KR101984454B1

KR101984454B1 - 친유성 화합물의 개선된 리포좀 제형

Info

Publication number: KR101984454B1
Application number: KR1020187021874A
Authority: KR
Inventors: 하인리히 하스; 어슐러 패틀러
Original assignee: 신코어 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2019-05-30
Also published as: MX2012013528A; US10413511B2; AU2011254553A1; ZA201206557B; CN103002876B; EP2571492B1; BR112012029628B1; KR20180091102A; MY162921A; RU2012155697A; CN103002876A; CA2796806C; MX353677B; US20130259922A1; AU2011254553B2; JP5966168B2; HUE036459T2; BR112012029628A2; JP2013526563A; CA2796806A1

Abstract

본 발명은 실질적으로 리포좀 막에 용해되는 약제학적으로 및/또는 진단학적으로 활성인 작용제 및/또는 화장료 작용제를 위한 장입량이 개선된 리포좀 제조방법, 이 제조방법으로 수득할 수 있는 리포좀으로부터 상기 활성 작용제 및/또는 화장료 작용제를 방출함에 있어 개선된 안정성을 갖는 리포좀 분산물, 또한 상기의 안정화된 리포좀 분산물을 포함하는 약제학적 혹은 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 제조방법은 리포좀 분산물의 탈수 및 재수화 단계들을 수반하며 이 단계들은 분무-건조법에 따라 수행될 수 있다.

Description

친유성 화합물의 개선된 리포좀 제형{IMPROVED LIPOSOMAL FORMULATIONS OF LIPOPHILIC COMPOUNDS}

본 발명은, 리포좀 막에 의해 실질적으로 용해되는 약제학적 및/또는 진단학적 활성 작용제 및/또는 화장료 작용제 용도의 개선된 장입 용량의 리포좀 제조방법, 상기 방법으로 얻을 수 있는 리포좀으로부터의 활성 작용제 및/또는 화장료 작용제 방출에 관련한 개선된 안정도의 리포좀 분산물, 또한 상기 안정화된 리포좀 분산물을 포함한 약제학적 또는 화장료 조성물에 관한 것이다. 이 방법은 분무-건조 처리에 의해 수행되는 리포좀 분산물의 탈수 및 재수화 단계를 수반한다.

리포좀은 수성 격실을 봉입하는 단일 혹은 다중막으로 된 인공 소포성 구조이다. 대부분 리포좀 막은 지질 이중막으로 형성되나 그 외에도, 양쪽친화성 물질, 고분자 및 폴리펩타이드류 등을 포함하여 기타의 단량체 및 고분자형 양쪽성 화합물로도 구성될 수 있다(Antonietti and Forster 2003). 지질이 적절한 조건에서 수성 환경에 분산될 때 리포좀이 자발적으로 형성된다. 대부분의 리포좀은 포유동물성 막의 분자특성을 갖기 때문에 비독성, 무항원성 및 생체 분해성이다. 지질성 혹은 양쪽친화성 약물 및 화합물은 리포좀 막에 봉입할 수 있으며, 친수성 약물 및 화합물은 리포좀의 수성 코어에 캡슐화될 수 있다.

최근에는 리포좀이 약물 전달을 위한 제약 산업에서 중요한 역할을 한다(Gregoriadis 1995). 리포좀은 인체에 대한 약물의 지연 방출로 약동학에 영향을 미치거나 약물의 유리농도를 제한함으로써 부작용을 감소시킨다. 리간드를 리포좀에 부착하거나 이의 전하를 공급함으로써, 이 리포좀은 원하는 작용 부위를 목표로 한 약물 전달을 촉진한다. 약제학적 용도 이외에도 리포좀은 화장품에도 흔히 이용된다.

리포좀을 약제학적 혹은 화장료 용도에서 활성 작용제 투여에 이용할 경우, 리포좀 제형에 대한 활성 화합물의 장입 효과 및 활성 혹은 화장료 화합물 내에 장입될 리포좀 제형의 안정성을 제어 및 최적화하는 것이 중요하다. 제형의 안정성은 제형의 제조, 보관 및 적용에서 중요한 특성이다. 다수의 경우, 리포좀 산물의 물리적 혹은 화학적 안정성은 제한적이며 이는 생산 공정 설계(보류시간(hold time)), 보관(보관수명 안정성) 및 제품의 적용(사용시의 안정성) 등을 고려하여야 한다.

약제학적 적용을 위해, 리포좀 제형은 보통 주사 투여한다. 따라서 리포좀은 정맥 투여(iv) 혹은 복강투여(ip)에 적합한 조건에서 수성 상에 존재하여야 한다.

약제학적 리포좀 제형은 매우 엄격한 품질 기준이 적용된다. 대부분 현재의 액상 리포좀 제품은 장기 보관기간 동안 안정하지 않은데, 이는 이들 제품이 다양한 화학적 및 물리적 분해 과정을 거칠 수 있기 때문이다. 그러나, 약제학적 제품의 경우, 실온 혹은 냉장 온도에서 적어도 6개월 내지 2년간 안정한 최종 제형을 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 요인 탓에 리포좀은 생물학적 활성 화합물의 담지체로 실제 사용함에 있어 그 이용이 제한된다. 리포좀에 관하여, 상술한 요구사항을 만족하기 위한 탈수 기법들이 개발되었다.

리포좀 제형의 장기 안정성은 액상 제형보다는 이들을 탈수처리하여 건조 상태로 보관할 경우 현저히 개선된다. 건조한 리포좀 제품은 주사하기 전에 투여용 수성 현탁액을 형성할 적절한 수성 매질에 재수화시켜야 한다. 재수화된 리포좀 제형의 안정성은 화학적 및 물리적 분해 과정에 의해 또다시 제한될 수 있으므로, 위와 같이 준비된 리포좀 현탁액의 사용시의 안정성을 증대하는 것이 약제학적 제형 기술에서의 또 다른 중요한 목표이다.

통상 이용되는 냉동-건조 처리를 통한 수성 리포좀 현탁액의 안정화 방법은 미국특허 제 4,229,360호 및 제 4,247,411호에 개시되어 있다. 냉동-건조법에서, 리포좀 현탁액은 냉동 및 실질적으로 감압처리되며, 이에 의해 냉동수가 승화 제거된다. 대체로 수성 현탁액은 부형제, 예컨대, 당을 포함하여 냉동 탈수화에 의해 야기된 결손 발생을 최소화 또는 방지한다. 냉동-건조법에 의해 리포좀은 부형제의 보호 매트릭스 안에 존재하게 되며, 재수화 후에는 원래의 액상 산물이 얻어진다. 미국특허 제 4,880,635호에 개시된 바와 같이, 리포좀은 리포좀의 외부뿐만 아니라 내부에서도 보호당의 존재에 의해 탈수 및 재수화 단계의 유해 영향으로부터 보호될 수 있다.

예를 들어 미국특허 제 5,089,181호에 발표된 바와 같은 분무-건조법은 또 다른 제조방법을 제공한다. 이 방법은 식품 산업에서 채택하고 있으며 현탁액을 분무함으로써 현탁액을 작은 방울로 세분화하는 단계, 및 승온에서 상기 작은 방울로부터 매질을 후속 증발시키는 단계를 이용한다. 냉동건조법과 마찬가지로, 리포좀 현탁액은 당과 같은 부형제를 포함하여 리포좀 막을 보호할 수 있다. 냉동건조법과 비교하여, 분무건조법은 대규모 산업 분야에서 크게 유리한데, 이는 저비용으로 또한 관리할 수 있는 기술노력으로 대용량 생산이 가능하기 때문이다. 그러나, 이 방법에 수반된 승온은 캡슐화된 활성 작용제뿐만 아니라 지질막에 응력을 부여한다.

분무건조용 리포좀에 캡슐화된 수용성 약물을 포함하는 현탁액을 안정화하기 위해, 미국특허 제 4,895,719호는 고 내부농도의 가용성 약물에 의해 발생된 높은 내부 삼투질 농도를 주변 매질의 균일한 높은 삼투질 농도와 평형화하는 방법을 개시한다.

수성상(aqueous phase)의 리포좀에서 소수성 약물을 안정화하기 위하여, WO 2007/005754는 캡슐화에 앞서 사이클로덱스트린을 이용한 상기 약물의 복합화 방법을 개시한다. 복합처리된 소수성 약물은 사이클로덱스트린에 의해 야기된 막통과 삼투성 구배 하에서도 고농도의 리포좀 안에 보존된다. 그러나, 리포좀 막에 봉입된 활성 작용제의 안정화는 아직 공지되지 않았다.

삼투활성의 용질, 예컨대, 당 또는 이온 등이 리포좀 막 내부나 외부에 존재하면 삼투력을 발생한다. 막 전달 삼투성 구배가 생물학적 막의 구조와 동력학에 작용하는 방식은 문헌에서 연구되었으며 응력-변형 관계와 용리 작용 등의 현상을 설명하는 모델도 제안되었다(Ertel Marangoni et al. 1993; Hallett, Marsh et al. 1993). 요약하면, 상기 저자들의 실험 및 분석에서 소정의 삼투 응력에서의 리포좀 팽윤이 이들의 크기에 의존하는 것을 확인하였다. 크기 의존의 임계 항복점까지 팽윤하면 용혈(누출)이 일어나는 것으로 기술되었다. 리포좀이 일정한 변형 상태에 존재하는 것으로 예상되는 조건이 부여되었다.

개선된 보관 수명을 가지는 친유성 약물을 포함하는 리포좀 제조와 관련하여, WO 2004/002468은 파클리탁셀을 포함하는 리포좀의 제조방법을 개시한다. 리포좀은 트레할로스를 함유한 수성 완충액 내에서 형성되는데, 이는 리포좀 내부 및 외부에 동일한 삼투질 농도를 갖는 리포좀 현탁액을 초래한다. 수성 리포좀 현탁액은 그 후 탈수처리된다. 탈수 공정은 냉동-건조 혹은 분무-건조에 의해 실행될 수 있다. 이 출원은 상기 리포좀 현탁물을 냉동 건조하는 다수의 프로토콜을 개시한다. 탈수 처리후, 리포좀 조제물은 물 또는 수용액을 첨가함으로써 재수화될 수 있다. 이 문헌은 그러나 재수화 처리에 앞서 냉동-건조 혹은 분무-건조에 의해 탈수화된 리포좀 조제물의 사용시의 안정성에 대한 비교 데이터를 제공하지 않는다.

상술한 공지기술의 관점에서, 본 발명의 근거가 되는 과제는, 높은 작용제 대 지질 비를 가지며 특히 물리적 안정성에 대해 개선된 안정성을 가지는 적어도 하나의 친유성 활성 작용제 및/또는 화장료 작용제를 포함하는 리포좀의 제조 및 리포좀으로부터 작용제의 방출이었다. 특히, 본 발명은 제조시 보류 시간이 연장되고 사용시의 안정성이 있는 상기 리포좀 조제물을 제조하기 위해 빠른 탈수 단계를 수반하는 공정을 제공하는 과제에 관한 것이다.

따라서, 상술한 문제의 해결방법은 본원의 청구범위에 기술된 특징과 또한 발명의 상세한 설명에 개시된 기술구현을 제공함으로써 본 발명에 따라 달성된다.

상기 과제의 해결방안은 리포좀 막에 대한 인장 응력이 삼투력에 의해 인가되는 리포좀 조제물 및 상기 리포좀을 제조하는 방법에 의해 제공된다.

특히, 이 해결방안은 리포좀 막에 존재하는 적어도 하나의 활성 작용제 및/또는 화장료 작용제와 함께 수성상에서 리포좀 현탁액을 제조하는 방법으로서, 이때 리포좀으로 캡슐화된 부피 내의 수성상의 삼투질 농도, O_in 가 리포좀으로 캡슐화된 부피 밖의 수성상(의 삼투질 농도) O_out 보다 높은 것을 특징으로 하는 제조방법에 의해 제공된다.

상기 리포좀은 리포좀 막에 인장 강도를 갖는 것 (응력 리포좀)을 특징으로 한다. 이는 리포좀 형성시 직접 혹은 리포좀 형성 후 임의의 처리단계에서 수득할 수 있다.

응력 리포좀은 리포좀 내부 및/또는 외부의 수성상의 삼투질 농도에 직접 영향을 미치거나 혹은 리포좀이 주어진 삼투질 농도의 매질에 존재하는 리포좀 막의 막 특성, 예컨대, 분자 충전 등을 변화시켜 얻을 수 있다.

응력 리포좀은 리포좀 막에 존재하는 활성 작용제 및/또는 화장료 작용제를 직접 이용하여 제조할 수 있다. 또는, 이러한 작용제 없이 응력 리포좀을 제조한 후 상기 작용제를 추가로 첨가할 수도 있다.

