JP5512887B2

JP5512887B2 - 成長因子アンカーリング型骨移植材料および成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット

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Publication number: JP5512887B2
Application number: JP2013515034A
Authority: JP
Inventors: 健太郎内田; 康治成瀬; 晶士高相; 健彦美間; 治松下; 高志原口; 望西
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: US20140335146A1; WO2012157339A1; EP2708246A1; JPWO2012157339A1; EP2708246A4; US9248164B2; EP2708246B1

Description

本発明は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に成長因子を結合させた骨移植材料に関し、より詳細には、成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含有するコラーゲン結合部位含有成長因子を骨移植基材に結合させた成長因子アンカーリング型骨移植材料、成長因子アンカーリング型骨移植材料の製造方法、成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット、および骨形成方法に関する。

関節リウマチや変形性関節症などの治療のために人工関節が装着され、長期使用によって人工関節と骨組織との間にゆるみが生じた場合に、新しい人工関節に入れ替える人工関節再置換術が行われている。この人工関節再置換術の際には、失われた骨の一部を補う目的で、患者本人に由来する自家骨等による骨移植が行われている。骨移植の特徴は、移植骨に含まれる骨タンパクが移植骨の吸収と自家組織への置換を促進することであり、人工物では再建しえない症例においても関節機能再建が可能となる利点がある。また、骨は再生能力に優れた組織であるため、骨折した場合には適切に整復および固定することで略元通りの形態に再生される可能性がある。

しかしながら、自家骨移植は、患者本人のある部分から自分の骨をブロックとして切り取り、ブロックのまま、あるいは顆粒状、粉体状に砕いた後、骨の足りない部分に移植する方法である。自分の骨を利用するため安全性が高い利点があるが、骨欠損部が大きい場合などは、骨の採取部分の痛みが激しく、骨移植のための外科手術後の回復期間も長く掛かり、骨移植のための骨を供給する供与部の確保に多大の困難が伴う場合がある。このような不都合を回避するため、自家骨に代えてドナー由来の骨を使用する同種骨移植が行われ、更に、各種の骨移植材料も開発されている。

例えば、関節固定術において骨形成を促進するために使用される、血小板由来成長因子の溶液とリン酸カルシウムなどの足場材料や多糖類を含む生体適合性マトリックスとの組成物がある(特許文献１)。実施例では、１０００〜２０００μｍの平均直径のリン酸カルシウムに１．０ｍｇ／ｍｌの血小板由来成長因子を滴下して組成物を調製し、この組成物を関節の骨癒合部位に塗布している。その結果、上記組成物は、自家骨移植と同等の骨架橋及び関節癒合を示す、という。

また、ＲＧＤのアミノ酸配列を有する細胞付着誘導ペプチドや組織成長因子由来ペプチドが表面に固定された骨移植材もある（特許文献２）。組織再生効果を得ることが可能な組織成長因子と細胞外基質蛋白の活性部位ペプチドとが表面に付着する骨移植材料は、低濃度のペプチドを付着させた場合でも安定的かつ持続的な薬理効果を示す、という。実施例では、牛骨由来骨ミネラル粒子の表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理してアミン残基を形成し、これに架橋剤１，４−ビス−マレイミドブタンを添加して結合させ、これに細胞付着誘導ペプチドを反応により結合させて骨移植材を調製している。ペプチドが固定されていない骨移植材と比較して優れた骨再生力を示す、という。

また、無細胞性組織基材の断片を脱ミネラル化骨材の断片と合わせて乾燥してなる骨移植片組成物もある(特許文献３)。上皮細胞などから採取したコラーゲンなどの無細胞性組織基材は、細胞認識および細胞結合ならびに細胞伸展、細胞増殖、細胞分化を支持する能力があり、脱ミネラル化骨材は、骨移植を成功させるために重要な天然の骨の生理学的特性を有する。得られた骨移植片組成物を水和した後に移植または埋め込み部に塗布すると、骨形成幹細胞を刺激することでレシピエントの骨組織中もしくは表面又は非骨組織中もしくは表面における新生骨形成を誘導することができる、という。

一方、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニストをコラゲナーゼ由来のコラーゲン結合性ポリペプチド断片に融合した融合タンパクを含む組成物もある（特許文献４）。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、骨粗しょう症の同化療法に使用されるが、１日１回の投与が必要である。上記組成物は、コラーゲン結合性ポリペプチド断片によってコラーゲンとの安定的な結合が可能であり、体液循環から逃れて投与部位に長くとどまり、ＰＴＨより長い半減期を持つことができるため、ＰＴＨの投与と同等またはそれ以上の有効性を発揮するという。実施例では、腹腔内投与し、骨密度の上昇を観察している。

なお、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ受容体アゴニストに代えて塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をコラーゲン結合性ポリペプチド断片に結合した融合タンパクも知られている（非特許文献１）。

更に、骨折などの治療では骨形成を促進する因子を用いることが有用であるとの知見から、フィブロネクチン由来のコラーゲン結合性ドメインを有するポリペプチドと骨形成促進蛋白質とが連結されてなる骨形成促進融合蛋白質もある（特許文献５）。骨形成促進蛋白質としてＢＭＰ(Bone Morphogenetic Proteins）サブファミリーに属する成長因子や、ｂＦＧＦ、甲状腺ホルモンなどが例示されている。実施例では、ヒト腎臓の細胞から抽出したｍＲＮＡをテンプレートとして前記ポリペプチドを調製し、骨形成促進蛋白質としてＢＭＰ２やＢＭＰ７を連結して骨形成促進融合蛋白質を製造している。これをマウス頭蓋冠由来の樹立細胞である骨芽細胞に懸濁したところ、当該骨形成促進融合蛋白質の投与は、前記ポリペプチドの投与と比較して骨芽細胞に対して濃度依存的にアルカリフォスファターゼ活性の亢進を示したという。

また、硫酸カルシウムなどから構成され、少なくとも４つ湾曲した突起を有する造形粒子と懸濁液材料とからなる骨欠損を治療用の組成物がある（特許文献６）。複数の造形粒子の前記突起が相互に組合うことで欠損部への充填を安定化させることができ、懸濁液としてコラーゲン誘導体などのゲルを形成しうる結合剤や、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）であってもよい。

また、リン酸カルシウム、発泡剤、および生体適合性凝集剤を含み、生理的に許容される液体と混合される自己硬化性多孔性リン酸カルシウム組成物であって、前記発泡剤の気体成分の放出が前記組成物の水和により起こり、前記組成物に少なくとも５％の多孔度を与え、かつ、硬化した後、前記リン酸カルシウム組成物が１ＭＰａ以上の圧縮強度を有する、前記組成物もある（特許文献７）。生体適合性凝集剤としてコラーゲンが開示され、前記組成物には、更にコラーゲン露出処理基質を含有しうる旨が記載されている。該発明は、発泡剤により多孔のリン酸カルシウム組成物を生成する点に特徴があり、実施例ではコラーゲン露出処理基質と、発泡剤として炭酸水素ナトリウムとリン酸カルシウムと、カルボキシメチルセルロースを凝集剤として混合し、自己硬化性ペーストを調製している。この自己硬化性ペーストをウサギの末端大腿顆に形成した欠損に充填したところ、完全に近い治癒を示したという。

加えて、粒子状の線維状コラーゲン成分とリン酸カルシウム成分とからなり、更に、精製された骨成長因子、組換え骨成長因子、骨髄成分、脱塩骨及び自家骨から成るグループより選択される物質を含むを含む骨成長組成物もある（特許文献８）。コラーゲン成分は、架橋コラーゲンや多孔質粒状などの不溶性コラーゲンである。実施例では、複合コラーゲンにリン酸カルシウムゲル分散物を混練し、凍結乾燥および熱的脱水による架橋工程の後に、粒子状に加工し、血液を添加してペーストとし、分散骨に移植している。これにより、欠損部分を強固に固定しえた、という。

特表２０１０−５０８９１２号公報特表２００７−５３００９９号公報特表２００９−５３４１２５号公報特表２０１０−５２３６７１号公報特開２００２−５８４８５号公報特表２００３−５２５６９６号公報特表２００９−５１９０５２号公報特表２０１０−５１２９６７号公報

