BR112012029628B1

BR112012029628B1 - Preparação lipossômica contendo placlitaxel com gradiente de osmolaridade distinto entre as fases aquosas dentro e fora dos lipossomas, seus processos de fabricação, e suspensão lipossômica

Info

Publication number: BR112012029628B1
Application number: BR112012029628-0A
Authority: BR
Inventors: Heinrich Haas; Ursula Fattler
Original assignee: Syncore Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2022-08-30
Also published as: MY162921A; CN103002876B; KR20180091102A; EP2394640A1; ES2640563T3; EP2571492A2; RU2641605C2; US20130259922A1; PL2571492T3; BR112012029628B8; KR101984454B1; MX2012013528A; IL222406A0; AU2011254553B2; CN103002876A; CA2796806A1; WO2011144745A3; ZA201206557B; RU2012155697A; KR20130085368A

Abstract

PREPARAÇÃO LIPOSSÔMICA, SEUS PROCESSOS DE FABRICAÇÃO, E SUSPENSÃO LIPOSSÔMICA. A presente invenção refere-se à preparação de lipossomas com capacidade de carga realçada para agentes farmaceuticamente e/ou diagnosticamente ativos e/ou agentes comésticos que são substancialmente solubilizados pelas membranas lipossômicas, às dispersões de lipossoma com estabilidade realçada com respeito à liberação do agente ativo e/ou agente cosmético dos lipossomas obtenível pelo processo, e às composições farmacêuticas ou comésticas compreendendo as referidas dispersões de lipossoma estabilizadas. A preparação pode envolver as etapas de desidratação e reidratação de dispersões de lipossoma que podem ser realizadas por secagem por spray.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere à preparação de lipossomas com capacidade de carga realçada para agentes farmaceuticamente e/ou diagnosticamente ativos e/ou agentes comésticos que são substancialmente solubilizados pelas membranas lipossômicas, às dispersões de lipossoma com estabilidade realçada com respeito à liberação do agente ativo e/ou agente coméstico dos lipossomas obtenível pelo processo, e às composições farmacêuticas ou comésticas compreendendo as referidas dispersões de lipossoma estabilizadas. A preparação pode envolver as etapas de desidratação e reidratação de dispersões de lipossoma que podem ser realizadas por secagem por spray.

ANTECEDENTES

[0002] Lipossomas são estruturas vesiculares artificiais compostas de membrnas simples ou múltiplas que fecham um compartimento aquoso. Mais tipicamente, as membranas de lipossoma são formadas a partir de bicamadas de lipídios, porém elas podem consistir também em outros compostos anfifílicos monoméricos e poliméricos, incluindo outros tipos de anfifilos, polímeros e polipeptídeos (Antonietti e Forster 2003). Os lipossomas se formam espontaneamente quando os lipídios são dispersos em um ambiente aquoso sob condições adequadas. A maioria dos lipossomas é não tóxica, não antigênica e biodegradável em caráter, visto que eles têm características moleculares de membranas mamíferas. Fármacos e compostos lipofílicos ou anfifílicos podem ser incorporados na membrana de lipossoma, fármacos e compostos hidrofílicos podem ser encapsulados nos núcleos aquosos dos lipossomas.

[0003] Nos últimos anos os lipossomas tornaram-se uma ferramenta na indústria farmacêutica para a liberação de fármacos (Gregoriadis 1995). Os lipossomas são capazes de influenciar os farmacocinéticos pela liberação prolongada do fármaco para o corpo ou reduzir os efeitos colaterais limitando-se a concentração livre de um fármaco. Por ligação dos ligantes ao lipossoma ou redistribuindo sua carga, lipossomas facilitam uma liberação alvejada de fármacos para um sítio desejado de ação. Além do uso farmacêutico, os lipossomas são também frequentemente usados para produtos cosméticos.

[0004] Se lipossomas são usados para a administração de agentes ativos dentro do uso farmacêutico ou cosméticos, é importante controlar e optimizar a eficácia de carga do composto ativo para a formulação lipossômica e a estabilidade da formulação lipossômica carregada com o composto ativo ou cosmético. A estabilidade da formulação é uma característica crucial durante a fabricação, armazenagem e aplicação da formulação. Na maioria dos casos, a estabilidade química ou física deprodutos de lipossoma é limitada, que deve ser levada em consideração para planejamento de processos de fabricação (tempo de retenção), armazenagem (estabilidade de vida de prateleira) e aplicação do produto (estabilidade em uso).

[0005] Para aplicação farmacêutica as formulações de lipossoma são frequentemente administradas por injeção. Desse modo, os lipossomas devem estar presentes em uma fase aquosa sob condições adequadas para administração intravenosa (iv) ou intraperitoneal (ip).

[0006] As formulações de lipossoma farmacêuticas são submetidas à critério de qualidade extremamente rigorosos. Produtos de lipossoma líquidos mais atuais não são adequados durante um período de armazenagem maior, porque eles podem passar por uma variedade de processos de degradação química e física. Entretanto, para produtos farmacêuticos é desejável ter formulações finais que são estáveis durante pelo menos seis meses a dois anos em temperatura ambiente ou em temperatura de refrigeração. Estes fatores restrigem o uso de lipossomas como veículos práticos de compostos biologicamente ativos. Para lipossomas, técnicas para desidratação foram desenvolvidas para attender estes requerimentos.

[0007] Estabilidade de longa duração das formulações de lipossoma é grandemente realçada quando elas são desidratadas e armazenadas como formulações secas em vez de líquidas. Antes da injeção, os produtos de lipossoma secos devem ser reidratados em um meio aquoso adequado gerando suspensões aquosas para administração. Porque a estabilidade das formulações de lipossoma reidratadas pode novamente ser limitada por processos de degradação química e física, o aumento da estabilidade em uso da referida suspensão lipossômica pronta para uso é outro objetivo importante da tecnologia da formulação farmacêutica.

[0008] Um método de estabilização comumente usado para suspensões de lipossoma aquosas por secagem por congelamento é descrito nas US 4,229,360 e US 4,247,411. No processo de secagem por congelamento, uma suspensão lipossômica é congelada e subsequentemente submetida à pressão reduzida, que induz à remoção da água congelada por sublimação. Geralmente, a suspensão aquosa compreende um excipiente, tal como um açúcar, para prevenir ou minimizar a formação de defeito induzida por congelamento e desidratação. O procedimento de secagem por congelamento resulta em lipossomas em uma matriz protetora de excipiente da qual, após a reidratação, o produto líquido antecedente deve ser obtido. Como descrito na US 4,880,635 os lipossomas podem ser protegidos de efeitos prejudiciais das etapas de desidratação e reidratação pela presença de um açúcar protetor, não apenas fora, porém também dentro do lipossoma.

[0009] O método de secagem por spray, como, por exemplo, descrito na US 5,089,181, fornece um processo alternativo para preparação de uma formulação lipossômica desidratada estável. O processo foi adaptado a partir da indústria alimentícia e emprega a atomização de suspensões em pequenas gotículas vaporizando-se a referida sspensão, e a subsequente evaporação do meio das gotículas em elevadas temperaturas. Como no processo de secagem por congelamento, a suspensão lipossômica pode compreender um excipiente, tal como um açúcar, para proteger as membranas lipossômicas. Em comparação à secagem por congelamento, o processo de secagem por spray tem vantagens consideráveis com respeito à aplicação industrial em grande escala, porque ele permite capacidades de fabricação maiores em baixo custo e com eforços tecnológicos manuseáveis. Entretanto, as temperaturas elevadas envolvidas neste método aplicam tensão ao agente ativo encapsulado bem comoàs membranas de lipídio.

[00010] Para estabilizar suspensões que compreendem o fármaco encapsulado solúvel em água em lipossomas para secagem por spray, a US 4,895,719 descreve o equilíbrio de uma osmolaridade interna elevada por uma concentração interna elevada do fármaco solúvel com uma osmolaridade uniformemente elevada do meio circundante.

[00011] Para estabilizar os fármacos hidrofóbicos na fase aquosa de lipossomas, o WO 2007/005754 descreve a complexação de tais fármacos por ciclodextrinas antes da encapsulação. O fármaco hidrofóbico complexado é retido no lipossoma em concentrações elevadas, mesmo na presença de um gradiente osmótico de transmembrana causado pela ciclodextrina. Entretanto, uma estabilização para agentes ativos embutidos na membrana lipossômica não é descrita.

[00012] A presença de solutos que são osmoticamente ativos, tais como açúcares ou íons, dentro ou fora das membranas lipossômicas gera forças osmóticas. O modo como os gradientes osmóticos de transmembrana agem sobre a estrutura e dinâmicas de membranas biológicas foi investigado na literatura, e modelos para descrever os fenômenos tipo relação de tensão-linhagem e lise foram propostos (Ertel, Marangoni e outro, 1993; Hallett, Marsh e outro, 1993). Resumidamente, os experimentos pelos autores e a análise acompanhante delineam que a dilatação de lipossomas em uma determinada tensão osmótica depende de seu tamanho. A dilatação até um tamanho depende do ponto de produtividade crítica foi descrita, no qual a lise (vazamento) ocorreu. Condições sob as quais, os lipossomas são supostos residirem em um estado consistentemente constrangido foram determinadas.

[00013] Com respeito à produção de lipossomas compreendendo um fármaco lipofílico que têm uma vida de prateleira realçada, o WO 2004/002468 descreve a preparação de lipossomas que compreendem paclitaxel. Os lipossomas são formados em um tampão aquoso compreendendo trealose, resultando em uma suspensão lipossômica tendo a mesma osmolaridade dentro e fora do lipossoma. A suspensão lipossômica aquosa é subsequentemente desidratada. Um processo de desidratação pode ser realizado por secagem por congelamento ou secagem por spray. O pedido descreve diversos protocolos para a secagem por congelamento das referidas suspensões lipossômicas. Após desidratação, a preparação lipossômica pode ser reidratada pela adição de água ou uma solução aquosa. O documento não fornece dados comparativos sobre a estabilidade em uso de preparações lipossômicas que foram desidratadas por secagem por congelamento ou por secagem por spray antes da sua reidratação.

[00014] Em vista do estado descrito da técnica, o problema subjacente da presente invenção foi a preparação de lipossomas, compreendendo pelo menos uma agente ativo e/ou agente coméstico lipofílico com um agente elevado para relação de lipídio e com estabilidade melhorada, especialmente com respeito da estabilidade física e liberação do agente do lipossoma. Especialmente a invenção se refere ao problema de fornecimento de um processo para fabricação das referidas preparações lipossômicas que têm um tempo de retenção prolongado durante a fabricação e estabilidade em uso, em que o processo envolve uma rápida etapa de desidratação.

[00015] Desse modo, a solução do problema acima é obtida de acordo com a presente invenção fornecendo-se modalidades caracterizadas nas reivindicações e também descritas na descrição da invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00016] A solução do problema acima é fornecida por preparações de lipossoma onde esforço de tensão sobre as membranas de lipossoma é aplicado por forças osmóticas e um processo para preparação dos referidos lipossomas.

[00017] Especialmente, a solução é fornecida por um processo para a preparação de uma suspensão lipossômica em uma fase aquosa com pelo menos um agente ativo e/ou agente coméstico presente na membrana lipossômica, em que a referida suspensão compreende pelo menos uma substância osmoticamente ativa na fase aquosa, e em que a osmolaridade da fase aquosa dentro do volume lipossomicamente encapsulado, Odentro, é maior do que a fase aquosa fora do volume lipossomicamente encapsulado, Ofora.

[00018] Os lipossomas são caracterizados pela presença de esforço de tensão sobre as membranas de lipossoma (lipossomas estressados). Eles podem ser obtidos diretamente durante a formação de lipossoma ou em uma etapa de processamento após formação de lipossoma.

[00019] Lipossomas estressados podem ser obtidos diretamente afetando-se a osmolaridade da fase aquosa dentro e/ou fora dos lipossomas ou mudando-se as características da membrana, tal como empacotamento molecular, da membrana de lipossoma onde os lipossomas são presente em um meio de uma determinada osmolaridade.

[00020] Lipossomas estressados podem ser preparados diretamente com the agente ativo e/ou agente coméstico presente na membrana de lipossoma. Alternativamente, lipossomas estressados podem ser preparados sem o agente, que é subsequentemente adicionado aos lipossomas.

[00021] Um aspecto da invenção se refere a um processo para a fabricação de uma preparação lipossômica compreendendo: a) fornecer uma primeira preparação lipossômica compreendendo uma suspensão de lipossomas em uma fase aquosa, em que os lipossomas compreendem pelo menos uma membrana, em que a membrana engloba um volume lipossomicamente encapsulado da fase aquosa e a fase aquosa compreende pelo menos uma substância osmoticamente ativa e tem uma osmolaridade total inicial, O1, b) depois disso, gerar um gradiente osmolar na fase aquosa da referida preparação em que a osmolaridade da fase aquosa fora do volume lipossomicamente encapsulado, Ofora, é menor do que a osmolaridade da fase aquosa dentro do volume lipossomicamente encapsulado, Odentro, para produzir uma segunda (estressada) preparação lipossômica, c) opcionalmente desidratar a segunda (estressada) preparação lipossômica para obter uma preparação desidratada, e d) opcionalmente reidratar a preparação desidratada.

[00022] A preparação lipossômica de etapa a) preferivelmente compreende pelo menos um agente ativo ou agente cosmético na membrana lipossômica. Alternativamente, o agente pode ser adicionado em um estágio posterior do processo de fabricação.

[00023] A etapa b) pode ser realizada reduzindo-se a osmolaridade total inicial, O1, da suspensão lipossômica derivada de etapa a) para produzir uma preparação lipossômica estressada com uma osmolaridade total, O2, que é menor do que a osmolaridade O1.

[00024] A etapa b) pode ser realizada diluindo-se a suspensão lipossômica derivada de etapa a) com um meio aquoso tendo uma osmolaridade que é menor do que O1, ou por diálise da suspensão em um meio aquoso com uma osmolaridade que é menor do que O1. Do modo mais simples, a suspensão lipossômica é diluída com água.

[00025] De acordo com o conceito geral da invenção um gradiente osmolar pode ser gerado ou alterado em diferentes estágios durante a fabricação da preparação de lipossoma. Além disso, o gradiente osmolar pode ser alterado uma vez ou diversas vezes em diversos estágios do processo de produção. Isto pode possivelmente ser obtido por procedimentos iguais ou diferentes como descrito nos seguintes. O processo de produção da preparação lipossômica se refere a todas as etapas realizadas antes da aplicação final da suspensão lipossômica.

[00026] A etapa b) do processo inventivo pode compreender as etapas de: b1) desidratar a preparação lipossômica na etapa a) para obter uma preparação lipossômica desidratada, e b2) reidratar a referida preparação lipossômica desidratada sob condições para produzir uma preparação lipossômica estressada, preferivelmente em um meio aquoso.

[00027] Preferivelmente a desidratação é realizada por secagem por spray da suspensão lipossômica.

[00028] A invenção também se refere a composições obtidas ou obteníveis pelos processos acima.

[00029] A invenção também se refere a uma preparação lipossômica compreendendo pelo menos um agente ativo ou um agente cosmético na membrana lipossômica, em que a membrana lipossômica está sob esforço de tensão.

[00030] Mais particularmente, a invenção se refere a uma preparação lipossômica compreendendo pelo menos um agente ativo ou agente cosmético na membrana lipossômica em que os lipossomas estão presentes em uma fase líquida com uma osmolaridade dentro do volume lipossomicamente encapsulado (Odentro) que é maior do que a osmolaridade da fase líquida fora do volume lipossomicamente encapsulado (Ofora).

[00031] Surpreendentemente, os inventores constataram que as suspensões lipossômicas contendo lipossomas, cuja membrana lipossômica está sob esforço de tensão, têm uma solubilidade melhorada para compostos lipofílicos.

[00032] Desse modo, a invenção também se refere a um processo para fabricação de uma preparação lipossômica compreendendo pelo menos um fármaco lipofílico ou composto cosmético, compreendendo as etapas de: i) fornecer uma preparação lipossômica estressada, compreendendo uma suspensão de lipossomas em uma fase aquosa, ii) incubar a referida preparação lipossômica estressada com pelo menos um agente ativo lipofílico ou agente cosmético, opcionalmente em uma forma não solubilizada, e iii) opcionalmente separar o agente não solubilizado da preparação de lipossoma, preferivelmente por filtragem ou centrifugação, iv) opcionalmente desidratar a preparação lipossômica incubada, e v) opcionalmente reidratar a preparação lipossômica desidratada.

[00033] Os lipossomas estressados podem ser obtidos por qualquer dos métodos acima mencionados. Mais preferivelmente, pelo menos uma substância osmoticamente ativa está presente na fase aquosa da suspensão lipossômica, em que Odentro é maior do que Ofora.

[00034] O agente ativo ou agente cosmético acima mencionado preferivelmente tem uma baixa solubilidade em água.

[00035] O agente ativo ou agente cosmético acima mencionado é lipofílico e preferivelmente tem um log P maior do que 1. Mais preferivelmente, o composto é um taxano, mais preferivelmente, paclitaxel ou um derivado do mesmo.

[00036] Constatou-se surpreendentemente que a eficácia da carga de compostos fracamente solúveis em água, lipofílicos, tal como paclitaxel, em membranas lipossômicas pode ser melhorada, e a liberação de tais compostos das membranas lipossômicas pode ser reduzida, se a membrana lipossômica for estressada, particularmente, se uma solúvel em água for quantidade molar de lipídio) em comparação com lipossomas sem tal gradiente. Isto pode ser realizado, por exemplo, por exposição do composto lipofílico a lipossomas vazios.