본 발명의 한 측면은 리포좀 조제물의 제조방법에 관한 것으로서, 이 방법은:

a) 수성상에 리포좀의 현탁물을 포함한 제1 리포좀 조제물을 제공하는 단계로서, 이때의 상기 리포좀은 적어도 하나의 막을 포함하되, 이 막은 상기 수성상의 리포좀으로 캡슐화된 부피를 둘러싸고 상기 수성상은 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질을 포함하며 초기 총 삼투질 농도(O₁)를 갖는 것인, 상기 제1 리포좀 조제물의 제공 단계;

b) 그 후, 상기 조제물의 수성상에서 삼투 구배(osmolar gradient)를 발생시키는 단계로서, 이때 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 수성상의 삼투질 농도(O_out)는 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 수성상의 삼투질 농도(O_in)보다 낮아 제2(응력) 리포좀 조제물을 수득하는 단계;

c) 선택적으로, 제2 (응력) 리포좀 조제물을 탈수처리하여 탈수된 조제물을 수득하는 단계; 및

d) 선택적으로, 탈수 조제물을 재수화 처리하는 단계를 포함한다.

단계 a)의 리포좀 조제물은 바람직하게는 리포좀 막 안에 적어도 하나의 활성 작용제 혹은 화장료 작용제를 포함한다. 또한, 작용제는 제조방법의 후속 단계에서 첨가되기도 한다.

단계 b)는 상기 단계 a)로부터 유래된 리포좀 현탁물의 초기 총 삼투질 농도(O₁)를 감소시켜 수행할 수 있으며, 이에 따라 상기 삼투질 농도(O₁)보다 낮은 총 삼투질 농도(O₂)를 갖는 응력 리포좀 조제물을 수득한다.

단계 b)는 상기 단계 a)로부터 유래된 리포좀 현탁물을 O₁보다 낮은 삼투질 농도를 갖는 수성 매질로 희석하거나 혹은 이 현탁물을 O₁보다 낮은 삼투질 농도를 가진 수성 매질에 투석처리함으로써 수행할 수 있다. 가장 간단한 방식은 리포좀 현탁물을 물로 희석하는 것이다.

본 발명의 전반적인 개념에 따르면, 리포좀 조제물을 제조하는 동안 삼투 구배를 형성하거나 상이한 단계에서 변화시킬 수 있다. 또한, 삼투 구배는 제조과정 중 여러 단계에서 1차 혹은 다수회 변경할 수 있다. 이는 하기의 설명과 같이 동일하거나 상이한 절차에 따라 달성할 수 있다. 리포좀 조제물의 제조방법은 리포좀 현탁물의 최종 사용 전에 실행된 모든 단계에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 단계 b)는:

b1) 상기 단계 a)의 리포좀 조제물을 탈수화 처리하여 탈수된 리포좀 조제물을 수득하는 단계; 또한

b2) 바람직하게는 수성 매질 내에서, 응력 리포좀 조제물을 수득하기 위한 조건하에 상기 탈수된 리포좀 조제물을 재수화하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 탈수화 처리는 리포좀 현탁물을 분무-건조함으로써 수행된다.

본 발명은 또한, 상술한 방법에 따라 수득했거나 수득할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 리포좀 막에 적어도 하나의 활성 작용제 혹은 화장료 작용제를 포함하되, 이 리포좀 막은 인장 응력하에 있는 리포좀 조제물에 관한 것이다.

더 구체적으로, 본 발명은 리포좀 막 내에 적어도 하나의 활성 작용제 또는 화장료 작용제를 포함하되, 리포좀은, 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 액상의 삼투질 농도(O_out)보다 높은 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 삼투질 농도(O_in)를 가진 액체 상태로 존재하는 리포좀 조제물에 관한 것이다.

놀랍게도, 본 발명자는 리포좀 함유 리포좀 현탁물이 친유성 화합물의 개선된 용해도를 가지며 이 현탁물의 리포좀 막이 인장 응력 하에 있다는 사실을 발견하였다.

따라서 본 발명은 또한 적어도 하나의 친유성 약물 혹은 화장료 화합물을 포함하는 리포좀 조제물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은:

i) 수성상 중에 리포좀의 현탁액을 포함하는 응력 리포좀 조제물을 제공하는 단계;

ii) 상기 응력 리포좀 조제물을 적어도 하나의 친유성 활성 작용제 또는 화장료 작용제와 함께, 선택적으로 불용해된 형태로 배양하는 단계; 및

iii) 선택적으로, 불용해된 작용제를 바람직하게는 여과 또는 원심분리에 의해 리포좀 조제물로부터 분리하는 단계;

iv) 선택적으로, 배양된 리포좀 조제물을 탈수 처리하는 단계; 또한

v) 선택적으로, 탈수 리포좀 조제물을 재수화 처리하는 단계를 포함한다.

응력 리포좀은 상술한 절차 중 어느 것에 따라 수득할 수 있다. 가장 바람직하게는, 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질이 리포좀 현탁물의 수성상에 존재하며 이때의 O_in 는 O_out 보다 높다.

상술한 활성 작용제 혹은 화장료 작용제는 바람직하게는 물에 대해 낮은 용해도를 갖는다.

상술한 활성 작용제 혹은 화장료 작용제는 친유성이며 바람직하게는 1 초과의 log P 값을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 화합물은 탁산이고 가장 바람직하게는 파클리탁셀이나 이의 유도체이다.

리포좀 막이 응력화 된 경우 특히 수용성 삼투작용 화합물이, 리포좀으로 캡슐화된 수성상의 외부보다 높은 농도로 리포좀으로 캡슐화된 수성상 내에 함유되어 있는 경우, 친유성, 수난용성 화합물, 예컨대, 파클리탁셀의 리포좀 막에 대한 장입 효능이 개선될 수 있으며 이러한 화합물을 리포좀 막으로부터 방출이 감소될 수 있다는 놀라운 사실을 확인하였다. 농도 구배가 없는 리포좀과 비교하여, 리포좀에 대한 친유성 화합물의 장입 효능이 높으면 화합물/지질간 고 몰비의 제형을 제조할 수 있고 또한 소정 제형의 안정성을 개선할 수 있는데, 이는 리포좀으로부터의 화합물 방출 경향이 감소하기 때문이다.

상기 삼투 구배가 존재할 경우, 막 격실에 친유성 작용제가 함유된 리포좀은 수성 매질에 대한 화합물을 방출하기 용이하지 않다. 수성 매질내 상기 친유성 물질의 평형 비율이 감소된다. 따라서, 수성상 내 친유성 화합물의 농도가 용해도를 초과할 위험이 제한되고 침전물 역시 감소한다.

또한, 상술한 구배를 가진 공백(속이 빈) 리포좀이 친유성 화합물에 대한 높은 장입량을 갖고, 즉, 상기 구배를 갖지 않은 리포좀과 비교시, 더 높은 몰량의 친유성 화합물이 동량의 리포좀(지질 몰량으로 정의된)에 의해 용해된다는 놀라운 사실을 확인하였다. 이는 예컨대 공백 리포좀에 대한 친유성 화합물의 노출에 의해 실현될 수 있다.

또한 놀라운 것은, 앞서 탈수화된 리포좀을 재수화시켜 얻은 리포좀 조제물이 균질한 크기분포를 갖는다는 사실이며 낮은 다중분산 지수(polydispersity index: PI)가 이러한 사실을 가리킨다. 품질관리에 있어서, 특히 약제학적인 용도 측면에서 균질한 산물을 수득하는 것이 늘 바람직하다. 또한, 본 발명의 리포좀 현탁물은 실질적으로 장기간에 걸쳐 무변화 상태를 유지하는 다중분산 지수를 표시한다. 이는 본 발명의 현탁물에 함유된 리포좀이 응집물을 형성하지 않는다는 사실을 가리킨다. 특히, 정맥투여된 리포좀 현탁물의 경우, 응집물은 반드시 피해야 하며 이는 이들 응집물이 혈관을 막아 색전증을 야기할 수 있기 때문이다.

본 발명은 리포좀 조제물의 리포좀 막 내에서 친유성 작용제를 안정화시키는 방법을 제공하고 또한, 재수화된 리포좀 조제물의 크기 및 다중분산도를 유지함으로써, 실질적으로 공지기술을 개선한다. 결과적으로, 리포좀과 친유성 화합물을 포함하는 최종 조제물의 사용시 안정성이 연장지속될 수 있다. 또한, 이러한 제형을 처리하는 동안 상기 리포좀의 안정성이 연장지속될 수 있다.

다수의 경우에서, 리포좀으로부터 작용제의 원치않는 방출의 위험 탓에, 리포좀 제형의 제조시(보류 시간) 액상 제형의 처리기간이 제한된다. 본 발명은 악물 방출의 위험을 낮추며 따라서 장기간의 제조시 리포좀의 연속처리가 가능하고 제조공정의 더 유연한 설계를 가능하게 한다.

더 구체적으로, 본 발명은 냉동 건조 대신 분무-건조에 따라 상술한 제형을 제조할 수 있다. 냉동 건조시 리포좀은 냉동되고 따라서 제조 직후 안정화되어 제조시의 방출 위험이 낮다. 분무-건조시, 액상 제형은 액상에서의 보류시간이 연장되는데 이는 소정의 배취(batch)를 분무하는데 수시간 혹은 수일이 소요될 수 있기 때문이다. 본 발명은 소정 제형의 안정성을 증가시킬 수 있기 때문에, 장애 없이 더 긴 분무시간을 실현할 수 있다. 분무-건조는 냉동 건조보다 전체에 걸쳐 더 골고루 실행되므로 대량 생산이 가능하고 제품 품질을 유지하면서도 생산 비용을 감소될 수 있다.

또한, 탈수 리포좀 조성물의 재구성과 환자 투여(사용시 안정성) 사이의 기간에 약물 방출 및 결정화가 발생하는 위험이 적어진다. 결정화는, 정맥투여(iv) 제품에 소정 한계 값 이하로 존재해선 안 되는 육안관찰이 불가한(subvisible) 입자의 형성을 촉진하게 된다. 다수의 경우, 수시간 정도만 사용시 안정성을 제공하며 이는 임상진료에 장애가 된다. 따라서, 약제학적 혹은 화장료 제품의 실제 응용분야에서 충분한 수준의 사용시 안정성이 매우 중요하다.

리포좀 조제물은 에탄올 같은 유기용매를 자주 이용하며 이는 탈수 리포좀 제품과 또한 이로부터 유래한 재수화 리포좀 분산물에서 대체로 확인된다. 특히, 냉동 건조(동결 건조)에 의해 탈수된 리포좀 조제물이 이 경우에 해당한다. 그러나, 인간에 응용하는 리포좀 제품은 유기용매를 가능한 적은 양으로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명은 분무-건조에 따른 탈수화가 가능하며 이에 따라 대부분 혹은 모든 유기용매 잔사를 용이하게 제거하는 동시에 고안정성의 리포좀을 수득할 수 있다.

상술한 이점을 달성하는 한편, 본 발명은 실용화하기 쉽고 비용은 많이 들지 않는다. 복잡한 기술장치나 상술한 조성물에 추가적인 성분을 첨가할 필요가 없다. 또한, 본 발명을 실행하는데 이용할 삼투적으로 활성인 물질은, 미국특허 제 4,880,635호 혹은 WO 2004/002468에 개시된 바와 같이 탈수되는 리포좀 조성물에서 이미 공지된 것이다.

도 1은 10 mM의 지질 농도 및 10 중량%(w/w)의 총 트레할로스 농도를 갖는 리포좀 조제물에 용해된 파클리탁셀의 양. 리포좀은 농축 선구체 제형을 물로 희석하여 수득하였다. 가로좌표는 초기 농도를 나타내며, 즉, 10% 트레할로스일 때의 데이터를 희석되지 않은 현탁물로부터 수득했고, 한편 40% 트레할로스일 때의 데이터는 초기의 트레할로스 농도가 40 중량% 및 지질 농도가 40 mM이었고 물로 1+3배로 희석한 무희석 현탁물로부터 얻었다;
도 2는 30 mM 지질 및 30 중량%의 트레할로스의 농축 제형으로부터 얻은 10 mM DOTAP/DOPC 리포좀의 수변화율을 도시하며, 이 용액은 30 중량% 내지 10 중량%의 범위에서 상이한 총 트레할로스 농도가 되도록 물/트레할로스 혼합물을 이용하여 희석한 것이다. 모든 제형이 10 mM의 동일한 최종 지질 농도를 갖는 반면, 캡슐화 및 유리 수성상 간의 트레할로스 농도 구배는 x-축 상에 표시되었다.

