JPH038436A

JPH038436A - リポソームの保存方法

Info

Publication number: JPH038436A
Application number: JP14268589A
Authority: JP
Inventors: Jiro Yamaguchi; 山口　治朗; Mitsunori Ono; 光則小野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1989-06-05
Filing date: 1989-06-05
Publication date: 1991-01-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はリボソームの保存方法に関し、更に詳しくは、
リボソーム分散液にジグリセリンを添加した保存方法に
関する。

（従来の技術）リボソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）は、脂質２分子膜から
なる閉鎖小胞体である。天然の生体膜は、脂質の２分子
膜構造をとっていると言われており、このリボソームは
生体膜のモデル膜としてその物理化学的性質の研究に広
く用いられている。また、リボソームは内部の水層や膜
内に種々の物質を閉し込めることが出来、細胞と融合し
たり、細胞に取り込まれたりするので、生体内へ物質を
送り込むキャリヤーとして利用される。リボソームを利
用した研究は、生物学、医学、薬学など広範な分野にわ
たっており、酵素や制ガン剤を運ぶキャリヤーとしての
利用、免疫学分野で利用、細胞との相互作用、ドラック
デリバリ−システムとしての利用等が研究されている。

リボソームは上述したように、極めて広範な利用分野を
有するが、その問題点として膜構造の脆弱性が指摘され
ている。

即ち、膜形成物質である脂質の化学的または物理的変化
により膜の配向が乱れ、内包物の漏出、リボソームどう
しの会合、凝集が起こり、やがて沈澱を生成してしまう
現象である。

そこでリボソーム膜の強化法として、従来、多糖で被覆
したリボソームの製法（特開昭６１−６９８０１号）や
水素結合によって構造強化されたリン脂質（日本化学会
誌　５６９頁、１９８７年）また脂質にアスコルビン酸
エステルを混合する方法（特開昭６０−２３１６０８号
）、保存液の外部浸透圧を高くする方法（特開昭６２−
２０１８１５号）などが提案されてきたが、いずれも内
包物の漏出抑制という観点が主体であり、実用する場合
にもっとも重要となる保存液中での凝集抑制には技術的
な進歩が見られていなかった。

最近、プロピレングリコール、グリセリン等を用いるリ
ボソーム製造法（特開昭６０−７９３２号）が開示され
たが、この方法は繁雑であり、かつ脂質類、コレステロ
ール等を高温（６０〜１６０°Ｃ）下でそれらの多価ア
ルコールに分散するものであり、内包物として使用でき
るものは著しく限定されるなどの問題を有していた。更
にこの方法で作製したリボソームでは、一般に未封入物
を除去する目的で透析、ゲル濾過、遠心分離などを行う
ため、最初用いた多価アルコールは大部分除去されてし
まう。そのため残留多価アルコールによって最終的に得
られるリボソーム分散液が分散性の面で安定化される事
は実質的に期待できない。

上記のように現在までのｔころ封入部材を有するリボソ
ームを液状で安定に保存する方法が見出されていない。

（発明の目的）従って本発明の目的は、膜構造が強化され、保存時の凝
集が少ないリボソームの保存方法を提供することにある
。

（発明の構成）上記の目的は、封入部材を有するリボソーム分散液中に
ジグリセリンを添加することを特徴とするリボソームの
保存方法によって達成された。

本発明者等は、内包物の漏出、リボソームの粒子の凝集
という観点で、リボソームの膜構造を強化する方法を鋭
意研究した結果、リボソーム分散液に、ジグリセリンを
添加することにより、漏出、凝集が大きく抑制できるこ
とを見出した。特に驚くべきことは、上記特開昭６０−
７９３２号などで用いられているプロピレングリコール
やグリセリンなどのモノマー型の多価アルコールを添加
した場合に比べて格段に凝集が抑制されることを見出し
たことにより本発明を完成した。

本発明におけるリボソーム膜形成脂質には、特に側限は
なく、リボソームを形成するものであれば、天然または
合成の脂質が使用可能である。

その例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル
グリセロールスフィンゴミエリン、カルシオリピンおよ
びこれらを常法に従って水素添加したものが挙げられ、
これらを適当に組合せて用いることもできる。

さらにリボソーム膜の構成成分には所望によりコレステ
ロール等の膜構造強化剤や電荷付与物質（例えばステア
リン酸、オレイン酸、リノール酸、リルン酸、ジセチル
リン酸、ステアリルアミン）を添加することもできる。