[00037] O composto ativo foi também osmoticamente compreendido na fase aquosa lipossomicamente encapsulada em uma concentração maior do que fora da fase lipossomicamente encapsulada. A eficácia de carga elevada do composto lipofílico para estes lipossomas em comparação com lipossomas sem um gradiente de concentração para permitir fabricar formulações com relação molar maior de composto/Lipídio, e para melhorar a capacidade das formulações fornecidas por causa da tendência à liberação do composto do lipossoma é reduzida.

[00038] Os lipossomas compreendendo um agente lipofílico no compartimento de membrana são menos propensos à liberação do composto para o meio aquoso se o referido gradiente osmolar estiver presente. A fração de equilíbrio da referida substância lipofílica no meio aquoso é reduzida. Consequentemente, o risco da concentração do composto lipofílico na fase aquosa exceder o limite de solubilidade e precipitar-se é também reduzido.

[00039] Além disso, constatou-se surpreendentemente que os lipossomas vazios compreendendo o gradiente acima descrito têm uma capacidade de carga superior para compostos lipofílicos, isto é, uma quantidade molar superior de composto lipofílico é solubilizada pela mesma quantidade de lipossomas (como definido, surpreendentemente constatou-se que as preparações lipossômicas obtidas por reidratação de lipossomas previamente desidratados têm uma distribuição de tamanho homogênea, como indicado por um índice de polidispersidade baixo (PI). com relação ao controle de qualidade, é sempre desejável obter um produto homogêneo, especialmente para usos farmacêuticos. Além disso, as suspensões de lipossoma da presente invenção apresentam um índice de polidispersidade que permanece substancialmente não carregado durante um período prolongado de tempo. Isto indica que os lipossomas nas suspensões inventivas não formam agregados. Especialmente para suspensões lipossômicas intravenosamente administradas, os agregados devem ser evitados, porque estes agregados podem obstruir os vasos sanguíneos e, desse modo, levar a embolias.

[00040] A presente invenção substancialmente melhora o estado da técnica fornecendo um processo para estabilizar os agentes lipofílicos nas membranas lipossômicas de uma preparação lipossômica, bem como manter o tamanho e a polidispersidade de uma preparação lipossômica reidratada. Como sequência, a estabilidade em uso de uma preparação final compreendendo lipossomas com um composto lipofílico pode ser prolongada. Além disso, a estabilidade de referidos lipossomas durante o processamento de tais formulações pode ser prolongada.

[00041] Em muitos casos, o período de tempo para processar as formulações líquidas durante a fabricação (tempo de manutenção) de formulações de lipossoma é limitado devido ao risco de liberação indesejada do agente dos lipossomas. A invenção reduz o risco de liberação de fármaco, e consequentemente, permite o processamento contínuo de lipossomas durante a fabricação durante escalas de tempo prolongadas e permite um planejamento mais flexível do processo de produção.

[00042] Mais especificamente, a invenção permite a preparação das formulações acima mencionadas por secagem por spray em vez de secagem por congelamento. Na secagem por congelamento os lipossomas são congelados e, desse modo, estabilizados diretamente após a fabricação, desse modo, o risco de liberação durante fabricação é baixo. Na secagem por spray as formulações líquidas encontram tempos de manutenção prolongados na fase líquida, porque a vaporização de uma determinada batelada pode levar várias horas ou dias. Porque a invenção permite aumentar a estabilidade de uma determinada formulação, as sessões de vaporização mais longas sem interrupção podem ser realizadas. Visto que a secagem por spray tem uma produtividade total superior em comparação com a secagem por congelamento, a produção em grande escala é facilitada e os custos de produção podem ser reduzidos, ao mesmo tempo em que a qualidade de produção é mantida.

[00043] Além disso, o risco de liberação de fármaco e cristalização no período entre a reconstituição da composição lipossômica desidratada e a administração a um paciente (estabilidade em uso) é reduzido. A cristalização pode promover a formação de partículas subvisíveis que não devem estar presentes fora de certos limites em produtos para administração iv. Em muitos casos, apenas uma estabilidade em uso de poucas horas é fornecida, o que é um obstáculo na prática médica. Consequentemente, a estabilidade suficiente em uso é de grande importância para aplicação prática de tais produtos farmacêuticos ou cosméticos.

[00044] A preparação de lipossomas frequentemente emprega solventes orgânicos, tal como etanol, que é geralmente encontrado em produtos lipossômicos desidratados, e, consequentemente, nas suspensões lipossômicas desidratadas derivadas deles. Isto é especialmente o caso de preparações lipossômicas que foram desidratadas por secagem por congelamento (liofilização). Entretanto, é desejável para produtos lipossômicas usados para aplicação a humanos compreender tão pouco solvente orgânico quanto possível. A presente invenção permite desidratação por secagem por spray, que facilita a remoção da maioria ou todo o solvente orgânico residual, ao mesmo tempo em que obtendo os lipossomas com uma alta solubilidade.

[00045] Ao mesmo tempo em que fornecendo as vantagens acima mencionadas, a invenção pode ser praticada facilmente e não é cara. Não requer dispositivos técnicos complicados, nem a adição de outros ingredientes às composições acima mencionadas. As substâncias osmoticamente ativas, que são usadas para praticar a invenção, são já conhecidas de composições lipossômicas que são desidratadas como descrito na US 4,880,635 ou no WO 2004/002468.

DEFINIÇÕES

[00046] "Cerca de" em relação aos valores de quantidade se refere a um desvio médio de máximo +/- 20 %, preferivelmente +/- 10 % com base no valor indicado. Por exemplo, uma quantidade de cerca de 30 % em mol de lipídio catiônico se refere a 30 % em mol +/- 6 % em mol e preferivelmente 30 % em mol +/- 3 % em mol de lipídio catiônico com relação à molaridade de lipídio/anfifilo.

[00047] "Composto ativo" ou "agente ativo" se refere a um composto ou mistura de compostos, tendo uma atividade biológica ou física particular com base no que é útil como um agente para a diagnose, prevenção, ou tratamento de uma doença ou condição humana ou animal. Os agentes terapêuticos tais como substâncias de fármaco e agentes diagnósticos são exemplos importantes de agentes ativos de acordo com a presente invenção.

[00048] "Densidade anidrosa" de lipossomas dentro da atual invenção significa a massa de todos os compostos que constituem os referidos lipossomas, incluindo os compostos encapsulados pelos lipossomas, porém excluindo a massa de água compreendida em tais lipossomas, dividida pelo volume do lipossoma em uma fase aquosa, com base no tamanho de partícula zmédio. Em um exemplo muito específico, a densidade anidrosa de lipossomas pode se referir à massa de DOTAP, DOPC, paclitaxel, ácido cítrico e trealose compreendida em um lipossoma, dividida pelo volume do lipossoma em uma fase aquosa. Os lipossomas de densidade anidrosa podem ser determinados por métodos de ultracentrifugação como descrito nos exemplos.

[00049] "Meio aquoso", "líquido aquoso" ou "fase aquosa" como usado aqui se refere a um material líquido que compreende água. Em algumas modalidades, o material líquido compreende pelo menos 50% (peso/peso), pelo menos 70% (peso/peso) ou pelo menos 90% (peso/peso) de água. Em outras modalidades, o material líquido é livre de solventes orgânicos. A fase aquosa pode conter um ou vários compostos. Desse modo, uma dispersão aquosa, suspensão aquosa e uma emulsão em que a fase contínua é aquosa são também exemplos de líquidos aquosos. Um líquido aquoso que contém um material coloidal é a seguir algumas vezes referido como uma dispersão ou solução coloidal aquosa.

[00050] "Catiônico" se refere a um agente que tem uma carga positiva líquida ou potencial zeta positivo sob as respectivas condições ambientais. Na presente invenção, é referido como condições ambientais onde o pH é na carga entre 3 e 9, preferivelmente entre 5 e 8.

[00051] "Estabilidade química" do composto lipofílico se refere a uma carga significante de sua estrutura química original, e é definida como cerca de 5 % de carga de atividade do valor de ensaio inicial (composto original), preferivelmente cerca de 2 % ou aparência de produtos de degradação específicos que excede seus critérios de aceitação em relação aos limites toxicológicos e aspectos de segurança. Para compostos lipofílicos, tal como paclitaxel, a estabilidade química pode ser definida por HPLC/LC MS/MS e tipicamente significa menos do que 5 % de produtos de degradação de referido composto. Os produtos de degradação típicos de paclitaxel são, por exemplo, Baccatinlll, 7-Epi-Taxol etc. (Monography of Paclitaxel, USP26, [Jan.-Mar.2003], USPC,Inc.).

[00052] "Composto cosmético" se refere a um composto que tem um efeito sobre a pele ou cabelo humano.

[00053] "Agente diagnosticamente ativo" ou "diagnóstico" se refere a um agente farmaceuticamente aceitável que pode ser usado para visualizar uma propriedade ou estado biológico em um paciente ou amostra por vários métodos. A visualização pode ser usada para fazer um diagnóstico.

[00054] "Desidratação" ou "desidratar" se refere ao processo de remoção de água de uma composição. Em algumas modalidades, a água é retirada da composição a um teor residual menor do que cerca de 10 % (peso/peso), preferivelmente menor do que cerca de 5 % (peso/peso), com base no teor de água presente antes do procedimento de desidratação.

[00055] "Volume encapsulado" ou "fase encapsulada" se refere a um volume que é fechado por pelo menos uma membrana de lipossoma. O volume pode ser fechado por uma membrana em lipossomas unilamelares ou várias membranas em lipossomas multilamelares. Desse modo, a fase encapsulada representa o espaço dentro de um lipossoma, enquanto o volume fora do volume lipossomicamente encapsulado ou "fase livre (aquosa)" representa o espaço circundante a um lipossoma. Em caso de lipossomas multilamelares, os termos encapsulado e fase livre se referem ao volume interior e exterior próximo a uma determinada membrana do lipossoma multilamelar.

[00056] "Tempo de manutenção" se refere ao período de tempo para processar as formulações líquidas durante a fabricação de formulações de lipossoma.

[00057] "Homogeneidade de tamanho" como usado aqui se refere à distribuição de tamanho de uma população de partícula. Homogeneidade de tamanho alta ou distribuição de tamanho reduzida é caracterizada por um índice de polidispersidade baixo.

[00058] "Lipídio" é referido em seu sentido convencional como um termo genérico que abrange gorduras, lipídios, constituintes solúveis em álcool-éter de protoplasma, que são insolúveis em água. Os lipídios geralmente consistem em uma porção hidrofílica ou hidrofóbica. Em água os lipídios podem se auto-organizar para formarem membranas de bicamadas, onde as porções hidrofílicas (grupos cabeças) são orientadas para a fase aquosa, e as porções lipofílicas (cadeias de acila) são incrustadas no núcleo das bicamadas. Os lipídios podem compreender igualmente duas porções hidrofílicas (anfifilos em bola). Neste caso, as membranas podem ser formadas de uma única camada de lipídio, e não uma bicamada. Os exemplos típicos de lipídios no atual contexto são gorduras, óleos graxos, óleos essenciais, ceras, esteroide, estereois, fosfolipídios, glicolipídios, sulfolipídios, aminolipídios, cromolipídios, e ácidos graxos. O termo abrange ambos os lipídios sintéticos e de ocorrência natural. Os lipídios preferidos em relação à presente invenção são: esteróis e esterol, particularmente colesterol, fosfolipídios, incluindo fosfatidila, fosfatidilcolinas e fosfatidiletanolaminas, e esfingomielinas. Onde existem ácidos graxos, eles podem ser cerca de 12 a 24 cadeias de carbono em comprimento, contendo até 6 ligações duplas. Os ácidos graxos são ligados ao esqueleto, que pode ser derivado de glicerol. Os ácidos graxos dentro de um lipídio podem ser diferentes (assimétricos), ou pode ser apenas 1 cadeia de ácido graxo presente, por exemplo, lisolecitinas. As formulações misturadas são também possíveis, particularmente quando os lipídios não catiônicos são derivados de fontes naturais, tais como lecitinas (fosfatidilcolinas) purificadas de gema de ovo, coração bovino, cérebro, fígado ou soja.

[00059] Os "lipossomas" estruturas vesiculares auto fechadas, artificiais de vários tamanhos e estruturas, onde uma ou várias membranas encapsulam um núcleo aquoso. Mais tipicamente as membranas lipossômicas são formadas de membranas de bicamadas de lipídio, onde os grupos cabeças hidrofílicos são orientados para o ambiente aquoso e as cadeias de lipídio são incrustadas no núcleo lipofílico. Os lipossomas podem ser formados também de outras moléculas monoméricas e poliméricas anfifílicas, tais como polímeros, tipo copolímeros de bloqueio, ou polipeptídeos. As vesículas unilamelares são lipossomas definidos por membrana única fechando um espaço aquoso. Em contraste, as vesículas oligo- ou multilamelares são construídas de várias membranas. Tipicamente, as membranas têm aproximadamente 4 nm de espessura e são compostas de lipídios anfifílicos, tais como fosfolipídios, de origem natural ou sintética. Opcionalmente, as propriedades da membrana podem ser modificadas pela incorporação de outros lipídios tais como esteróis ou derivados de ácido cólico. Os lipossomas com membranas particularmente flexíveis com base em fosfolipídios com uma baixa temperatura de transição de fase (isto é, abaixo da temperatura corporal) são às vezes referidos como transfersomas.

[00060] "Suspensão lipossômica" se refere a uma composição compreendendo lipossomas em um meio aquoso.

[00061] "Preparação lipossômica" ou "composição lipossômica" se refere a qualquer composição compreendendo lipossomas incluindo uma suspensão lipossômica ou uma composição desidratada obtida de referida suspensão por desidratação.

[00062] "Lipofílico" se refere à propriedade de um composto de se dissolver preferencialmente em uma fase tipo gordura (por exemplo, hidrocarboneto), tal como uma fase sendo substancialmente compreendida de lipídios. A propriedade lipofílica de um composto pode ser descrita pelo coeficiente de divisão (log P). Os compostos de interesse no presente contexto têm um log P maior do que cerca de 1, mais preferivelmente, maior do que cerca de 2, mais preferivelmente, maior do que cerca de 3.

[00063] "Log P" se refere ao coeficiente de divisão de um composto entre uma fase de água e uma de octanol a 25°C. Geralmente, um número de log P maior significa que um agente é mais solúvel em octanol. O log P é definido como ([concentração do agente em octanol]/[concentração do agente em água]). É bem conhecido pela pessoa versada na técnica que o log P de um certo composto pode ser experimentalmente determinado.

[00064] "Baixa solubilidade em água" se refere a uma solubilidade de um composto que é menor do que 0,1 mg/mL, mais preferivelmente, menor do que 0,01 mg/mL e mais preferivelmente, menor do que 0,001 mg/mL em água um pH fisiológico a 25°C na ausência de aditivos que facilitam a solubilidade.

[00065] A "osmolaridade global" de uma suspensão lipossômica é a quantidade total de substâncias osmoticamente ativas presentes em um certo volume de referida suspensão dividida pelo volume da suspensão. Para o cálculo da osmolaridade global, as substâncias osmoticamente ativas dentro e fora do volume lipossomicamente encapsulado da suspensão são igualmente considerados. No presente contexto as abreviações O1 e O2 se referem à osmolaridade global.

[00066] "Odentro" e "Ofora" se referem à osmolaridade dentro e fora da membrana auto fechada. Para os lipossomas unilamelares, Ofora é a osmolaridade da fase aquosa livre, e Odentro é a osmolaridade do volume encapsulado. Para os lipossomas multilamelares, Odentro e Ofora se referem às osmolaridades dentro e fora de cada membrana auto fechada individual. No presente contexto, as situações onde Odentro é maior do que Ofora são de relevância particular. As referências relativas entre Odentro e Ofora podem ser investigadas por técnicas de centrifugação, por exemplo, por centrifugação ou ultracentrifugação analítica ou preparativa. Porque geralmente um composto osmoticamente ativo muda a densidade da fase aquosa, as diferenças entre Odentro e Ofora podem ser reconhecidas do comportamento de sedimentação dos lipossomas (Goormaghtigh and Scarborough 1986, Huang and Charlton 1971). Além disso, os gradientes osmolares podem afetar os parâmetros estruturais da membrana lipossômica, tal como pode ser determinado pelos métodos tipo dispersão de raio X ou nêutron, ou tamanho de lipossoma, tal como pode ser determinado por dispersão de luz e raio X.

[00067] Uma "substância osmoticamente ativa" no presente contexto se refere a uma substância solúvel em água que não é capaz de substancialmente permear a membrana de lipossoma. Os exemplos típicos são, por exemplo, íons ou açúcares, tipo glicose, ou trealose que podem ser eficazmente capturados em lipossomas, ao mesmo tempo em que as moléculas de água apresentam uma alta permeabilidade e, consequentemente, no atual contexto, água não é considerada uma substância osmoticamente ativa. A seletividade para permeação de compostos diferentes é uma característica chave de lipossomas (Bangham e outro, 1965). A permeabilidade de um composto através de uma membrana depende da composição da membrana, estado da fase e de outras condições limites.

[00068] "Osmolaridade" é a soma das concentrações molares na solução aquosa, incluindo a substância biologicamente ativa e quaisquer moléculas auxiliares, tais como excipientes osmóticos usados para retardar a taxa de liberação do agente ativo. Se o soluto estiver presente em uma forma dissociada, ionizada, ou agregada, osmoticamente será definido como a soma das concentrações molares das formas dissociadas, ionizadas ou agregadas. A contribuição para a osmolaridade de uma solução feita por qualquer soluto na solução é aproximadamente equivalente à concentração do soluto na solução dividida por seu peso molecular.