Collagen-binding growth factors: Production and characterization of functional fusion proteins having a collagen-binding domain, Nozomu Nishi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 95, pp7018 – 7023, June 1998, Medical Sciences

人工関節再置換術や骨折治療時、悪性骨肉腫による骨欠損などで骨移植が行われるが、自家骨や同種骨に由来する移植骨を用いた場合でも、一部の症例では母床骨と移植骨との癒合不全や遷延癒合をきたすことが報告されている。このような癒合不全や遷延癒合は、治療期間の長期化を意味し、患者本人の経済的、肉体的、精神的負担となっている。更に、昨今の高齢化に伴って高齢者の骨折が多発している現状において、早期にリハビリが開始できるよう、一刻も早い骨癒合が望まれている。

しかしながら、上記特許文献１記載の骨移植材料は、リン酸カルシウムなどを足場材料として使用するため入手が容易な点で優れるが、自家骨を越える骨増殖や早期癒合は困難である。また、特許文献２記載の骨移植材は、細胞付着誘導ペプチドや組織成長因子由来ペプチドが骨表面に固定されているため、投与部での残存率が高く、優れた骨再生力を発揮しうるが、骨表面にペプチドを固定するために架橋処理を必要とし、製造が容易でない。また、特許文献３は脱ミネラル化骨材を使用するが、脱ミネラル化は、０．６Ｎの塩酸で３〜２４時間抽出するというものであり、処理時間が長い。更に、特許文献３や特許文献４記載の骨移植材料は、骨増殖にかかる有効成分を利用する点で優れるが、これらの成分は体液循環によって投与部から離脱しやすく、投与部での高い残存率を維持できない場合がある。

さらに、特許文献５記載の方法は、コラーゲン結合性ドメインとしてフィブロネクチン由来に限定するものであり、骨形成促進蛋白質としてｂＦＧＦの開示はあるが、実際の効果は不明である。更に、特許文献６は所定形状の造形粒子を使用する点に特徴があり、ＢＭＰを更に配合しうる旨の記載はあるが実際の評価はしておらず、たとえこれらの成分を添加しても、体液循環によって投与部から離脱しやすく、投与部での高い残存率を維持できないと推定される。また、特許文献７は多孔のリン酸カルシウムを形成し、これに生体適合性凝集剤としてコラーゲンを混合しうる旨が記載されているが、実際の評価は行っていない。更に、多孔リン酸カルシウムとコラーゲンとは共有結合で固定されていないため、体液循環によって投与部から離脱しやすく効果持続は困難と推定される。更に、特許文献８は、架橋コラーゲンを粒子状に加工したものを使用するものであるが調製が容易でなく、骨成長因子を配合しうる旨が開示されているが実際の評価は行っていない。更に、たとえ架橋コラーゲンに骨成長因子を混合しても、骨成長因子は体液循環によって投与部から離脱しやすく、長期に亘る効果の維持は困難と推定される。

更に、人工関節再置換術では、大腿骨の半分を入れ替えるなど、解剖学的形状を有していない自家骨や人工骨では再建が困難な症例が多数存在する。この場合には、解剖学的形状が保持され、かつ力学的強度を有する同種骨を移植する以外に方法がない。同様に、難治性骨折治療でも力学的強度を有する皮質骨のプレートが用いられている。しかし、解剖学的形状を有する巨大な同種骨を移植すると、力学的強度や解剖学的形状を有しないコラーゲン露出骨材や粉砕骨と比較して母床骨との間で癒合不全や遷延癒合をきたす場合がある。

本発明は上記現状に鑑み、骨の解剖学的形状と力学的強度とを確保しつつ投与部での骨増殖因子の残存率を高く維持でき、早期の骨癒合を期待しうる骨移植材料を提供することを目的とする。

また本発明は、力学的強度を有し、骨形成能に優れる骨移植材料、前記骨移植材料の製造方法、前記骨移植材料製造用キット、および前記骨移植材料を用いた骨形成方法を提供することを目的とする。

本発明は、成長因子をコラーゲン結合性ペプチド部に結合した融合タンパクを骨に結合させると優れた骨形成能が期待できること、前記融合タンパクは、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材と混合することで架橋反応などを行うことなく前記骨移植基材に容易に結合しうること、得られた成長因子アンカーリング型骨移植材料は、投与部で骨形成能を長期に亘って発揮できるため迅速な骨癒合を期待できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子（Collagen-binding Growth factor;以下「ＣＢ−ＧＦ」とも称する。）が、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に結合された成長因子アンカーリング型骨移植材料であって、前記コラーゲン結合部位含有成長因子は、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである、成長因子アンカーリング型骨移植材料を提供するものである。

また本発明は、前記骨移植基材が、コラーゲン線維の密度が１００〜８００ｍｇ／ｃｍ ^３である高密度コラーゲン材、またはカルシウム含有量が９５〜６０％に酸処理されたコラーゲン露出骨材である、前記成長因子アンカーリング型骨移植材料を提供するものである。

また本発明は、前記骨移植基材が、シート状の高密度コラーゲン材である、前記成長因子アンカーリング型骨移植材料を提供するものである。

また、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部は、塩基性線維芽細胞増殖因子であることを特徴とする、前記成長因子アンカーリング型骨移植材料を提供するものである。

また本発明は、成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液と、コラーゲン線維が露出してなる骨移植基材とを含み、前記コラーゲン結合部位含有成長因子が、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである、成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キットを提供するものである。

また、前記骨移植基材が、コラーゲン線維の密度が１００〜８００ｍｇ／ｃｍ ^３である高密度コラーゲン材である、上記成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キットを提供するものである。

また、本発明は、前記ＣＢ−ＧＦを含有する溶液と、コラーゲン露出骨材調製溶液とを含み、前記コラーゲン結合部位含有成長因子が、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインであり、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部が、塩基性線維芽細胞増殖因子であることを特徴とする、成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キットを提供するものである。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に、コラーゲン結合性ペプチド部を介して成長因子受容体アゴニストペプチド部を結合したものであり、全てが生体成分由来であって生体との親和性や安全性に優れる。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に、予め調製したＣＢ−ＧＦを混合するだけで結合させる事ができ、製造が容易である。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材と成長因子による骨形成作用とを併用することができるため、母床骨と移植骨との癒合が困難な症例において、優れた癒合効果を発揮することができる。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キットは、短時間でコラーゲン露出骨材を調製できるため、自家骨移植の際に簡便に使用することができる。

実施例１の骨移植基材と、成長因子受容体アゴニストペプチド部としてＥＧＦを結合したＣＢ−ＧＦであるＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図であり、図１(ａ)は、骨端部を原料とし、コラーゲン露出処理前の骨材とＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合能を評価する結果であり、図１(ｂ)は、コラーゲン露出処理後の骨材とＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図である。図１の骨端部に代えて、骨幹部を使用した骨材とＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図であり、図２(ａ)は、骨幹部のコラーゲン露出処理前の骨材とＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合能を評価する結果であり、図２(ｂ)は、コラーゲン露出処理後の骨幹部の骨材とＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図である。実施例２の骨移植基材と、成長因子受容体アゴニストペプチド部としてｂＦＧＦを結合したＣＢ−ＧＦであるｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図であり、図３(ａ)は、骨端部を原料とし、コラーゲン露出処理前の骨材とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合能を評価する結果であり、図３(ｂ)は、コラーゲン露出処理後の骨材とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図である。図３の骨端部に代えて、骨幹部を使用した骨移植基材とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図であり、図４(ａ)は、骨幹部のコラーゲン露出処理前の骨材とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合能を評価する結果であり、図４(ｂ)は、コラーゲン露出処理後の骨幹部の骨材とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合能の結果を示す図である。実施例３の結果を示す図であり、図５（ａ）は、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を結合させた骨移植基材群の結果を、図５（ｂ）は、骨端部の粉砕骨結合群の結果を示す。実施例３における仮骨面積を示す図である。実施例４の結果を示す図である。実施例５における新生骨体積を示す図である。実施例６における新生骨体積を示す図である。実施例７における新生骨体積を示す図である。実施例８における軟Ｘ線像の時系列変化を示す図である。コラーゲン結合性ペプチド部（ＣＢＤ）を有する細菌性コラゲナーゼの種類と、ＣＢＤを説明する図である。