本発明に使用される封入部材としては親水性薬物と親油
性薬物のいずれかあるいは両者を同時に用いることがで
きる。

このような親水性薬物としては例えばアドリアマイシン
、アドリアマイシン、マイ斗マイシン、■−β−アラビ
ノフラシルシトシン、プレオマイシン、シスプラチン等
の抗がん剤、インターフェロン等の抗ウィルス剤、アミ
ノ配糖体（例えば、ゲンタマイシン）、β−ラクタム系
（例えばスルペニシリン、セフォチウム、セフメツキシ
ム）等の抗生物質、ＴＲＨ，リュウブロライド、インス
リン等のペプチドホルモン剤、リゾチーム、アスパラギ
ナーゼ、グリコシダーゼ等の酵素剤、ムラミルジペプチ
ド、ムラミルトリペプチド等の免疫賦活剤、イムノグロ
ブリン、各種トキシン等の蛋白質があげられる。

親油性薬物の例としては、アンサマイトシンのような抗
ガン剤や、ＴＭＤ−６６（Ｇａｎｎ工土（２）１９２−
１９５　（１９８３））、ＭＴＰ−ＰＥ（特開昭５９−
１６３３８９号）のような免疫賦活剤、リン脂質誘導体
（特開昭５９−１６３３８９号）が挙げられる。

その他薬物以外のものでも、マーカー、あるいはプラス
ミド、［ｌＮＡ　、、ＲＮＡ等生体内に投与して有用な
ものであれば、特に制限されることはない。

次に封入液は水を媒体とし、これに適宜の水溶性物質を
熔解した水溶液が用いられる。場合によっては単に薬物
を溶解したものであってもよい。

水溶性物質としては、種々の緩衝液（例、リン酸緩衝液
、クエン酸緩衝液）、各種塩類（例、塩化ナトリウム、
リン酸−ナトリウム、リン酸二ナトリウム）、糖類（例
、グルコース）、アミノ酸類（例、！−アルギニン）な
どを単独または混合して用いることができる。

この封入液中には、必要に応じて、保恒剤（例、パラベ
ン）等を加えておいてもよい。

本発明に用いられる封入部材を有するリボソームは公知
の方法によって調製される。

すなわちポルチクスイング法〔八、Ｄ、Ｂａｎｇｈａｍ
　　Ｊ。

門ｏｆ、　Ｂｉｏｌ、、上３，２３８　（１９６５）、
　　ソニケーション法（Ｃ，ｌｌｕａｎｇ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、、　　８．　３４４（１９６９）Ｌプレベシク
ル法（Ｉｌ、　Ｔｒａｕｂｌｅ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　　Ｒｅｓ、　Ｐｒｏｇ、　　Ｂｕ
ｌｌ、、　　９．　２７３　　（１９７１））、エタノ
ール注入法（Ｓ、　Ｂａｔｚｒｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ、、　ｌＪ」Ｌｌｏ　１
５　　（１９７３）　　）、フレンチプレス押出法（Ｙ
、　Ｂａｒｅｎｈｏｌｌｚ、、　ＦＥＢＳしｅｔｔ、、
９９，２１０　（１９７９））、　コール酸除去法げ、
　Ｋａｇａｗａ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、＋　Ｌ
１旦、５４７７　（１９７１））、トリトンＸ−１００
バツチ法［Ｗ、　Ｊ、　Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ、　Ｅｕｒ
、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　８５２２５　（１９７
８））、Ｃａ”°融合法（Ｄ。

ＰａＰａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、ｉｉ土、４８３　（
１９７５））、エーテル注入法ＣＤ。

Ｄｅａｍｅｒ＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ａｃｔａ、」１ユ、　　６２９　（１９７６））、　
アニーリング法（Ｒ，ＬａｗａｃｚｅｃｋＢｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、土工ｌ、　　３１
３　（１９７６）Ｌ凍結融解融合法（Ｍ、　Ｋａｓａｈ
ａｒａ、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、ＩｉＩ、７３８４　（１９７７
））。

Ｗ１０／Ｗエマルジョン法（Ｓ、　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ
、　Ｊ。

Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ、＋　ｆ
ＬＬ、　　１４９　　（１９７７）〕、逆相蒸発法（Ｆ
、　５ｚｏｋａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ユ、　　４１９４　
　（１９７Ｂ）　）。

高圧乳化法（Ｅ、　Ｍａｙｈｅｗ＋　Ｂｉｏｃｈｃ＋＋
、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａｌ、１６９　（１９８４
））の他、特開昭６０７９３２、同６（１−７９３３、
同６０−７９３４、同６０−１２１２７、同６２−１５
２５３１に記載の方法等、多くの方法が知られているが
、本発明では上記のいずれかの調製法を用いてもよくま
たこれらに限定されるものではない。