정의:

양을 표시하는 값에서 "약"이란 표시 값을 근거로 최대 +/- 20%, 바람직하게는 +/- 10%의 평균편차를 가리킨다. 예를 들어, 약 30 몰%의 양이온성 지질의 양은 전체 지질/양쪽 친화성 물질의 몰농도에 관하여 30 몰% +/- 6 몰% 및 바람직하게는 30 몰% +/- 3 몰%의 양이온 지질을 말한다.

"활성 화합물" 또는 "활성 작용제"는 인간이나 동물의 질환 또는 상태를 진단, 예방 혹은 치료하는 작용제로서 유용한 생물학적 혹은 물리적 활성을 가진 화합물 또는 그의 혼합물을 말한다. 약물 및 진단 작용제 등의 치료 작용제는 본 발명에 따른 활성 작용제의 중요한 예이다.

본 발명에서 리포좀의 "무수밀도"는, 리포좀 입자크기(Z_평균)에 기초하여, 리포좀에 캡슐화된 화합물을 포함한 상기 리포좀을 구성하는 모든 화합물의 질량을 수성상 내의 리포좀의 부피로 나눈 값을 말하며, 단, 리포좀에 함유된 물의 양은 상기의 질량에서 제외한다. 구체적인 실시예에서, 리포좀의 무수밀도는 리포좀에 함유된 DOTAP, DOPC, 파클리탁셀, 시트르산 및 트레할로스의 질량을 수성상 내의 리포좀의 부피로 나눈 값을 말한다. 무수밀도의 리포좀은 실시예에 개시된 바와 같은 초원심분리법에 의해 결정될 수 있다.

여기서 사용하는 "수성 매질", "수용액" 혹은 "수성상" 등은 물을 함유하는 액상 물질을 말한다. 어떤 구현예에서, 액상 물질은 적어도 약 50 중량%, 적어도 약 70 중량% 혹은 적어도 90 중량%의 물을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 액상 물질은 유기용매가 존재하지 않는다. 수성상은 하나 혹은 다수의 화합물을 함유할 수 있다. 따라서, 수성 분산물, 수성 현탁물, 또한 연속상이 수성인 에멀젼 등도 수용액의 예가 된다. 콜로이드성 물질을 함유하는 수용액은 이후 때로 수성 콜로이드성 분산물 혹은 용액이라고도 한다.

"양이온성" 은 각각의 환경조건에서 순수 양전하 혹은 양의 제타 전위를 갖는 작용제를 말한다. 본 발명에서는 pH가 3 내지 9, 바람직하게는 5 내지 8의 범위에 있는 환경적 조건을 말한다.

친유성 화합물의 "화학적 안정성"은 본래의 화학 구조상의 큰 변화를 말하며, 초기 분석값(최초 화합물)의 약 5%의 활성 변화율, 바람직하게는 약 2%, 또는 독성학적 한계치 및 안전 측면에 있어서 수용기준치를 초과하는 특정의 분해 산물이 출현하는 것으로 정의된다. 파클리탁셀 같은 친유성 화합물에서, 화학적 안정성은 HPLC/LC MS/MS로 정의할 수 있으며 통상은 상기 화합물의 5% 미만의 분해 산물을 말한다. 파클리탁셀의 일반적인 분해 산물은 예를 들어 바카티닐, 7-에피-탁솔 등이다(Monography of Paclitaxel, USP26, (Jan-Mar 2003), USPC, Inc.).

"화장료 화합물"은 인간 피부나 모발에 영향을 미치는 화합물을 말한다.

"진단활성 작용제" 또는 "진단"은 다양한 방법에 따라 대상체나 시료에서 생물학적 성질이나 상태를 가시화하는데 이용할 수 있는 약제학적 수용가능한 작용제를 말한다. 가시화는 진단을 내리는데 이용할 수 있다.

"탈수화" 또는 "탈수"는 조성물에서 물을 제거하는 방법을 말한다. 어떤 구현예에서, 물은 탈수처리 전 존재하는 물의 함량을 기준으로 약 10 중량% 이하, 바람직하게는 약 5 중량% 이하의 잔사량까지 조성물로부터 제거된다.

"캡슐화 부피" 혹은 "캡슐상"은 적어도 하나의 리포좀 막에 봉입되는 부피를 말한다. 이 부피는 단일층 리포좀의 1개 막 혹은 다중 층 리포좀의 다수개의 막으로 에워싸인다. 따라서, 캡슐상은 리포좀 내부의 공간을 나타내며 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 부피 혹은 "자유(수성)상"은 리포좀을 둘러싼 공간을 나타낸다. 다중 층 리포좀의 경우, 캡슐화 및 자유상 이란 용어는 다중 층 리포좀에서 소정의 막 옆의 내부 및 외부 부피를 말한다.

"보류 시간"은 리포좀 제형의 제조에서 액상 제형을 처리하는 기간을 말한다.

여기서 사용한 "크기 균일도"는 입자군의 크기 분포를 말한다. 고 크기 균일도 혹은 좁은 크기 분포는 다중분산 지수를 특징으로 한다.

"지질"은 종래의 정의에 따르면 지방, 지질, 물에 불용인 원형질의 알코올-에테르 가용 성분들 등을 포함하는 일반적 명칭이다. 지질은 대체로 친수성 및 소수성 성분으로 구성된다. 물에서 지질은 외피를 구성하여 2중층 막을 형성하며 친수성 부분(헤드 그룹)은 수성상에 배향하고 친유성 부분(아실 사슬)은 2중층 코어 안에 삽입된다. 지질은 또한 2개의 친수성 부분(볼라 양쪽친화성 물질)을 포함한다. 이 경우, 막은 2중층이 아닌 단일 지질층으로 형성될 수 있다. 본원에서 지질의 전형적인 예는 지방, 지방 오일, 에센셜 오일, 왁스, 스테로이드, 스테롤, 인지질, 당지질, 술포지질, 아미노지질, 크로모지질 및 지방산 등이 있다. 이 용어는 자연발생 및 합성 지질을 모두 포함한다. 본 발명에 관련하여 바람직한 지질은: 스테로이드와 스테롤, 특히 콜레스테롤, 포스파티딜, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜 에탄올아민을 포함한 인지질, 및 스핑고마이엘린 등이다. 지방산이 있을 경우, 이들은 약 12 내지 24개의 탄소 사슬 길이로서 최대 6개의 이중결합을 가질 수 있다. 지방산은 글라이세롤에서 유래한 골격에 연결된다. 1개의 지질에 있는 지방산은 상이할 수 있으며 (비대칭) 또는 리소레시틴 같이 단일의 지방산 사슬을 갖기도 한다. 특히 비-양이온성 지질이 난황, 소의 심장, 뇌, 간 혹은 콩 에서 정제된 레시틴(포스파티딜콜린) 등과 같은 자연 재료에서 유래될 경우, 혼합 제형도 가능하다.

"리포좀"은 인공의 외피에 감싸인 다양한 크기와 구조로 된 소포성 구조물이며, 이 구조물에서 1개 또는 다수개의 막이 수성 코어를 캡슐화한다. 가장 일반적인 리포좀 막은 지질 2중층 막으로 형성되며 이때 친수성 헤드 그룹은 수성 환경에 배향되며 지질 사슬은 친유성 코어에 삽입되어 있다. 리포좀은 또한 기타의 양쪽친화성 단량체 및 중합체 분자, 예컨대, 고분자, 유사 블록 공중합체 혹은 폴리펩타이드 등으로 형성할 수 있다. 단일층 소포체는 수성 공간을 감싼 단일 막으로 정의되는 리포좀이다. 이와 대비하여, 올리고 층 또는 다중 층 소포체는 수개의 막으로 구성된다. 통상, 상기의 막은 대략 4 ㎚의 두께이며 양쪽친화성 지질, 예컨대, 자연계나 합성계열의 인지질로 구성된다. 선택적으로, 스테롤이나 콜린산 유도체 등의 다른 지질을 함입하여 상기 막의 성질을 변화시킬 수 있다. 특히 저 상전이 온도(예, 체온 이하)의 인지질에 기초한 유연성 막을 가진 리포좀은 때로 트랜스퍼좀이라고도 한다.

"리포좀 현탁물"은 수성 매질에 리포좀을 포함하는 조성물을 말한다.

"리포좀 조제물"이나 "리포좀 조성물"은 리포좀 현탁물을 포함한 리포좀으로 된 조성물 또는 탈수처리를 통해 상술한 현탁물로부터 수득한 탈수화된 조성물을 말한다.

"친유성"은 지방형(예, 탄화수소)상, 예컨대, 실질적으로 지질로 이루어진 상에 선호적으로 용해되는 화합물의 성질을 말한다. 화합물의 친유 성질은 분배계수(log P)로 표시할 수 있다. 본원의 대상 화합물은 약 1 초과의 log P, 더욱 바람직하게는 약 2 초과, 가장 바람직하게는 약 3 초과의 log P를 갖는다.

"Log P"은 25℃에서 물과 옥탄올상 사이의 화합물의 분배계수를 말한다. 일반적으로, 고 log P수는 작용제가 옥탄올에 더 잘 용해됨을 보여준다. log P는 [옥탄올 내의 작용제의 농도]/[물 내의 작용제의 농도]로 정의한다. 당업자는 화합물의 log P을 실험을 통해 결정하는 방법을 숙지하고 있다.

"물에 대한 저 용해도"는 용해를 촉진하는 첨가제가 없는 상태에서 25℃ 및 생리학적 pH에서 화합물의 수 용해도가 0.1 ㎎/㎖ 이하, 더 바람직하게는 0.01 ㎎/㎖, 및 가장 바람직하게는 0.001 ㎎/㎖ 이하인 경우를 말한다.

리포좀 현탁물의 "총 삼투질 농도"는 이 현탁물의 소정 부피에 존재하는 삼투적으로 활성인 물질의 총량을 현탁물의 부피로 나눈 값이다. 총 삼투질 농도 계산시, 현탁물의 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부과 내부의 삼투적으로 활성인 물질 역시 마찬가지로 간주한다. 본원에서 O₁ 및 O₂ 의 약어는 각각 총 삼투질 농도를 말한다.

"O_in" 및 "O_out"은 자기 밀폐(self closed)된 리포좀 막의 내부와 외부의 삼투질 농도를 말한다. 단일층 리포좀에서 O_out은 자유 수성상의 삼투질 농도이며 O_in은 캡슐화 부피의 삼투질 농도이다. 다중 층 리포좀의 경우, O_in 및 O_out은 외피 밀폐된 막 각각의 내부와 외부의 삼투질 농도를 말한다. O_in과 O_out의 차이는 원심분리법, 예를 들어, 분석 혹은 조제형 원심분리법이나 초원심분리법을 통해 조사할 수 있다. 대개 삼투활성 화합물이 수성상의 밀도를 변화시키므로, O_in과 O_out의 차이는 리포좀의 침전 거동으로 인지할 수 있다(Goormaghtight and Scarborough 1996, Huang and Charlton 1971). 또한, 삼투 구배는 X-선이나 중성자 산란 등의 방법으로 결정할 수 있는 리포좀 막의 구조적 변수, 또는 광산란 및 X-선 산란으로 측정할 수 있는 리포좀 크기 등에 영향을 미칠 수 있다.

본원에서 "삼투적으로 활성인 물질"은 실질적으로 리포좀 막을 투과할 수 없는 수 용해성 물질을 말한다. 이의 전형적인 예로는, 이온이나 글루코스 같은 당, 혹은 리포좀에 효율적으로 포집될 수 있는 한편 물 분자가 고투과성을 나타내는 트레할로스 등이며, 따라서 본원에서는 물을 삼투적으로 활성인 물질로 간주하지 않는다. 상이한 화합물의 투과선택도는 리포좀의 핵심적인 특징이다(Bangham et al., 1965). 화합물의 막 투과도는 막의 조성, 상의 상태 및 기타의 경계부 조건에 따라 달라진다.

"삼투질 농도"는, 생물학적 활성 물질 및 기타의 보조 분자, 예컨대, 활성 작용제의 방출속도를 느리게 하는데 이용된 삼투성 부형제 등을 포함한, 수성 용액에 존재하는 용질의 몰 농도의 합이다. 용질이 해리, 이온화 혹은 응집 형태로 존재하면, 삼투질 농도는 몰 농도의 합으로 정의한다. 용액의 삼투질 농도에 대한 용액내 용질의 기여도는 용액 내 용질의 농도를 분자량으로 나눈 값과 대략 같다. 따라서, 일반적인 원리에 따르면, 용질의 분자량이 클수록 용질의 삼투질 농도는 작고 또한 용액의 총 삼투질 농도에 대한 상기 용질의 기여도 역시 더 작아진다. 삼투질 농도의 차이는, 밀도, 전자 밀도, 굴절지수 혹은 점도 등, 각종 물리적 화학적 변수의 변화로부터 측정할 수 있으며 이는 물리화학적으로 확립된 방법에 따라 결정할 수 있다.