本発明の第一は、ＣＢ−ＧＦが、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に結合されたことを特徴とする、成長因子アンカーリング型骨移植材料である。

（１）成長因子アンカーリング型骨移植材料
骨は、網目状に形成されたコラーゲン線維にヒドロキシアパタイトが沈着したものであり、骨の有機質の大部分はコラーゲンである。コラーゲン分子は、３本のポリペプチド鎖がラセン状に結合したものであり、生体内ではこの分子が多数会合して不溶性線維を形成している。骨を酸性溶液やキレート剤で処理して調製して無機質をぼぼ完全に除去したコラーゲン露出処理マトリックス（ＤＢＭ）は、含まれる活性物質が皮下組織や筋肉内に存在する未分化間葉細胞を骨芽細胞に分化させ骨形成を促進するため骨移植材料として使用されていが、ほぼ完全にミネラルを消失しているため、骨に本来備わっている力学的強度も失われる。本発明の「成長因子アンカーリング骨移植材料」は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材を使用するものであり、たとえば、骨に含まれる少なくも一部の無機質を除去して骨表面にコラーゲン線維を露出させた骨移植基材を使用することができる。これにＣＢ−ＧＦを結合させたものは、当該骨移植基材にミネラルが多量に残存しているため解剖学的形状が高度に維持され、かつ力学的に優れる。このような骨移植基材には、コラーゲン線維が分解されずに存在するため、骨移植基材に前記ＣＢ−ＧＦを混合するだけで結合させることができ、製造が容易である。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材が元来有する骨形成能に加え成長因子による相乗的な骨形成作用を期待することができる。しかも、成長因子は、骨移植基材に結合しているため移植部に長く留まり、継続的な骨形成を促すことができる。なお、骨移植基材が自家骨を原料とする場合には、免疫学的な拒絶反応を回避することができる点で有利である。

本発明の成長因子アンカーリング骨移植材料において、骨移植基材に結合させるＣＢ−ＧＦの量に限定はないが、骨移植基材１ｍｇ（乾燥重量）にＣＢ−ＧＦを０．０１〜１ｎモル、好ましくは０．１〜１ｎモル、より好ましくは０．５〜１ｎモル結合したものであることが好ましい。１ｎモルを越えて前記ＣＢ−ＧＦを結合しても、骨形成の増加率は更に向上せず、一方、０．０１ｎモルを下回るとＣＢ−ＧＦを結合した効果が十分に期待できない場合がある。

本発明の成長因子アンカーリング骨移植材料は、使用時に骨をコラーゲン露出処理して骨移植基材を調製し、ついでＣＢ−ＧＦを結合し、これを骨移植材料として使用してもよいが、あらかじめ骨移植基材にＣＢ−ＧＦを結合した成長因子アンカーリング骨移植材料を乾燥保存し、必要時に緩衝液に懸濁して骨移植材料として使用することもできる。なお、成長因子アンカーリング骨移植材料に含まれるコラーゲン結合性ペプチド部がその立体構造によってコラーゲン線維と結合する場合には、コラーゲン線維と結合する立体構造を確保しうる緩衝液に懸濁することが好ましい。このような緩衝液としては、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液や、トリス緩衝液などがある。

本発明の成長因子アンカーリング骨移植材料は、従来の自家骨移植材料などの骨移植材料と同様に、骨密度の増大、骨塩量の増大、新生骨の増大の目的で局所投与を行うことができる。例えば、腫瘍掻爬や人工関節再置換術後に生じる骨欠損部や偽関節部への移植などにより投与することで骨形成を促進させることができる。特に、人工関節再置換術、難治性骨折治療など解剖学的形状、力学的強度が保たれた骨移植材料が必要とされる症例に好適に用いることができる。

（２）ＣＢ−ＧＦ
本発明で使用するＣＢ−ＧＦは、成長因子受容体アゴニストペプチド部(以下、「ＧＦ部」とも称する。)とコラーゲン結合性ペプチド部（以下、「ＣＢ部」とも称する。）とを含むものであればその構造や製造方法に特に制限はなく、両ペプチド部が化学的に結合されたものであってもよく、ＧＦ部とＣＢ部とを含む融合タンパクであってもよい。この際、たとえば、ＣＢ部が、直接またはポリペプチド断片からなるリンカー部を介して、ＧＦ部に連結されるものであってもよい。更に、ＧＦ部とＣＢ部という二つのポリペプチドを、アミノ基を介してジスクシンイミドイルグルタレートやグルタルアルデヒドを含む試薬により架橋結合するものであってもよい。また、一つのポリペプチドをスクシンイミドイル−４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾンにより、もう一方のポリペプチドをスクシンイミドイル−４−フォルミルベンゾエートにより誘導化した後に、二つの誘導化されたポリペプチドを混合し、アミノ基を介して架橋結合してもよい。なお、本発明では、上記以外にＧＦ部とＣＢ部とを結合するために、ポリペプチド以外の架橋剤その他の化合物でこれらを連結してもよい。

（ｉ）コラーゲン結合性ペプチド部
本発明で使用するＣＢ−ＧＦを構成する「コラーゲン結合性ペプチド部」は、骨移植基材に成長因子受容体アゴニストペプチド部を結合させるための結合部として機能する部位である。前記したように、成長因子は骨形成作用を示すが、静脈注射などによって全身投与すると局所残存率が低く、持続的な骨形成作用を期待することができない。本発明は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材を骨移植材料として使用し、かつ、予めＧＦ部とＣＢ部とを含むＣＢ−ＧＦを調製し、これを骨移植基材と混合させることで成長因子受容体アゴニストを骨移植基材に結合させたものである。

骨移植基材にＧＦ部を結合する方法としては、例えば、特許文献２に示すように、コラーゲン露出骨材などのコラーゲン露出骨材と特定成分とを化学的架橋反応で結合する方法が知られている。しかしながら該方法は反応操作に手間がかかり、かつコラーゲン露出骨材に架橋剤が残存する場合がある。しかしながら、ＣＢ−ＧＦを使用する本発明では、ＣＢ−ＧＦに含まれるＣＢ部を介して架橋剤その他の化学的成分を使用せずにコラーゲン露出骨材にＧＦ部を結合させることができる。本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は調製が容易であり、かつ架橋剤を使用しないため安全性に優れる。更に、コラーゲン露出骨材の力学的強度や解剖学的形状の保持性に優れる。

なお、本発明において、「ＣＢ部」とは、コラーゲン線維の少なくとも一部と結合するものを広く対象とすることができる。コラーゲン線維と結合するポリペプチドとしては、例えば、コラゲナーゼ由来のコラーゲン結合部位などを例示することができる。コラゲナーゼ由来のコラーゲン結合部位の構造遺伝子の例としては、配列番号１に示すＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍコラゲナーゼ（以下、「ＣｏｌＨ」と称する場合がある。）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１）の３００１番目〜３３６６番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片がある。このＤＮＡ断片は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＢＡＡ０６２５１で特定されるアミノ酸配列をコードするものである。図１２に示すように、ＣＤで示される触媒部位と、ＣＢＤで示されるコラーゲン結合部位とが含まれ、３００１番目〜３３６６番目の塩基配列はＣＢＤに該当する。同様に、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＢＡＡ７７４５３で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍコラゲナーゼ（以下、「ＣｏｌＧ」と称する場合がある。）、同アクセッション番号ＢＡＣ５７５３２で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｌｉｍｏｓｕｍコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５３５で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｅｐｔｉｃｕｍコラゲナーゼ，同Ａ３６８６６で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５４５で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｎｏｖｙｉコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５４１で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５５０で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｏｒｄｅｌｌｉｉコラゲナーゼ、同ＡＡＯ３７４５６で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉコラゲナーゼ，同ＣＢＯ１６２０で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍコラゲナーゼ，同ＢＡＣ５７５３８で特定されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３３２６２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿９７９８３６で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３３２６２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿９７９８３６で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８４５８５４で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓコラゲナーゼ，同ＹＰ＿０３７６０８で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３２９０２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８４５５９０で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８３０３７３で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ，同ＹＰ＿０３４８１４で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓコラゲナーゼ，同ＮＰ＿８４３０９０で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓコラゲナーゼ、同ＮＰ＿９７６９４２で特定されるＢａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓコラゲナーゼ、その他の細菌性コラゲナーゼに由来するコラーゲン結合性ペプチド部も同様に使用することができる。なお、本発明で使用する「ＣＢ部」は、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材の前記コラーゲン線維に成長因子を保持しうる程度に結合できればよく、従って、コラゲナーゼ由来のコラーゲン結合部位の全てのアミノ酸配列を含む必要はない。たとえば、前記コラーゲン結合性ペプチド部は、上記アミノ酸配列におけるＣＢＤを構成する塩基配列と９０％の相同性を有するものを好適に使用することができる。結合方法は問わず、例えば、コラーゲン露出骨材の表面から露出するコラーゲン線維の一部と親和性を有して結合するものであってもよい。