上記の方法で調製されたリボソーム液はそのまま未封入
の部材を含んだ状態で１．？、ジグリセリンをＪ添加して保存してもよい。

他方、リボソーム内部に封入されなかった部材を除去し
た後に、ジグリセリンを添加して保存してもよい。更に
ジグリセリンを添加した後に、リボソーム内部に封入さ
れなかった部材を除去し、除去後に更にジグリセリンを
加えて保存してもよい。未封入部材の除去の方法として
は、透析法、ろ過性（例、ゲル濾過）、遠心分離法等が
挙げられる。

ジグリセリンの添加量は、リボソーム分散液１００容量
部あたり１〜２０容量部である。より好ましくは２〜１
０容量部である。これらの世より少ないと凝集防止効果
が少なく、また多いと実用上種々問題をひきおこす（例
、増粘）。

本発明で用いることのできるジグリセリンとしては、少
量のトリグリセリン以上のポリグリセリンを含んでいて
もよい。

次に実施例をあげて本発明の作用効果をさらに具体的に
説明する。

実施例１下記の組成を有するリボソームを逆相蒸発法（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ、　　
７５（９）４　Ｌ　９４（１９７８）、特開昭５５−１
１８４１５号）により作製した。封入部材としてはカル
ボキシフルオレセインを用いた。各４５μｍｏｌの卵黄
ホスファチジルコリン、コレステロールをクロロホルム
２０ＣＩＩｌに溶解した溶液を、容Ｎ　５０　ｃｄ用の
ナス型フラスコに入れた。ロータリーエバポレーターを
用いて溶媒を留去し、フラスコ内壁に薄膜を形成させた
。

ついでジエチルエーテル２０ａｊを加えて脂質を溶解し
、更にＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ＝７．５）３ｅｄを加え
た。

そして、ナスフラスコ内の気相をＮ２ガスで置換した後
にナスフラスコを２０℃に保ちながら、均一なけんだく
液ができるまで、約５分間プローブ型の超音波照射を行
った。

次にロータリーエバポレーターで２０’〜２５℃の減圧
下、ジエチルエーテルの大部分を留去した。このように
してできたゲル状脂質を２０秒間ポルテックスで混合し
た後、２０〜２５℃の減圧下、溶媒を完全に除去した。

これに、ＩＩＥＰＥｓ緩衝液に１２ｒＲ１を入れ（ｐＨ
−７，５）２０°Ｃで２０分間超音波照射を行った。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂでゲル濾過後、各フラクシ
ョンについて（株式会社、日科機製；コールターＮ−４
サブミクロン粒子アナライザー使用）平均粒径とリン脂
質濃度（和光型；リン脂質測定用キット使用）を測定し
た。そして平均粒径０，１〜０゜２μのフラクションを
用いリン脂ｆｆｉ度を２．５Ｘ１０−’Ｍに調整した。

その調整液５ｃｃに表１に示すような種々の多価アルコ
ールを０．５ｃｃ（固体の場合は０．５ｇ）を加えて溶
解させた。そして溶解直後の外観観察と粒径測定を行な
った。また多価アルコールを添加したリボーム液を５℃
で４ケ月冷蔵保管後の外観観察とを行なった。結果を表
１に示す。

表１の結果から、本発明の方法を用いることにより、無
添加や、他の多価アルコール添加の場合に比べて、リボ
ソームの凝集が少なく、粒径も殆ど変化しないことがわ
かる。

ホスファチジルコリン／コレステロール／ジセチルホス
フヱートからなるリボソームでも同様の効果が見られた
。

（発明の効果）本発明の方法は脂質を水性液中に分散させた時に形成さ
れるリボソームを液状で保存する際に凝集を抑制するの
に有効である。

以下に本発明の好ましい実施態様を列挙する。

（１）　　前記リボソームがリン脂質及び／または糖脂
質とコレステロールからなるリボソームであることを特
徴とする請求項記載のリボソームの保存方法。

（２）　　前記リボソーム分散液中に添加するジグリセ
リンの量がリボソーム分散液１００容量部あたり１〜２
０容量部であることを特徴とする請求項記載のリボソー
ムの保存方法。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）封入部材を有するリボソームを調製後、そのリボ
ソーム分散液にジグリセリンを添加することを特徴とす
るリボソームの保存方法。
（２）前記リボソームがリン脂質及び／又は糖脂質とコ
レステロールからなるリボソームであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載のリボソームの保存方法。
（３）前記リボソーム分散液中に添加するジグリセリン
の量がリボソーム分散液１００容量部あたり１〜２０容
量部であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
のリボソームの保存方法。