[00069] Desse modo, como um princípio geral, quanto maior o peso molecular de um soluto, menor a osmolaridade do soluto, e menor a contribuição de tal soluto para a osmolaridade global da solução. As diferenças em osmolaridade podem ser determinadas a partir de permutas de vários parâmetros químicos físicos, tal como densidade, densidade de elétron, índice refrativo, ou viscosidade, que podem ser determinado por métodos estabelecidos em química física.

[00070] "Lipídios Negativamente Permutados" se refere a lipídios que têm uma carga líquida negativa.

[00071] "Composição farmacêutica" se refere a uma combinação de dois ou mais componentes diferentes com propriedades farmacêuticas diferentes dos que são possuídos por cada componente. Na presente invenção, os dois ou mais componentes se referem a um lipídio ou dispersão coloidal e um agente ativo, opcionalmente junto com um veículo, diluente, e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[00072] "Estabilidade física" de um lipossoma se refere à mudança de estado físico do lipossoma. Um lipossoma é estável quando o estado físico é mantido. Um aspecto importante da estabilidade física é a liberação de compostos incrustados na membrana lipossômica para o meio aquoso de suspensão lipossômica. A liberação de composto é um aspecto de estabilidade física. A liberação de composto da membrana pode levar a concentração elevada e agregação do composto no meio aquoso. No caso de taxanos, a agregação é visível pela formação de agulhas do taxano. A cristalização de um taxano pode ser medida por inspeção visual de formação lipossômica líquida, microscopia óptica, medição de bloqueio de luz ou dispersão de luz. Tamanho lipossômico e distribuição de tamanho são também aspectos do estado físico da suspensão lipossômica.

[00073] "Polidispersidade" é a largura da distribuição do tamanho de partícula em uma determinada amostra de partícula, por exemplo, uma suspensão lipossômica. Uma medida quanto à polidispersidade é o índice de polidispersidade (PI), como obtido de uma análise cumulante dos dados de espectroscopia de foto correlação (PCS).

[00074] "Índice de polidispersidade" (PI) é um número adimensional como obtido da assim chamada análise cumulante de resultados de medições de espectroscopia de foto correlação (PCS) (Koppel 1972). A análise cumulante permite ajustamento livre de modelo de dados de PCS dos quais o Zmédio, como uma medida para o tamanho de partícula, e o valor de PI, como uma medida para a polidispersidade, são obtidos. Os cálculos destes parâmetros são definidos no documento padrão ISO 13321:1996 E. Em relação às medições de tamanho de partícula, frequentemente, os termos PCS e Dispersão de Luz Dinâmica (DLS) são usados sinonimicamente. Esta técnica mede as flutuações dependentes do tempo na intensidade de luz dispersa que ocorre porque as partículas são submetidas a movimento browniano. A análise destas flutuações de intensidade permite a determinação dos coeficientes de difusão das partículas que são convertidas em uma distribuição de tamanho. Dentro do significado da presente invenção, PI e Zmédio são determinados como descrito no Exemplo 6.

[00075] "Espectroscopia de foto correlação" é uma técnica que mede as flutuações dependentes de tempo na intensidade de luz dispersa que ocorre porque as partículas são submetidas ao movimento browniano. A análise destas flutuações de intensidade permite a determinação dos coeficientes de difusão das partículas que são convertidas em uma distribuição de tamanho. Em relação às medições de tamanho de partícula, frequentemente PCS e DLS são usados sinonimicamente.

[00076] "Lipídios Positivamente Carregados" é usado como um sinônimo de lipídios catiônicos (para definição veja a definição de "lipídios catiônicos"). Na presente invenção, se refere a ambientes onde o pH é na faixa entre 3 e 9, preferivelmente entre 5 e 8.

[00077] "Estabilidade" pode se referir à estabilidade física de um lipossoma e à estabilidade química dos constituintes únicos (por exemplo, lipídios e composto ativo) compreendidos no lipossoma.

[00078] "Lipossomas estressados" ou "preparações lipossômicas estressadas" se refere aos lipossomas em que a membrana de lipossoma está sob esforço de tensão e às preparações compreendendo tais lipossomas.

[00079] O "Esforço de tensão" sobre a membrana de lipossoma no atual contexto pode ser exercido por aplicação de um gradiente de concentração de um composto osmoticamente ativo entre a fase aquosa dentro e fora de um volume lipossomicamente encapsulado. Se a osmolaridade dentro Odentro for maior do que a osmolaridade fora Ofora, isto resultará em um aumento do gradiente de pressão, ΔP, entre o volume encapsulado e o livre por forças osmóticas. A pressão em excesso é equilibrada pela tensão de superfície, Y, na membrana de lipossoma, onde a correlação entre o gradiente de pressão e a tensão de superfície é fornecida pela equação de Young-Laplace bem conhecida (Evans and Wennerstrom, 1994). (Fórmula 1)

[00080] Para os sistemas de lipossoma presentes, deve ser levado em conta que a tensão de superfície exercida leva a uma expansão de área da membrana de lipossoma que pode resultar em permutas do rádio, volume encapsulado, e, consequentemente, a mudanças de osmolaridade de tal volume encapsulado. A expansão de área, ΔA, como uma função da tensão de superfície depende do módulo elástico da membrana, K, e é fornecida pela equação de Young como: (Fórmula 2)

[00081] A Fórmula 1 torna claro que a relação entre a tensão e a pressão de superfície é dependente de rádio. Em um determinado gradiente de pressão, a tensão de superfície aumenta com aumento do rádio. O aumento da área e o aumento de tamanho correspondente dos lipossomas é maior para big lipossomas do que para aqueles menores. Para sistemas com determinada tensão de superfície, tal como bolhas de sabão, o gradiente de pressão pdentro - pfora aumenta com a diminuição do rádio, ou, em outras palavras, com aumento da curvatura.

[00082] "Agente terapeuticamente ativo" ou "agente terapêutico" se refere a um agente que previne ou reduz a extensão de uma condição patológica em um animal, particularmente em um mamífero, preferivelmente em humanos.

[00083] "Molécula pequena" se refere a uma molécula com um peso molecular menor do que cerca de 2000 Da.

[00084] "Potencial zeta" se refere ao potencial eletrostático medido de uma partícula coloidal em ambiente aquoso, medido com um instrumento tal como um Zetasizer 3000 usando microeletroforese associada a Laser Doppler em cerca de 0,05 mM de solução de KCI a cerca de pH 7,5. O potencial zeta descreve o potencial no limite entre a solução em volume e a região de cisalhamento hidrodinâmico ou camada difusa. O termo é sinônimo de "potencial eletrocinético" porque é o potencial das partículas que age exteriormente e é responsável pelo comportamento eletrocinético da partícula.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00085] Um processo inventivo para a fabricação de uma preparação lipossômica pode ser determinado pelas seguintes etapas: a) fornecer uma primeira preparação lipossômica compreendendo uma suspensão de lipossomas em uma fase aquosa, em que os lipossomas compreendem pelo menos uma membrana, em que a membrana fecha um volume lipossomicamente encapsulado da fase aquosa e a fase aquosa compreende pelo menos uma substância osmoticamente ativa e tem uma osmolaridade total inicial, O1, depois disso b) gerar um gradiente osmolar na fase aquosa da referida preparação em que a osmolaridade da fase aquosa fora do volume lipossomicamente encapsulado, Ofora, é menor do que a osmolaridade da fase aquosa dentro do volume lipossomicamente encapsulado, Odentro, para produzir uma segunda (estressada) preparação lipossômica, c) opcionalmente desidratar a segunda (estressada) preparação lipossômica para obter uma preparação desidratada, e d) opcionalmente reidratar a preparação desidratada.

[00086] A preparação lipossômica de etapa a) preferivelmente compreende pelo menos um agente lipofílico presente na membrana lipossômica. Os agentes lipofílicos, entretanto, podem também ser adicionados em fases posteriores do processo de produção.

[00087] A etapa b) pode ser realizada reduzindo-se a osmolaridade global inicial, O1, da preparação lipossômica derivada da etapa a) para produzir uma preparação lipossômica estressada com a osmolaridade global, O2, que émenor do que a osmolaridade O1.

[00088] Dentro do contexto da presente invenção, reduzir a osmolaridade global O1 se refere a um processo em que inicialmente a osmolaridade do meio aquoso fora do volume lipossomicamente encapsulado, Ofora, é reduzida. Se uma assumir inicialmente uma concentração idêntica em todos os compartimentos, O1 = Ofora= Odentro, a diluição afetará, antes de mais nada, apenas a fase aquosa livre, Ofora, resultando em Ofora< Odentro. Consequentemente, um agente osmótico entre o volume lipossomicamente encapsulado dentro e fora do volume lipossomicamente encapsulado é gerado. Está bem entendido que, na presença de um gradiente osmótico, os lipossomas podem dilatar-se, porque as membranas são permeáveis por moléculas de água. Consequentemente, como um efeito secundário de diluição, também a osmolaridade do meio aquoso encapsulado, O2, pode diminuir até certo ponto. As permutas absolutas de osmolaridade dependem de vários fatores tipo fração de volume encapsulado, tamanho de lipossoma, elasticidade de membrana (módulo de Young) etc. Desse modo, a relação entre O1 e O2, não é necessariamente idêntica à relação entre Odentro e Ofora após a diluição.

[00089] Entretanto, a redução da osmolaridade na fase aquosa não encapsulada, livre levará a um aumento do gradiente de osmolaridade Odentro-Ofora entre o exterior e o interior da fase encapsulada. Se a dilatação em resposta ao estresse osmótico ocorre fora de um certo fator, os defeitos de membrana poderão ser formados, permitindo a liberação de soluto da fase de maior osmolaridade para a fase de menor osmolaridade. Isto reduzirá o gradiente osmolar e o estresse osmolar. As membranas podem selar sob condições de esforço de tensão máximo e limite crítico máximo de gradiente osmótico para formação de poro. Consequentemente, o sistema pode ser considerado auto estabilizante, no sentido que se um gradiente em excesso for aplicado, independente de condições detalhadas, o sistema adotará o estado de gradiente osmótico máximo. Tal efeito pode ser considerado favorável para garantia de condições reproduzíveis durante a fabricação.

[00090] Os lipossomas usados dentro do contexto da presente invenção podem compreender lipídios neutros, aniônicos e/ou catiônicos. Os lipídios neutros ou aniônicos podem ser selecionados de esterois ou lipídios tais como colesterol, fosfolipídios, lisolipídios, lisofosfolipídios, esfingolipídios ou lipídios pegilatos com uma carga líquida neutra ou negativa. Os lipídios neutros e aniônicos úteis, desse modl, incluem: fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol (não limitado a um açúcar específico), ácidos graxos, esterois, contendo grupo ácido carboxílico, por exemplo, colesterol, 1,2-diacil-sn-glicero- 3-fosfoetanolamina, incluindo, porém não limitado a, 1,2- dioleilfosfoetanolamina (DOPE), 1,2-diexadecilfosfoetanolamina (DHPE), 1,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas, 1,2- diestearilfosfosfatidilcolina (DSPC), 1,2-dipalmitilfosfosfatidilcolina (DPPC), 1,2-dimiristilfosfosfatidilcolina (DMPC), fosfatidilcolina preferivelmente PC de ovo, PC de soja e esfingomielina. Os ácidos graxos ligados ao esqueleto de glicerol não são limitados um comprimento específico ou número de ligações duplas. Os fosfolipídios podem também ter dois ácidos graxos diferentes. Preferivelmente, os outros lipídios são no estado cristalino líquido em temperatura ambiente e eles são miscíveis (isto é, uma fase uniforme pode ser formada e nenhuma separação de fase ou formação de domínio ocorre) com o lipídio catiônico usado, na relação como elas são aplicadas. Em uma modalidade preferida o lipídio natural é 1,2- dioleilfosfosfatidilcolina (DOPC).

[00091] Os lipídios catiônicos preferidos da preparação lipossômica são sais de N-[1-(2,3-dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetil amônio, por exemplo, o sal de metilsulfato. Representativos preferidos da família de lipídios de -TAP (metilsulfato de trimetilamônio) são DOTAP (dioleoil-), DMTAP (dimiristoil-), DPTAP (dipalmitoil-), ou DSTAP (distearoil-). Outros lipídios úteis para a presente invenção podem incluir: DDAB, brometo de dimetildioctadecil amônio; propanos de 1,2- diacilóxi-3-trimetilamônio, (incluindo, porém não limitado à: dioleoíla, dimiristoíla, dilauroíla, dipalmitoila e distearoíla; além disso, duas cadeia acila diferentes podem ser ligadas ao esqueleto de glicerol); N- [1-(2,3-dioloilóxi)propil]-N,N-dimetil amina (DODAP); propanos de 1,2- diacilóxi-3-dimetilamônio, (incluindo, porém não limitado à: dioleoíla, dimiristoíla, dilauroíla, dipalmitoila e distearoíla; além disso, duas diferentes cadeia acila podem ser ligadas ao esqueleto de glicerol); cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA); propanos de 1,2-dialquilóxi-3-dimetilamônio, (incluindo, porém não limitado à: dioleíla, dimiristila, dilaurila, dipalmitila e distearila; além disso, duas cadeias de alquila diferentes podem ser ligadas ao esqueleto de glicerol); dioctadecilamidoglicilspermina (DOGS); 3β-[N- (N',N'-dimetilamino-etano)carbamoil]colesterol (DC-Col); trifluoro- acetato de 2,3-dioleoilóxi-N-(2-(esperminacarboxamido)-etil)-N,N- dimetil-1-propanamínio (DOSPA); colesterol de β-alanil; brometo de trimetil amônio (CTAB); diC14-amidina; N-terc-butil-N'-tetradecil-3- tetradecilamino-propionamidina; 14Dea2; cloreto de N-(alfa- trimetilamonioacetil)didodecil-D-glutamato (TMAG); cloreto de O,O'- ditetradecanoil-N-(trimetilamônio-acetil)dietanolamina; 1,3-dioleoilóxi-2- (6-carbóxi-espermil)-propilamida (DOSPER); iodeto de N,N,N',N'- tetrametil-N,N'-bis(2-hidroxiletil)-2,3-dioleoilóxi-1,4-butanediamônio; derivados de cloreto de 1-[2-(acilóxi)etil]2-alquil(alquenil)-3-(2- hidroxietil)-imidazolínio como descrito por Solodin e outro, (Solodin e outro, 1995), tal como cloreto de 1-[2-(9(Z)-octadecenoilóxi)etil]-2- (8(Z)-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)imidazo línio (DOTIM), cloreto de 1- [2-(hexadecanoilóxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)imidazolínio (DPTIM), derivados de composto de amônio quartenário de 2,3- dialquiloxipropila, contendo uma porção hidroxialquila na amina quartenária, como descrito por exemplo, por Felgner e outro, (Felgner e outro, 1994) tal como: brometo de 1,2-dioleoil-3-dimetil-hidroxietil amônio (DORI), brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amônio (DORIE), brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipropil amônio (DORIE-HP), brometo de 1,2-dioleil-óxi-propil-3-dimetil- hidroxibutil amônio (DORIE-HB), brometo de 1,2-dioleiloxipropil-3- dimetil-hidroxipentil amônio (DORIE-Hpe), brometo de 1,2- dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxiletil (DMRIE), brometo de 1,2- dipalmitiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amônio (DPRIE), brometo de 1,2- disteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amônio (DSRIE); ésteres catiônicos de carnitinas de acila como reportado por Santaniello e outro, (US 5.498.633); triésteres catiônicos de fosfatidilcolina, isto é, 1,2-diacil-sn- glicerol-3-etilfosfocolinas, onde as cadeias hidrocarboneto podem ser saturadas ou insaturadas e ramificadas ou não ramificadas com um comprimento de cadeia de C12 a C24, as duas cadeias acila não sendo necessariamente idênticas.

[00092] Os lipossomas podem ter diferentes tamanhos, lamelaridade e estrutura. Preferivelmente os lipossomas têm um diâmetro médio Zmédio de cerca de 50 nm a cerca de 500 nm. Mais preferred é um Zmédio de tamanho de cerca de 100 a cerca de 200 nm. Os lipossomas podem ser lipossomas uni-, oligo- ou multilamelares. Preferivelmente os lipossomas são lipossomas unilamelares.

[00093] O agente ativo ou agente cosmético empregado nas diferentes modalidades do composto da invenção preferivelmente tem um log P maior do que 1, mais preferivelmente maior do que cerca de 2, mais preferivelmente maior do que cerca de 3.

[00094] O agente ativo ou agente cosmético empregado nas diferentes modalidades da invenção preferivelmente tem uma baixa solubilidade em água. Preferivelmente o composto tem uma solubilidade menor do que 0,1 mg/mL, mais preferivelmente menor do que 0,01 mg/mL e mais preferivelmente menor do que 0,001 mg/mL em água em pH fisiológico em temperatura ambiente.

[00095] Preferivelmente o agente ativo compreendido nos lipossomas da presente invenção é um agente terapeuticamente ou diagnosticamente ativo. Mais preferivelmente o composto é terapeuticamente ativo.

[00096] Preferivelmente o agente ativo ou agente cosmético é uma molécula com um peso molecular menor do que 2000 Da, mais preferivelmente menor do que 1000 Da.