（ｉｉ）成長因子受容体アゴニストペプチド部
本発明で使用するＣＢ−ＧＦを構成するＧＦ部は、骨移植基材に結合して成長因子などの機能を発揮する部位である。成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などがあり、このような作用を発揮しうる成長因子受容体アゴニストを広く使用することができる。その他、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、ＢＭＰなどの成長因子は、異所性の骨誘導能を示さないが骨形成作用を示し、骨折部に適用すると骨折の治癒を促進する。

このような成長因子受容体アゴニストの構造遺伝子として、特に、塩基性線維芽細胞増殖因子を使用することが好ましい。このような塩基性線維芽細胞増殖因子としては、配列番号２に示すＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の４６８番目〜９３２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片がある。また、上皮成長因子の構造遺伝子として、ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのｐｒｅｐｒｏＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ０４８４２）のｃＤＮＡ（配列番号３）もある。このＤＮＡがコードするｐｒｅｐｒｏＥＧＦのアミノ酸配列を、配列番号４に記載する。

本発明では、ＧＦ部として、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を好適に使用することができる。塩基性線維芽細胞増殖因子は骨形成能に優れており、ＣＢ−ＧＦを構成する成長因子として塩基性線維芽細胞増殖因子が結合したもの（以下、「ＣＢ−ｂＦＧＦ」と称する。）を骨移植基材に結合すると、母床骨と移植骨との癒合性に優れるからである。なお、塩基性線維芽細胞増殖因子に代えて上皮成長因子（ＥＧＦ）を結合したＣＢ−ＧＦをＣＢ−ＥＧＦと称する。

（ｉｉｉ）リンカー部
ＣＢ−ＧＦは、ＣＢ部とＧＦ部とをリンカー部によって連結するものであってもよい。リンカー部を挿入することでＣＢ部とＧＦ部とを所定間隔に隔離することにより、各部位の機能を独立して十分に発揮させることができる。この結果、リンカー部を挿入することでリンカー部を有しないＣＢ−ＧＦを使用する場合よりも強くコラーゲン線維に結合させることができる。

このようなリンカー部としては、セリン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等のアミノ酸からなる特定の三次元構造を持たないペプチド断片が例示できる。また、このようなリンカー部として、前記ＣｏｌＨに由来するアミノ酸配列を好適に使用することができる。より具体的には、ＣｏｌＨの多発性嚢胞腎Ｉ（Polycystic kidney disease I；以下、「ＰＫＤ」と称する。）ドメインを好適に使用することができる。その他、他の細菌コラゲナーゼに由来するＰＫＤもリンカー部として好適に使用することができる。ＰＫＤの共存によりＣＢＤのコラーゲン結合性が強化されるからである。このような細菌コラゲナーゼに由来するリンカー部は、図１２のＰＫＤとして記載されている。なお、このようなリンカー部は、生体循環液に含まれるペプチド水解酵素などに対する抵抗性を有することが好ましく、これによってＧＦ部の局所残存性を高め、継続的な骨形成を可能とすることができる。

（３）骨移植基材
本発明で使用する「骨移植基材」とは、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材である。このような骨移植基材としては、コラーゲン露出骨材や高密度コラーゲン材などがある。

（ｉ）コラーゲン露出骨材
コラーゲン露出骨材としては、たとえば、少なくも骨を形成する無機鉱物成分の一部を除去した粉砕骨などの、コラーゲン露出骨材を好適に使用することができる。骨に含まれる無機鉱物成分の全てを除去した、いわゆる完全脱灰骨に限定されるものではない。これにより骨の力学的強度を確保し、解剖学的形状を維持することができる。なお、一部の無機鉱物成分を除去することで骨に含まれるコラーゲン線維が骨表面に露出し、前記コラーゲン結合性ペプチド部を介してＣＢ−ＧＦを結合することができる。

本発明で使用する「骨」は、自家骨、同種骨、異種骨を問わない。ヒト以外の異種骨の場合は、サル、ヒヒ、チンパンジーなどの霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスであってもよい。また、「コラーゲン露出骨材」には、コラーゲンの他に成長因子、様々のペプチドおよび小タンパク質が豊富に含まれ、骨形成能が保持されている。本発明では、コラーゲン露出骨材を使用することで、骨材に含まれる成長因子を効率的に結合させ、かつ骨の解剖学的形状、力学的強度、骨誘導能を有効に利用することができる。

本発明で使用しうるコラーゲン露出骨材は、コラーゲン線維を露出するために骨を酸溶液に浸漬して調製することができる。なお、酸処理に先立ち、軟部組織の除去処理や、アルコールなどの有機溶媒による骨髄や血液、脂質の除去処理を行ってもよい。

骨は、ブロック状に採取した骨を、骨欠損部の形状に沿わせて成形したものでもよいが、粉砕した骨を使用してもよい。骨を粉砕する場合、その形状が不規則であってもよく、サイズも不均一であってもよい。骨基材を好適な大きさの粒子にミル処理する工程は、コラーゲン露出処理の前に限定されずコラーゲン露出処理と同時に行ってもよく、コラーゲン露出処理後に行ってもよい。粉砕処理は、通常、標準的な粉砕機または混合機を用いて行うことができ、湿った骨基材または乾燥した骨基材のどちらに対しても実施することができる。その粒子径は、例えば、最長寸法が５０〜５０００μｍの範囲であり、好ましくは５０〜1０００μｍ、より好ましくは５０〜２０００μｍである。

本発明で使用しうるコラーゲン露出骨材は、コラーゲン線維を骨表面に露出させるために骨から少なくとも一部の無機鉱物成分を除去したものを好適に使用することができる。露出の程度は、コラーゲン線維が骨組織から露出することでＣＢ−ＧＦを結合できればよい。無機鉱物成分の一部除去の目安としては、カルシウムを指標としてカルシウム含有量を、コラーゲン露出処理前と比較して９５〜１０％、好ましくは９５〜４０％、より好ましくは９５〜６０％、特に好ましくは９５〜８０％に低減すればよい。この後にＣＢ−ＧＦを混合することでコラーゲン露出骨材に結合させることができる。従来は、骨移植基材として、可能な限りカルシウム分を除去した完全脱灰物を使用することが一般的であったが、本発明では、上記範囲で無機鉱物成分を除去すればよく、コラーゲン露出処理時間を短縮することができる。

