなわち、（１）各々の投与に続いである期間 、治療部位での活性物質を維持する能力、（２）外科医にとり、最善のハンドリ ング性、（３）患者にとり精神的衝撃の減少（例えば、毎日の、あるいはそれ以 上の治療の代わりに週１〜３回の治療）、および（４）患者にとり治療費の軽減 、を含む。さらに、これらのマトリックスのコラーゲン組成物は、宿主組繊と同 様の環境を提供し。

創傷治癒の反応を促進し、かつ、マトリックスは２時がたつと分解するので、宿 主組織により置換される。

Ｃ１支柵且 本発明を３次の実施例により、さらに説明する。これらの実施例は１本発明の実 施をより詳細に説明するためにだけ。

提供され９本発明の範囲を制限するものとして、解釈されるべきではない。

Ｌ血匠上 （コラーゲン移植片の調製） 創傷治癒のためのマトリックスとしての使用に適したコラーゲン移植片は１次の ように調製される：約３　ｍｇ／ｍＬの濃度を有する水溶液中の流動性粘性Ｖｉ ｔｒｏ−ｇｅｎｔ’　１００のコラーゲンの９部を、　０．２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ ４１０，０９Ｍ　ＮａＯＨ。

ｐ）Ｉｌｌ、　２緩衝液１．０容量部を加えることにより沈澱させた。この緩衝 液中の塩基の量は、　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ’　１００溶液中の酸を中和するように 選ばれる。沈澱は、室温で実施される。形成された沈澱物は、遠心分離により採 取され１次に、均質化され、均質な分散液を生じる。それから、ホモジエネート の中のタンノでりの濃度が決定され、４０〜７０冒ｇ／ｍＬであることがわかる 。ホモジェネートの一部を希釈して、コラーゲン濃度が０．０２Ｍ　Ｎａ２ＨＰ Ｏ４１０，１３Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４の中５ｍｇ／ｍＬとする。

ホモジェネートを約５Ｈの厚さに金属シートに広げる。欠に、この金属シートを 、１時間、−８０℃の冷却器の中に入れる。

このような条件下では、この層は非常に急速に凍結するため、この時間は、おそ らく、必要以上に長い。

このように形成された固形層を、凍結乾燥器の中に入れ３約−２０°Ｃに暖まる まで放置し、この間約０．０１−ｍＨｇの真空度（こ吸引する。置する。これを 、約２５ｖｔ％未滴の湿度（こなるまで、２４時間続ける。

次に、凍結乾燥させた層を、１５〜２０℃に暖まるまで放置し、真空中で約８時 間乾燥させ、残存する遊離の水分を取り除く。

この移植片は１繊細で一様な繊維状の構造を有し、非常１こ高密度で、密着性を 有し、かつ、破れにくい。この移植片に！。

創傷治癒の移植片として、あるいは火傷の包帯材等として。

有用である。

Ｋ胤且ユ （空気を用いた移植片の調製） 実施例１の工程の１ケ所を変化させて繰り返す。多量のホモジェネートを、チェ ンバーの中に入れ、その容積の１０分の１の空気を含む第二のチェンバーに連結 する。この空気をホモジェネートに、注入する。　空気の全容積が、ホモジェネ ート中にとり込まれて半固形の分散液中にガスを保有するようになるまで、２つ の相を、ゆるやかに、チェンバーからチェンバーへ送り込む。分散液は、さらに 、実施例１のように処理され、繊維状のコラーゲンの固形の移植片を生じる。こ の移植片は、実施例１で調製されたマトリックスよりも、より密度が低く、かつ 、引裂かれやすい。この移植片は、定量的には、測定されていないが、定量的に は、実施例１の移植片よりも強くない。すなわち、この移植片は、引裂き抵抗力 がより低い。また、この移植片は、実施例１の移植片程、堅くない。この移植片 は、創傷治癒のためのマトリックスとして。

有用である。

Ｋ立皿主 （圧縮移植片の調製） 実施例１あるいは２のいずれかにより、Ｒ製されて得られれた移植片を、さらに 、各々の移植片を、ローラープレスに通して処理し、各々の層を約１ｍｍの一様 な厚さに圧縮する。圧縮移植片は、より密度が高く、引裂き抵抗性がより高い。

圧縮移植片は、長期間の創傷のための保護カバーとして有用で弗り、また、創傷 治癒のための環境を提供をする。

火胤匠工 （コラーゲン／ヘパリン移植片の調製）医用グレードヘパリンを、　０．０２Ｍ 　Ｎａ２ＨＰＯａ緩衝液（ｐＨ７，８）中に溶解させ、５００〜１５００μｇ／ ■Ｌの濃度にした。このヘパリン溶液を、　７．５ｇ＋ｇ／ｍＬ繊維状コラーゲ ンを含むこと以外は実施例１と同様に調製されたコラーゲン分散液に加え、１０ ０μｇ／閣Ｌヘパリンおよび５μｇ／■Ｌヘパリンを含む分散液を提供する。次 に。