"음전하 지질"은 음성 순전하를 갖는 지질을 말한다.

"약제학적 조성물"은 각 성분이 가진 것과 상이한 약제학적 성질을 가진 2개 혹은 그 이상의 상이한 구성성분의 조합물을 말한다. 본 발명에서, 2개 혹은 그 이상의 구성성분은 지질 혹은 콜로이드성 분산물 또한 활성 작용제를 말하며, 선택적으로, 약제학적 수용가능한 담체, 희석제 및/또는 보조제를 함께 포함한다.

리포좀의 "물리적 안정성"은 리포좀의 물리적 상태의 변화를 말한다. 리포좀은 물리적 상태를 유지할 때 안정하다. 물리적 안정성의 중요한 측면은 리포좀 막에 삽입된 화합물을 리포좀 현탁물의 수성 매질에 방출하는 것이다. 화합물 방출은 물리적 불안정성의 한 특징이다. 화합물을 막으로부터 방출하면 수성 매질내 화합물의 응집과 농도 상승이 일어날 수 있다. 탁산의 경우 응집은 탁산의 바늘 형성으로 가시화된다. 탁산의 결정화는 액상 리포좀 제형의 육안검사, 광학 현미경법, 광차단 방법 혹은 광산란법 등으로 측정할 수 있다. 리포좀 크기와 크기 분포 역시 리포좀 현탁물의 물리적 상태에 관한 특성이다.

"다중분산도"는 소정의 입자 시료, 예컨대, 리포좀 현탁물의 입자 크기 분포의 폭이다. 다중분산도에 대한 측정은 광자상관법(photon correlation spectroscopy: PCS) 데이터의 누적분석을 통해 얻은 다중분산 지수(PI)에 따라 제공된다,

"다중분산 지수"(PI)는 광자상관법(PCS)으로 측정한 결과에 대한 소위 누적분석을 통해 얻은 단위가 없는 수치이다(Koppel 1972). 누적분석을 통해 입자 크기 측정값인 Z_평균및 다중분산도 측정값인 PI 값을 얻기 위한 PCS 데이터의 모델 자유설정이 가능하다. 이들 변수의 계산법은 ISO 표준 문헌 13321:1996 E에서 정의하고 있다. 입자크기 측정에 관련하여, PCS 및 동적 광산란법(DLS)은 같은 의미로 자주 사용한다. 이 방법은 입자가 브라운 운동을 하기 때문에 일어나는 산란광의 강도의 시간의존형 변화를 측정한다. 이러한 강도 변화의 분석으로, 크기분포로 전환되는 입자의 확산계수를 결정할 수 있다. 본 발명에서 정의하는 바에 따르면, PI 및 Z_평균은 실시예 8에서 설명하는 바와 같이 결정된다.

"광자상관법"은 입자가 브라운 운동을 하기 때문에 일어나는 산란광의 강도의 시간의존형 변화를 측정하는 기법이다. 이러한 강도 변화를 분석하면, 크기분포로 전환되는 입자들의 확산 계수를 결정할 수 있다. 입자크기의 측정에 관하여 PCS와 DLS는 같은 의미로 자주 사용한다.

"양전하 지질"은 양이온성 지질과 같은 의미로 사용한다("양이온성 지질" 의 정의를 참조). 본 발명에서는 pH가 3 내지 9, 바람직하게는 5 내지 8의 범위일 때의 환경을 말한다.

"안정성"은 리포좀의 물리적 안정성 및 리포좀에 함유된 단일 구성성분(예, 지질 및 활성 화합물)의 화학적 안정성을 말한다.

"응력 리포좀" 또는 "응력 리포좀 조제물"은 리포좀 막이 인장응력 하에 있는 리포좀과 또한 이러한 리포좀을 포함하는 조제물을 말한다.

"인장 응력"은 본원의 리포좀에서 리포좀으로 캡슐화된 부피의 내부 및 외부의 수성상 간의 삼투활성 화합물의 농도 구배를 인가함으로써 구할 수 있다. 내부 삼투질 농도 O_in 가 외부 삼투질 농도 O_out보다 높을 경우, 삼투력에 의한 캡슐화 부피와 자유 부피 간의 압력 구배(△P)가 증가하는 결과를 가져온다. 과잉 압력은 리포좀 막의 표면장력(γ)이 평형화하고 이때 압력 구배와 표면장력 간 상호관계는 공지의 영-라플라스식에 따라 얻어진다(Evans and Wennerstrom, 1994).

(식 1)

본 발명의 리포좀계에 있어서, 부여된 표면장력이 리포좀 막의 면적 팽창을 야기하며 이에 따라 반경, 캡슐화 부피의 변화를 가져올 수 있고 결과적으로 캡슐화 부피의 삼투질 농도도 변할 수 있다는 점을 고려해야 한다. 면적 팽창(△A)은 표면장력의 함수로서 막의 탄성률(κ)에 의존하며 다음과 같은 영의 식에 의해 얻는다:

(식 2)

식 1은 표면장력과 압력간 관계가 반경에 의존하는 것을 명확히 나타낸다. 소정의 압력 구배에서, 표면장력은 반경의 증가시 증가한다. 면적의 증가 및 이에 상응하는 리포좀 크기의 증가는 소형 리포좀보다 대형 리포좀에서 더욱 크다. 소비눗방울처럼 소정의 표면장력을 갖는 계에서, 압력 구배(p_i내부 - p_외부)가 반경 감소시 증가하거나 혹은 곡률 증가시 증가한다.

"치료활성 작용제" 또는 "치료 작용제"는 동물 특히 포유동물, 바람직하게는, 인간의 병리적 상태를 경감하거나 예방하는 작용제를 말한다.

"소분자"는 분자량이 약 2000 Da 미만의 분자량을 갖는 분자를 말한다.

"제타 전위"는 수성 환경에서, 예컨대, 약 pH 7.5에서 약 0.05 mM KCl 용액 내에서 행하는 레이저 도플러 미세 전기영동을 응용한 제타시저(Zetasizer) 3000 같은 장비를 이용하여 측정한 콜로이드성 입자의 정전기 전위 측정값을 말한다. 제타 전위는 완충액과 수력학적 전단 영역이나 확산층 간의 경계의 전위를 나타낸다. 이 용어는 "전자역학적 전위"와 같은 의미로 사용되며 이는, 상기 전위가 외향하며 입자의 전자역학적 거동에 대응하는 입자의 전위이기 때문이다.

본 발명의 리포좀 조제물 제조방법은 다음과 같은 단계들에 의해 수행될 수 있다:

a) 수성상에 리포좀의 현탁물을 포함한 제1 리포좀 조제물을 제공하는 단계로서, 이때의 상기 리포좀은 적어도 하나의 막을 포함하고 이 막은 상기 수성상의 리포좀으로 캡슐화된 부피를 둘러싸고 상기 수성상은 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질을 포함하며 초기 총 삼투질 농도(O₁)를 갖는 것인, 상기 제1 리포좀 조제물의 제공단계;

b) 그 후, 상기 조제물의 수성상에서 삼투 구배를 발생시키는 단계로서, 이때 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 수성상의 삼투질 농도(O_out)는 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 수성상의 삼투질 농도(O_in)보다 낮아 제2 (응력) 리포좀 조제물을 수득하는 단계;

단계 a)의 리포좀 조제물은 바람직하게는 리포좀 막 안에 적어도 하나의 친유성 작용제를 포함한다. 그러나 이 친유성 작용제는 또한 제조방법의 후속 단계에서 첨가되기도 한다.

본 발명에 관련하여, 총 삼투질 농도(O₁)의 감소는 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 수성 매질의 삼투질 농도(O_out)를 초기에 감소시키는 방법에 관한 것이다. 격실 내의 농도가 초기에 모두 동일하다고 가정할 경우(즉, O₁ = O_out = O_in), 자유 수성상(O_out)에만 희석 효과가 있으므로 결과적으로 O_out< O_in이 된다. 따라서, 리포좀으로 캡슐화된 부피의 내부와 외부 간에 삼투 구배가 일어난다. 삼투 구배의 존재하에 리포좀이 팽윤하는 것은 널리 공지되어 있으며 이는 막이 물 분자를 투과시킬 수 있기 때문이다. 그러므로, 희석의 부차적인 효과로서, 캡슐화 수성 매질의 삼투질 농도(O₂)는 소정 수준으로 감소할 수 있다. 삼투질 농도의 절대 변화는 각종 요인, 예를 들어, 캡슐화 부피 비율, 리포좀 크기, 막의 탄성(영의 모듈) 등에 의존한다. 따라서, O₁ 대 O₂ 비가 반드시 희석 후의 O_in 대 O_out 비와 동일할 필요는 없다.

그러나, 자유 비캡슐화 수성상의 삼투질 농도의 감소는 캡슐상의 외부과 내부간 삼투질 농도 구배(O_in-O_out)의 증가를 유도한다. 삼투 응력에 따라 팽윤 현상이 소정 요인 이하로 발생할 경우, 고 삼투질 농도의 상에서 저 삼투질 농도의 상으로 용질이 방출하게 된다. 이 결과, 삼투 구배와 삼투 응력이 감소한다. 최대 인장 응력 및 기공 형성을 위한 삼투 구배의 최대 임계값 조건하에 막이 재밀폐되기도 한다. 그러므로 이 시스템은, 과잉 구배가 인가될 경우 세부적인 조건에 관계없이 최대 삼투 구배의 상태를 채택한다는 측면에서, 자체 안정화될 수 있는 것으로 판단된다. 이러한 영향은 제조과정에서 재현가능한 조건을 확보한다는 측면에서 유리한 것으로 간주된다.

본 발명에 관련하여 사용된 리포좀은 중성, 음이온성 및/또는 양이온성 지질을 포함한다. 중성 혹은 음이온성 지질은 중성이나 음성 순전하를 갖는 것으로서 스테롤 또는 콜레스테롤, 인지질, 리소지질, 리소인지질, 스핑고지질 혹은 페길레이트 지질 등의 지질류 중에서 선택된다. 유용한 중성 및 음이온성 지질은 따라서: 포스파티딜세린, 포스파티딜글라이세롤, 포스파티딜이노시톨(특정 당에 한정되지 않음), 지방산, 카복실산을 함유하는 스테롤류, 예컨대, 콜레스테롤, 1,2-다이아실-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민으로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 1,2-다이올레일포스포에탄올아민(DOPE), 1,2-다이헥사데실포스포에탄올아민(DHPE), 1,2-다이아실-글라이세로-3-포스포콜린, 1,2-다이스테아릴포스포스파티딜콜린(DSPC), 1,2-다이팔미틸포스포스파티딜콜린(DPPC), 1,2-다이미리스틸포스포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜-콜린, 바람직하게는, 에그 PC, 콩 PC 및 스핑고미엘린 등을 들 수 있다. 글라이세롤 골격에 연결된 지방산은 특정 길이나 이중결합 수에 한정되지 않는다. 인지질 역시 2개의 상이한 지방산을 갖는다. 바람직하게는, 추가의 지질은 실온에서 액상 결정 상태이며 이들은 공지의 양이온 지질과 이들에 부여된 임의의 비율로 잘 섞인다(예, 균일한 상이 형성되며 어떤 상 분리나 도메인 형성도 야기되지 않는다). 바람직한 구현예에서, 중성 지질은 1,2-다이올레일포스포스파티딜콜린(DOPC)이다.