このような骨に対するコラーゲン露出処理は、塩酸、酢酸、硝酸、硫酸、ギ酸などで無機鉱物成分を溶解して行うことができる。使用する酸によって濃度や処理条件を適宜選択することができる。例えば、０．６Ｎ塩酸を使用する場合は、温度０〜１０℃で３０秒から１８時間、好ましくは６０秒から６時間、より好ましくは６０秒から１時間、特に好ましくは６０秒から２分である。従来、コラーゲン露出処理には、特許文献３に記載されるように、０．６Ｎの塩酸で３〜２４時間抽出するものであり、酸抽出の目安はカルシウム含有量を５％未満に減少することであった。しかしながら、本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、粉砕骨に含まれるコラーゲン線維にＣＢ−ＧＦが結合できればよく、更に抗原性が除去される程度に生細胞が死滅等すればよい。このため、コラーゲン露出処理方法を再検討したところ、例えば、骨を最長寸法が５０〜５０００μｍの範囲に粉砕し、ついで０．６Ｎ塩酸を上記範囲で処理することで、ＣＢ−ＧＦを効率的に結合し、しかも力学的強度が保たれ、生細胞も死滅し同種骨を使用した場合でも抗原性が低減することが判明した。本発明で使用するコラーゲン露出骨材は、上記酸処理の後に、この酸溶液に含まれる無機鉱物成分を除去すればよい。無機鉱物成分の除去方法は、上澄みを除去し、水やリン酸緩衝液などで洗浄すればよく、キレート剤による洗浄を行ってもよい。

本発明で使用するコラーゲン露出骨材は、自家骨より調製してもよいが、同種骨移植を行う場合には、ドナー骨から上記によって調製されたコラーゲン露出骨材を緩衝液に保存し、または乾燥保存したものを使用してもよい。

（ｉｉ）高密度コラーゲン材
本発明では、高密度コラーゲン材を骨移植基材として使用することができる。コラーゲン露出骨材を調製する場合のように酸によるコラーゲン露出処理の必要がないため、短時間で成長因子アンカーリング型骨移植材料を作成できる。
高密度コラーゲン材としては、コラーゲン線維の密度が１００〜８００ｍｇ／ｃｍ^３、好ましくは３００〜８００ｍｇ／ｃｍ^３、より好ましくは４００〜８００ｍｇ／ｃｍ^３である。この範囲で、力学的強度に優れるからである。なお、高密度コラーゲン材は、シート状、柱状、球状、多角状、その他の不定形であってもよい。これらの中でもシート状の高密度コラーゲン材は、骨の表面を被覆する際などに好適に使用することができる。なお、高密度コラーゲン材を構成するコラーゲン線維としては、特に限定されないが、コラーゲンＩ〜ＸＩ型のいずれであってもよい。好ましくはＩ型である。高密度コラーゲン材は、テロペプチドの一部または全部を除去したアテロコラーゲンから構成されることが好ましい。このような高密度コラーゲン材は、コラーゲン線維を含む溶液を凍結乾燥その他によって乾燥し、次いで上記密度に加圧することでシート状に成形して調製することができる。また、市販品を使用してもよい。

（４）成長因子アンカーリング型骨移植材料の製造方法
本発明で使用するＣＢ−ＧＦを構成するＧＦ部とＣＢ部とは、共にペプチドであるため融合タンパクとして調製することができる。ＣＢ−ＧＦとして、成長因子受容体アゴニストが塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）であり、リンカー部およびＣＢ部がＣｏｌＨに由来するＰＫＤ−ＣＢＤである場合のＣＢ−ＧＦをｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤと称すれば、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤの製造方法は、非特許文献１に開示されている。これにより、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤを製造することができる。また、ＧＦ部として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を使用し、ＣＢ部としてＣｏｌＧに由来するＣＢＤを使用することで、これらが融合したｂＦＧＦ−ＣＢＤを製造することもできる。また、ｂＦＧＦの遺伝子配列に代えて上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の遺伝子配列を使用することで、上記と同様にしてＣＢ−ＥＧＦを製造することができる。更に、他の成長因子受容体アゴニストをコードする遺伝子配列を使用することで、ＣＢに他の成長因子受容体アゴニストが結合したＣＢ−ＧＦを製造することができる。なお、前記したように架橋剤によってＣＢ部とＧＦ部とを架橋結合させてもよい。

本発明では、前記した骨移植基材に、ＥＧＦ―ＰＫＤ―ＣＢＤ、その他のＣＢ−ＧＦを混合することで、成長因子アンカーリング型骨移植材料を製造することができる。一般には、リン酸緩衝液に骨移植基材とＣＢ−ＧＦとを所定量添加し、温度０〜１０℃で６０秒から６０分、好ましくは５から３０分、より好ましくは１５から３０分撹拌し、または静置することで骨移植基材にＣＢ−ＧＦを結合することができる。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、予めＣＢ−ＧＦを調製しておけば、従来の自家骨移植の際に骨移植基材を調製し、ただちにＣＢ−ＧＦを添加して成長因子アンカーリング型骨移植材料を調製するだけで簡便に使用することができる。なお、同種骨移植の場合には、予め上記方法で骨移植基材を調製し、緩衝液などに保存したものを使用することができ、または、乾燥した骨移植基材を緩衝液に含浸させ、これにＣＢ−ＧＦを添加して成長因子アンカーリング型骨移植材料を調製し、移植用骨材として使用することができる。

（５）成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット
本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キットには、前記したＣＢ−ＧＦ溶液と骨移植基材とからなるキット（Ｉ）と、ＣＢ−ＧＦ溶液とコラーゲン露出骨材調製溶液とからなるキット（ＩＩ）とがある。

（ｉ）キット（Ｉ）
キット（Ｉ）は、ＣＢ−ＧＦ溶液と骨移植基材とからなる。骨移植基材としては、ドナー骨に含まれる無機鉱物成分の少なくとも一部を除去してコラーゲン線維を露出し、緩衝液に保存したものや、乾燥保存したもの、高密度コラーゲン材などを例示することができる。
キット（Ｉ）を構成するＣＢ−ＧＦ溶液は、ＣＢ−ＧＦを緩衝液中に０．５〜２.０ｍｇ／ｍｌの範囲で溶解した溶液である。緩衝液としては、ｐＨ７．０〜８.０のリン酸緩衝液や、トリス緩衝液、生理食塩水を例示することができる。予め骨移植基材がセットされているため、移植時に骨移植基材にＣＢ−ＧＦ溶液を加えるだけで簡便に成長因子アンカーリング型骨移植材料を調製することができる。

（ｉｉ）キット（ＩＩ）
キット（ＩＩ）は、骨移植基材に換えて、コラーゲン露出骨材調製溶液をＣＢ−ＧＦ溶液に組み合わせたものである。たとえば、自家骨移植を行う際に、コラーゲン露出骨材調製溶液に自家骨を含浸させ、その後に洗浄するだけで、簡便にコラーゲン露出骨材を調製することができる。得られたコラーゲン露出骨材にＣＢ−ＧＦ溶液を添加して混和すれば、成長因子アンカーリング型骨移植材料を調製することができる。なお、０．６Ｎ塩酸溶液や酢酸などの酸溶液、更には、これらの酸液にキレート剤を含有したものをコラーゲン露出骨材調製溶液として使用することができる。キット（ＩＩ）は、自家骨移植を行う際に好適に使用することができる。

（６）骨形成方法
本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、前記骨移植基材にＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦなどのＧＦ部とＣＢ部とを含むＣＢ−ＧＦを結合させたものである。骨移植基材による骨形成能と成長因子による骨形成の作用を期待することができる。従来から、腫瘍掻爬や人工関節再置換術後に生じる骨欠損部の治療や、偽関節部の治療には、自家骨を粉砕した移植骨や、同種骨を粉砕した移植骨が使用されてきた。従来の移植骨に代えて本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料を使用することで、成長因子が移植部に長く留まるため継続的な骨形成を促すことができ、従来よりも早期に骨を形成させることができる。