この分散液を実施例１のようにフラッシュ凍結させ凍結乾燥させる。得られたコ ラーゲン−ヘパリン移植片を、真空乾燥器の中に入れ、室温であるいは８０°Ｃ で、２４時間加熱硬化させる。

試験を、３回同様に実施する。

硬化した移植片の強度は、　懸垂分銅で引っ張ることにより、湿ったスポンジの 断裂強度を決定する張力試験を用いて。

測定される。　移植片の乾燥試料を、２μ１ｃｍ”　片に切り。

Ｐｅｒｍａｂｏｎｄ’　９１０接着剤を使って、プラスチックアンカープレート に接着する。、移植片を、リン酸緩衝化生理食塩水で湿らせ、プラスチック板の 一端を、固定板にとめて固定する。固定試料に、２０ｇの懸垂分銅で応力を加え る。移植片を引き裂く時間は１秒で測定した。この時間は、「強度時間」（”ｓ ｔｒｅｎｇｔｈｔｉｍｅ”）と呼ばれる。試験の結果を下記の表１に示す。

表１ 乾燥前の　処理　厚さ　強度　平均 試料組成　（ｍ＋＊）　時間（秒） Ａ、　７．５ｍｇ／■Ｌ　ＦＣ室温　２　１０．０１００μｇ／■Ｌ　ＨＰ真空 　２３．１２４時間　２　１８．９　１１ ｉｏｏμｇ／ｍＬ　ＨＰ真空　２７７ ２４時間　２　７７１　４１５ Ｃ，７，５ｍｇ／ｍＬ　ＰＣ室温　２〈１５　ｔｔ　ｇ／ｍＬ　ＨＰ　真空　２ 　＜１２４時間　２　＜ｌ　＜Ｉ Ｄ、　７．５ｍｇ／＋＊Ｌ　ＰＣ８０℃　２　２１．５５Ｍｇ／閣Ｌ　）ＩＰ　 真空　２　ｌ？０．４２４時間　２　、　１４．１　６９ ＨＰ：ヘパリン ＦＣ：繊維状コラーゲン 表１の結果は、移植片の引き裂き強度が、加熱硬化により高められ得ることを示 す。

硬化コラーゲン−ヘパリン移植片の孔の大きさは、光学顕微鏡を使って測定した 。孔の大きさの結果を、下記の表２（こ示す。

（以下余白） 表２ 乾燥前の　処理　孔の大きさ　孔の大きさ試料組成　の平均　の範囲 Ａ、　７．５μｇ／ｍＬ　ＦＣ室温　１０３±６３　４５−２８２１００μｇ／ ＋＊Ｌ　ＵＰ真空 ２４時間 Ｂ、７．５ｍｇ／鵬ＬＦＣ８０℃　９３±　３１　４８−１６２１００μｇ／■ Ｌ　ＵＰ真空 ２４時間 Ｃ，７，５ｍｇ／ｍＬ　ＦＣ室温　５７±１９　、．２７−１０９５μｇ／■Ｌ 　ＨＰ　真空 ２４時間 り、　７．５ｍｇ／ｍＬ　ＦＣ８０℃　７４±２８　３２−９８５μｇ／ｌＬ　 ＨＰ　真空 ２４時間 孔の大きさはミクロンで示されている；全移植片は２ｍｍの厚さである。

表２に示すように、移植片に加えられたヘパリンの量は。

移植片の孔の大きさに影響を及ぼす。

本発明を実施するための上記の様式の改変は、フラーゲン化学および／または傷 の包帯材の当業者には、目明であり、それらの改変は、請求の範囲内にである。

夫立五旦 （コラーゲン／因子移植片の調製） 形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）を含むコラーゲン／ヘパリン移植片を１次の ように、調製した。

（Ａ）　ＴＧＦ−βの調製 ＴＧＦ−βを、米国特許第４．７７４．３２２号に記載されているように調製し た。方法は１次の通りである。

ウソの中足の骨を、畜殺基から新鮮なままで手に入れ、ドライアイスを入れて運 んだ。骨から、骨髄および骨でない組織を取り除き、直径がｌｅａを下まわる断 片に砕き、製粉器で。