리포좀 조제물의 바람직한 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸 암모늄 염, 예를 들어, 메틸설페이트 염이다. TAP(트라이메틸암모늄 메틸설페이트)지질의 바람직한 대표예는 DOTAP(다이올레일-), DMTAP(다이미리스토일-), DPTAP(다이팔미토일-), 혹은 DSTAP(다이스테아로일-) 등이다. 본 발명에서 유용한 기타의 지질류는: DDAB, 다이메틸다이옥타데실 암모늄 브로마이드; 1,2-다이아실옥시-3-트라이메틸암모늄 프로판(제한되지 않으나, 다이올레일, 다이미리스토일, 다이라우로일, 다이팔미토일 및 다이스테아로일 등으로 포함하고; 또한, 2개의 상이한 아실 사슬이 글라이세롤 골격에 결합할 수 있다); N-[1-(2,3-다이올오일옥시)프로필]-N,N-다이메틸아민(DODAP); 1,2-다이아실옥시-3-다이메틸암모늄 프로판(제한되지 않으나, 다이올레오일, 다이미리스토일, 다이라우로일, 다이팔미토일 및 다이스테아로일을 포함하고; 또한, 2개의 상이한 아실 사슬은 글라이세롤 골격에 결합할 수 있다); N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); 1,2-다이알킬옥시-3-다이메틸암모늄 프로판(제한되지 않으나, 다이올레일, 다이미리스틸, 다이라우릴, 다이팔미틸 및 다이스테아릴을 포함하며; 또한 2개의 상이한 알킬 사슬이 글라이세롤 골격에 결합할 수 있다); 다이옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS); 3β-[N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol); 2,3-다이올레오일옥시-N-2-(스페민카복사미도)-에틸)-N,N-다이메틸-1-프로판암모늄 트라이플루오로-아세테이트(DOSPA); β-알라닐 콜레스테롤; 세틸 트라이메틸 암모늄 브로마이드(CTAB); 디C14-아미딘; N-tert-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노-프로피온아미딘; 14Dea2; N-(알파-트라이메틸암모니아아세틸)다이도데실-D-글루타메이트 클로라이드(TMAG); O,O'-다이테트라데카노일-N-(트라이메틸암모니오-아세틸)다이에탄올아민 클로라이드, 1,3-다이올레오일옥시-2-(6-카복시-스퍼밀)-프로필아미드(DOSPER); N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-하이드록실에틸)-2,3-다이올레오일옥시-1,4-부탄디암모늄 이오다이드; 문헌[Solodin et al.(1995)]에서 기술한 1-[2-(아실옥시)에틸]2-알킬(알케닐)-3-(2-하이드록시에틸)-이미다졸리늄 클로라이드 유도체, 예컨대, 1-[2-(9(Z)-옥타데세노일옥시)에틸]-2-(8(Z)-헵타데세닐-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DOTIM), 1-[2-(헥사데카노일옥시)에틸]-2-펜타데실-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄 클로라이드(DPTIM); 문헌[Felgner et al.(1994)]에 기술된 바와 같이 4가 아민에 하이드록시알킬 성분을 함유하는 2,3-다이알킬옥시프로필 4가 암모늄 화합물 유도체, 예컨대; 1,2-다이올레일-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORI), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DORIE), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시프로필 암모늄 브로마이드(DORIE-HP), 1,2-다이올레일-옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시부틸 암모늄 브로마이드(DORIE-HB), 1,2-다이올레일옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시펜틸 암모늄 브로마이드(DORIE-Hpe), 1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DMRIE), 1,2-다이팔미틸옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DPRIE), 1,2-다이스테릴옥시프로필-3-다이메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드(DSRIE); Santaniello et al.(US 5,498,633)이 발표한 아실 칼니틴의 양이온성 에스터; 포스파티딜콜린의 양이온 트라이에스터, 예컨대, 탄화수소 사슬이 포화 또는 불포화되고 또한 C₁₂ 내지 C₂₄의 사슬 길이로 분기화 혹은 분기화되지 않을 수 있으며, 2개의 아실 사슬이 반드시 동일할 필요는 없는 1,2-다이아실-sn-글라이세롤-3-에틸포스포콜린 등이다.

리포좀은 상이한 크기, 층수 및 구조를 갖는다. 바람직하게는, 리포좀은 약 50 ㎚ 내지 약 500 ㎚의 평균직경 Z_평균을 갖는다. 가장 바람직한 것은 약 100 내지 약 200 ㎚의 크기 Z_평균이다. 리포좀은 단일층, 올리고 층 혹은 다중 층 리포좀일 수 있다. 리포좀은 단일층 리포좀이 바람직하다.

본 발명의 화합물의 상이한 구현예에서 이용되는 활성 작용제 또는 화장료 작용제는 바람직하게는 1 이상, 더 바람직하게는 2 이상, 가장 바람직하게는, 약 3 이상의 log P 값을 갖는다.

본 발명의 상이한 구현예에서 활성 작용제 또는 화장료 작용제는 바람직하게는 낮은 수용해도를 갖는다. 바람직하게는, 이 화합물은 실온 및 생리적인 pH값에서 0.1 ㎎/㎖ 이하, 더 바람직하게는 0.01 ㎎/㎖ 이하 및 가장 바람직하게는 0.001 ㎎/㎖ 이하의 수용해도를 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 리포좀에 함유된 활성 작용제는 치료활성 혹은 진단활성의 작용제이다. 이 화합물은 치료활성을 갖는 것이 가장 바람직하다.

바람직하게는, 활성 작용제 혹은 화장료 작용제는 2000 Da 미만, 더 바람직하게는 1000 Da 미만의 분자량을 갖는 분자이다.

한 측면에서, 활성 작용제는 아바렐릭스, 알트레타민, 아나스트로졸, 아프레피탄트, 비칼루타미드, 캄토테신스, 카페시타빈, 클로로트리아니센, 접합 에스트로겐, 사이클로스포린, 닥티노마이신, 다이에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 돌라세트론, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에포틸론 B 혹은 에피틸론 D 같은 에피틸론, 또는WO2004048372, WO2004007492, WO2005051947 및 WO2005030767(이의 전문을 본 명세서에 참조로 수록함) 등에 개시된 바와 같은 에피틸론 유도체, 수베르로티닙, 에틸 에스트라다이올, 엑세메스탄, 펜타닐, 플라보피리돌, 플루옥심에스테론, 풀베스트란트, 게피티닙, 그라니세트론, 헤스페레틴, 히드로모르폰, 이리노테칸, 케토코나졸 라파티닙, 레트로졸, 레우프롤리드, 로무스틴, 루칸톤, 마리놀, 마소프로콜, 메게스트롤, 나빌론, 닐루타미드, 말로노세트론, 포르피머, 퀴네스트롤, 퀴네스트롤, 타목시펜, 탁산, 템시롤리무스, 테스토락톤, 토포테칸, 토레미펜, 트라이메트렉세이트, 발루비신, 빈블라스틴, 비타민 E, 및 이들 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직한 화합물은 탁산이고 가장 바람직한 것은 파클리탁셀 또는 이의 유도체이다.

본 발명의 한 측면에서, 활성 작용제는 DNA 혹은 RNA 분자 등의 뉴클레오티드나 폴리뉴클레오티드 분자가 아니다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 범주는 제형화 시 이온화되는 활성 작용제 및/또는 예컨대 아드리아마이신 같은 고수용해성 화합물인 활성 작용제를 포함하지 않는다.

바람직하게는, 본 발명의 리포좀은 약 2.5 몰% 내지 약 4.5 몰%의 파클리탁셀을 리포좀 막 안에 포함한다. 따라서, 파클리탁셀은 지질 및 관련 분자와 파클리탁셀 등, 막에 존재하는 모든 분자에 바람직하게는 약 2.5 몰% 내지 약 4.5 몰%의 양으로 포함될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이들 리포좀은 현탁시 및/또는 재수화후의 약물 방출을 방해하거나, 및/또는 실질적으로 하기에서 정의하는 바와 같이 보관시 결정을 형성하지 않는다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 리포좀은 양이온성 리포좀, 예컨대, DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀을 약 50:47:3의 몰비로 함유하는 양이온성 리포좀이다. 이 조성물의 제형은 MBT-0206이나 EndoTAG-1 등이 공지되어 있다. DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀을 함유하는 리포좀 조제물의 제조방법은 WO 2004/002468 에 개시되어 있으며, 이의 내용을 본원에 참조로서 수록한다.

일반적으로, 리포좀은 당업자가 숙지하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 다양한 리포좀 제조방법이 New et al.(1990)에 개시되어 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용하는 리포좀은 에탄올 주입법으로 제조한다.

본 발명의 특정 구현예에 있어서, 리포좀은 양성 제타전위를, 더 바람직하게는 약 +30 mV 이상의 제타전위를 갖는다.

본 발명의 방법에서 이용하거나 본 발명의 조성물에 포함된 삼투적으로 활성인 물질은 실질적으로 지질 이중층을 투과할 수 없는 가용성 물질이다. 바람직하게는, 상기 삼투적으로 활성인 물질은 리포좀의 내부 및 외부에 존재한다.

삼투적으로 활성인 물질은 당류, 예컨대, 모노-, 올리고- 혹은 다당류나, 당알코올, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 수용성 고분자, 유기- 또는 무기염, 이온 혹은 이들의 조합물과 같은 유기 분자일 수 있다.

유용한 당류는 당과 당알코올, 올리고당류, 수용성 다당류 및 그 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 당류는 글루코스, 프룩토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 셀로비오스, 갈락토스, 말토펜토스, 라피노스, 덱스트린, 덱스트란, 이눌린, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 키토산 및 가장 바람직하게는 트레할로스 등을 포함한다.

수용성 고분자의 예는 폴리에틸렌글라이콜, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴레이트, 혹은 폴리비닐피롤리돈 등이다.

한 측면에서, 본 발명의 방법이나 조성물에 삼투적으로 활성인 물질을 사용할 때 저수용해도를 갖는 화합물의 용해를 촉진하는 착화제의 이용은 제외한다. 이러한 착화제의 예로는 Zhang et al.의 WO 2007/005754 또는 MacLachlan et al.의 WO 2007/012191에서 개시한 사이클로덱스트린이 있다.

본 발명에 관련하여 수성 매질이나 수성상은, 알코올(예, 에탄올 같은 C_1-4 알코올) 혹은 케톤(예, 아세톤 같은 C_1-4 케톤) 등, 적어도 일부가 물과 혼화되는 하나 이상의 또 다른 구성성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 수성상은 에탄올을 함유한다.

수성상은 완충 물질이나 기타의 안정화제를 더 포함할 수 있다. 적절한 완충 물질은, 예컨대, 아세트산, 트리스, 비스, 인산, 락트산 등에서 선택되며 바람직한 것은 시트르산이다. 완충 물질은 수성 매질의 pH 값을 약 3 내지 7, 바람직하게는 약 4 내지 약 5의 범위로 설정할 수 있다.

바람직하게는, 단계 a)의 리포좀 조제물은 지질 및 선택적으로 활성 작용제 또는 화장료 작용제를 포함한 유기용액(예, 에탄올)을 총 삼투질 농도(O₁)를 갖는 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질이 함유된 수성 매질에 혼합함으로써 제조할 수 있다.

바람직한 삼투 구배(O_in-O_out)의 범위는 10 mOsm 내지 2000 mOsm이며, 더 구체적으로는 50 mOsm 내지 1000 mOsm이고 더욱 구체적으로는 100 mOsm 내지 1000 mOsm이다.

삼투 구배는 또한 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 삼투적으로 활성인 물질의 농도/중량과 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 삼투적으로 활성인 물질의 농도/중량 간의 농도/중량 차이로 표시될 수도 있다. 바람직한 삼투 구배 범위는 5 중량% 내지 30 중량%의 농도/중량 차이, 즉, 캡슐화 부피 외부의 0 중량% 내지 30 중량%의 삼투적으로 활성인 물질과 캡슐화 부피 내부의 10 중량% 내지 40 중량%의 삼투적으로 활성인 물질 사이의 구배이다.

단계 a)에서 유래된 리포좀 조제물은 압출, 막 필터를 통한 여과, 고압 균질화 및/또는 고속 균질화 등에 의해 수행되는 균질화 단계를 거치며, 특히, 가압하에 기공크기가 약 200 ㎚인 막을 통한 압출법이 가장 바람직하다. 다른 기공크기, 예를 들어, 당해 분야에 공지된 50 ㎚, 100 ㎚, 150 ㎚, 400 ㎚ 등의 기공크기를 가진 막도 또한 이용할 수 있다. 막 필터를 통한 여과법은 PVDF, PES, 나일론 필터로 구성된 막을 통과 여과시킴으로써 수행되며 그 외 기타의 재질도 적절히 한정하여 사용할 수 있다. 막의 기공크기는 바람직하게는 약 200 ㎚ 내지 450 ㎚의 범위이나 이러한 기공크기는 상술한 크기에 한정되지는 않는다. 다른 재질 및 상이한 기공크기는 멸균 여과법으로 처리할 용액을 수득하는 방식으로 조합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 a)에서 유래된 리포좀은 삼투 구배가 생성하기 전에 균질화된다.

멸균성은 약제학적 제품의 의무사항이므로, 본 발명의 방법에 이용된 리포점 현탁물은 공정의 어느 단계에서 멸균처리된다. 바람직하게는, 현탁물은 멸균용 멸균 여과막(0.22 pm)을 통과하여 여과함으로써 멸균된다. 한 바람직한 구현예에서, 리포좀 현탁물은 본 발명의 단계 b)에 따라 삼투 구배가 발생한 후에 여과하여 멸균한다.