[00097] Em um aspecto, o agente ativo pode ser selecionado do grupo compreendendo abarelix, altretamina, anastrozol, aprepitante, bicalutamida, camptotecinas, capecitabina, clorotrianisene, estrogênios conjugados, ciclosporina, dactinomicina, dietilstilbestrol, docetaxel, dolasetron, dromostanolona, epirubicina, epotilonas, por exemplo, epotilona B, epotilona D, ou derivados de epotilona, por exemplo, como descrito no WO2004048372, WO2004007492, WO2005051947 e WO2005030767 (o teor dos quais é aqui incorporado por referência), suberlotinibe, etinil estradiol, exemestano, fentanila, flavopiridol, fluoximesterona, fulvestrante, gefitinibe, granisetron, hesperetina, hidromorfona, irinotecan, cetoconazol lapatinibe, letrozol, leuprolida, lomustina, lucantona, marinol, masoprocol, megestrol, nabilona, nilutamida, palonosetron, porfímero, quinestrol, quinestrol, tamoxifeno, taxanos, temsirolimus, testolactone, topotecan, toremifene, trimetrexate, valrubicina, vinblastina, vitamina E, e derivados destes compostos. Preferivelmente o composto é um taxano, mais preferivelmente paclitaxel ou um derivado do mesmo.

[00098] Em um certo aspecto da invenção, o agente ativo não é uma molécula de nucleotídeo ou polinucleotídeo como uma molécula de DNA ou RNA.

[00099] Em outro aspecto, o escopo da invenção não compreende agentes ativos que são ionizados durante a formulação e/ou agentes ativos que são compostos altamente solúveis em água como, por exemplo, adriamicina.

[000100] Preferivelmente, os lipossomas da invenção compreendem entre cerca de 2,5 % em mol e cerca de 4,5 % em mol de paclitaxel nas membranas lipossômicas. Desse modo, paclitaxel pode preferivelmente representar uma quantidade dentre cerca de 2,5 % em mol e cerca de 4,5 % em mol da quantidade de todas as moléculas presentes nas membranas tal como lipídios e moléculas relacionadas e paclitaxel. Mais preferivelmente, estes lipossomas mostram uma liberação de fármaco impedido como uma suspensão e/ou após reidratação, e/ou substancialmente não formam cristais durante a armazenagem como definido aqui abaixo.

[000101] Em uma modalidade especialmente preferida da invenção, os lipossomas são lipossomas catiônicos, por exemplo, lipossomas catiônicos compreendendo DOTAP, DOPC e paclitaxel em uma relação molar de cerca de 50:47:3. As formulações desta composição são conhecidos na técnica como MBT-0206 ou EndoTAG-1. A fabricação de preparações lipossômicas compreendendo DOTAP, DOPC e paclitaxel é descrita no WO 2004/002468, o teor do qual é aqui incorporado por referência.

[000102] Em geral, os lipossomas podem ser preparados por métodos que são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Vários métodos para preparar lipossomas são descritos por New e outro, (1990).

[000103] Preferivelmente os lipossomas empregados na presente invenção são preparadas por injeção de etanol.

[000104] Em uma modalidade especial da invenção, os lipossomas têm um potencial zeta positivo, mais preferivelmente um potencial zeta maior do que cerca de + 30 mV.

[000105] A substância osmoticamente ativa empregada no método inventivo ou compreendida nas composições inventivas é uma substância solúvel que não é capaz de substancialmente permear uma bicamada de lipídio. Preferivelmente a substância osmoticamente ativa está presente dentro e fora dos lipossomas.

[000106] A substância osmoticamente ativa pode ser uma molécula orgânica como um sacarídeo, por exemplo, um mono-, di-, oligo- ou poli sacarídeo, um álcool de açúcar, um aminoácido, um peptídeo, uam proteína, um polímero solúvel em água, um sal orgânico ou inorgânico, íon, ou uma combinação do mesmo.

[000107] Sacarídeos úteis incluem açúcar e álcoois de açúcar, oligossacarídeos, polissacarídeos solúveis em água e derivados dos mesmos. Sacarídeos preferidos de acordo com a invenção incluem glicose, frutose, lactose, sacarose, maltose, celobiose, galactose, maltotriose, maltopentose, rafinose, dextrina, dextrano, inulina, manitol, sorbitol, xilitol, quitosana e mais preferivelmente trealose.

[000108] Exemplos de polímeros solúveis em água são polietileno glicóis, polivinilálcool, poliacrilatos, ou polivinilpirrolidona.

[000109] Em um certo aspecto, o uso de uma substância osmoticamente ativa no método ou composições inventivas exclui o uso de agentes complexantes que facilitam a solubilização de compostos que tem uma baixa solubilidade em água. Exemplos de tais agentes complexantes são ciclodextrinas como descrito por Zhang e outro, em WO 2007/005754 ou MacLachlan e outro, em WO 2007/012191.

[000110] O meio aquoso ou fase usada dentro do contexto da presente invenção pode compreender um ou mais outros constituintes que são pelo menos parcialmente miscíveis com água, tal como álcoois (por exemplo, C1-4 álcoois tal como etanol) ou cetonas (por exemplo, C1-4 cetonas tal como acetona). Em uma modalidade preferida da invenção, a fase aquosa contém etanol.

[000111] A fase aquosa pode também compreender uma substância de tampão ou outros agentes de estabilização. As substâncias de tampão adequadas são selecionadas de, por exemplo, ácido acético, Tris, Bis, ácido fosfórico, ácido láctico e similares, preferivelmente ácido cítrico. A substância de tampão pode estabilizar um pH do meio aquoso entre cerca de 3 e 7, preferivelmente entre cerca de 4 and cerca de 5.

[000112] Preferivelmente, a preparação lipossômica de etapa a) é fabricada misturando-se uma solução orgânica (por exemplo, etanol) compreendendo lipídios e opcionalmente um agente ativo ou agente cosmético em um meio aquoso compreendendo pelo menos uma substância osmoticamente ativa caracterizada por uma osmolaridade total O1.

[000113] A faixa preferida de gradientes osmóticos, Odentro-Ofora, está entre 10 mOsm e 2000 mOsm, mais especialmente entre 50 mOsm e 1000 mOsm e ainda mais especialmente entre 100 mOsm e 1000 mOsm.

[000114] Os gradientes osmóticos podem também ser indicados pela diferença de concentração/peso entre a concentração/peso da substância osmoticamente ativa dentro do volume lipossomicamente encapsulado e a concentração/peso da substância osmoticamente ativa fora do volume lipossomicamente encapsulado. A faixa preferida de gradientes osmóticos é a diferença de concentração/peso entre 5 % e 30 % por peso, isto é, a gradient entre 0 % e 30 % por peso da substância osmoticamente ativa fora do volume encapsulado e entre 10 % e 40 % por peso da substância dentro do volume encapsulado.

[000115] A preparação lipossômica derivada de etapa a) pode ser submetida a uma etapa de homogeneização, que pode ser realizada por extrusão, filtragem através de filtros de membrana, homogeneização de pressão elevada e/ou homogeneização de velocidade elevada e na maior parte preferida por extrusão através de uma membrana, por exemplo, com um tamanho de poro de cerca de 200 nm sob pressão. Membranas com outros tamanhos de poro tais como 50 nm, 100 nm, 150 nm, 400 nm bem conhecidas na técnica podem também ser usadas. A filtragem através de filtros de membrana pode ser realizada por filtragem através de membranas compostas de PVDF, PES, filtros de náilon, porém também outros materiais podem ser usados se definidos serem adequados. O tamanho de poro de membranas está preferivelmente na faixa de cerca de 200 nm a 450 nm, porém o tamanho do poro não é limitado aos tamanhos mencionados. Diferentes materiais e diferentes tamanhos de poro podem ser combinados de um modo para obter uma solução que pode ser processada por uma filtragem de grau esterilizante. Em uma modalidade preferida, os lipossomas derivados da etapa a) são submetidos à homogeneização antes de um gradiente osmolar ser gerado.

[000116] Visto que a esterilidade é uma característica obrigatória para produtos farmacêuticos, as suspensões lipossômicas empregada no processo inventivo podem ser esterilizadas em algum estágio durante o processo. Preferivelmente as suspensões são esterilizadas por filtragem através de uma membrana de filtragem estéril de grau esterilizante (0,22 pm). Em uma modalidade preferida, suspensões lipossômicas são esterilizadas por filtragem após um gradiente osmolar ser gerado de acordo com a etapa b) da invenção.

[000117] De acordo com o conceito geral da invenção o gradiente osmótico entre o volume encapsulado e livre pode ser gerado ou alterado uma vez ou diversas vezes em diferentes estágios durante o processo de produção de uma preparação lipossômica. Isto pode ser possivelmente obtido pelos procedimentos iguais ou diferentes como descrito no seguinte.

[000118] Em uma modalidade preferida da invenção, etapa b) do processo inventivo pode compreender as etapas de: b1) desidratar a preparação lipossômica derivada de etapa a) para obter uma preparação lipossômica desidratada, e b2) reidratar a referida preparação lipossômica desidratada, preferivelmente em um meio aquoso sob condições, em que uma preparação lipossômica estressada é obtida.

[000119] Dentro do significado da presente invenção "preparação lipossômica derivada de etapa a)" se refere a uma preparação lipossômica preparada na etapa a) ou qualquer preparação lipossômica que pode ser obtida da preparação lipossômica preparada na etapa a) por meio de diferentes etapas de processamento. Estas etapas de processamento podem, por exemplo, incluir homogeneização e/ou esterilização como acima descrito.

[000120] Em uma modalidade preferida, a geração ou alteração de um gradiente osmolar é realizada pelo menos uma vez após a fabricação da primeira preparação lipossômica na etapa a) e antes da desidratação da referida preparação lipossômica derivada de etapa a). Preferivelmente geração ou alteração do gradiente osmolar é realizada após uma etapa de extrusão e/ou após filtragem estéril. Como mencionado acima, o gradiente osmolar realça a estabilidade da suspensão lipossômica submetida às etapas de processamento.

[000121] Preferivelmente a desidratação é realizada em temperaturas acima da temperatura ambiente.

[000122] Em uma modalidade especialmente preferida da invenção, a desidratação de etapa b1) é realizada por secagem por spray da suspensão lipossômica. No processo de secagem por spray, a suspensão lipossômica é primeiro atomizado nas pequenas gotículas vaporizando-se a referida suspensão. Subsequentemente, os lipossomas são secados pela evaporação do meio das gotículas em temperaturas elevadas. A secagem dos lipossomas após a formação da gotícula pode ser obtida contatando-se as gotículas com uma corrente de gás fornecida, seca, possivelmente aquecida para obter partículas sólidas. A possível corrente gasosa pode ser um gás inerte ou ar. O gás de secagem pode preferivelmente ser um gás de baixo oxigênio contendo menos do que 0,1 % em volume, preferivelmente menor do que 0,05 % em volume, oxigênio ou um gás livre de oxigênio. Gases inertes estão aumentando a proteção de sistemas de secagem aquecidos que contêm soluções altamente inflamáveis, bombeando-se nitrogênio, dióxido de carbono, hélio, neon, argônio, criptônio, xênon e radônio ou algum outro gás inerte a fim de remover o oxigênio. O efeito destes sistemas é completamente remover o oxigênio, ou reduzí-lo a um nível insignificante. Em uma modalidade preferida nitrogênio é usado como um gás inerte. Em outra modalidade da invenção o gás inerte protege os ingredientes ativos e excipientes contidos na formulação. Preferivelmente a secagem por spray é realizada em um dispositivo adequado para secagem por spray. Os lipossomas desidratados são separados da corrente de gás e coletados. A secagem por spray podem ser realizada sob excesso de pressão, pressão normal ou vácuo parcial. Uma faixa de pressão de processo favorável pode existir se o pó adequando-se à especificação for produzido com o gás de secagem na temperatura de sistema máxima permissível e em capacidade máxima. Para a seleção de condições de secagem, a combinação de parâmetros como taxa de alimentação líquida, taxa de gás de secagem, temperatura de gás de secagem, parâmetros termodinâmicos dos excipientes, e limites de estabilidade dos compostos foram levados em consideração. Parâmetros importantes são a temperatura de entrada do gás de secagem Tdentro, e a temperatura de saída, Tfora, que está presente dentro do secador por spray. Tfora é substancialmente menor do que Tdentro devido ao resfriamento adiabático na evaporação. A temperatura real da superfície de particular pode ser significantemente menor do que Tfora, dependendo da taxa de evaporação local. Portanto, nenhum parâmetro de secagem por spray genérico pode ser definido. Para secagem de lipossomas, a temperatura dentro da câmara de processo pode variar entre 10 °C e 200 °C. Mais tipicamente, a suspensão é secada pelo método da invenção com 30 °C a 150 °C, e mais preferivelmente de cerca de 60 °C a cerca de 120 °C. O equipamento para o processo de secagem por spray pode ser obtido de Büchi (Flawil, Suíça), ou GEA Niro (Soeborg, Dinamarca) ou feito sob encomenda. A pessoa versada na técnica é capaz de selecionar as condições do processo de secagem, por exemplo, taxas de alimentação e temperaturas, dependendo da suspensão a ser secada, do equipamento usado e das especificações desejadas.

[000123] Especialmente, as condições de uma etapa de desidratação podem ser escolhidas para obter a composição lipossômica desidratada com ua quantidade muito baixa de solvente orgânico. A desidratação por secagem por spray é especialmente adequada para obtenção de baixas quantidades de solvente orgânico residual.

[000124] Além disso, a desidratação por secagem por spray como descrito aqui resulta em uma composição de lipossoma desidratada em forma de um pó vertível. Tais pós melhoraram as propriedades de manipulação, por exemplo, com respeito à carga de tais composições desidratadas, quando comparadas às composições desidratadas obtidas por secagem por congelamento que têm uma estrutura tipo massa.

[000125] Em um aspecto da invenção, a desidratação não substancialmente afeta a relação entre o composto osmoticamente ativo encapsulado e livre quando comparando a relação na suspensão lipossômica que foi submetida à secagem por spray e a relação na preparação secada por spray após reidratação em água.

[000126] Em um certo aspecto da invenção a desidratação por liofilização, ou secagem por congelamento, em que uma suspensão lipossômica é congelada e subsequentemente submetida à pressão reduzida para retirar as moléculas de água não é incluída no escopo da invenção.

[000127] A composição desidratada, por exemplo, como obtido na etapa b1) ou c) pode ser carregada em recipientes adequados e pode ser armazenada durante um certo período de tempo. Preferivelmente a composição é carregada e armazenada sob condições estéreis. O tempo de armazenagem pode ser de diversos dias a diversos meses ou mesmo anos. A composição pode ser armazenada em temperatura ambiente, em temperaturas entre 2 °C a 8 °C ou abaixo de 0 °C.

[000128] Antes da composição lipossômica desidratada é usada, por exemplo, administrada a um paciente em caso de uma composição lipossômica usada como uma composição farmacêutica, ou outra processada, a composição desidratada é reidratada de acordo com a etapa b2 ou c). Para este propósito a composição desidratada obtida como acima descrito é misturada com um meio aquoso. Para realçar a reidratação, a mistura pode ser agitada ou centrifugada.

[000129] A osmolaridade do meio aquoso usado para reidratação é menor do que a osmolaridade total O1 da suspensão que foi submetida a uma etapa de desidratação. Preferivelmente o meio aquoso usado para reidratação não substancialmente compreende substâncias osmoticamente ativas. Mais preferivelmente, água de grau farmacêutico para injeção é usada para reidratação.

[000130] Em algumas modalidades, o volume de meio aquoso usado para reidratação pode ser maior do que o volume da suspensão lipossômica que foi desidratada para obter a respectiva quantidade de composição lipossômica desidratada.

[000131] De acordo com a invenção a osmolaridade do meio aquoso usado para reidratação e o volume do meio usado para reidratação são selecionados em uma combinação para obter uma suspensão reidratada que tem uma osmolaridade total O2 que é menor do que a osmolaridade O1 da suspensão que foi submetida a uma etapa de desidratação.

[000132] Em outro aspecto da invenção, a etapa b) é realizada diluindo-se a suspensão lipossômica derivada de etapa a) para produzir um meio aquoso tendo uma osmolaridade total O2 que é menor do que O1.

[000133] A suspensão lipossômica é diluída com um meio aquoso como acima descrito. Em uma modalidade preferida, a suspensão lipossômica é diluída com água. Em uma modalidade, o meio aquoso usado para diluir a suspensão lipossômica não compreende um agente ativo, especialmente não um agente ativo que deve ser encapsulado nos lipossomas.

[000134] Em uma modalidade preferida da invenção O2 é pelo menos 10 mOsm menor do que O1, mais preferivelmente O2 é pelo menos 50 mOsm menor do que O1, and even mais preferivelmente O2 é pelo menos 100 mOsm menor do que O1.

[000135] Em outro aspecto da invenção, etapa b) é realizada por diálise da suspensão lipossômica derivada de etapa a) em um meio aquoso tendo uma osmolaridade total que é menor do que O1.

[000136] Preferivelmente a diálise é realizada sob condições para produzir um gradiente osmótico entre O1 e a osmolaridade do meio aquoso em que a diálise é realizada de pelo menos 10 mOsm mais preferivelmente pelo menos 50 mOsm e ainda mais preferivelmente pelo menos 100 mOsm.

[000137] Alternativamente, a etapa b) pode ser realizada por outros métodos adequados. Por exemplo, a concentração da substância osmoticamente ativa pode ser reduzida por métodos cromatograficamente adequados tais como permuta de íon ou cromatografia de afinidade.

[000138] Em um outro aspecto da invenção, a suspensão lipossômica estressada obtida de acordo com a etapa b) o processo descrito como acima pode ser desidratada. A desidratação da referida suspensão lipossômica estressada pode ser realizada por qualquer processo adequado conhecido pela pessoa versada na técnica. Procedimentos de secagem adequados são, por exemplo, secagem por congelamento, secagem por congelamento por spray ou secagem por spray. Em uma modalidade preferida, a desidratação por secagem por spray pode ser realizada como acima descrito para a etapa b1). Em um outro aspecto da invenção, a preparação lipossômica desidratada resultante é reidratada como acima descrito.