具体的には、腫瘍掻爬や人工関節再置換術後に生じる骨欠損部や偽関節部へ前記成長因子アンカーリング型骨移植材料を移植することで、骨形成を促進させることができる。

この際、例えば、自家骨移植を行う場合には、移植骨を採取し、最長寸法が５０〜５０００μｍの範囲に粉砕し、０．６Ｎの塩酸中で１分間撹拌することでコラーゲン露出処理を行えばよい。次いで、コラーゲン露出骨材を水洗し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）で洗浄し、これにＣＢ−ＧＦを添加して約１〜３０分間混和すれば、成長因子アンカーリング型自家骨移植材料を調製することができる。これを腫瘍掻爬や人工関節再置換術後に生じる骨欠損部や偽関節部へ移植すれば、自家骨移植を行うことができる。しかも、本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、従前の自家骨と相違してＣＢ−ＧＦが結合しているためＣＢ−ＧＦの作用により、優れた骨形成を期待することができる。骨折などの際に患部の早期癒合により早期離床を可能とし、リハビリを早期に開始することができる。また、同種骨移植を行う際は、術前に成長因子アンカーリング型同種骨移植材料を調整することが可能であり、短い手術時間かつ低侵襲で効果的な同種骨移植を行うことができる。

コラーゲン露出骨材を調製する際に、前記成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット（ＩＩ）のコラーゲン露出骨材調製溶液を使用し、ＣＢ−ＧＦとしてキット（ＩＩ）に含まれるＣＢ−ＧＦ溶液を使用することができる。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

製造例１（ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の製造）
（１）ＣｏｌＨのＤＮＡ（配列番号１）における塩基番号３００１〜３３６６の領域は、コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）をコードする遺伝子断片である。また、上記ＤＮＡ（配列番号１）中、塩基番号２７１９〜３０００の領域は、細菌性コラゲナーゼのＰＫＤドメイン(ＰＫＤ) をコードする遺伝子断片であり、リンカー部として使用することができる。そこで、これらの領域を含む上記ＤＮＡ（配列番号１）の塩基番号２７１９番目〜３３９１番目の領域をｐＧＥＸ−４Ｔ−２プラスミドのＳｍａＩ部位に常法に従って挿入した。

（２）ＲａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのｐｒｅｐｒｏＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｕ０４８４２）のｃＤＮＡ（配列番号３）中、塩基番号３３０８〜３４４８の塩基配列からなるＤＮＡ（配列番号５）を、５’末端側にＢａｍＨＩ部位、３’末端側に融合タンパク質の読み枠を整合させるための１ヌクレオチド（Ｇ残基）とＥｃｏＲＩ部位を持つよう、ＰＣＲ法により増幅した。この断片を（１）の発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に常法に従って挿入した。得られた発現プラスミドは、ＧＳＴ−ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号６）をコードする読み枠（配列番号７）を有している。

（３）得られた（２）の発現プラスミドを大腸菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＬ）にエレクトロポレーション法により導入した。
前記大腸菌を、５０ｍＬの５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ−Ｇ培地中で、一晩、前培養した。得られた前培養液１０ｍＬを前記培地５００ｍＬに加え、この菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が約０．７になるまで、３７℃で振とう培養した。得られた菌液に、０．１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液５ｍＬを添加し、３７℃で２時間培養した。その後、０．１Ｍフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）のイソプロパノール溶液５ｍＬを添加し、培養液を６，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心して形質転換体を集菌した。１ｍＭＰＭＳＦを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）７．５ｍＬに菌体を懸濁し、フレンチ・プレスにて細胞破砕処理を行った。懸濁液の１／１９容量の２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を添加し、４℃で３０分間撹拌した。この溶菌液を１５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心して得た上清を、再度同じ条件で遠心し、その上清を清澄溶菌液とした。グルタチオン−セファロース・ビーズ（２ｍＬ）にこの清澄溶菌液を添加し４℃で１時間撹拌してＧＳＴ−ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質をビーズに結合させた。このビーズをＰＢＳ１２ｍＬで５回洗浄したのち、少量のＰＢＳに懸濁してカラムに充填した。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭグルタチオン溶液で融合タンパク質を溶出した。融合タンパク質１ｍｇあたり５ｕｎｉｔのトロンビンを添加して２５℃で１０時間反応し、ＧＳＴタグを切断した。その後ＰＢＳ３００ｍＬに対して４℃で１２時間の透析を４回繰り返した。ＰＢＳで洗浄した新しいグルタチオン−セファロース・ビーズ（２ｍＬ）を充填したカラムに透析を完了した切断産物を添加してそのまま溶出することにより、ＧＳＴタグを除去してＧＳＴタグを有しないＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号６の２２５〜４９１）を得た。

製造例２（ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の製造）
まず、配列番号１に示すＣｏ１Ｈ遺伝子の２７１９番目〜３３９１番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片（ＰＫＤ−ＣＢＤ遺伝子）を、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２プラスミド（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）のＳｍａＩ部位に、常法を用いて挿入した。他方、配列番号２に示すＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の４６８番目〜９３２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を、５´末端側にＢｇｌＩＩ部位を有し、３´末端側に１ヌクレオチド（塩基Ｇ）およびＥｃｏＲＩ部位を有するように、ＰＣＲ法により増幅した。増幅したＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を、前記ＤＮＡ断片（ＰＫＤ−ＣＢＤ遺伝子）を挿入した前記プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、常法を用いて挿入し、発現プラスミドを調製した。前記発現プラスミドは、ＧＳＴ−ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号８）をコードするリーディングフレーム（配列番号９）を有している。前記ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に示し、前記ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質をコードする塩基配列を配列番号１１に示す。配列番号１０に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、ＧＳＴタグ切断用酵素（トロンビンプロテアーゼ）の認識部位の一部である。エレクトロポレーション法を用いて、前記発現プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、形質転換体を作製した。

前記形質転換体を、５０ｍＬの５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有２×ＹＴ−Ｇ培地中で、一晩、前培養した。得られた前培養液１０ｍＬを前記培地５００ｍＬに加え、この菌液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が約０．７になるまで、３７℃で振とう培養した。得られた菌液に、０．１Ｍイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液５ｍＬを添加し、３７℃で２時間培養した。さらに、０．１Ｍフェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）含有イソプロパノール液５ｍＬを添加後、前記菌液を６０００×ｇ、４℃で１０分間遠心し、形質転換体を回収した。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＰＭＳＦ７．５ｍＬに、前記形質転換体を懸濁し、フレンチ・プレスにより細胞を破壊した。この懸濁液１９容量に対して、２０％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００１容量を加え、４℃で３０分間撹拌した。得られた菌液を、１５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。この上清を、さらに１５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心し、上清を回収した。この上清を、清澄溶菌液とした。グルタチオン−セファロースビーズ２ｍＬに前記清澄溶菌液を添加し、４℃で１時間撹拌した。前記ビーズを、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭＮａＣｌ１２ｍＬを用いて５回洗浄後、少量の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭＮａＣｌに懸濁してカラムに充填し、溶出液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭグルタチオン）を用いて、前記ＧＳＴ−ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を溶出した。この融合タンパク質１ｍｇあたり、５ｕｎｉｔのトロンビンを添加して、２５℃で１０時間反応させた。得られた反応液を、ヘパリン−セファロースビーズ１ｍＬに添加し、４℃で３時間撹拌してｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を本ビーズに結合させた。上清を静かに捨て５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭＮａＣｌ１２ｍＬを用いて３回洗浄した。このビーズをカラムに充填し、０．５〜２ＭＮａＣｌの塩勾配を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）計１０ｍＬを用いてタンパク質を溶出し、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号１０）を得た。

製造例３（ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質の製造）
配列番号１２に示すＣｏｌＧ遺伝子の４０１１番目〜４３５８番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片を、５´末端側にＳｍａＩ部位を有し、３´末端側にＸｈｏＩ部位を有するように、ＰＣＲ法により増幅した。この断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−２プラスミドのＳｍａＩ部位とＸｈｏＩ部位の間に常法に従って挿入した。他方、配列番号２に示すＨｏｍｏｓａｐｉｅｎｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２（ｂａｓｉｃ）遺伝子（ＮＣＢＩＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅアクセッション番号ＮＭ＿００２００６．４）の４６８番目〜９３２番目の塩基配列からなるＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を、５´末端側にＢｇｌＩＩ部位を有し、３´末端側に１ヌクレオチド（塩基Ｇ）およびＥｃｏＲＩ部位を有するように、ＰＣＲ法により増幅した。増幅したＤＮＡ断片（ｂＦＧＦ遺伝子）を、前記ＤＮＡ断片（ＣＢＤ遺伝子）を挿入した前記プラスミドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位に、常法を用いて挿入し、発現プラスミドを調製した。前記発現プラスミドは、ＧＳＴ−ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質（配列番号１３）をコードするリーディングフレームを有している。前記ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３の塩基配列第７２０番目から１５０３番目に対応するアミノ酸配列である。このアミノ酸配列において、Ｎ末端の２つのアミノ酸残基Ｇｌｙ−Ｓｅｒは、ＧＳＴタグ切断用酵素（トロンビンプロテアーゼ）の認識部位の一部である。エレクトロポレーション法を用いて、前記発現プラスミドを、大腸菌ＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入し、形質転換体を作製した。
この形質転換体を用いた以外は製造例２と同様に操作して、ｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を製造した。