４℃にて粉砕した。粉砕された骨を、　ＩＫｇの骨に対して、９．４Ｌの２回蒸 留水で、１５分間にわたり洗浄した。次に、それを。

０．０１Ｎ　ＨＣｌ中で、−晩、４℃にて洗浄した。洗浄された骨を、３容量の エタノールで３回９次に、３容量のジエチルエーテルで３回、（各２０分間ずつ 、室温で）脱脂した。得られた。脱脂された骨の粉末を１次に、　０．５Ｎ　Ｈ ＣＩ　（２ＳＬ／Ｋｇの脱脂された骨に対して）中で、４℃にて鉱物質除去した 。酸を、デカントして除き、得られた。鉱物除去された骨（ＤＭＢ）を、洗浄液 のｐ）Ｉが４より大きくなるまで、水で洗浄した。続いて、吸引濾過して乾燥さ せた。

次に、ＤＭＢを、　１Ｋｇ当り３．３Ｌの４Ｍグアニジン−〇ＣＩ、１０ｍＭ　 ＥＤＴＡ、　ｐ）１６．８．１ｍＭ　ＰＭＳＦ、　１０■Ｍ　ＮＥＭで、　１６ 時間抽出した。懸濁液を、吸引濾過し、不溶性の物質を、再び４時間にわたり抽 出した。可溶性の両分を合わせて、　Ａｓ１ｃｏｎ限外濾過（ＩＯＫ）ユニット を用いた限外濾過により、少なくとも５倍に濃縮した。濃縮物を、冷脱イオン水 ３５容量で、４日間にわたり６回透析し１次いで凍結乾燥した。（全過程は、凍 結乾燥以外は、４℃にて。

実施した。） 得られたタンパク抽出物を、　４Ｍグアニジン−ＨＣｌ中に、再溶解サセ、４Ｍ グア＝ジ：／−ＨＣｌ、　０．０２％　ＮａＮ３．１０＋ａＭ　ＥＤＴＡ、　ｐ Ｈ６，８で平衡化させた５ｅｐｈａｃｒｙｌｅＳ−Ｚｏｏカラムで分画した。こ れらの画分を、　２８０ｍｍでの吸光度および軟骨形成活性により（ＥＬＩＳＡ を用い、軟骨細胞細胞培養物中での特徴的なプロテオグリオンの生成を測定した ）１分析し２次に、これらの画分を合わせた。最大活性（タンパク■豐１０．０ ００−４０．０００ダルトン）を示す画分を、１８０容量の脱イオン水に６回に わたり透析し、そして、凍結乾燥した。

この画分を、　６Ｍ尿素、　１０ＩＩＭ　ＮａＣ＋、　１ｍＭ　ＮＥＭ、　５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）　、　ｐＨ４，８中に溶解させ、　１０．０ ０Ｏｒｐｍで、５分間遠心分離にかけた。上清を、同様の緩衝液中で平衡させた ＣＭ５２カラム（２，５Ｘ２０Ｃ■）で分画した。結合したタンパクを、同様の 緩衝液中の１０１Ｍから４０ｈＭまでのＮａＣ１勾配を用い、　２７＋ｉＬ／ｈ ｒの流速で、全容ｊｌ１３５０ｍＬを用いてカラムより溶離させた。その溶離液 を３つの画分にプールした（Ａ、　Ｂ、およびＣ）。画分ＢおよびＣは、約１ｌ ５０−２５０ｓのＮａＣ１で９溶離された。各々の画分を、１１０８Ｊｌの脱イ オン水で、４日間にわたり６回、透析し１次に、凍結乾燥させた。

凍結乾燥した画分であるＡおよびＢＣ（合わせもつ）を、０．１％トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）に溶解させ、そしてその溶液の一部を、　ＶｙｄａｃｅＣＩＢ　 ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（４，６１１ｍ　ＩＤｘ２５ｃｍ）にかけ、　０．１％　 ＴＦＡで、５分間、１束し／ｗｉｎで洗浄した。溶離する溶媒は、０．１％ＴＦ Ａ中０−６０％のＣｈＣＮ勾配で、２％／分の速度であった。両分ＢＣは、２つ のピークを与えた。それらは、２９．５分で出現するＴＧＦ−βｌを含むピーク ｌ、および３１．２分で出現するＴＧＦ−β２を含むピーク２である。