[000139] Em uma modalidade específica a invenção se refere a um processo em que uma suspensão lipossômica inicial, preferivelmente compreendendo lipossomas catiônicos compreendendo DOTAP e opcionalmente DOPC como lipídios, e também compreendendo um agente ativo lipofílico, preferivelmente paclitaxel, na membrana lipossômica, é preparada em uma fase de trealose aquosa. As concentrações dos constituintes da suspensão lipossômica estão presentes em uma concentração de cerca de três vezes quando comparada à suspensão lipossômica produzida pelo processo que é finalmente usada, por exemplo, administrada a um humano. Preferivelmente a suspensão lipossômica inicial tem uma concentração de cerca de 30 mM de lipídios e cerca de 30 mg/mL, mais preferivelmente 29,4 mg/mL de trealose. A suspensão lipossômica inicial é opcionalmente homogeneizada por extrusão através de uma membrana na etapa seguinte. Subsequentemente a osmolaridade total da suspensão lipossômica é reduzida, preferivelmente por um fator de 1,5, preferivelmente diluindo-se o volume da suspensão lipossômica com água, por exemplo, para o volume de 1,5 vezes. Subsequentemente a suspensão lipossômica é opcionalmente esterilizada, preferivelmente por filtragem. Na etapa seguinte a suspensão lipossômica é desidratada, preferivelmente por secagem por spray , para produzir uma suspensão lipossômica desidratada. A suspensão lipossômica desidratada é finalmente reidratada para produzir uma suspensão lipossômica, que é usada para seu respectivo propósito, tal como administração a um humano. A última suspensão lipossômica preferivelmente tem uma concentração de cerca de 10 mM de lipídios e cerca de 10 mg/mL, preferivelmente 9,79 mg/mL de trealose.

[000140] Em outro aspecto a invenção se refere a um processo para fabricação de uma preparação lipossômica, compreendendo: i) fornecer uma suspensão lipossômica, em que pelo menos uma substância osmoticamente ativa é compreendida na fase aquosa de a suspensão, em que uma osmolaridade maior está presente dentro do volume lipossomicamente encapsulado do que fora do volume lipossomicamente encapsulado, ii) incubar a referida suspensão lipossômica com um composto lipofílico, opcionalmente em uma forma não solubilizada, iii) opcionalmente separar qualquer composto não solubilizado da suspensão lipossômica, por exemplo, por filtragem, centrifugação ou outros métodos adequados, iv) opcionalmente desidratar a preparação lipossômica, e v) opcionalmente reidratar a preparação lipossômica desidratada.

[000141] Preferivelmente o gradiente osmótico entre o volume lipossomicamente encapsulado interno e externo é entre 10 mOsm e 2000 mOsm, more especialmente entre 50 mOsm e 1000 mOsm e ainda mais especialmente entre 100 mOsm e 1000 mOsm.

[000142] Em uma modalidade preferida da invenção a suspensão lipossômica de etapa i) não compreende um agente ativo ou agente cosmético.

[000143] Os lipossomas compreendendo um gradiente osmótico de etapa i) podem ser preparados como acima descrito. Em uma modalidade preferida da invenção, não existe nenhum agente ativo ou cosmético adicionado na fabricação da suspensão lipossômica de etapa i). A forma não solubilizada do agente ativo ou agente cosmético pode ser, por exemplo, uma forma cristalina, por exemplo, de tamanho e morfologia diferentes ou uma forma de pó.

[000144] Em uma modalidade da invenção, o agente não solubilizado é separado da dispersão após a incubação. Em uma modalidade preferida, composto não dissolvido é separado por centrifugação ou filtragem. A filtragem pode ser realizada em um filtro de seringa.

[000145] Em outro aspecto a invenção se refere a uma preparação lipossômica obtida ou obtenível pelos processos como acima descrito. A preparação pode ser em forma desidratada ou em forma de uma suspensão aquosa.

[000146] A preparação lipossômica da presente invenção é preferivelmente usada na medicina, por exemplo, na medicina humana ou veterinária. A preparação é preferivelmente administrada intravenosamente. Mais preferivelmente a preparação é usada para o tratamento de câncer tal como câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer endometrial, leucemia, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer ovariano, câncer de próstata e a cânceres infantis tais como glioma tronco-cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, ependimoma, sarcoma de Ewing/família de tumores, tumor de célula germinativa, extracranianos, doença de Hodgkin, leucemia, aguda linfoblástica, leucemia, mieloide aguda, câncer de fígado, meduloblastoma, neuroblastoma, linfoma de não Hodgkin, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de osso, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, sarcoma de tecido mole, tumores neuroectodérmicos e pineais supratentoriais primitivos, cânceres infantis não habituais, glioma da trilha visual e hipotalâmico, tumor de Wilms e outros tumores de rim infantis e a cânceres menos comuns incluindo leucemia linfótica aguda, leucemia mieloide aguda de adulto, linfoma de não Hodgkin adulto, câncer cervical, cânceres infantis, sarcoma infantil, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, câncer esofágico, leucemia da célula pilosa, câncer renal, câncer hepático, mieloma múltiplo, neuroblastoma, câncer oral, câncer pancreático, linfoma do sistema central primário, câncer de pele, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer d ecabeça e pescoço, câncer de vesícula biliar e ducto de bílis, câncer de estômago, câncer gastrointestinal, sarcoma de Kaposi, carcinoma de célula urotelial, carcinoma de glândula da tiroide, carcinoma testicular, câncer vaginal, angiossarcoma, sarcoma do tecido mole, mesotelioma e carcinoma hepatocelular. Particularmente, o câncer pode ser um câncer com mestátase e/ou um câncer resistente à (quimio) terapia padrão. A administração da composição da invenção pode reduzir ou interromper a progressão de doença, ou pode induzir a uma remissão parcial ou completa em um humano. Mais preferivelmente câncer pancreático ou de mama, especialmente câncer de mama negativo de triplo receptor é tratado. A preparação lipossômica da presente invenção pode ser administrada em uma dose unitária de cerca de 11 mg/m2 de paclitaxel a cerca de 44 mg/m2 de paclitaxel, preferivelmente em uma dose unitária de cerca de 22 mg/m2 de paclitaxel. Preferivelmente as preparações são administradas uma vez ou duas vezes semanalmente. As preparações lipossômicas podem ser usadas como descrito no WO2005/039533, WO 2006/117220, e WO 2007/107305.

[000147] Além disso, a preparação lipossômica da presente invenção pode ser usada como uma preparação diagnóstica ou cosmética.

[000148] Além disso, a invenção se refere a uma suspensão lipossômica compreendendo um composto ativo ou cosmético nas membranas lipossômicas, em que os lipossomas encapsulam-se um meio aquoso de uma osmolaridade que é maior do que a osmolaridade do meio aquoso fora do volume lipossomicamente encapsulado. O meio aquoso da suspensão compreende pelo menos uma substância osmoticamente ativa. A diferença entre osmolaridade do meio dentro do lipossoma e fora do lipossoma é preferivelmente pelo menos 10 mOsm, preferivelmente pelo menos 50 mOsm.

[000149] A diferença de osmolaridade dentro e fora do lipossoma induz a um gradiente de pressão osmótica que induz a um esforço de tensão sobre a membrana de lipossoma, tal como descrito em Hallet e outro, 1993. Consequentemente a invenção se refere a uma suspensão lipossômica compreendendo um composto ativo ou cosmético na membrana lipossômica, em que a membrana lipossômica está sob esforço de tensão.

[000150] Lipossomas em que a membrana lipossômica está sob esforço de tensão podem ser obtidos por aplicação de gradientes osmóticos como acima descrito.

[000151] Diversos métodos de caracterização físico-química podem ser aplicados para determinar gradientes osmolares e esforço de tensão em preparações de lipossoma. Em muitos casos, soluções de componentes osmoticamente ativostêm uma densidade maior do que aquela de água e a densidade muda monotonamente com a concentração do composto. Se a osmolaridade do volume encapsulado de lipossoma for maior do que aquela do volume livre, isto afetará a densidade de lipossoma. Para trealose em uma concentração de 5 % (150 mOsm) em água a densidade é de cerca de 0,02 g/L maior do que aquela de água pura (Handbook of Chemistry and Physics, CRC Press, Boca Raton, Florida). Consequentemente, a diferença de osmolaridade dentro e fora do lipossoma induz a uma densidade diferente do meio dentro do volume lipossomicamente encapsulado e o meio fora do volume lipossomicamente encapsulado.

[000152] Desse modo, é um aspecto da invenção descrever suspensões lipossômicas, em que o volume lipossomicamente encapsulado tem uma densidade maior do que o meio fora do volume lipossomicamente encapsulado. A diferença na densidade é fornecida pelo gradiente osmolar preferido e a densidade da solução do respectivo composto osmoticamente ativo. A densidade de partículas coloidais, tal como lipossomas, pode ser determinada, por exemplo, por métodos de ultracentrifugação.

[000153] Uma modalidade especialmente preferida das suspensões lipossômicas inventivas compreendendo um gradiente osmolar é uma suspensão lipossômica compreendendo lipossomas contendo DOTAP, DOPC, e paclitaxel, preferivelmente em uma relação molar de 50:47:3, em uma concentração de lipídio total de cerca de 10 mM, trealose, e opcionalmente ácido cítrico, suspensa em uma fase aquosa compreendendo cerca de 10 mg/mL, especialmente 9,79 mg/mL de trealose, e opcionalmente cerca de 0,011 mg/mL de ácido cítrico, em que os referidos lipossomas têm uma densidade anidrosa de pelo menos cerca de 1,1g/mL, especialmente pelo menos cerca de 1,15 g/mL, pelo menos cerca de 1,17 g/mL, ou pelo menos cerca de 1,17 g/mL. Preferivelmente, os referidos lipossomas têm um zmédio de cerca de 140 nm.

[000154] O processo acima descrito permite a preparação de suspensões lipossômicas compreendendo lipossomas como acima descrito que são também disso caracterizados por uma distribuição de tamanho de partícula controlada, onde o diâmetro do perfil de distribuição de tamanho não é substancialmente apliado pelo processo de fabricação, como caracterizado, por exemplo, por mudanças do índice de polidispersidade (PI). Preferivelmente o PI da suspensão lipossômica inventiva compreendendo um gradiente osmolar não é elevado por mais do que 0,2, mais preferivelmente ele não é elevado por mais do que 0,1, pela geração do gradiente osmolar.

[000155] Em um outro aspecto da invenção o composto ativo ou cosmético é substancialmente apenas compreendido em um compartimento de membrana dos lipossomas nas preparações lipossômicas inventivas. Desse modo, pelo menos cerca de 98 %, preferivelmente pelo menos cerca de 99 % da quantidade molar de todo o composto ativo ou cosmético presente na preparação são embutidos na fase lipídica das membranas lipossômicas. Apenas a quantidade restante pode ser solubilizada na fase aquosa da preparação ou pode ser presente em forma de composto ativo ou cosmético cristalizado.

[000156] As suspensões descritas aqui que podem ser obtidas pelo processo descrito são mais estáveis com respeito à liberação de fármaco do que as suspensões lipossômicas convencionais comparáveis que são preparadas sem um gradiente osmótico. A estabilidade temporal com respeito à liberação de fármaco dos lipossomas é maior, e a formulação é menos propensa à liberação de fármaco quando submetida à tensão mecânica e/ou outra tensão. Preferivelmente, a liberação de fármaco pode ser impedida pelo menos durante 6 horas, preferivelmente pelo menos durante 12 horas, pelo menos durante 24 horas, pelo menos durante 2 dias, pelo menos durante 7 dias ou pelo menos durante 14 dias ou mais a 25 °C, em comparação com uma suspensão sem um gradiente osmótico. A determinação de liberação de fármaco depende do tipo de fármaco. Para lipossomas carregados com paclitaxel, a liberação de fármaco pode ser sensivelmente monitorada determinando-se as partículas de fármaco (cristais) que se formam após a liberação. As partículas podem ser determinadas, por exemplo, por avaliações de difração de raio X, ou técnicas de dispersão de luz.

[000157] Em uma modalidade da invenção, pelo menos cerca de 90 %, preferivelmente pelo menos cerca de 95 %, mais preferivelmente 99 % da quantidade de composto ativo ou cosmético solubilizado pelas membranas lipossômicas são mantidos nos lipossomas durante pelo menos cerca de 24 horas em temperatura ambiente e não liberados na fase aquosa das suspensões. Visto que a liberação de compostos ativos ou cosméticos lipofílicos, que têm uma baixa solubilidade na referida fase aquosa, pode induzir à formação de cristal, as suspensões inventivas não substancialmente formam cristais em uma quantidade correspondente a mais do que cerca de 10 %, preferivelmente mais do que cerca de 5 %, mais preferivelmente mais do que cerca de 1 % do material solubilizado em 24 horas a 25 °C.

[000158] Além disso, as suspensões lipossômicas inventivas obtidas por reidratação da composição lipossômica desidratada como acima descrito não formam agregados durante um período de pelo menos cerca de 24 horas a 25 °C. A formação de agregados pode ser determinada avaliando-se as mudanças no Zmédio e PI por meio de espectroscopia de correlação de fóton (PCS). As suspensões inventivas são caracterizadas por mudanças do Zmédio por um fator não maior do que cerca de 1,5, preferivelmente não maior do que 1,25, e mudanças do valor de PI por um fator não maior do que cerca de 2, preferivelmente não mais do que cerca de 1,5, mais preferivelmente não mais do que cerca de 1,25 durante 24 horas. Preferivelmente as suspensões lipossômicas com estas propriedades são derivadas da reidratação da composição lipossômica desidratada.

[000159] Visto que solventes orgânicos são frequentemente usados na preparação de lipossomas, por exemplo, como acima descrito para o método de injeção de etanol, solvente ogânico residual, tal como etanol, é geralmente encontrado no produto lipossômico desidratado, e consequentemente na suspensão lipossômica reidratada derivada dele. Este é especialmente o caso para preparações lipossômicas que foram desidratadas por secagem por congelamento (liofilização). Entretanto é desejável para o produto lipossômico usado para aplicação a humanos compreender solvente tão pouco orgânico quanto possível. A presente invenção permite a desidratação por secagem por spray, que facilita a remoção da maioria ou todo o solvente orgânico residual, ao mesmo tempo em que obtendo lipossomas com uma estabilidade elevada. Consequentemente, é outro aspecto da invenção descrever preparações lipossômicas desidratadas como acima descrito que compreendem cerca de menos do que 1 % peso/peso, mais preferivelmente cerca de menos do que 0,5 % peso/peso, mais preferivelmente cerca de menos do que 0,1 % peso/peso de solvente orgânico com base no peso total da preparação desidratada. Reidratando-se estas preparações lipossômicas desidratadas, suspensões lipossômicas são obtidas, que compreendem cerca de menor do que 1 mg/mL, mais preferivelmente cerca de menos do que 0,5 mg/mL, mais preferivelmente cerca de menos do que 0,1 mg/mL de solvente orgânico. Preferivelmente o solvente orgânico é etanol.

[000160] Além disso, as suspensões lipossômicas inventivas, que são obtidas por reidratação da composição lipossômica desidratada como acima descrito, têm um perfil de distribuição de tamanho muito similar comparado às suspensões lipossômicas originais que foram desidratadas como acima descrito. Mais especialmente, o tamanho do lipossoma é bem mantido e nenhuma formação significante de agregados de lipídio como determinado a partir da avaliação de PCS é encontrada. Em uma modalidade da invenção, a suspensão lipossômica submetida à desidratação e a suspensão lipossômica obtida por reidratação como acima descrito são caracterizadas por um Zmédio que difere por um fator menor do que 1,5 e um valor PI que difere por um fator menor do que dois (a partir de avaliações de PCS). O PI da suspensão lipossômica reidratada 1 hora após reconstituição é preferivelmente menor do que 0,4, mais preferivelmente menor do que 0,3, mais preferivelmente menor do que 0,25. Preferivelmente o PI das referidas suspensões muda apenas levemente durante 24 horas a 25 °C, como acima descrito.

[000161] Em uma modalidade especial, a invenção se refere a uma suspensão lipossômica aquosa reidratada compreendendo lipossomas catiônicos compreendendo até cerca de 5 % em mole, preferivelmente até cerca de 3 % em mole de paclitaxel nas membranas lipossômicas, em que o PI da suspensão lipossômica 1 hora após reconstituição é menor do que 0,4, mais preferivelmente menor do que 0,3, mais preferivelmente menor do que 0,25 e, além disso, caracterizada por mudanças do Zmédio por um fator não maior do que cerca de 1,5, preferivelmente não maior do que 1,25, e mudanças do valor de PI por um fator não mair do que cerca de 2, preferivelmente não maior do que cerca de 1,5, mais preferivelmente não maior do que cerca de 1,25 durante 24 horas a 25 °C.

[000162] Preferivelmente os lipossomas da suspensão lipossômica reidratada descrita acima não liberam mais do que cerca de 2 % por peso, preferivelmente não mais do que cerca de 1 % por peso, paclitaxel (com base no peso total de paclitaxel) das membranas lipossômicas no meio aquoso dentro de 24 horas a 25 °C.

Legendas da Figura

[000163] Figura 1: Quantidade de paclitaxel solubilizado por preparações de lipossoma com uma concentração de lipídio de 10 mM e uma concentração total de trealose de 10 % (peso/peso). Os lipossomas foram obtidos a partir de formulações precursoras concentradas por diluição com água. A abscissa mostra a concentração inicial, isto é, os dados em 10 % de trealose foram obtidos a partir de uma suspensão que não foi diluída, e os dados em 40 % de trealose foram obtidos a partir de uma suspensão não diluída que foi originalmente de 40 % (peso/peso) em trealose, e 40 mM em lipídio, e que foi diluída 1+3 com água.