実施例１
生後２ヶ月齢オスのＷｉｓｔａｒラットから大腿骨を採取し、脱脂凍結乾燥を行った。
この骨組織を骨端部と骨幹部とにわけ、それぞれを平均粒子径５０〜３００μｍに粉砕した。各粉砕骨４０ｍｇに０．６Ｎの塩酸１ｍｌを添加し、温度４℃で１８時間、撹拌処理した。次いで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で２度洗浄し骨端部および骨幹部のコラーゲン露出骨材を調製した。

骨端部の粉砕骨（コラーゲン露出処理前の骨材）５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、８０ｍｇ、１６０ｍｇに、それぞれリン酸緩衝液０．２ｍｌと、製造例１で得たＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を１．１６ｎモル添加し、３０分間混和した。混和後、上澄みを採取して上澄みに含まれる融合タンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。結果を図１（ａ）に示す。なお、図１（ａ）において、左から分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、製造例２で得たＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の原液（ｃｏｎ）、コラーゲン（ＣＰ）５ｍｇ、粉砕骨（ＢＰ）５ｍｇ、粉砕骨（ＢＰ）１０ｍｇ、粉砕骨（ＢＰ）２０ｍｇ、粉砕骨（ＢＰ）４０ｍｇ、粉砕骨（ＢＰ）８０ｍｇ、粉砕骨（ＢＰ）１６０ｍｇを示す。

また、骨端部の粉砕骨（コラーゲン露出処理前の骨材）に代えて、上記した骨端部のコラーゲン露出骨材（ＤＢＰ）を５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、８０ｍｇおよび１６０ｍｇ（コラーゲン露出処理前重量）とり、それぞれにリン酸緩衝液０．２ｍｌと、製造例１で得たＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を１．１６ｎモル添加し、３０分間混和した。混和後、上澄みを採取して上澄みに含まれる融合タンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。また、比較として、ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質に代えてウシアルブミンを１．１６ｎモル添加して上記と同様に操作した。結果を図１（ｂ）に示す。以下、図１〜図４において、粉砕骨使用群をＰｒｅ−ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＰ）と、コラーゲン露出骨材使用群をＰｏｓｔ−ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＤＢＰ）で示す。

更に、骨端部の粉砕骨に代えて、骨幹部の粉砕骨を使用し、骨端部のコラーゲン露出骨材に代えて骨幹部のコラーゲン露出骨材を使用し、上記と同様に操作して、ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合活性を評価した。結果をそれぞれ図２（ａ）、図２（ｂ）に示す。

図１（ａ）と図１（ｂ）とを比較すると、図１（ａ）では、上澄み中の融合タンパク質の量は、粉砕骨の量にかかわらず一定であるが、図１（ｂ）では、コラーゲン露出骨材量が増加するにつれて上澄み中の融合タンパク質の量が低下した。コラーゲン露出骨材と結合しなかったＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質が上澄みに存在するため、コラーゲン露出骨材量を増加することで、より多くのＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質がコラーゲン露出骨材と結合したと考えられる。なお、骨端部ではウシアルブミンでも、ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質と同様に、コラーゲン露出骨材量に依存して上澄みへの残存量が減少し、コラーゲン露出処理によって、タンパク質の結合能が増加することが判明した。

また、図１（ｂ）と図２（ｂ）とを比較すると、コラーゲン露出骨材に対するＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合量は、骨端部に由来するコラーゲン露出骨材と骨幹部に由来するコラーゲン露出骨材とでほぼ同じ結合量を示した。一方、図１（ｂ）と図２（ｂ）とを比較して明らかなように、上澄みにおけるＢＳＡ量は骨幹部の方が多い。このことは、アルブミンの結合量は、使用する骨の部位によって異なることを意味する。本発明を用いることで、使用する骨の部位によらず、粉砕骨にＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質をアンカーリング可能であると考えられた。

実施例２
ＥＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質に代えて、製造例２で得たｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を使用した以外は実施例１と同様に操作して、骨端部の粉砕骨とコラーゲン露出骨材、および骨幹部の粉砕骨とコラーゲン露出骨材に対するｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合活性を評価した。骨端部の粉砕骨とコラーゲン露出骨材とに対するｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合活性の結果を図３(ａ)、図３（ｂ）に、骨幹部の粉砕骨とコラーゲン露出骨材とに対するｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合活性の結果を、図４（ａ）、図４（ｂ）に示す。

図３（ａ）と図３（ｂ）とを比較すると、共に粉砕骨やコラーゲン露出骨材の量が増加するにつれて上澄み中の融合タンパク質の量が低下した。しかしながら粉砕骨よりもコラーゲン露出骨材の方が骨量に対する依存性が高く、コラーゲン露出処理によってｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質との結合性が向上することが判明した。

また、図３と図４とを比較すると、骨幹部に由来するコラーゲン露出骨材は、８０ｍｇの添加で、ほぼ上澄み中のｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質が消失したが、骨端部に由来するコラーゲン露出骨材は４０ｍｇの添加で上澄み中からほぼ消失しており、骨端部に由来するコラーゲン露出骨材の方が、骨幹部に由来するコラーゲン露出骨材よりもｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質の結合能が高いことが判明した。本発明により、使用する骨の部位、使用するＣＢ−ＧＦの種類によらず、コラーゲン露出処理骨剤にＣＢ−ＧＦをアンカーリングしうることが示された。

実施例３
生後２ヶ月齢のオスのＷｉｓｔａｒラット６匹を３匹ずつの２群に分けた。両群のラットにおいて、ネンブタール麻酔下に、大腿骨前方の骨膜上に、実施例１と同様に調製したコラーゲン露出骨材２０ｍｇ（コラーゲン露出処理前重量）に製造例２で調製したｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を２０mｇ結合させたコラーゲン露出骨材（成長因子アンカーリング型骨移植材料）を移植し、他の一群には、実施例１で調製した骨端部の粉砕骨を２０ｍｇ移植した。

一週間毎に、軟Ｘ線撮影を行い、骨形成を経時的に観察した。ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を結合させたコラーゲン露出骨材を移植した結果を図５（ａ）に、骨端部の粉砕骨を移植した結果を図５（ｂ）に示す。

図５（ａ）に示すように、大腿骨前方の骨膜上に成長因子アンカーリング型骨移植材料を移植すると、約１週間後に移植した成長因子アンカーリング型骨移植材料の近傍に骨組織が観察（矢印）され、約２週間後には、より広範囲に骨組織が厚みをもって観察された。これに対し、粉砕骨を移植したコントロール群では、移植２週間後でも、粉砕骨の近傍に骨組織を観察することはできなかった。また、新生した骨組織（仮骨）の面積を図６に示す。黒カラムがコントロール群であり、白カラムがｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質結合群である。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、従来の同種骨移植と比較して、迅速に骨組織を形成しうることが判明した。

実施例４
生後２ヶ月齢のオスのＷｉｓｔａｒラットから大腿骨を採取し、脱脂凍結乾燥を行った。
この骨組織の骨幹部を平均粒子径５０〜３００μｍに粉砕した。粉砕骨を４０ｍｇ（コラーゲン露出処理前重量）ずつに３分割し、その１を非コラーゲン露出処理粉砕骨（ＢＰ）とし、その２，その３をコラーゲン露出処理粉砕骨（ＤＢＰ）群とした。コラーゲン露出処理粉砕骨（ＤＢＰ）群は、０．６Ｎの塩酸１ｍｌを添加し、温度４℃で１分または１８時間、撹拌処理した。次いで、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で２度洗浄し骨幹部の骨移植基材とした。