（Ｂ）コラーゲン／ＴＧＦ−β移植片の調製ＴＧＦ−β１を酸性溶液（ｐＨ２゜ ０）中に溶解させ２希釈し、溶液（ＣＩＳ）中のコラーゲンで再構成して、最終 濃度３０μｇ１０＋ＬのＴＧＦ−β１および３００μｇ／ＩＩＬのＣＩＳを得た 。次に、溶液を、　０．２２ｕｖａＭｉｌｌｅｘ＠−ＧＶフィルター二ニットを 用いて濾過し、タン、（り因子を滅菌した。無菌ＴＧＦ−β１／ＣＩＳ溶液を、 ０．２ＭＮａ２ＨＰＯａ緩衝液（ｐＨ１１，２）と混合し、２７μｇ／ｍＬ　Ｔ ＧＦ−β１および２７０μｇ／ｍＬｃＩｓを含む貯蔵可能な分散液を得た。

医用グレードヘパリンを、　０．０２Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯａ緩衝液（ｐＨ１，８） 中に溶解させ、４００μｇ／ｍＬヘパリン溶液を調製した。へ、？リン溶液一部 を、等容量のコラーゲン溶液（３０μｇ／ｉＬ含むこと以外は、実施例１と同様 に：Ａ製された）に加えて、２００μｇ／ａＬヘパリンおよび１５Ｍｇ／ｍＬコ ラーゲンを含むコラーゲン／ヘパリンスラリーを、得た。この分散液１部をコラ ーゲン／　ＴＧＦ−β１分散液１部と混合し、　７．６μｇ／ｍＬコラーゲン、 １００　ｌｔｇ／Ｌヘパリン、および１３，５μｇ／ｍＬ　ＴＧＦ−βｌを有す る最終的な分散液を提供した。

得られた分散液を型に流し込み、　ＶｉｒｔｉｓｇＳＲＣ１５凍結乾燥器中に入 れ、４凍結乾燥街中させた。分散液を実施例１のように。

フラッシュ凍結させ凍結乾燥させた。

（Ｃ）ＴＧＦ−β１をＴＧＦ−β２に置き換えたこと以外は、上記Ｂと同様に処 理して１本発明のＴＧＦ−β２／コラ一ゲン移植片を調製した。

（Ｄ）ＰＤＧＦをＴＧＦ−β１の代わりに用いたこと以外は、上記Ｂと同様に処 理して１本発明のＰＤＧＦ／コラーゲン移植片を調製した。

尖１旦」− （動物モデルにおける創傷治癒） モルモットのかなりの深さの創傷の治癒が１次の実験で調べられた。

次の移植片の処方物が、まず、調製された：１、　７．５ｍｇ／ｍＬコラーゲン 、１００μｇ／ｌＬヘパリン、４．０μｇ／ｍＬＴＧＰ−β１ ２、　７．５ｍｇ／ｍＬコラーゲン、ｉｏｏμｇ／ｍＬヘパリン、２０μｇ／ｍ ＬＴＧＦ−β１ ３、無しく対照） 分散液（１，２■Ｌ）をキャストし、上記のように凍結乾燥させ。

４．５ｃｍ　ｘ　１．３ｃｍ　ｘ　Ｏ，１５ｃｍの断片を得た。

皮膚の筋肉に、正中線に沿って長さＳｅａのの切り目を、６０匹の雄のｔｌａｒ ｔｌｅｙモルモットの背部の皮膚に作った。皮膚の端をそのまま大きく裂けたま まにして、長さ５ｃ■、中間点で最大幅約１．２ｃ■、平均表面積４．２ｃｓ２ の長手方向にレンズ状の形の創傷を形成した。１２匹の動物を、各々の試験グル ープに使用した。試験処方物（あるいは対照）の−片を、創傷に挿入し。

水和させ、必要に応じて損傷の全体を覆うのに必要なように成形する。次いで、 創傷を０ｐｓｌｔｅ”で覆い、包帯をする。

各々のグループから４匹の動物を、１４日および１２日に調べた。

創傷部位を外植し１組織学的に、上皮形成および、結合組織および肉芽組織の沈 着について調べた。

その結果によると、１４４日目おいては、　ＴＧＦ−β１を含む移植片を付与さ れた創傷は、マトリックスのみを付与されたらのりも強いことがわかった。２１ １日目は、４μｇのＴＧＦ−β１を付与された創傷は、２０μｇのＴＣＰ−β１ を付与された傷よりも、有意に強かった。結果により、コラーゲン／ヘパリン中 のＴＧＦ−β１により治療されると、開いた創傷の強さは、治癒の初期段階で、 高められることが示唆される。

爽１匠工 （繊維芽反応の持続性） 生物活性剤を含む創傷治癒マトリックスにより、銹発される繊維芽反応（例えば 、結合組織の沈着、繊維増殖、および血管形成）の有益な長期の持続性を９次の 実験で調べた。試験組成物は１次のように調製された： Ａ：　ＰＢＳ中のＴＧＦ−β１（１，５μｇ）　（毎日の注射）；Ｂ：　ＰＢＳ 中のＴＧＦ−β１（１０，５μｇ）　（巨丸剤）；Ｃ：　繊維状ノコラーゲ７　 （３２ｍｇ／ｗＬ）　＋　ヘパリン（３ｏ。