[000164] Figura 2: Taxa de contagem de 10 mM de lipossomas de DOTAP/DOPC obtidos de uma formulação concentrada de 30 mM de lipídio em 30 % (peso/peso) de trealose. A solução foi diluída com misturas de água/trealose para diferenciar concentração de trealose total entre 30 % e 10 % (peso/peso). Todas as formulações tinham a mesma concentração de lipídio final de 10 mM, porém a concentração de gradiente de trealose entre a fase aquosa encapsulada e livre foi como indicado pelo eixo x.

EXEMPLOS CARGA DE PACLITAXEL PARA LIPOSSOMAS COM GRADIENTES DE TREALOSE DIFERENTES SUMÁRIO

[000165] O efeito de gradientes osmolares sobre a divisão de paclitaxel em lipossomas em equilíbrio com uma fase aquosa saturada foi investigado. Os lipossomas com diferentes gradientes osmolares foram produzidos e incubados em cristais de paclitaxel. Todas as formulações tinham a mesma composição; mais precisamente, a concentração de lipídio e a concentração de trealose foram clipídio= 10 mM e ctrealose = 10 % (peso/peso). Algumas das formulações foram preparadas e extrusadas em concentração elevada de lipídio e trealose, e diluídas com água após extrusão para a concentração final. Deste modo, a fase aquosa livre foi diluída, porém a fase aquosa encapsulada não foi diluída (negligenciando os efeitos de dilatação e permuta de soluto através dos defeitos). Um gradiente osmolar entre a fase aquosa encapsulada e livre foi estabelecido, que aumentou com a diluição crescente. Os lipossomas desse modo formados foram incubados com paclitaxel seco e a quantidade de paclitaxel que foi solubilizada pelos lipossomas foi determinada. Um aumento monótono de paclitaxel solubilizado com a diluição crescente (gradiente de concentração) foi encontrado. Os resultados indicam que a quantidade de paclitaxel que se divide na membrana de lipossoma em equilíbrio, aumenta com o gradiente osmolar crescente. MATERIAIS Paclitaxel, Lote 06/150 Cedarburg Pharmaceuticals DOTAP, Lote MBA 113 Merck Eprova DOPC, Lote G181PC49 Água, Milli-Q -Synthesis Trealose-Diidrato, altamente puro Clorofórmio, p.a. Acetonitrila, grau de HPLC (ACN) Tetraidrofurano, grau de HPLC (THF) Acetato de amônio, p.a. Ácido trifluoroacético, p.a. Filtro de seringa minisart Avanti Polar Lipídios Millipore Senn Chemicals Merck Merck Merck Merck Merck Sartorius 0,2 μm de tamanho do poro , 25 mm de diâmetro Membrana: Acetato de Celulose HPLC System 1100 Degaseificador (G1379A) Bomba binária (G1312A) Agilent Autoamostrador com termostato (Autoinjektor G1329A, Thermostat G1330B) Compartimento de coluna com termostato (G1316A) Detector de disposição de iodo (G1315B) ou deterctor de comprimento de onda variável (G1314A) ChemStation for LC 3D, Rev. A.09.01 Extrusor, 10 mL Northern Lipídios Zetasizer 3000 Malvern Instruments

MÉTODOS Preparação de lipossomas vazios

[000166] Formulações de DOTAP/DOPC (relação de 1:1), ou formulações compreendendo apenas DOTAP ou DOPC, foram preparadas pelo método de película. As requeridas quantidades de lipídios foram pesadas em um frasco redondo e dissolvidas em clorofórmio. O solvente foi evaporado até a secura em um evaporador giratório (Heidolph, Alemanha) em uma pressão de cerca de 150 mbar em uma temperatura de cerca de 40 °C durante cerca de 15 minutos. A película foi secada a 10 mbar durante 60 minutos e subsequentemente hidratada na solução de trealose em água agitando-se suavemente o frasco. Quantidades de lipídios, concentração de trealose e volume de solução de trealose foram escolhidas para resultar em suspensões compreendendo concentrações de lipídio entre 10 mM a 40 mM e concentrações de trealose entre 9,8 % e 39,2 % (peso/volume) para formulações de DOTAP/DOPC e entre 10 mM a 30 mM de concentração de lipídio e entre 9,8 % e 29,4 % (peso/volume) de concentrações de trealose para formulações de apenas DOTAP ou DOPC. As suspensões resultantes de lipossomas multilamelares foram extrusadas cinco vezes através de uma membrana de policarbonato de um tamanho de poro de 200 nm em uma pressão de cerca de 500 KPa (5 bar). Após extrusão, as suspensões foram diluídas com água para produzir suspensões com as concentrações de lipídio de 10 mM e uma concentração total de trealose de 9,8 % (peso/volume).

Carga de Paclitaxel

[000167] 5 mL das suspensões compreendendo lipossomas vazios preparados como acima descrito foram adicionados a 2,6 mg de paclitaxel seco (correspondendo a uma concentração de paclitaxel teórica de 600 μM) em tubos Falcon de 15 mL. As bateladas foram agitadas durante 1 hora em temperatura ambiente (agitador magnético).

[000168] Após agitação, paclitaxel de ligação não lipossômica foi separado por filtragem de 2 mL de cada batelada através de um filtro de seringa (Sartorius minisart, 0.2 μm, membrana de acetato de celulose). Concentração de Paclitaxel- e lipídio nos filtrados resultantes foi subsequentemente analisada por HPLC. Métodos analíticos Determinação de teor de paclitaxel As amostras foram diluídas em ACN/THF/acetato de amônio a 2 mM 48/18/34 (volume/volume/volume). Fase estacionária: LiChroCART® 250-4; LiChrospher 60, RP-select B Comprimento de 250 mm, ID: 4 mm, tmanho de partícula 5 μm Fase móvel: ACN/THF/acetato de amônio a 2 mM 32/12/56 (volume/volume/volume) Taxa de fluxo: 1 mL/minuto Temperatura de compartimento de coluna: 35 °C Comprimento de onda detectado: 229 nm Volume injetado: 10 μl Tempo de realização: 40 min

Determinação de teor de lipídio

[000169] O teor de lipídio das bateladas antes e depois da filtragem foi analisado por HPLC para monitorar uma perda potencial de material lipossômico pelo processo de filtragem. As amostras foram diluídas em ACN/água 50/50. Fase estacionária: Phenomenex Luna 5 μ C8(2) 100 Â, 150 mm x 2 mm Fase móvel: Acetonitrila com 0,1 % de TFA, água com 0,1 % de TFA Determinação de lipídio de gradiente;

Taxa de fluxo: 0,4 mL/min Temperatura de compartimento de coluna: 45 °C Comprimento de onda detectado: 205 nm Volume injetado: 5 μl Tempo de realização: 30 min

RESULTADOS Formulações de DOTAP/DOPC

[000170] Na Figura 1 a quantidade de paclitaxel que foi solubilizada por incubação com diferentes formulações de lipossoma de DOTAP/DOPC é mostrada. Todas as formulações continham a mesma quantidaee de lipídio (lipossomas) e trealose. Elas foram obtidas a partir de diferentes formulações mais concentradas por diluição com água. Exceto da concentração absoluta, todas as formulações de origem foram equivalentes e elas foram igualmente tratadas. A abscissa fornece uma concentração inicial de trealose, antes da diluição. Porque em todos os casos, a concentração final de trealose total foi de 10 %, o gradiente de trealose aumenta com os valores crescentes da abscissa. Como pode ser observado, a quantidade de paclitaxel que foi solubilizada pelos lipossomas aumentou monotonamente com o gradiente de trealose (diluição). A capacidade de carga dos lipossomas aumentou com gradiente de trealose crescente.

Formulações de DOTAP- e DOPC

[000171] A seguinte tabela mostra a quantidade de paclitaxel solubilizada pelas formulações de lipossoma de DOTAP e DOPC (componentes simples) em dependência da concentração inicial de trealose usada para preparação: Tabela 1: Formulações de DOTAP- e DOPC

[000172] Além disso, para os lipossomas de lipídio puro, uma clara dependência da capacidade de solubilização do gradiente de trealose foi encontrada. Para formulações de DOTAP, um aumento da capacidade de carga de paclitaxel com uma diferença de concentração crescente de trealose dentro e fora do lipossoma comparável aos resultados para formulações de DOPTAP/DOPC foi observado. O efeito foi lipossomas menos pronunciados que consistem em 100 % de DOPC.

2 CARGA DE PACLITAXEL PARA LIPOSSOMAS COM GRADIENTES DE TREALOSE DIFERENTES APÓS SECAGEM POR SPRAY 2.1 SUMRIO

[000173] O objetivo deste exemplo foi testar se o efeito positivo do gradiente osmótico sobre a carga de paclitaxel para lipossomas está presente, e se os lipossomas são secados por spray entre a formação e ajuste do gradiente de trealose. Lipossomas de DOTAP/DOPC foram preparados em duas concentrações diferentes, a saber, 10 mM de lipídio em solução de trealose a 10 % (peso/peso) e 20 mM de lipídio em solução de trealose a 20 % (peso/peso). Ambas as formulações foram secadas por spray na respectiva concentração. Os pós secados por spray foram ambos reconstituídos com água para um concentração de lipídio de 10 mM e uma concentração de trealose correspondente 10 % (peso/peso). As formulações líquidas foram expostas a paclitaxel como acima descrito, e a quantidade de paclitaxel solubilizado foi determinada. Constatou-se que a formulação que foi secada por spray da formulação de estado duplo concentrado (20 mM de lipídio / 20 % (peso/peso) de trealose) solubilizou mais paclitaxel do que aquela que foi secada por spray do estado concentrado simples (10 mM de lipídio, 10 % em peso/peso de trealose).

[000174] Os resultados indicam que a distribuição de trealose dentro/fora dos lipossomas não foi afetada pela secagem por spray sob as condições selecionadas. Após a reconstituição do produto anteriormente concentrado duplo, lipossomas com um gradiente de concentração de trealose foram obtidos, correspondentemente ao efeito de diluição direta da formulação líquida.

2.2 MÉTODOS Formação de lipossoma

[000175] As formulações foram preparadas por injeção de etanol. As quantidades apropriadas de solução de lipídio em etanol (200 mM de DOTAP-Cl, 188 mM de DOPC) foram injetadas sob agitação em uma solução de trealose em água. A concentração de trealose foi de 20 % (peso/peso) para os lipossomas a 20 mM e 10 % (peso/peso) para os lipossomas a 10 mM. A quantidade requerida de solução de lipídio em etanol foi de cerca de 2,5 mL/L para a formulação a 10 mM e 5 mL para a formulação a 20 mM.

[000176] As formulações de lipossoma polidispersas resultantes foram extrusadas cinco vezes através das membranas de policarbato de tamanho de poro de 200 nm em uma pressão de cerca de 500 KPa (5 bar).

Secagem por spray

[000177] A secagem por spray foi realizada com um secador de micro spray Niro SD usando um bico de dois fluidos. Condições de vaporização foram como segue: Temperatura de saída = 100 °C, temperatura de entrada = 145 °C, taxa de alimentação = 340 g/h, taxa de gás de atomizador de 2,3 kg/h, taxa de gás de secagem de 30 kg/h.

Reconstituição

[000178] Os pós secos, ambos da anterior formulação a 10 mM e a 20 mM, foram reconstituídos com água para concentração de lipídio de 10 mM.

Ensaio de carga de Paclitaxel

[000179] A carga de paclitaxel para os lipossomas foi realizada como descrito aqui0.

2.3 RESULTADOS

[000180] Os resultados como obtido do carregamento de paclitaxel para os pós reconstituídos são mostrados na tabela 2. Como pode ser observado, a formulação que foi secada por spray em concentração de lipídio a 20 mM de lipídio solubilizou muito mais paclitaxel do que a formulação com a concentração de lipídio inicial de 10 mM. Conclui-se que a carga de paclitaxel elevada para a anterior formulação a 20 mM foi devido ao um gradiente osmolar entre a fase aquosa encapsulada e livre, que não estava presente na anterior formulação a 10 mM. A secagem por spray e reconstituição do pó seco não induziriam ao equilíbrio de trealose entre a fase aquosa interior e exterior e, portanto, a osmolaridade da fase aquosa encapsulada foi maior no caso da anterior formulação a 20 mM. Tabela 2: Solubilização de paclitaxel por formulações obtidas por reconstituição de pós secados por spray. A concentração de lipídio e trealose foi idêntica em ambos os casos (lipídio a 10 mM, 10 % em peso/peso de trealose), porém, portanto, a secagem por spray de uma formulação foi de 10 mM de lipídio, trealose a 10 % e a outra formulação foi de 20 mM de lipídio, trealose a 20 %.

3 . Estabilidade de Lipossomas Carregados 3.1 SUMÁRIO

[000181] Para avaliar a questão, se preparações de lipossoma com um gradiente de trealose interior / exterior não apenas têm uma capacidade de carga maior, porém também uma estabilidade maior com respeito à liberação de paclitaxel, a liberação de paclitaxel dos lipossomas foi traçada como uma função de tempo. Formulações com uma fração de paclitaxel relativamente elevada, a saber 5 % em mol, e com diferentes gradientes de trealose entre 0 % e 20 % (peso/peso) foram preparadas. Lipossomas compreendendo um gradiente de trealose não mostraram qualquer liberação substancial de paclitaxel dentro do período de teste de 21 dias, ao mesmo tempo em que em lipossomas sem um gradiente de trealose, a fração retida de paclitaxel diminuiu para menos do que 1 %.

3.2 MÉTODO Formulações de DOTAP/DOPC

[000182] Lipossomas de DOTAP/DOPC compreendendo cerca de 5 % em mol de paclitaxel (para valores exatos, observe a tabela), lipídios a 10 a 30 mM, e 9,8 % a 29,4 % (peso/volume) de trealose foram preparados de acordo com o método de película acima descrito adicionando-se a respectiva quantidade de lipídios e paclitaxel à solução de clorofórmio. Subsequentemente as bateladas a 30 mM foram diluídas para uma concentração de lipídio de 10 mM (concentração de trealose total de 9,8 % em peso/volume) com água.

[000183] As amostras foram armazenadas a 4 °C e o teor de paclitaxel dos lipossomas foi determinado após 0, 1, 5, 14, e 21 dias pelo método acima descrito usando filtragem e análise de HPLC.

3.3 RESULTADOS

[000184] Os resultados são sumariados na tabela 3. A concentração de paclitaxel (μm) retida nos lipossomas é mostrada. A concentração de lipídio foi de 10 mM, portanto, a concentração de paclitaxel de 100 μM corresponde a uma concentração molar com respeito ao lipídio de 1 %.

[000185] Na formulação sem gradiente de trealose, a fração de trealose retida monotonamente decaiu para um valor menor do que 100 μM (menor do que 1 % em mol com respeito ao lipídio) após 21 dias. Ao contrário, com gradiente de trealose o paclitaxel retido não caiu abaixo de 400 μM. Nenhum declínio monótono foi observado naquele caso, em outras palavras, parece que o valor de cerca de 400 μM representa um estado fisicamente estável de paclitaxel nos lipossomas. Tabela 3: Retenção de paclitaxel em lipossomas de DOTAP/DOPC.

[000186] As frações finais de paclitaxel retido são similares aos valores quando obtidas a partir do ensaio de carga para lipossomas equivalentemente tratados. Portanto, os dados do ensaio de carga podem ser considerados como preditivo para o limite de estabilidade de lipossomas carregados. Se nenhum outro efeito ocorrer, os números do ensaio de carga fornecerão informação acerca da quantidade de paclitaxel que é retida pelos lipossomas sob as condições fornecidas. Como uma outra conclusão dos presentes exemplos, parece que o gradiente de trealose, e a estabilidade melhorada, é totalmente mantido durante diversos dias. No presente caso, o efeito foi mantido durante 21 dias.

4 MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DE GRADIENTES DE TREALOSE EM PREPARAÇÕES DE LIPOSSOMA IN SITU 4.1 SUMÁRIO

[000187] Formulações de lipossoma concentradas em trealose em uma concentração c1 foram preparadas e diluídas com água ou com solução de trealose em diferentes relações para obter meios com concentração de trealose C2, onde C2 < ci. Todas as formulações tinham a mesma concentração de lipídio final de 10 mM. As formulações foram analisadas com base nas mudanças locais de propriedade óticas (índice refrativo). Taxas de contagem de avaliações de dispersão de luz dinâmica foram usadas para demonstrar as mudanças de intensidade de dispersão. Com gradiente de trealose crescente, ci-c2, a taxa de contagem de avaliações de dispersão de luz dinâmica (PCS) monotonamente aumentou.

4.2 MÉToDo

[000188] Dispersão de luz dinâmica foi avaliada com um goniômetro BI-200SM de Brookhaven Instruments (Holtsville USA). As avaliações foram realizadas com um laser de 30 mW de um comprimento de onda de 64i nm em um ângulo de 90°. Para análise de dados, transformação Laplace inversa com técnicas de regulação otimizadas foi realizada.