본 발명의 일반적인 개념에 따르면, 캡슐화물과 자유 부피 간의 삼투 구배는 리포좀 조제물의 제조 공정 중 상이한 단계에서 1회 혹은 수회 발생하거나 변경될 수 있다. 이는 하기의 기술과 동일하거나 상이한 절차에 의해 성취 가능하다.

본 발명의 한 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법의 단계 b)는:

b1) 상기 단계 a)의 리포좀 조제물을 탈수화 처리하여 탈수된 리포좀 조제물을 수득하는 단계; 및

본 발명의 용어 설명에 따른 의미 중 "단계 a)에서 유래된 리포좀 조제물"은 단계 a)에서 제조한 리포좀 조제물 혹은 단계 a)에서 제조한 리포좀 조제물로부터 상이한 처리단계를 거쳐 수득할 수 있는 임의의 리포좀 조제물에 관한 것이다. 이들 처리단계는 예컨대 상술한 바와 같이 균질화 및/또는 멸균처리를 포함할 수 있다.

한 바람직한 구현예에서, 삼투 구배의 생성이나 변경은 단계 a)에서 제1 리포좀 조제물을 제조한 후 및 단계 a)에서 유래한 상기 리포좀 조제물을 탈수하기 전에 적어도 1회 수행된다. 바람직하게는, 삼투 구배의 생성이나 변경은 압출 단계 후 및/또는 멸균 여과 후에 수행된다. 상술한 바와 같이, 삼투 구배는 처리단계를 거친 리포좀 현탁물의 안정성을 향상시킨다.

바람직하게는, 탈수처리는 실온 이상의 온도에서 수행된다.

본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 단계 b1)의 탈수처리는 리포좀 현탁물의 분무-건조로 수행된다. 분무-건조법에서 리포좀 현탁물은 상기 현탁물을 우선 먼저 분무하여 작은 방울 형태로 세분화한다. 이어서, 승온에서 상기 작은 방울로부터 매질의 증발에 의해 리포좀을 건조시킨다. 작은 방울 형성 후의 리포좀 건조는 공급된 무수 기체, 가능하면, 가열된 기체 스트림에 작은 방울을 접촉시켜 달성하며 이에 따라 고체 입자를 수득한다. 가능한 기체 스트림은 불활성 기체 혹은 공기일 수 있다. 무수 기체는 바람직하게는 0.1 부피% 이하, 바람직하게는 0.05 부피% 이하의 산소를 함유하는 저산소 기체 혹은 무산소 기체가 될 수 있다. 불활성 기체는, 산소를 대체하기 위하여 질소, 이산화탄소, 헬륨, 네온, 아르곤, 크립톤, 제논 및 라돈 혹은 그외의 일부 불활성 기체를 펌핑하여 고가연성 용액을 함유하는 가열된 건조장치의 안전도를 증대한다. 이들 장치의 효과는 산소를 완전히 제거하거나 혹은 무시할 수 있는 수준까지 낮추는 것이다. 바람직한 구현예에서, 질소는 불활성 기체로 이용된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 불활성 기체는 제형 내에 함유된 활성 성분과 부형제를 보호한다. 바람직하게는, 분무-건조는 적절한 분무-건조 장치를 이용하여 수행한다. 탈수 리포좀은 기체 스트림으로부터 분리되고 수집된다. 분무-건조는 과잉 압력, 정상 압력 혹은 부분 감압 상태에서 수행될 수 있다. 최대 허용 시스템 온도 및 최대 용량일 때의 건조 기체를 이용하여 사양에 맞는 분말을 제조하는 경우, 적절한 공정 압력의 범위가 존재할 수 있다. 건조 조건을 선택함에 있어, 액체 공급속도, 건조기체 속도, 건조기체 온도 등의 변수, 부형제의 열역학 변수 및 화합물의 안정도 한계치 등의 조합을 고려해야 한다. 중요한 변수는, 건조 기체의 유입온도 T_in 및 스프레이 건조기 내부에 존재하는 유출온도 T_out이다. T_out은 증발시 실질적으로 단열 냉각 탓에 T_in 보다 낮다. 입자 표면의 실제 온도는 국소 증발속도에 따라 T_out 보다 훨씬 낮을 수 있다. 따라서, 어떤 일반적인 분무-건조 변수도 한정할 수 없다. 리포좀 건조에 있어서, 처리챔버 내부의 온도는 10℃ 내지 200℃의 범위이다. 더욱 전형적으로, 현탁액은 30℃ 내지 150℃의 온도에서, 더 바람직하게는 약 60℃ 내지 약 120℃의 온도에서 본 발명의 방법에 따라 건조시킨다.

분무-건조용 장치는 Buchi(Flawil, 스위스) 혹은 GEA Niro(Soeborg, 덴마크)에서 제작한 것이거나 또는 주문제작 방식일 수 있다. 당업자라면 건조공정의 조건, 예컨대, 공급속도 및 온도 등을 건조 대상인 현탁물, 사용될 장치 및 원하는 사양 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.

특히 탈수 단계의 조건은, 극소량의 유기용매로 탈수 리포좀 조성물을 수득할 수 있도록 적절히 선택한다. 분무-건조에 따른 탈수처리는 특히 소량의 유기용매 잔사를 얻는데 적합하다.

또한, 여기서 기술된 분무-건조에 따른 탈수처리시 순수한 분말 형태의 탈수 리포좀 조성물을 결과로서 수득한다. 이러한 분말은, 예를 들어, 냉동-건조로 수득한 케이크형 구조를 갖는 탈수 조성물과 비교시, 탈수 조성물 충전시의 취급성이 더욱 개선된다.

본 발명의 한 측면에서, 분무-건조 처리될 리포좀 현탁물 내에서의 비율 및 물에 재수화 한 후의 분무-건조된 조제물 내에서의 비율을 비교할 때, 탈수처리는 실질적으로 캡슐화 대 자유 삼투활성 화합물의 비율에 실질적으로 영향을 미치지 않는다.

본 발명의 어떤 측면에서, 동결건조 또는 냉동건조에 의한 탈수처리는 리포좀 현탁물이 냉동되고 후속으로 감압 하에 물 분자를 제거하는 것으로서, 이는 본 발명의 범위에 포함되지 않는다.

예컨대, 단계 b1) 또는 c)에서 수득한 탈수 조성물은 적절한 용기에 담아 소정기간 동안 보관할 수 있다. 바람직하게는, 이 조성물은 멸균 조건에서 충전 보관된다. 보관기간은 수일 내지 수개월 심지어는 수년에 이를 수 있다. 이 조성물은 실온, 2℃ 내지 8℃ 범위의 온도 또는 0℃ 이하의 온도에서 보관할 수 있다.

탈수 리포좀 조성물을 사용하기 전에, 예를 들어, 약제학적 조성물로 이용된 리포좀 조성물의 경우 환자에 투여하기에 앞서서 또는 추후 가공하기 전에, 상기 탈수 조성물을 상기 단계 b2) 혹은 c)에 따라 재수화 처리한다. 이 목적을 위해, 상술한 바와 같이 수득한 탈수 조성물을 수성 매질과 혼합한다. 재수화성을 향상시키기 위해, 혼합물을 교반하거나 원을 그리며 젓는다.

재수화에 이용되는 수성 매질의 삼투질 농도는 탈수 단계를 거친 현탁물의 총 오스모 농도(O₁)보다 낮다. 바람직하게는, 재수화에 이용되는 수성 매질은 실질적으로 삼투적으로 활성인 물질을 포함하지 않는다. 가장 바람직하게는, 주사용도의 약제용 물을 재수화에 사용한다.

어떤 구현예에서, 재수화에 이용되는 수성 매질의 부피는 각 소정량의 탈수 리포좀 조성물을 수득하기 위해 탈수처리된 리포좀 현탁물의 부피보다 클 수 있다.

본 발명에 있어서, 재수화에 이용되는 수성 매질의 삼투질 농도 및 재수화에 이용되는 매질의 부피는, 탈수 단계를 거친 현탁물의 삼투질 농도(O₁)보다 낮은 총 삼투질 농도(O₂)를 갖는 재수화된 현탁물을 제공하도록 상호 조합적으로 선택한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 단계 b)는 단계 a)에서 유래한 리포좀 현탁물을 희석하여 O₁보다 낮은 총 삼투질 농도(O₂)를 갖는 수성 매질을 수득하기 위해 수행된다.

리포좀 현탁물은 상술한 수성 매질로 희석한다. 바람직한 구현예에서, 리포좀 현탁물은 물로 희석한다. 한 구현예에서, 리포좀 현탁물을 희석하는데 이용되는 수성 매질은 활성 작용제, 특히, 리포좀에 캡슐화된 활성 작용제를 포함하지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, O₂는 O₁보다 적어도 10 mOsm 작으며, 더 바람직하게는 O₂는 O₁보다 적어도 50 mOsm 작고, 더욱더 바람직하게는, O₂ 는 O₁보다 적어도 100 mOsm 작다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 단계 b)는 단계 a)에서 유래된 리포좀 현탁물을 총 삼투질 농도가 O₁보다 작은 수성 매질에 대해 투석함으로써 수행된다.

바람직한 투석은 O₁과 수성 매질의 삼투질 농도 간의 삼투 구배를 얻을 수 있는 조건하에 수행되며, 상기 투석은 적어도 상기 매질에 대해 적어도 10 mOsm, 더 바람직하게는 적어도 50 mOsm, 및 더욱더 바람직하게는 적어도 100 mOsm에서 실된다.

이와 별도로, 단계 b)는 다른 적절한 방법에 따라 행할 수도 있다. 예를 들어, 삼투적으로 활성인 물질의 농도는 이온교환 혹은 친화성 크로마토그래피 같은 적절한 크로마토그래피법에 의해 감소될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 상술한 바와 같은 방법의 단계 b)에서 수득한 응력 리포좀 현탁물은 탈수처리한다. 상기 응력 리포좀 현탁물의 탈수처리는 당업자가 숙지하는 적절한 방법에 따라 행할 수 있다. 적절한 건조방법은, 예를 들어, 냉동-건조, 분무-냉동-건조 혹은 분무-건조 등이다. 바람직한 구현예에서, 분무 건조에 따른 탈수처리는 단계 b1)에 대하여 상술한 바와 같이 수행한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 결과로 나온 탈수 리포좀 조제물은 또한 상술한 바와 같이 재수화 처리한다.

특정 구현예에서 본 발명은, 바람직하게는 DOTAP 및 선택적으로 DOPC를 지질로서 함유하는 양이온성 리포좀과 또한 친유성 활성 작용제 바람직하게는 파클리탁셀을 리포좀 막 안에 포함하는 초기 리포좀 현탁물이 수성 트레할로스상에서 조제되는 방법에 관한 것이다. 리포좀 현탁물의 구성성분들의 농도는, 인간에 투여하는 등 최종으로 사용된 방법에 따라 수득한 리포좀 현탁물에 대비시, 약 3배인 것으로 나타난다. 바람직하게는, 초기 리포좀 현탁물은 약 30 mM의 지질 및 약 30 ㎎/㎖, 바람직하게는 29.4 ㎎/㎖의 트레할로스로 된 농도를 갖는다. 초기 리포좀 현탁물은 선택적으로 후속 단계에서 막을 통한 압출법에 의해 균질화 처리된다. 그 후, 바람직하게는 리포좀 현탁물의 부피를 1.5배가 될 때까지 물로 희석함으로써, 리포좀 현탁물의 총 삼투질 농도를 바람직하게는 1.5배로 감소시킨다. 그 후, 리포좀 현탁물은 선택적으로, 바람직하게는, 여과법에 따라 멸균처리한다. 후속 단계에서 리포좀 현탁물을 바람직하게는 분무 건조로 탈수처리하여 탈수 리포좀 현탁물을 수득한다. 탈수 리포좀 현탁물은 마지막으로 재수화하여 인체에 대한 투여 등 각각의 목적에 이용될 리포좀 현탁물을 수득한다. 바람직하게는, 후자 즉 리포좀 현탁물은 약 10 mM의 지질 및 약 10 ㎎/㎖, 바람직하게는, 9.79 ㎎/㎖의 트레할로스로 된 농도를 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 리포좀 조제물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은:

i) 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질이 현탁물의 수성상에 함유되고, 리포좀으로 캡슐화된 부피의 외부보다 리포좀으로 캡슐화된 부피의 내부에서 더 높은 삼투질 농도가 나타나는 리포좀 현탁물을 제공하는 단계;

ii) 상기 리포좀 현탁물을 친유성 화합물로, 선택적으로는, 불용해 형태로 배양하는 단계;

iii) 선택적으로, 불용해된 화합물을 예컨대 여과, 원심분리 혹은 기타의 적절한 방법에 따라 리포좀 현탁물로부터 분리하는 단계;

iv) 선택적으로, 상기 리포좀 조제물을 탈수 처리하는 단계; 또한

바람직하게는, 리포좀으로 캡슐화된 부피의 내부와 외부 간의 삼투 구배는 10 mOsm 내지 2000 mOsm, 더 구체적으로는 50 mOsm 내지 1000 mOsm 또한 더더욱 특벼히는 100 mOsm 내지 1000 mOsm의 범위에 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 단계 i)의 리포좀 현탁물은 활성 작용제 또는 화장료 작용제를 포함하지 않는다.