μｇ／ｍＬ）　（”Ｐｃｔ（ゲル°）；Ｄ：　繊維状のコラーゲ７　（３２ｍｇ ／ｍＬ）　＋　ヘハリ：／（３００μｇ／■Ｌ）　十ＴＧＦ−β１（１０，５μ ｇ）；Ｅ：　繊維状のコラーゲン（７，５ｍｇ／ｍＬ）　＋ヘハリ：’　（１０ ０μｇ／ｍＬ）　（″マトリックス”）；Ｆ：　繊維状ノフラーゲ７　（７，５ ｍｇ／ｍＬ）　＋へｔ＜す：／　（１ｏ。

μｇ／謁Ｌ）　十丁ＧＦ−β１（１０，５μｇ）各々の製剤は、さらに、　５０ ０μｇ／ｗＬのマウスの血清アルブミン（ＭＳＡ）を含んでいた。乾燥したコラ ーゲンマトリックスを調製するために、試料ＥおよびＦの分散液をキャストし、 　−４０”Ｃにて２時間、凍結乾燥工程で凍結させた。次に、凍結乾燥チェンバ ーを排気して、温度を、２４時間の間に一２０’Ｃまで上げた。

この凍結乾燥工程は、さらに２４時間にわたり温度を２０”Ｃまで上げることに より完了される。

１２匹の成体の雌のＳ＋ｙｉｓｓ　Ｗｅｂｓｔｅｒマウスが、各々の試験グルー プで使われた。グループＡには、試料＾を、７日間、連日類の皮下に注射するこ とにより投与した。グループＢ、　Ｃ，およびＤには、１日目にだけ各々の試験 製剤を頚の皮下に注射した。グループＥおよびＦには、各々の試験製剤を、肩部 に、外科的に皮下に内移植することにより、授与した（創傷は、クツノブで閉じ られた）。　各々のグループから７日、１５日、および３０日に、外植片を組織 学的分析および形態の分析のために、採取した。

グループ毎に４匹の動物を、各々の時点で調べた。７日後。

投与部位での結合組織沈着および血管新生が、　ＴＧＦ−β１を授与したグルー プで観察された。　グループＡ（丁ＧＦ−β連日）、グループＤ（ＦＣＨゲル＋ ＴＧＦ−βｌ）、およびグループＦ（マド１ルックス＋ＴＧＦ−βｌ）において は、他のグループに比べて有意に大きな反応が起こった。１５日後には、グルー プＦの投与部位では。

グループＢ、　ＣあるいはＥでの部位よりも、かなり大きな反応が起こった。７ 日目および１５５日目両日においては、グループＡ、　ＤあるいはＦの部位の間 には有意な相違はなかった。３０日までにおいては、グループＡとＤとの間には 有意な相違はなかった。しかしながら、　ＴＧＦ−βｌに対する反応の程度は、 グループＡおよびＤでは１着実に低下したが、グループＦでは、ざら（こより遅 く低下した。データによると１部位が、増殖因子だけで処理されるよりも１本発 明のコラーゲンマトリ・マウス中（こ存在する増殖因子で処理される場合の方が 、成体のマウスの皮下部位での繊維芽反応の持続性が、高まることがわかった。

夫監勇工 （因子を用いない創傷治癒） 皮膚の創傷治癒を高めるための生物学的増殖因子を加えない、創傷治癒のための マトリ・マウスの能力が次の実験で示された。創傷治癒は、一般的に９創傷損傷 における肉芽組織（血管組織および結合組織）の沈着より成る。

コラーゲンマトリックスを、７．５μｇ／ｍＬの繊維状のコラーゲン、ｉｏｏμ ｇ／ｎ＋Ｌヘパリン、および０．５■ｇ／ｍＬのブタの血清アルブミンを含むよ うに処方した。

家畜のブタの皮膚に、レンズ状の皮膚の創傷５ｃｍを作った。

コラーゲン／ヘパリンマトリックス（４，５ｘＯ，４ｘＯ，１５ｃｍ）の−片を 、各々の１５の皮膚の厚み全体にわたる創傷の中に入れ、２．３滴の生理食塩水 で水和させた。１５の同様の創傷を、未治療のまま放置された。全創傷は、透明 の閉鎖用包帯およびゲージスポンジで覆い１弾性テープで周囲を包むことにより 、保護した。３日、７日および１４日に、各々の治療グループの創傷５つを動物 から切除し組織形態的方法で調べた。