4.3 AMoSTRAS

[000189] Lipossomas de DOTAP/DOPC (relação molar de 1:1) com uma concentração de lipídio total de 30 mM foram preparados em uma solução de 30 % de trealose. A preparação de lipossoma de lipídio a 30 mM em trealose a 30 % foi extrusada através de 200 membranas de extrusão. Subsequentemente, os lipossomas foram diluídos com água, solução de 30 % de trealose ou misturas dos mesmos em relações como indicado na tabela. A: 30 mM de lipossomas em 30 % de trealose B: 30 % de trealose em água C: água Tabela 4: Protocolo de diluição para formulações de lipídio a 10 mM em uma fase aquosa com trealose em concentrações entre 10 % e 30 % (peso/peso)

[000190] A concentração de lipídio na preparação final foi sempre de 10 mM, porém a concentração de trealose total variou entre 10 % (diluição com água) e 30 % (diluição com solução de trealose a 30 %). Com a concentração de trealose inicial de 30 %, isto resultou em um gradiente de concentração de trealose numérico entre 0 % (concentração total = 30 % ) e 20 % (concentração total =10 % ). Uma hora após diluição, avaliação de dispersão de luz dinâmica foi realizada.

4.4 RESULTADOS

[000191] A Figura 2 mostra resultados das avaliações de dispersão de luz dinâmica. A taxa de contagem é fornecida como uma função de gradiente de trealose. A taxa de contagem monotonamente aumentou com gradiente de trealose crescente. Isto pode estar correlacionado com o aumento do gradiente de índice refrativo e efeitos de dilatação sobre o gradiente de trealose crescente. Sabe-se bem que, os lipossomas podem agir como osmômetros ideais, e gradientes osmolares podem ser determinados de propriedades de dispersão de luz e absorção de luz sob condições adequadas (de Gier 1993; Cabral, Hennies e outro, 2003). Além da intensidade da dispersão de luz quase elástica, também outras técnicas de dispersão de luz, bem como avaliações de absorção ou turbidimetria podem ser usadas. As presentes indicações indicam que análise da taxa de contagem em avaliações de dispersão de luz dinâmica podem ser usadas como uma ferramenta para controlar o sucesso da formação de gradiente de trealose para uma determinada formulação. Além disso, os dados confirmam que a mudança da osmolaridade do meio aquoso de uma suspensão lipossômica produz as propriedades físicas dos lipossomas.

5 . Influência de um Gradiente de Trealose sobre a Estabilidade Física de Formulações de Lipossoma Líquidas de DOTAP/DOPC de paclitaxel 5.1 SUMÁRIO

[000192] Neste exemplo o efeito estabilizante de gradientes de trealose sobre as formulações de lipossoma de DOTAP/DOPC de paclitaxel como mostrado pelo exemplo 3 foi também investigado. Lipossomas foram preparados em uma concentração de 30 mM (em 32 % em peso/peso de solução de trealose), diluídos com diferentes soluções de trealose/água, e liberação de paclitaxel após tensão mecânica foi determinada.

[000193] Constatou-se que a estabilidade física aumentou com gradiente de trealose crescente. As constatações confirmaram o efeito estabilizante de gradientes de trealose sobre paclitaxel compreendendo lipossomas também para processamento em escala piloto.

5.2 MÉTODOS E MATERIAIS Fabricação de lipossoma

[000194] Os lipossomas foram produzidos pela técnica de injeção de etanol. Resumidamente, uma solução de DOTAP a 200 mM e DOPC a 188 mM (concentração total de lipídio 388 mM) foi injetada sob agitação em uma temperatura de 2-8 °C na fase aquosa (8,11 mL de solução de lipídio em etanol para 100 mL de fase aquosa) para produzir lipossomas polidispersos com uma concentração de lipídio de cerca de 30 mM. Para a fase aquosa uma solução de 32,1 % peso/peso de diidrato de trealose com 184,5 μM de ácido cítrico foi selecionada.

[000195] A extrusão foi realizada como indicado em uma pressão de 300 KPa (3 bar) com membranas de policarbonato de 220 nm de tamanho de poro. A filtragem estéril foi realizada como indicado usando filtros estéreis milipak 20 ou membranas durapore (Millipore, Molsheim, França).

Gradientes de Concentração gradients

[000196] As formulações de lipossoma a 30 mM iniciais em solução de trealose a 30 % (peso/peso) (PD-L-09111) foram diluídas com água para diferenciar as concentrações finais de lipídio e trealose. Tabela 5: Diluição de amostras testadas

Teste de Estabilidade

[000197] As amostras foram colocadas em um agitador e agitadas a 150 rpm a 25 °C ou a 2 a 8 °C, respectivamente. Após 24 e 48 horas as amostras foram analisadas e a quantidade de paclitaxel retida nos lipossomas foi determinada.

Determinação de retenção de paclitaxeL/Liberação nas preparações de lipossomas

[000198] A retenção de paclitaxel em lipossomas foi investigada por filtragem das preparações de lipossoma a fim de remover cristais de paclitaxel do produto de lipossoma (como descrito no exemplo 3). O paclitaxel restante foi quantificado por análise de HPLC. Adicionalmente, microscopia ótica foi usada para investigar as amostras quanto aos cristais de paclitaxel.

5.3 RESULTADOS

[000199] Os resultados são fornecidos nas tabelas 6 a 12. Para simplicidade, a concentração inicial de trealose é próxima a 30 % (peso/peso). Os gradientes de concentração como descrito são calculados a parir da concentração inicial de trealose e o fator de diluição. Os gradientes de concentração reais entre a fase aquosa encapsulada e livre terão a mesma tendência, porém os valores absolutos podem se diferenciar levemente daqueles fornecidos nas tabelas.

[000200] Como pode ser observado, a estabilidade aumenta com gradiente de trealose crescente. A quantidade de paclitaxel lipossomicamente retido aumenta e menos cristais de paclitaxel são observados. A estabilidade é maior a 5 °C em comparação a 25 °C. Tabela 6: Estabilidade a 0 % de gradiente de trealose

Tabela 7: Estabilidade a 5 % de gradiente de trealose

Tabela 8: Estabilidade a 8,6 % de gradiente de trealose

Tabela 9: Estabilidade a 11,2 % de gradiente de trealose

Tabela 10: Estabilidade a 13,3 % de gradiente de trealose

Tabela 11: Estabilidade a 13,3 % de gradiente de trealose

Tabela 12: Estabilidade a 15 % de gradiente de trealose

6 ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS CARREGADOS COM PACLITAXEL SECADOS POR SPRAY 6.1 MÉTODOS E MATERIAIS Materiais foram usados como descrito nos exemplos anteriores.

[000201] Lipossomas que consistem em DOTAP, DOPC e paclitaxel (relação molar 50/47/3) foram formados pelas técnicas de injeção de etanol como acima descrito. O paclitaxel foi solubilizado com os lipídios na solução de etanol. Lipossomas em uma concentração de 20 mM de lipídio em 20 % em peso/peso de trealose (batelada PD-L- 09031) e 10 mM de lipídio em 10 % de trealose (bateladas MDG09.108-08-001 e PD-L-09032) foram preparados. Os lipossomas foram extrusados cinco vezes através de membranas de policarbonato de 200 nm tamanho do poro e friltrados estéreis como acima descrito.

[000202] Após preparação das suspensões lipossômicas, os lipossomas foram desidratados. As bateladas PD-L-09031 e PD-L- 09031 foram secadas por spray em um secador por spray Niro SD- Micro com parâmetros de secagem por spray como descrito no exemplo 2.

[000203] A batelada MDG09.108-08-001 foi desidratada por secagem por congelamento, usando uma unidade de secagem por congelamento Epsilon 2-12D (Christ). A suspensão lipossômica foi mantida a 4 °C durante 1 hora e congelada a -40 °C durante cerca de 5 horas. Após congelamento, a temperatura aumentou para -16 °C e secagem primária foi realizada em uma pressão de 10 KPa (0,1 bar) durante 90 horas. Para secagem, a temperatura aumentou para 20 °C, ao mesmo tempo em que a pressão foi reduzida para 1KPa (0,01 bar).

[000204] Os pós secos foram reconstituídos com água para uma concentração de lipídio de 10 mM em 10,5 % (peso/peso) de trealose. Os produtos de lipossoma líquido resultantes foram investigados uma hora após reconstituição e 24 horas após a reconstituição com avaliações de dispersão de luz dinâmica usando um Malvern Zetasizer 1000HSA, Series DTS5101 (Parâmetros: Análise = mono modal, Dilatação = 1.2; Ordem de Ajuste = 3; Primeira seleção de ponto = 18; Última seleção de ponto = Por número 22; Pesagem de ponto = quátrico; Atenuador = x16; Viscosidade 1.200 cp; Índice refrativo = 1,348; Número de Avaliações = 3; Retardo entre as Avaliações = 0; Duração de avaliação = Auto) para determinar Zmédio e PI. Antes da avaliação, as amostras foram diluídas dez vezes com solução de diidrato de trealose a 10,5 % (peso/peso).

6.2 RESULTADOS Os resultados são mostrados na tabela 13.

[000205] As constatações para a formulação que foi secada por spray na mesma concentração de lipídio e trealose no produto reidratado foram substancialmente diferentes dos resultados para o produto que foi alimentação líquida duplamente concentrada vaporizada e um gradiente de trealose foi gerado na reidratação. A formulação sem gradiente de concentração exibiu valores de Zmédio e PI significantemente maiores e aumentou dentro de 24 horas após reconstitução, ao mesmo tempo em que a formulação com gradiente de concentração não mostrou tal aumento. O aumento em Zmédio e PI é considerado estar relacionado à liberação de paclitaxel da formulação sem gradiente de concentração, que foi lmenos estável. Os dados estão de acordo com os resultados de exemplo 2, onde mais paclitaxel poderia ser carregado em lipossomas que foram obtidos após secagem por spray em concentração dupla e subsequente geração de um gradiente de trealose. Secagem por spray das formulações de lipossoma de paclitaxel em concentrações elevadas de trealose e subsequente geração de um gradiente de trealose imelhora a estabilidade da formulação após reconstituição.

[000206] Em comparação às amostras secadas por spray, a formulação secada por congelamento mostrou um PI muito maior já após reconstitução. Tabela 13: Comparição de métodos de desidratação e reidratação

7 SECAGEM POR SPRAY E FABRICAÇÃO EM GRANDE ESCALA LARGE 7.1 MATERIAL 7.1.1 MATERIAIS BÁSICOS

• USP Semi-Synthetic Paclitaxel API, Phyton Biotech, Lot CP209N0014 • DOTAP-CI, Merck Eprova AG, Lote MBA-020 • DOPC, Avanti Polar Lipids Inc., Lote GN181PC-12 • Desidrato de α,α-Trealose de Pureza Elevada (Baixa Endotoxina), Ferro Pfanstiehl, Lote 33205A • Etanol absoluto EP, Nova Laboratories Art.-Nr. A4478B • Monoidrato de ácido cítrico EP/USP, Nova Laboratories Art.-Nr. V290 • Água para injeção, Nova Laboratories Art.-Nr. A15210C 7.1.2 EQUIPAMENTo • Injeção capilar ID: 2 mm • Cartucho de Filtro Memtrex PC 0,2 pm de GE, Artigo n° MPC92O5FHV, Lote 60240937 • Filtro estéril Opticap XL4 com 0,22 pm de membrana Durapore de Millipore, Artigo n° KVGLAO4TT3 Lote: COCA1 0972 • Vaso de Formulação (Nova Laboratories Ltd.) • Vaso de Extrusão (Nova Laboratories Ltd.) • Vaso de redução Bioburden (Nova Laboratories Ltd.) • Vaso de retenção (Nova Laboratories Ltd.) • Bomba Peristáltica (Nova Laboratories Ltd.) • Vaso de pressão de 20 L com fontanários (Nova Laboratories Ltd.) • Abertura borboleta (Nova Laboratories Ltd.) • Secadora por spray asséptico ASD-1 (GEA Niro S/A, Copemhagen, Dinamarca)

7.2 MÉTODOS 7.2.1 PRODUÇÃO DE FORMULAÇÃO LÍQUIDA 7.2.1.1 PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO ORGÂNICA

[000207] Para batelada 001, 349,3 g de DOTAP-CL foram dissolvidos em 700 g de etanol absoluto e agitados durante aproximadamente 4 horas. 369,5 g de DOPC foram dissolvidos em 700 g de etanol absoluto e agitados durante aproximadamente 3 horas. Subsequentemente as duas soluções de lipídio foram combinadas e adicionadas a 25,617 g de paclitaxel. A solução ogânica resultante foi agitada durante cerca de 2 horas e finalmente ajustada para um peso total de 2122,5 g pela adição de etanol absoluto. As bateladas 002 a 004 foram consequentemente preparadas.

7.2.1.2 PREPARAÇÃO DE SOLUÇÃO AQUOSA

[000208] Para a batelada 001, 10819 g de desidrato de trealose foram adicionados a cerca de 20 kg de água para injeção em um vaso de formulação e agitados a 700 rpm durante 90 minutos. Subsequentemente 1,258 g de monoidrato de ácido cítrico foram adicionados e agitados até a dissolução completada. O volume final da solução aquosa foi ajustado para 34,53 kg e agitado durante mais 10 minutos. As bateladas 002 a 004 foram preparadas consequentemente.

7.2.1.3 INJEÇÃO DE ETANOL

[000209] Para a batelada 001, a solução orgânica foi injetada na solução aquosa por meio de uma bomba peristáltica com uma taxa de injeção de cerca de 250 g/minuto. Durante injeção, a solução foi agitada a cerca de 500 rpm. Após a injeção ser finalizada, a solução foi agitada durante 2 minutos a 600 rpm e subsequentemente durante 1 minuto a 700 rpm. Durante o processo de injeção completo, a temperatura foi mantida abaixo de 8 °C. As bateladas 002 a 004 foram agitadas a 550 rpm durante injeção sem nenhuma agitação adicional depois disso.

7.2.1.4 EXTRUSÃO

[000210] 8 extrusões sobre um cartucho de filtro 5" com uma membrana de policarbonato de 0,2 pm foram realizadas. O cartucho de filtro foi ventilado com 40 a 50 KPa (0,4 a 0,5 bar) cada, e a extrusão foi realizada com uma pressão de 300 KPa (3,0 bar). A temperatura foi mantida abaixo de 8 °C.

7.2.1.5 DILUIÇÃO

[000211] Após a 8a extrusão o peso da formulação foi determinado. Com base na densidade da formulação de 1,106 g/mL, a quantidade de água foi calculada que foi requerida para obter uma formulação a 20 mM (com base na concentração total de lipídio), que corresponde a uma diluição de 1:1.5. Para a batelada 001, a quantidade requerida de água para injeção foi adicionada a 1,66 L/minuto por meio de uma bomba peristáltica através de um ID capilar de 2 mm I, ao mesmo tempo em que a solução foi agitada a cerca de 500 rpm. A água adicionada para injeção foi resfriada para abaixo de 8 °C antes da adição à formulação. Para as bateladas 002 a 004, a diluição foi realizada a 0,62 L/minuto a 0,83 L/minuto em uma velocidade de agitação de cerca de 600 rpm.

7.2.1.6 REDUÇÃO DE BIOCARGA

[000212] Antes da redução de biocarga (1a filtragem estéril), o filtro OpticapXL4 foi lavado com 20 L de água para injeção em uma pressão de cerca de 50 KPa (0,5 bar). A carga e ventilação do filtro foram realizadas gravimetricamente. A filtragem foi realizada em uma pressão de 250 KPa (2,5 bar), pela qual a pressão foi aplicada prontamente aplicada. A temperatura da formulação foi mantida abaixo de 8 °C.

7.2.1.7 FILTRAGEM ESTÉRIL

[000213] Antes da filtragem estéril, o filtro OpticapXL4 foi lavado com 20 L de água para injeção em uma pressão de cerca de 50 KPa (0,5 bar). Ventilação do filtro foi realizada a 50 KPa (0,5 bar). A filtragem foi realizada em uma pressão de 250 KPa (2,5 bar), pela qual a pressão foi prontamente aplicada. A temperatura da formulação foi mantida abaixo de 8 °C.

7.2.2 SECAGEM POR SPRAY

[000214] A formulação lipossômica foi secada por spray em uma secadora por spray asséptica ASD-1 (GEA Niro S/A, Copenhagen, Dinamarca). Batelada 001 foi decada como batelada simples (Ciclo 1), visto que as bateladas 002 a 004 foram pulverizadas sequencialmente em um modelo contínuo (Ciclo 2). Para secagem por spray um bico de dois fluidos, nitrogênio como gás de secagem, e os seguintes parâmetros foram usados: Tabela 14: Parâmetros de secagem por spray

7.3. ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS 7.3.1. MÉTODO

[000215] Composições lipossômicas desidratadas de Ciclo 1 foram reidratadas em água para injeção para uma concentração de lipídio total de 10 mM, desse modo, as condições de reconstituição também aumentam o gradiente osmolar da preparação que foi de 20 mM antes da desidratação. Para comparação, composição lipossômica correspondente (Batelada de referência) que foi preparada sem diluição e foi desidratada por liofilização (como, por exemplo, descrito no WO 2004/002468). A quantidade de paclitaxel (incluindo produtos de degradação de paclitaxel) retida nos lipossomas foi determinada de acordo com o método descrito no exemplo 1,3 após a reconstituição dos lipossomas e após 24 horas a 25° C. A porcentagem de paclitaxel retida e paclitaxel filterável (cristalizado) foi calculada com base no total paclitaxel presente nas preparações. 7.3.2. RESULTADOS Tabela 15: Liberação de paclitaxel de produtos

[000216] Os dados mostram que as preparações lipossômicas na ausência de um gradiente osmolar liberam o paclitaxel mais rápido. Isto pode ser observado logo após um intervalo de tempo relativamente curto de 24 horas.