단계 i)의 삼투 구배를 갖는 리포좀을 상술한 바와 같이 제조할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 i)의 리포좀 현탁물을 제조할 때 활성 혹은 화장료 작용제를 첨가하지 않는다. 불용 형태의 활성 작용제 또는 화장료 작용제는, 예를 들어, 결정 형태 즉 다양한 형상과 크기 혹은 분말 형태 등이 있다.

본 발명의 한 구현예에서, 불용화된 작용제는 배양후 분산물로부터 분리한다. 한 바람직한 구현예에서, 용해되지 않은 화합물은 원심분리나 여과법으로 분리한다. 여과법은 주사기 필터로 수행한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상술한 방법으로 수득했거나 수득할 수 있는 리포좀 조제물에 관한 것이다. 이 조제물은 탈수형 혹은 수성 현탁물 형태일 수 있다.

본 발명의 리포좀 조제물은 의약품, 예컨대, 인간이나 수의학적 용도의 의약품에 바람직하게는 이용된다. 이 조제물은 바람직하게는 정맥투여된다. 더욱 바람직하게는, 상기 조제물은 방광암, 유방암, 직장암, 자궁내막암, 백혈병, 폐암, 림프종, 흑색종, 비소세포 폐암, 난소암, 전립선암, 또한 소아암으로서 예컨대, 뇌간교종, 소뇌성상세포종, 대뇌성상세포종, 상의세포종, 유잉(Ewing) 육종/가족성 암, 생식세포 종양, 뇌외 문제(extracranial), 호지킨 질환, 백혈병, 소아 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 수질아세포종, 신경모세포종, 비호지킨 림프종, 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구종, 망막아세포종, 횡문근육종, 연세포 육종, 천막성 원시 신경외배엽성 및 송과체 종양, 희귀성 소아암, 시삭 및 시상하부 신경교종, 윌름 종양, 및 기타의 소아 신장암류 등의 암종에 치료 용도로 사용되며, 한편 림프성 백혈병, 성인 급성 골수성 백혈병, 성인 비호지킨 림프종, 뇌종양, 자궁경부암, 소아함, 소아육종, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 식도암, 모발세포 백혈병, 모발상세포 백혈병, 신장암, 간암, 다발성 골수종, 신경아세포종, 구강암, 췌장암, 원시 중추신경계 림프종, 피부암, 소세포폐암, 두경부암, 담낭암 및 담도암, 위암, 위장암, 카포시 육종, 요로상피암, 갑상선암, 고환암, 난소암, 혈관육종, 연조직 육종, 악성중피종 등의 대중성이 적은 암종의 치료에도 이용한다. 특히 이들 암은 전이성 암 및/또는 표준(화학)치료에 대한 내성이 있는 암일 수 있다. 본 발명의 조성물을 투여하면 병의 진행이 느려지거나 정지할 수 있으며, 혹은 인간에 있어 부분적 차도를 보이거나 완쾌를 유도할 수도 있다. 가장 바람직하게는, 췌장암이나 유방암, 특히 3중음성 수용체 유방암이 치료된다. 본 발명의 리포좀 조제물은 단위 약량으로 약 11 ㎎/㎡의 파클리탁셀 내지 약 44 ㎎/㎡의 파클리탁셀, 바람직하게는 약 22 ㎎/㎡의 파클리탁셀을 단위 약량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 상기 조제물은 주 1회 혹은 2회 투여한다. 리포좀 조제물은 WO2005/039533, WO 2006/117220, 및 WO 2007/107305.등에 발표된 바와 같이 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 리포좀 조제물은 진단이나 화장료 조제물로서도 이용할 수 있다.

또한 본 발명은 리포좀 막에 활성 혹은 화장료 화합물을 포함한 리포좀 현탁액에 관한 것으로, 이때 리포좀은 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 수성 매질의 삼투질 농도보다 높은 삼투질 농도의 수성 매질을 캡슐화한다. 상기 현탁물의 수성 매질은 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질을 포함한다. 리포좀 내부와 리포좀 외부의 매질의 삼투질 농도간 차이는 바람직하게는 적어도 10 mOsm, 더 바람직하게는 적어도 50 mOsm이다.

리포좀 내부와 외부의 삼투질 농도 차이는 삼투압 구배를 유발하며 이는 Hallet et al.(1993)에서 개시한 바와 같이 리포좀 막 상에 인장 응력을 일으킨다. 따라서, 본 발명은 리포좀 막 안에 활성 혹은 화장료 화합물을 포함하는 리포좀 현탁물에 관한 것으로, 이때의 리포좀 막은 인장 응력을 받는다.

리포좀 막이 인장 응력을 받는 리포좀은 상술한 바와 같이 삼투 구배를 인가함으로써 얻을 수 있다.

물리화학적 특징을 부여하는 방법들을 적용하여 리포좀 조제물의 삼투 구배 및 인장 응력을 측정할 수 있다. 다수의 경우에서, 삼투활성 성분으로 된 용액은 물보다 높은 밀도를 갖고 이 밀도는 화합물의 농도에 따라 획일적으로 변화한다. 리포좀으로 캡슐화된 부피의 삼투질 농도가 자유 부피의 경우보다 높을 경우, 이는 리포좀 농도에 영향을 미친다. 물에 용해된 5%(150 mOsm) 농도의 트레할로스의 경우, 밀도는 순수(pure water)보다 약 0.02 g/ℓ 높다(Handbook of Chemistry and Physics, CRC Press, Boca Raton, Florida). 따라서, 리포좀 내부와 외부 간의 삼투질 농도 차이는 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 매질과 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 매질 간에 상이한 밀도를 야기한다.

그러므로 본 발명의 또 다른 측면은 리포좀 현탁물을 개시하는 것으로, 이것의 리포좀으로 캡슐화된 부피는 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 매질보다 높은 밀도를 갖는다. 밀도 차이는 적절한 삼투 구배 및 각 삼투활성 화합물로 된 용액의 밀도에 의해 얻어진다. 리포좀 등 콜로이드성 입자의 밀도는 예컨대 초원심분리법에 따라 측정할 수 있다.

삼투 구배를 갖는 본 발명의 리포좀 현탁물의 특히 바람직한 구현예는, DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀이 바람직하게는 50:47:3의 몰비로 함유된 리포좀이 약 10 mM의 지질농도로 포함되어 있고, 또한 약 10 ㎎/㎖ 특히 9.79 ㎎/㎖의 트레할로스 및 선택적으로 약 0.011 ㎎/㎖의 시트르산이 수성상에 현탁된 상태로 포함되어 있는 리포좀 현탁물로서, 이때 상기 리포좀은 적어도 약 1.1 g/㎖의 무수밀도, 특히 적어도 약 1.15 g/㎖, 적어도 약 1.17 g/㎖ 혹은 적어도 약 1.17 g/㎖의 무수밀도를 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 상기 리포좀은 약 140㎚의 Z_평균을 갖는다.

상술한 방법에 따르면 상술한 바와 같이 리포좀을 포함한 리포좀 현탁물을 제조할 수 있으며, 이는 또한 제어된 입자크기 분포를 특징으로 하고, 또한, 예컨대 다중분산 지수(PI)의 변화를 특징으로 하기 때문에, 상술한 크기분포 프로파일의 폭은 사실상 상기 제조방법에 의해 확대되지 않는다. 바람직하게는, 삼투 구배를 갖는 본 발명에 따른 리포좀 현탁물은 삼투 구배가 발생하여 PI가 0.2 이상 증가하지 않으며, 더욱 바람직하게는 0.1 이상 증가하지 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 활성 혹은 화장료 화합물은 실질적으로, 본 발명에 따른 리포좀에 함유된 리포좀의 막 격실에만 존재한다. 따라서, 상기 조제물에 존재하는 모든 활성 혹은 화장료 화합물의 적어도 약 98%, 바람직하게는 적어도 약 99%의 몰량이 리포좀 막의 지질상에 삽입된다. 보유량만 조제물의 수성상에 용해되며 또는 결정화된 활성 혹은 화장료 화합물 형태로 존재하기도 한다.

기술된 방법에 의해 수득될 수 있는 본원에 개시된 현탁물은, 약물 방출에 관하여, 비교대상으로서 삼투 구배 없이 제조되는 종래의 리포좀 현탁물보다 더 안정하다. 리포좀으로부터의 약물 방출에 관한 일시적 안정성이 높으면, 제형은 기계적 응력 및/또는 다른 응력이 가해질 때 약물을 방출하기 어렵다. 바람직하게는, 약물 방출은 삼투 구배가 없는 현탁물과 비교시, 25℃에서 적어도 6시간 동안, 바람직하게는 적어도 약 12시간, 적어도 24시간, 적어도 2일간, 적어도 7일간 혹은 적어도 14일간 또는 그 이상 차단될 수 있다. 약물 방출은 약물 종류에 따라 결정된다. 파클리탁셀 장입 리포좀의 경우, 약물 방출은 방출 후 형성할 약물 입자(결정)을 측정함으로써 모니터 감지할 수 있다. 입자를 예컨대 X-선 회절 측정 혹은 광산란 기술로 측정할 수 있다.

본 발명의 구현예에서, 리포좀 막에 의해 용해된 활성 혹은 화장료 화합물의 양 중 적어도 약 90%, 바람직하게는 적어도 약 95%, 가장 바람직하게는 99%가 실온에서 적어도 약 24시간 동안 유지되며 현탁액의 수성상 내로 방출되지 않는다. 상기 수성상에서 저 용해도를 갖는 친유성 활성 혹은 화장료 화합물이 결정 형성을 유도할 수 있으므로, 본 발명의 현탁물은 25℃에서 24시간 내에 사실상 용해된 물질의 약 10% 이상, 바람직하게는 약 % 이상, 가장 바람직하게는 약 1% 이상에 상응하는 양까지 결정을 형성하지 않는다.

또한, 상술한 바와 같이, 탈수 리포좀 조성물의 재수화 처리로 수득한 본 발명의 리포좀 현탁물은 25℃에서 적어도 약 24시간 동안 응집물을 형성하지 않는다. 광자상관법(PCS)을 통해 Z_평균 및 PI의 변화를 측정함으로써 응집물 형성을 확인할 수 있다. 본 발명의 현탁물은 24시간 동안 약 1.5배 이하, 바람직하게는 1.25배 이하의 Z_평균 변화와 또한 약 2배 이하, 바람직하게는 약 1.5배 이하, 가장 바람직하게는 1.25배 이하의 PI 값의 변화를 특징으로 한다. 바람직하게는, 이러한 성질을 갖는 리포좀 현탁물은 탈수 리포좀 조성물의 재수화로부터 유래된다.

에탄올 주입법에 대해 상술한 바와 같이 리포좀 제조시 유기용매를 자주 사용하므로, 에탄올 같은 잔사 유기용매는 대체로 탈수 리포좀 산물에서 확인되며 따라서 이로부터 유래된 재수화 리포좀 현탁물에서도 확인된다. 특히, 냉동-건조(동결건조)에 의해 탈수된 리포좀 조제물이 상기의 경우에 해당한다. 그러나, 인간에 응용할 리포좀 제품은 유기용매를 가능한 소량으로 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면 분무-건조를 통해 탈수가 가능하여 잔사 유기용매의 대부분 혹은 전체를 용이하게 제거할 수 있으며, 한편으로는 고안정성의 리포좀을 수득할 수 있다. 따라서 본 발명의 또 다른 측면은 상술한 바와 같이 탈수 리포좀 조제물을 개시하며, 이 조제물은 탈수 조제물의 총 중량에 기초하여 약 1 중량% 이하, 더 바람직하게는 약 0.5 중량% 이하, 가장 바람직하게는 약 0.1 중량%의 유기용매를 포함한다. 이러한 탈수 리포좀 조제물을 재수화하여 리포좀 현탁물을 수득하며, 이 현탁물은 약 1 ㎎/㎖ 이하, 더 바람직하게는 약 0.5 ㎎/㎖ 이하, 가장 바람직하게는 약 0.1 ㎎/㎖ 이하의 유기용매를 포함한다. 상기 유기용매는 에탄올이 바람직하다.