どの時点においても、マトリックスで治療された創傷の肉芽組織の平均量は、未 治療の創傷（Ｆ（２，３０）・１９．４．　ｐ−ｏ、ｏｏ。

１）よりも、有意に大きかった。特に、７日目には、肉芽組織は、マトリックス で治療された創傷（Ｆ（１，３０）・３２．０．　ｐ＜ｏ、。

０５）においてよりも大きかった。

データによると、コラーゲンマトリックスは、さらに付加的な因子がなくても、 創傷の肉芽組織の多量の沈着を促進することにより、創傷治癒を高めることがわ かる。

爽胤珂工 （ａＦＧＦおよびＴＧＦ−βの組合せ）はぼ同量の酸性繊維芽増殖因子（ａＦＧ Ｆ）およびＴＧＦ−βで：ｌｉ製された創傷治癒用処方物は、創傷治癒活性の相 乗的な高まりを示す。

水溶液中に約３　Ｂ／■Ｌの濃度を有する。流動可能で粘性のあるＶｉｔｒｏｇ ｅｎ’　１００コラーゲン９部を、０．２Ｍ　Ｎａ２■ＰＯ４１０，０９Ｍ　Ｎ ａＯＨ，ｐＨ１１，２，の緩衝液１．０容量部を加えることにより、沈澱させた 。緩衝液中の塩基の量は、　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ’　１００溶液中の酸を中和する ように選定された。沈澱は、　２０’Ｃで、約６時間にわたり実施された。形成 された沈澱物を遠心分離法により採取し、均質化して、一様な分散液とした。ホ モジェネート中のタンパクの濃度を測定し、約５６Ｉ１ｇ／ＩＩＬであることが わかった。このホモジェネートは、上記実施例で述べられているように、ヘパリ ンナトリウム（８ｍｇ／ｍＬ）　、　ａＦＧＦ　（４７０ｐｇ／＋Ｌ）　、およ びＴＧＦ−β２（５２２ｐｇ／諷Ｌ）と合わせて１次のようなコラーゲン／ヘパ リンスポンジ組成物を得た。

（以下余白） 組成物　ａＦＧＦ　（μｇ／ｃ＋＊２）　ＴＧＦ−β２　（ｔｔ　ｇ／ｃ簡２） Ｍ　Ｏ，Ｏ０，７ Ｎ　３．５　０．０ ０　０．７　０．０ ｐ　ｏ、　ｏ　ｏ、　。

これらの濃度は、スポンジマトリックスを、直径６Ｉ１１の円に切った場合、５ ｐｇ、１ｐｇ、あるいは０．２ｐｇの因子を提供するように算出された。

２５匹の成体のマウスを５グループに分け、各々の動物の背の中央部に、直径６ ＩＩＩｌ！皮膚の厚み全体にわたる創傷を作った。創傷を作った後、すぐに、ス ポンジ組成物の１つを、創傷中に入れ、　０ｐｓｉｔｅｅ包帯およびテープで覆 った。

７日月に、創傷を外植し１組織学的調査および組織形態的調査のために調製した 。創傷の組織学的断面における血管結合組織および非血管結合組織の量は、カメ ラ　ルシダ（ｃａ＋＊ｅｒａｌｕｃｉｄａ）およびディジタイザ−タブレット（ ｄｉｇｉｔｉｚｅｒ　ｔａｂｌｅｔ）を用いて１面積を測定する方法により測定 される。結果を、グラフで第３図に示す。点描されたバーは、マトリックスに反 応して沈着した。観察された結合組織を示す。一方、空白のバーは、相加効果だ けと思われる結合組織の”予想される”量を示す。これらのバーは、上記の処方 物と同様の順番（例えば、”Ａ−、１７，７μｇ／ａｍ２ａＦＧＦ＋１７．７μ ｇ／ｃｍ２ＴＧＦ−β２は。

５ｐｇａＦＧＦ＋５μｇ　ＴＧＦ−β２バーに相当する）で配列されている。Ｔ ＧＦ−β２と組み合わせてａＦＧＦを投与することにより、いずれかの因子だけ を投与するよりも、肉芽組織を、かなり、相乗的に増大させた。これは、　ａＦ ＧＦおよびＴＧＦ−βの組み合せが。