ついで、骨幹部の粉砕骨（ＢＰ）４０ｍｇ、コラーゲン露出処理１分群、コラーゲン露出処理１８時間群とにそれぞれリン酸緩衝液０．２ｍｌと、製造例２で得たｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を１．１６ｎモル添加し、３０分間混和した。混和後、上澄みを採取して上澄みに含まれる融合タンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。結果を図７に示す。なお、コラーゲン露出処理１分群のカルシウム含有量は、９０質量％、コラーゲン露出処理１８時間群のカルシウム含有量は、１０質量％であった。

なお、図７において、左から分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）、原液（ｃｏｎ）、粉砕骨（ＢＰ）、コラーゲン露出処理１分の粉砕骨（ＤＢＰ）、コラーゲン露出処理１８時間の粉砕骨（ＤＢＰ）を示す。

図７に示すように、粉砕骨（ＢＰ）では、上澄み液に融合タンパク質が観察されるのに対し、コラーゲン露出処理１分の粉砕骨（ＤＢＰ）、コラーゲン露出処理１８時間の粉砕骨（ＤＢＰ）では共に上澄み液に融合タンパク質が観察されておらず、短時間のコラーゲン露出処理でも骨移植基材にＣＢ−ＧＦを結合可能であることが分かる。

実施例５
生後１０週齢のオスのＷｉｓｔａｒラット６４匹を１６匹ずつの４群に分けた。実施例１と同様に調製した骨幹部の脱ミネラル化骨材２０ｍｇ（コラーゲン露出処理前重量）と１．１６ｎモルのｂＦＧＦ、０．２９ｎモルのｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質、１．１６ｎモルのｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質とを反応させて成長因子アンカーリング型骨移植材料を調製し、これを大腿骨骨幹部前方の骨膜上に移植した。
移植１週間後、および２週間後に各群の８匹のラットの大腿骨を採取し、マイクロＣＴを用いて新生骨体積を測定した。なお、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）とコラーゲン露出骨材を反応させた後に移植した群をコントロールとした。結果を図８に示す。
白カラムがコントロール群であり、灰色カラムが１．１６ｎモルｂＦＧＦ群、黒カラムが０．２９ｎモルｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質群，グラデーションカラムが１．１６ｎモルｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質群である。ａはコントロール群との有意差、ｂは１．１６ｎモルｂＦＧＦ群との有意差を示す。

図８より、１．１６ｎモルｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質群の１週後の新生骨量は１．１６ｎモルｂＦＧＦ群に比べ有意に多かった。また、２週後の新生骨量は、０．２９ｎモル、１．１６ｎモルｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質群共に、ｂＦＧＦ群に比べ有意に多かった。本発明によりコラーゲン露出骨材とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質を用いることによって低用量で長期に渡って骨形成を促進できることが示された。

実施例６
生後１０週齢のオスのＷｉｓｔａｒラット３２匹を１６匹ずつの２群に分けた。実施例１と同様に調製した骨幹部のコラーゲン露出骨材２０ｍｇ（コラーゲン露出処理前重量）とｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ、製造例３で得たｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質を反応後、大腿骨骨幹部前方の骨膜上に移植した。反応量は両群共に０．５８ｎモルとした。
移植１週間後、および２週間後に各群の８匹のラットの大腿骨を採取し、マイクロＣＴを用いて新生骨体積を測定した。結果を図９に示す。移植後２週後の新生骨量はｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質群で多い傾向にあった。本発明によりコラーゲン結合ドメインを変化させることによって、徐放期間や骨形成量をコントロールできることが示された。

実施例７
生後１０週齢のオスのＷｉｓｔａｒラット８０匹を２０匹ずつの４群に分けた。シート状の高密度コラーゲン材（コラーゲン線維の密度６４０ｍｇ／ｃｍ^３、５ｍｍ×５ｍｍ×１００μｍ）と０．５８ｎモルｂＦＧＦ、０．５８ｎモルｂＦＧＦ−ＣＢＤ融合タンパク質、０．５８ｎモルｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質とをそれぞれ反応させた骨移植材料を大腿骨骨幹部前方の骨膜上に移植した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）と高密度コラーゲン材を反応させた後に移植した群をコントロールとした。
移植１週間後、および２週間後に各群の１０匹のラットの大腿骨を採取し、マイクロＣＴを用いて新生骨体積を測定した。結果を図１０に示す。移植１週後の新生骨量はｂＦＧＦ群、ｂＦＧＦ−ＣＢＤ（I）融合タンパク質、ｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ（ＩＩ）融合タンパク質群で同等であったが、移植２週後はｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ（ＩＩ）融合タンパク質で有意に高かった。本発明により高い強度を有する高密度コラーゲン材を用いることで長期的に骨形成を促進する移植骨代替材料を提供できることが示された。

実施例８
生後１０週齢オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス６匹を２群に分けた。腫瘍掻爬や外傷後の広範囲骨欠損に対する再建を模擬してマウス大腿骨骨幹部に５ｍｍの骨欠損を作成後、同部位に骨移植を行った。骨移植後、実施例７と同様に調製したｂＦＧＦ−ＰＫＤ−ＣＢＤ融合タンパク質をシート状の高密度コラーゲン材（コラーゲン線維の密度６４０ｍｇ／ｃｍ^３、５ｍｍ×５ｍｍ×１００μｍ）と反応させて得た骨移植材料で被覆した。なお、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）とシート状の高密度コラーゲン材を反応させた後に被覆した群をコントロールとした。
各群の１匹のラットの経時変化を結果を図１１に示す。移植３週後、骨移植材料で被覆した群では移植骨周囲に旺盛な新生骨形成が認められ、移植骨と母床骨の癒合が認められた。これによりこの骨移植材料は、力学的強度が要求される同種皮質骨プレートの代替材料として有用であることが示された。

本発明は２０１１年５月１３日に出願された日本国特許出願２０１１−１０８６５０号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０１１−１０８６５０号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明の成長因子アンカーリング型骨移植材料は、簡便に製造することができ、かつ従来の骨移植材料と同様に使用することができる。しかも、成長因子が付加されているため、母床骨と移植骨との癒合性に優れ、有用である。

Claims

成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子が、少なくともコラーゲン線維が露出してなる骨移植基材に結合された成長因子アンカーリング型骨移植材料であって、
前記コラーゲン結合部位含有成長因子は、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、
前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである、成長因子アンカーリング型骨移植材料。
前記骨移植基材が、コラーゲン線維の密度が１００〜８００ｍｇ／ｃｍ^３である高密度コラーゲン材、またはカルシウム含有量が９５〜６０％に酸処理されたコラーゲン露出骨材である、請求項１記載の成長因子アンカーリング型骨移植材料。
前記高密度コラーゲン材がシート状である、請求項２記載の成長因子アンカーリング型骨移植材料。
前記成長因子受容体アゴニストペプチド部は、塩基性線維芽細胞増殖因子であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の成長因子アンカーリング型骨移植材料。
成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液と、コラーゲン線維が露出してなる骨移植基材とを含み、
前記コラーゲン結合部位含有成長因子が、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインである、成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット。
前記骨移植基材が、コラーゲン線維の密度が１００〜８００ｍｇ／ｃｍ^３である高密度コラーゲン材である、請求項５記載の成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット。
成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とを含むコラーゲン結合部位含有成長因子を含有する溶液と、コラーゲン露出骨材調製溶液とを含み、
前記コラーゲン結合部位含有成長因子が、前記成長因子受容体アゴニストペプチド部とコラーゲン結合性ペプチド部とがリンカー部を介して結合されたものであり、前記リンカー部が、コラゲナーゼの多発性嚢胞腎Ｉドメインであり、
前記成長因子受容体アゴニストペプチド部が、塩基性線維芽細胞増殖因子であることを特徴とする、成長因子アンカーリング型骨移植材料製造用キット。