7.4. ANÁLISE DE TAMANHO DE PARTÍCULA E POLIDISPERSIDADE 7.4.1. MÉTODOS

[000217] Tamanho de partícula (Zmédio) e índice de polidispersidade (PI) foram determinados por PCS (difração a 173°) usando um Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Em resumo, a amostra de Ciclo 1 (correspondendo à Batelada 1) e Ciclo 2 (correspondendo aos ciclos 2 a 4) e a amostra da Batelada de referência (veja acima) foram ressuspensos em água em uma concentração de lipídio total de 10 mM. Para avaliação, as amostras foram diluídas dez vezes com solução de desidrato de trealose a 10,5 % (peso/peso). As amostras foram armazenadas durante 24 horas e 25 °C e avaliadas novamente.

[000218] Os seguintes parâmetros foram usados para avaliação e análise de dados: Tipo de avaliação = tamanho; Amostra: Material = Látex de Polistireno, RI: 1.590; Absorção: 0.01; Dispersante = 10,5 % de trealose, Temperatura: 25 °C, Viscosidade 1,200 cP Rl: 1,342; Opções gerais = Parâmetros de Mark-Houwink; Temperatura = 25 °C, Tempo de equilíbrio: 5 minutos; Célula = DTS0012 - Cubeta de medição descartável; Avaliação: Número de ciclos = 15; duração de ciclo (segundos) = 100; Número de avaliações = 3; Retardo entre as avaliações; Avanço = Posição fixada na posição Position 4.65, Atenuante 6; Parâmetros de análise: Modo de análise = Geral; Análise cumulante: Ordem de ajuste = 3; Esquema de pesagem = Quadrático; seleção de pontos cumulantes: Primeiro ponto automático = Sim; Método de seleção do último ponto = Corte; Fração de sinal = 0,1; Dilatação = 1.2; faixa de exibição: Limite inferior = 0,6; Limite superior = 10000; Filtragem: Fator de filtro = 75; análise Multimodal: Transformação do resultado = Mie; Transformação do resultado de uso = Sim; Esquema de pesagem = Quadrático; Resolução = normal; Multimodal - seleção de pontos; primeiro ponto automático = Sim; Método de seleção de último ponto = Fração de corte de sinal = 0,01; Dilatação = 1,2; Classe de tamanho: Número de classes de tamanho = 70; Limite inferior = 0,4; Limite Superior = 10000; Limiares: Limiar Inferior = 0,05; Limite superior = 0,01; Fator de filtro = default. 7.4.2. RESULTADOS Os resultados são mostrados na tabela 16:

[000219] As formulações fabricadas com um gradienl e osmótico e desidratadas por secagem por spray (Ciclos 1 & 2) exibiram um Zmédio muito similar, porém valores significantemente de PI menores em comparação à amostra de referência fabricada sem um gradiente osmótico e desidratadas por liofilização. Desse modo, o produto produzido pelo processo descrito acima é mais homogêneo do que um produto produzido por um processo convencional.

7.5. CARACTERIZAÇÃO DE ULTRACENTRIFUGAÇÃO 7.5.1. MÉTODO

[000220] Análise de ultracentrifugação foi realizada por Nanolytics (Potsdam, Alemanha).

[000221] Cada amostra foi reconstituída em H2O e uma mistura de 1:1 de H2O: D2O para uma concentração de lipídio de 10 mM e equilibrada durante uma hora em temperatura ambiente. Subsequentemente as amostras foram diluídas 1:1 com o respectivo solvente. Após mais uma hora de equilíbrio, as amostras foram submetidas à ultracentrifugação. 400 μl da dispersão lipossômica respectiva foram submetidas a uma cubeta de ultracentrifugação de titânio com uma trilha ótica de 12 mm. As amostras foram centrifugadas em uma centrífuga analítica Optima XL-I (Beckmann- Coulter, Palo Alto) usando um rotor de 8 lugares An50Ti (Beckmann- Coulter, Palo Alto) equipado com óticos de interferência Rayleigh a 20000 rpm e 25 °C. Durante a centrifugação, um perfil de concentração ao longo da coordenada radial foi por meio do gradiente de refratividade dentro da solução. As amostras foram avaliadas como duplicatas.

7.5.2. ANÁLISE DE DADOS 7.5.2.1 DEFINIÇÃO DO COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO

[000222] O indicador primário na ultracentrifugação analítica é o coeficiente de sedimentação definido como segue:

[000223] Em que u é a velocidade de sedimentação da partícula, m a massa da partícula, : é o volume específico, é é o termo de fricção e é é a densidade do solvente.

[000224] Determinação do coeficiente de sedimentação

[000225] O coeficiente de sedimentação é calculado diretamente a partir dos dados avaliados sem outras suposições de acordo com:

[000226] Em que r é a distância para o eixo de rotação, e é o menisco. O tempo de ciclo integral / é determinado pelo equipamento de avaliação.

7.5.2.3 DITRIBUIÇÃO DE COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO

[000227] Em vez de um coeficiente de sedimentação simples em um raio específico, o eixo r inteiro pode ser transformado em um eixo s. a mudança de franja na respectiva posição é proporcional à concentração de massa das espécies de partícula presentes ali, de modo que amplitude das avaliações possa ser considerada como coordenada y. Entretanto é requerido corrigir a coordenada y com respeito à diluição radial. Incluindose o termo de correção a seguinte função g(s) é obtida, fornecendo a concentração de massa da sedimentação de espécies de partícula com velocidade s:

[000228] A concentração c, respectivamente c0 é fornecida em a mudança de franja das unidades, em que a franja iguala-se a uma fase total, desse modo, uma linha clara e uma escura do padrão de interferência. O tamanho é diretamente proporcional à concentração fornecida em g/L no caso o incremento de índice refrativo pode ser assumido ser igual para todas as espécies de partícula, que é o caso para as amostras presentes que são materiais uniformes químicos que estão simplesmente presentes na distribuição polidispersa:

[000229] Em que Φ é a concentração em fringe shift units, X é o d». comprimento de onda do laser, l o diâmetreo da cubeta, e i< é o incremento de índice refratário do soluto em um determinado solvente. Devido a esta porporcionalidade a concentração na equação (3) pode ser estabelecida diretamente como concentração de massa.

[000230] 1 ' (ou sua forma integrada pode, a princípio, ser calculada por transformação de coordenada de varredura e cálculo da cooredenada y de acordo com a equação (3); o resultado total pode ser obtido calculando-se a média das principais varreduras, que são principalmente redundantes. Desse modo, é razoável realizar um ajuste de dados globais em todas as varreduras. Desse modo, o ruído independente de tempo e espaço é isolado e outra intereferência estatística é dividida para obter a melhor, é obtido a partir dos dados de avaliação completos. O software SedFit v12.4. de Peter Schuck foi usado para o ajuste.

7.5.2.4 INTERPRETAÇÃO DE DISTRIBUIÇÃO DE COEFICIENTE DE SEDIMENTAÇÃO

[000231] A distribuição de coeficiente de sedimentação na forma da função já fornece informação sobre a forma de distribuição; geralmente é desejável para transformar o parâmetro de avaliação primário s no diâmetro ou massa da partícula. O coeficiente de sedimentação é relacionado com a massa molar pela equação SVEDBERG

[000232] Por meio do coeficiente de difusão. Para objetos globulares, como para os presentes lipossomas, o coeficiente de disfusão pode ser substituído pelo diâmetro de uma esfera, pela qual deve ser considerado, que o lipossoma é carregado com água, que não contribui para a sedimentação, porém para a fricção.

[000233] Se o coeficiente de difusão na equação n 5 é substituído pela equação de STOKES-EINSTEIN

considerar o diâmetro d=2Rh por uma esfera e uma fração de volume de água Φ; a equação SVEDBERG torna-se

em que é a viscosidade do solvente e é a densidade do soluto.

[000234] Para a conversão da distribuição de coeficiente de sedimentação. Desse modo, a densidade é determinada experimentalmente.

7.5.2.5 ANÁLISE DE UMA VARIAÇÃO DE DENSIDADE

[000235] A densidade de partículas de sedimentação pode ser determinada por ultracentrifugação analítica em dois solventes com densidade divergente. Nos solventes tendo uma densidade inferior, uma partícula normalmente exibe um valor s- menor- os sedimentos de partícula diminuem, se uma diferença de densidade para o solvente circundante diminui. Ambos os valores s-, que descrevem a mesma partícula, realizam a equação (7) com os parâmetros para o respectivo solvente. Para os dois solventes (índice 1 e 2) o seguinte aplica-se:

[000236] A densidade anidrosa da & e o parâmetro de dilatação Φ em ambos os lados da equação são idênticos, visto que eles se referem ao mesmo objeto. Partículas idênticas são desinidas como elementos da distribuição de coeficiente de sedimentação com coordenada y idêntica ?'.

[000237] Desse modo, a equação (8) pode ser recombinada e simplificada para obter a densidade anidrosa:

[000238] O diâmetro pode ser derivado de acordo com a seguinte equação:

[000239] Para resolver a equação (10), informação independente tal como o diâmetro das partículas é requerida, que pode ser determinada experimentalmente por experimentos de dispersão de luz dinâmica como acima descrito. 7.5.3. RESULTADOS Tabela 17: Densidade anidrosa de preparação lipossômica

Referências Antonietti, M. and S. Forster (2003). "Vesicles and liposomes: A self-assembly principle beyond lipids." Advanced Materials 15(16): 1323-1333. Bangham A. D., Standish M. M., Watkins, J.C. (1965). "Diffusion of univalent ions através de the lamellae of swollen fosfolipídios", J. Mol. Biol. 13: 238-52. Cabral, E. C. e outro, (2003). "Preparation and characterization of diacetylene polimerized liposomes for detection of autoantibodies." J Liposome Res 13(3-4): 199-211. De Gier, J. (1993). "Osmotic behaviour and permeability properties of liposomes." Chem Phys Lipídios 64(1-3): 187-196. Ertel, A., A. G. Marangoni, e outro, (1993). "Mechanical properties of vesicles. I. Coordinated analysis of osmotic swelling and lysis." Biophysical Journal 64(2): 426-434. Evans, D.F. and Wennerstrom H. (1994). "The Colloidal Domain", VHC Publishers, Inc., Nova Iorque, páginas 48 a 49. Goormaghtigh, E. and G. A. Scarborough (1986). "Density-based separation of liposomes by glicerol gradient centrifugation." Anal Biochem 159(1): 122-31. Gregoriadis G. (1995). "Engineering lipossomas for drug delivery: Progress and problems". Trends em biotechnology 13 (12): 527-537. Hallett, F. R., J. Marsh, e outro, (1993). "Mechanical properties of vesicles. II. A model for osmotic swelling and lysis." Biophysical Journal 64(2): 435-442. Huang, C.H., Charlton, J.P. (1971) "Determinação de partial specific volumes by sedimentation velocity method", The Journal of Biological Chemistry, 246(8): 2555-2560. Koppel, D. E. (1972). "Analysis of macromolecular polidispersity in intensity correlation spectroscopy: the method of cumulants." Journal of Chemical Physics 57(11): 4814-4820. New e outro, (1990). Liposomes. A Practical Approach. Oxford University Press. Páginas 33-104).

Claims

1. Processo para fabricação de uma preparação lipossômica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma primeira preparação lipossômica compreendendo uma suspensão de lipossomas em uma fase aquosa, sendo que os lipossomas compreendem uma membrana, sendo que a membrana engloba um volume lipossomicamente encapsulado da fase aquosa, e a fase aquosa compreende uma substância osmoticamente ativa e apresenta uma osmolaridade total inicial, O1, sendo que a primeira preparação lipossômica compreende um agente ativo na membrana lipossômica; (b) depois disso, gerar um gradiente osmolar na fase aquosa da referida preparação sendo que a osmolaridade da fase aquosa fora do volume lipossomicamente encapsulado, Ofora, é inferior à osmolaridade da fase aquosa dentro do volume lipossomicamente encapsulado, Odentro, para produzir uma segunda preparação lipossômica, e sendo que o agente ativo é incorporado na membrana lipossômica da segunda preparação lipossômica; (c) opcionalmente, desidratar a segunda preparação lipossômica para obter uma preparação desidratada; e (d) opcionalmente, reidratar a preparação desidratada; sendo que o referido agente ativo apresenta um log P superior a 1; sendo que o referido agente ativo é paclitaxel; sendo que a substância osmoticamente ativa da etapa (a) é selecionada de trealose; e sendo que os lipossomas compreendem lipídios catiônicos e neutros, sendo que os lipídios catiônicos são selecionados a partir de trimetilamônio metilsulfato de lipídios, de preferência, de DOTAP, e sendo que os lipídios neutros são selecionados a partir de fosfolipídios, de preferência, de DOPC.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada reduzindo-se a osmolaridade total inicial, O1, da fase aquosa da preparação lipossômica na etapa (a) para produzir uma preparação lipossômica estressada com uma osmolaridade total, O2, que é inferior a a osmolaridade O1.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada diluindo-se a preparação lipossômica na etapa (a) com um meio aquoso apresentando uma osmolaridade, que é inferior a O1.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada por: (b1) desidratação da preparação lipossômica na etapa (a) para obter uma preparação lipossômica desidratada; e (b2) reidratação da referida preparação lipossômica desidratada sob condições para produzir uma preparação lipossômica estressada, preferivelmente em um meio aquoso; e sendo que, opcionalmente, o volume de meio aquoso usado para reidratação é superior ao volume de preparação lipossômica, que foi desidratado para obter a respectiva quantidade de composição lipossômica desidratada.

5. Processo para fabricação de uma preparação lipossômica compreendendo um agente ativo lipofílico, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) fornecer uma preparação lipossômica estressada; (ii) incubar a referida preparação lipossômica estressada com um agente ativo lipofílico, opcionalmente em uma forma não solubilizada, desse modo obtendo uma preparação lipossômica estressada com um agente ativo lipofílico incorporado na membrana lipossômica; e (iii) opcionalmente, separar o composto não solubilizado da preparação lipossômica, preferivelmente por filtragem ou centrifugação; sendo que a etapa (i) é realizada fornecendo uma preparação lipossômica; sendo que a substância osmoticamente ativa é compreendida na fase aquosa da preparação; sendo que a fase aquosa apresenta uma osmolaridade maior está presente dentro do volume lipossomicamente encapsulado do que fora do volume lipossomicamente encapsulado; sendo que o referido agente ativo apresenta um log P superior a 1; sendo que o referido agente ativo é paclitaxel; e sendo que a substância osmoticamente ativa é selecionada de trealose.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a substância osmoticamente ativa está presente dentro e fora dos lipossomas, e que o sacarídeo é selecionado dentre mono-, di-, oligo- ou polissacarídeos, ou é trealose.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o agente ativo está substancialmente presente exclusivamente em um compartimento de membrana dos lipossomas.

8. Processo de acordo com acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que O2 é 10 mOsm inferior a O1, ou O2 é 50 mOsm inferior a O1, ou O2 é 100 mOsm inferior a O1.

9. Preparação lipossômica, caracterizada pelo fato de que: é obtida ou obtenível pelo processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8; ou compreende uma suspensão de lipossomas em uma fase aquosa, sendo que os lipossomas compreendem uma membrana, sendo que um agente ativo está presente nas membranas lipossômicas e uma substância osmoticamente ativa está presente na fase aquosa, sendo que a membrana lipossômica está sob esforço de tensão, sendo que a osmolaridade da fase aquosa dentro dos lipossomas, Odentro, é superior a da osmolaridade da fase aquosa fora dos lipossomas, Ofora, sendo que o referido agente ativo apresenta um log P superior a 1; sendo que o referido agente ativo é paclitaxel; sendo que os lipossomas compreendem até 5% molar de paclitaxel; e sendo que a substância osmoticamente ativa é selecionado de trealose; ou compreende uma suspensão de lipossomas em uma solução aquosa obtida por reidratação de uma preparação lipossômica desidratada, definida por um diâmetro médio (Zmédio), que se difere por um fator inferior a 1,5, e um índice de polidispersidade (PI), que se difere por um fator inferior a dois da preparação lipossômica submetida à desidratação para obter a referida preparação lipossômica desidratada; sendo que a osmolaridade da fase aquosa dentro dos lipossomas, Odentro, é superior a da osmolaridade da fase aquosa fora dos lipossomas, Ofora; sendo que o referido agente ativo apresenta um log P superior a 1; sendo que o referido agente ativo é paclitaxel; sendo que os lipossomas compreendem até 5% molar de paclitaxel; sendo que a substância osmoticamente ativa está presente dentro e fora dos lipossomas; e sendo que a substância osmoticamente ativa é selecionada de trealose.

10. Preparação lipossômica, caracterizada pelo fato de obtida ou obtenível pelo processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e que compreende uma suspensão de lipossomas em uma fase aquosa obtida por reidratação de uma preparação lipossômica desidratada, definida por mudanças do diâmetro médio (Zmédio) por um fator não superior a 1,5, ou não superior a 1,25, e mudanças do índice polidispersidade (PI) não superiores a um fator de 2, ou não superiores a 1,5, ou não superiores a 1,25, durante 24 horas a 25 °C; sendo que a osmolaridade da fase aquosa dentro dos lipossomas, Odentro, é superior a da osmolaridade da fase aquosa fora dos lipossomas, Ofora; sendo que o referido agente ativo apresenta um log P superior a 1, e sendo que o referido agente ativo é paclitaxel.

11. Preparação lipossômica, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que é para uso como uma preparação farmacêutica.

12. Suspensão lipossômica, caracterizada pelo fato de que compreende uma preparação lipossômica, que é obtida ou obtenível pelo processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e que compreende lipossomas contendo DOTAP, DOPC, e paclitaxel em uma concentração de lipídio total de de 10 mM, e trealose, suspensa em uma fase aquosa compreendendo 10 mg/mL, ou 9,79 mg/mL, de trealose, sendo que os referidos lipossomas são definidos por uma densidade anidrosa de 1,1 g/mL.