皮膚の創傷治癒の促進において、相乗的に、効果的であることを示す。

本発明を実施するための上記の様式の改変は、コラーゲン化学および／あるいは 創傷包帯材の当業者に自明である。これらの改変は１次に示す請求の範囲内にあ る。

国際調査報告

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．約０．０１から約０．３ｇ／ｃｍ３の密度、約１−２０ｍｍの厚さ、および 少なくともその８０％が少なくとも直径３５μｍの孔を有するマトリックスを含 むコラーゲン移植片であって、該マトリックスが繊維状のアテロペプチドコラー ゲンを含み、該繊維の直径が約５０から２００μｍであり化学的に架橋しない、 コラーゲン移植片。
2. ２．約５μｇ／ｍＬおよび約５００μｇ／ｍＬの間の濃度でヘパリンを更に含む 、請求項１に記載の移植片。
3. ３．創傷治癒、腫瘍細胞増殖阻止、免疫調節、骨形成または造血の調節に有効な 量の生物性増殖因子を更に含む、請求項１に記載の移植片。
4. ４．前記増殖因子がＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＰ− ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、結合 組織活性化ペプチド、β−トロンボグロブリン、インシュリン様増殖因子、腫瘍 壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、神経増殖 因子およびインターフェロンからなる群から選択される、請求項３に記載の移植 片。
5. ５．創傷治癒に共力して有効となる量のＴＧＦ−ＢおよびＦＧＦを含む、請求項 ４に記載の移植片。
6. ６．前記有効量のＴＧＦ−ＢおよびＦＧＦが、組成物中に、約０．０７から約２ ００μｇ／ｃｍ２の割合で存在する、請求項５に記載の移植片。
7. ７．前記ＴＧＦ−Ｂが天然ウシＴＧＦ−Ｂであり、前記ＦＧＦが組換えヒト酸性 ＦＧＦである、請求項５に記載の移植片。
8. ８．以下の工程によって生産させる生産物の特徴を有する、コラーゲン移植片： ａ）アテロペプチドコラーゲンの酸性水溶液を提供すること； ｂ）該溶液のｐＨを高めることにより該溶液からコラーゲンを沈澱させ、沈澱し た該コラーゲン繊維の均一な分散液を形成すること； ｃ）該分散液を所望の厚さにキャストすること；ｄ）該キャストした分散液を、 約−２０℃未満の温度でフラツシュ凍結すること、および ｅ）該凍結したキャスト分散液を凍結乾燥して、実質的に湿気のないコラーゲン マトリックスを形成すること。
9. ９．前記酸性水溶液が約４から約２０ｍｇ／ｍＬのアテロペプチドコラーゲンを 含む、請求項８に記載の移植片。
10. １０．１から２５％の水分を含む、請求項８に記載の移植片。
11. １１．前記方法が、キャスティングの前に、０．３３から３．０容量部の不活性 ガスを前記分散液に混合することによって更に特徴付けられる、請求項８に記載 の移植片。
12. １２．前記方法が、前記コラーゲンマトリックスを約４時間から１週間の間、温 度約６０℃から約１２０℃、相対湿度約５５％未満で加熱することによって更に 特徴付けられる、請求項８に記載の移植片。
13. １３．前記加熱が約７５から９０℃で実施される、請求項１１に記載の移植片。
14. １４．前記工程が、前記コラーゲンマトリックスを圧縮して密度を約０．０５か ら０．３ｇ／ｃｍ３にすることによって更に特徴付けられる、請求項８に記載の 移植片。
15. １５．前記工程が、前記コラーゲン繊維の沈澱中または沈澱後に有効量のへパリ ンを加えることによって更に特徴付けられる、請求項８に記載の移植片。
16. １６．増殖因子を更に含む、請求項８に記載の移植片。
17. １７．前記増殖因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧ Ｆ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、 結合組織活性化ペプチド、β−トロンボグロブリン、インシュリン様増殖因子、 腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、神経 増殖因子およびインターフェロンからなる群から選択される、請求項１６に記載 の移植片。
18. １８．創傷治療用マトリックスとして使用されるのに適切なコラーゲンをベース とする移植片の調製方法であって、以下の工程を含む、方法： ａ）アテロペプチドコラーゲンの酸性水溶液を提供すること； ｂ）該溶液のｐＨを高めることにより該溶液からコラーゲンを沈澱させ、沈澱し た該コラーゲン繊維の均一な分散液を形成すること； ｃ）該分散液を所望の厚さにキャストすること；ｄ）該キャストした分散液を、 約−２０℃未満の温度でフラッシュ凍結すること、および ｅ）該凍結したキャスト分散液を凍結乾燥して、実質的に湿気のないコラーゲン マトリックスを形成すること。
19. １９．前記コラーゲン繊維の沈澱中または沈澱後に、有効量のヘパリンを加える ことを更に含む、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．創傷治癒に有効な量の増殖因子を加えることを更に含む、請求項１９に記 載の方法。
21. ２１．前記増殖因子がＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ −ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、または塩基性ＦＧＦである、請 求項２０に記載の方法。
22. ２２．キャスティングの前に、前記分散液に、０．３３から３．０容量部の不活 性ガスを混合することを更に含む、請求項１９に記載の方法。
23. ２３．前記コラーゲンマトリックスを、約４時間から１週間の間、温度約６０℃ から約１２０℃、相対湿度約５５％未満で、加熱することを更に含む、請求項１ ９に記載の方法。
24. ２４．前記方法が、前記コラーゲンマトリックスを圧縮して約０．０５から０． ３ｇ／ｃｍ３の密度にすることによって更に特徴付けられる、請求項１８に記載 の移植片。
25. ２５．創傷を有する哺乳類において創傷治癒を促進するための方法であって、 約０．０１から約０．３ｇ／ｃｍ３の密度、約１から２０ｍｍの厚さ、および少 なくともその８０％が少なくとも直径３５μｍである孔を有するマトリックスを 該創傷に付与することを包含し、該マトリックスが、繊維状アテロペプチドコラ ーゲンを含み、該繊維が直径約５０から２００μｍであり化学的に架橋されない 、 創傷治癒促進方法。
26. ２６．前記マトリックスが、創傷を治癒させるのに有効な量で生物性増殖因子を 更に含む、請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記増殖因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧ Ｆ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＥＧＦ、酸性ＦＧＦ、塩基性ＰＧＦ、ＴＧＦ−α、 結合組織活性化ペプチド、β−トロンボグロブリン、インシュリン様増殖因子、 腫瘍壊死因子、インターロイキン、神経増殖因子、またはインクーフェロンを含 む、請求項２６に記載の方法。
28. ２８．腫瘍の増殖を防止する方法であって、増殖因子の影響を受けやすい腫瘍細 胞を有する被検体に、約０．０１から約０．３ｇ／ｃｍ３の密度、約１から２０ ｍｍの厚さ、および少なくともその８０％が少なくとも直径３５μｍの孔を有す るマトリックス、および腫瘍細胞増殖阻止に有効な量の生物性増殖因子を投与す ることを含み、 該マトリックスが、繊維状アテロペプチドコラーゲンを含み、該繊維の直径が約 ５０から２００μｍであり化学的に架橋されない、 方法。
29. ２９．前記増殖因子がＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、腫瘍壊死因子、インターロ イキン、コロニー刺激因子およびインターフェロンから選択される、請求項２８ に記載の方法。
30. ３０．被検体で免疫調節を行なう方法であって、免疫システムを有する被検体に 、約０．０１から約０．３ｇ／ｃｍ３の密度、約１から２０ｍｍの厚さ、および 少なくともその８０％が少なくとも直径３５μｍの孔を有するマトリツクス、お よび免疫調節に有効な量の生物性増殖因子を投与することを含み、該マトリック ス繊維状アテロペプチドコラーゲンを含み、該繊維の直径が約５０から２００μ ｍであり化学的に架橋されない、方法。
31. ３１．前記増殖因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧ Ｆ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、腫瘍壊死因子、インターロイキン、コロニー刺激因 子およびインターフェロンから選択される、請求項３０に記載の方法。
32. ３２．被検体で造血を行なわせる方法であって、免疫システムを有する被検体に 、約０．０１から約０．３ｇ／ｃｍ３の密度、約１から２０ｍｍの厚さ、および 少なくともその８０％が少なくとも直径３５μｍの孔を有するマトリックス、お よび造血を調節する量の生物性増殖因子を投与することを含み、該マトリックス 繊維状アテロペプチドコラーゲンを含み、該繊維の直径が約５０から２００μｍ であり化学的に架橋されない、方法。
33. ３３．前記増殖因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、インターロイキン、コロ ニー刺激因子、エリスロポエチンおよびインターフェロンから選択される、請求 項３２に記載の方法。
34. ３４．被検体で骨の成長を誘導または増進する方法であって、 被検体に、約０．０１から約０．３ｇ／ｃｍ３の密度、約１から２０ｍｍの厚さ 、および少なくともその８０％が少なくとも直径３５μｍの孔を有するマトリッ クス、および骨誘導に有効な量の生物性増殖因子を投与することを含み、 該マトリックス繊維状アテロペプチドコラーゲンを含み、該繊維の直径が約５０ から２００μｍであり化学的に架橋されない、方法。
35. ３５．前記増殖因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２および結合組織活性化ペプ チドである、請求項３４に記載の方法。