또한, 상술한 바와 같이 탈수 리포좀 조성물의 재수화에 의해 수득된 본 발명의 리포좀 현탁물은 상술한 바와 같이 탈수된 최초 리포좀 현탁물과 비교시 이유 유사한 크기분포 파일을 갖는다. 더 구체적으로, 리포좀 크기는 양호하게 유지되며 PCS 측정법으로 확인시 지질 응집물이 다량 형성되지 않는 것으로 나타난다. 본 발명의 한 구현예에서, 탈수처리할 리포좀 현탁물 및 상술한 바와 같이 재수화로 수득한 리포좀 현탁물은 변화율이 1.5 이하인 Z_평균 및 변화율이 2 이하인 PI (PCS 측정시)를 특징으로 한다. 재구성 1시간 후 재수화된 리포좀 현탁물의 PI는 바람직하게는 0.4 미만, 더 바람직하게는 0.3 미만 또한 가장 바람직하게는 0.25 미만이다. 바람직하게는, 상술한 현탁물의 PI는 상술한 바와 같이 25℃에서 24시간 동안 소폭으로만 변화한다.

특정의 구현예에서, 본 발명은 리포좀 막에 약 5 몰%까지, 바람직하게는 약 3 몰%까지의 파클리탁셀이 함유된 양이온성 리포좀을 포함하는 재수화된 수성 리포좀 현탁물에 관한 것이며, 이때 재구성 1시간 후의 리포좀 현탁물의 PI는 0.4 이하, 더 바람직하게는 0.3 이하 및 가장 바람직하게는 0.25 이하이고, 또한 25℃에서 24시간 동안 약 1.5배 이하, 바람직하게는 1.25배 이하의 Z_평균 변화 및 약 2배 이하, 바람직하게는 약 1.5배 이하의 PI 변화를 특징으로 한다.

바람직하게는, 상술한 재수화 리포좀 현탁물의 리포좀은 25℃에서 24시간 동안 리포좀 막으로부터 수성 매질 속으로 약 2 중량% 이상, 바람직하게는, 약 1 중량% 이상의 파클리탁셀을 방출하지 않는다(파클리탁셀의 총량 기준).

실시예

상이한 트레할로스 구배를 가진 리포좀에 대한 파클리탁셀의 장입

개요

포화 수성상과의 평형시 리포좀 내 파클리탁셀의 분배에 대한 삼투 구배를 조사하였다. 상이한 삼투 구배를 가진 리포좀을 조제 및 파클리탁셀 결정으로 배양하였다. 모든 제형이 동일한 조성을 갖는다: 구체적으로, 지질 농도 및 트레할로스 농도는 c_지질= 10 mM 및 c_{트레할로스} = 10%(w/w) 이었다. 제형 중 일부는 고 지질 및 트레할로스 농도로서 제조 및 압출하고, 압출 후 최종 농도까지 물로 희석하였다. 이 방법에서 자유 수성상을 희석했으나 캡슐화된 수성상은 희석되지 않았다(팽윤 효과 및 결함으로 인한 용질 교환을 무시한다). 캡슐화 및 자유 수성상 간의 삼투 구배를 설정했으나, 이는 희석도 증가시 증가하였다. 이렇게 형성된 리포좀은 건조 파클리탁셀로 배양했고 리포좀에 의해 용해된 파클리탁셀의 양을 측정하였다. 희석 증가에 따른 용해된 파클리탁셀의 단순 증가(농도 구배)를 확인하였다. 확인 결과, 삼투 구배가 증가할 경우 평형시 리포좀 막에 분배된 파클리탁셀의 양도 증가하는 것으로 나타났다.

재료

파클리탁셀, 로트 06/150 Cedarburg

약제 DOTAP, 로트 MBA 113 Merck Eprova

DOPC, 로트 G181PC49 Avanti Polar Lipids

물, Milli-Q -합성 Millipore

트레할로스-2수화물, 고순도 Senn Chemicals

클로로포름, p.a. Merck

아세토니트릴, HPLC 등급(ACN) Merck

테트라히드로푸란, HPLC 등급(THF) Merck

아세트산 암모늄, p.a. Merck

트라이플루오로아세트산, p.a. Merck

주사기 필터 미니사르트 Sartorius

0.2 ㎛ 기공크기, 25 ㎜ 직경

막; 아세트산 셀룰로오스

HPLC 시스템 1100 Agilent

탈기장치(G1379A)

바이너리 펌프(G1312A)

온도조절 자동샘플러(Autoinjektor G1329A, 서모스탯 G1330B)

온도조절 컬럼 컴파트먼트(G1316A)

다이오드 어레이 검출기(G1315B) 또는 가변파장 검출기(G1314A)

ChemStation for LC 3D, Rev. A.09.01

압출기, 10 ㎖ Northern Lipids

제타사이저 3000 Malvern Instruments

방법

공백 리포좀의 조제

DOTAP/DOPC-제형(1:1 상대비) 혹은 DOTAP이나 DOPC 단독으로 이루어진 제형을 필름법으로 제조하였다. 지질 요구량을 칭량하여 둥근바닥 플라스크에 담고 클로로포름에 용해시켰다. 용매를 로터리식 증발기(Heidolph, Germany)에서 약 150 mbar의 압력 및 약 40℃의 온도로 약 15분간 증발 건조하였다. 필름은 10 mbar에서 60분간 건조한 후, 천천히 플라스크를 흔들어 물에 넣은 트레할로스 용액에 수화되게 하였다. 지질량, 트레할로스 농도 및 트레할로스 용액의 부피 등을 선택하여, DOTAP/DOPC-제형의 경우 지질 농도가 10 mM 내지 40 mM이고 트레할로스 농도가 9.8 중량% 내지 39.2 중량%인 상청액을, 또한 DOTAP 혹은 DOPC만을 단독으로 함유한 제형의 경우 지질 농도가 10 mM 내지 30 mM이고 트레할로스 농도가 9.8 중량% 내지 29.4 중량%인 상청액을 각각 결과로서 얻었다. 결과로서 나온 다중 층 리포좀의 현탁물을, 약 5 bar의 압력에서 기공크기가 200 ㎚인 폴리카보네이트막을 통과시켜 5회 압출하였다. 압출 후, 현탁액을 물로 희석하여 10 mM의 지질농도 및 9.8 중량%의 총 트레할로스 농도를 가진 현탁액을 수득하였다.

파클리탁셀 장입

상술한 바와 같이 조제한 공백 리포좀을 함유한 5 ㎖의 현탁액을 15 ㎖ 용량의 팔콘관에 담긴 2.6 ㎎의 건조 파클리탁셀(이론상의 파클리탁셀 농도인 600μM에 상응함)에 부가하였다. 배취를 1시간 가량 실온에서 교반하였다(자기 교반기).

교반 후, 리포좀 무결합의 파클리탁셀을 주사기 필터를 통해(Sartorius minisart, 0.2㎛, 아세트산 셀룰로오스막) 각 배취당 2 ㎖을 여과하여 분리하였다. 결과로 얻은 여액의 파클리탁셀- 및 지질 농도는 추후 HPLC로 분석하였다.

분석 방법

파클리탁셀 함량의 결정

시료를 48/18/34(v/v/v)의 상대비로 된 ACN/THF/2 mM 아세트산 암모늄에 희석하였다.

고정상: LiChroCART(등록상표) 250-4; LiChrospher 60, RP-선택 B

길이 250 ㎜, ID: 4 ㎜, 입자 크기 5 ㎛

이동상: ACN/THF/2 mM 아세트산암모늄 32/12/56(v/v/v)

유동량: 1 ㎖/분

온도 컬럼 격실: 35℃

검출 파장: 229 ㎚

주입 부피: 10 ㎕

실행시간: 40 분

지질 함량의 측정

여과법으로 리포좀 물질의 잠재 손실을 모니터 하기 위하여 여과 전후의 배취의 지질 함량을 HPLC로 분석하였다. 시료를 ACN/물의 50/50 용액에 희석하였다.

고정상: Phenomenex Luna 5 μC8(2) 100 Å 150 ㎜ x 2 ㎜

이동상: 0.1% TFA의 아세토니트릴, 0.1% TFA의 물

경사 지질 측정;

유량: 0.4 ㎖/분

온도 컬럼 격실: 45℃

검출기 파장: 205 ㎚

주입 부피: 5 ㎕

실행시간: 30 분

결과

DOTAP/DOPC-제형

도 1에서, 상이한 DOTAP/DOPC 리포좀 제형으로 배양하여 용해시킨 파클리탁셀의 양을 도시한다. 제형은 모두 동일량의 지질(리포좀)과 트레할로스를 함유하였다. 더 농축된 상이한 제형을 물로 희석하여 이들을 수득하였다. 절대 농도를 제외하고, 모든 초기 제형들은 등가물이며 모두 동등하게 처리하였다. 가로좌표는 희석 전의 초기 트레할로스 농도를 표시한다. 어떤 경우나 최종 총 트레할로스 농도는 10%였으므로, 트레할로스 구배는 가로좌표값이 증가함에 따라 증가한다. 표시된 바와 같이, 리포좀에 의해 용해된 파클리탁셀의 양은 트레할로스 구배(희석)에 따라 지속적으로 증가하였다. 리포좀 장입량은 트레할로스 구배의 증가와 더불어 증가하였다.

DOTAP- 및 DOPC-제형

하기의 표는, 제조에 이용된 초기 트레할로스 농도에 의존하는, DOTAP 및 DOPC 리포좀(단일 성분)에 의해 용해된 파클리탁셀의 양을 도시한다.

DOTAP- 및 DOPC-제형
c ₀ 트레할로스(%)	파클리탁셀 농도(μM)
c ₀ 트레할로스(%)	DOTAP	DOPC
9.8	163	159
12.3	192	167
14.7	225	192
17.2	297	224
19.6	289	217
24.5	297	289
29.4	339	221

순수 지질로부터 얻은 리포좀에서, 트레할로스 구배로부터 가용량에 대한 뚜렷한 의존성을 확인하였다. DOTAP 제형에서, 리포좀 내부 및 외부의 트레할로스 농도차가 증가함에 따른 파클리탁셀 장입량의 증가를 DOPTAP/DOPC 제형에 대한 결과에 비교하여 관측하였다. 100% DOPC로 구성된 리포좀은 효과가 뚜렷하지 않았다.

2. 분무-건조후 상이한 트레할로스 구배를 갖는 리포좀에 대한 파클리탁셀의 장입

2.1 개요

이 실시예의 목적은, 트레할로스 형성과 조정 단계 사이에 리포좀을 분무 건조할 경우 파클리탁셀 장입에 관한 삼투 구배의 양성 효과가 존재하는지를 시험하는 것이다. DOTAP/DOPC 리포좀은 두가지 상이한 농도 즉, 10 중량% 트레할로스 용액에서 10 mM 지질농도 및 20 중량% 트레할로스 용액에서 20 mM 지질농도로 제조하였다, 양측 제형은 각각의 농도에서 분무 건조하였다. 분무 건조된 분말은 모두 물을 넣어 10 mM의 지질농도 및 이에 상응하는 10 중량%의 트레할로스 농도로 재구성하였다. 지질 제형은 상술한 바와 같이 파클리탁셀에 노출하고, 용해된 파클리탁셀의 양을 측정하였다. 2중 농도조건 (20 mM 지질/20 중량% 트레할로스)의 제형을 분무 건조하여 얻은 제형은, 단일 농도 조건(10 mM 지질, 10 중량% 트레할로스)의 제형을 분무 건조하여 얻은 경우보다 더 많은 양의 파클리탁셀을 용해한 것으로 확인되었다.

이 결과는, 선택 조건하에서 리포좀 내/외부의 트레할로스 분포가 분무 건조법의 영향을 받지 않았음을 가리킨다. 전자인 이중농축 산물의 재구성 후, 트레할로스 농도 구배를 가진 리포좀을 수득했으며 이는 액상 제형을 직접 희석하는 효과에 상응한다.

2.2 방법

리포좀 형성

에탄올 주입으로 제형을 제조하였다. 에탄올에 용해한 적정량의 지질용액(200 mM DOTAP-Cl, 188 mM DOPC)을 교반하에 물에 용해된 트레할로스 용액에 주입하였다. 20 mM의 리포좀에 대한 트레할로스 농도는 20 중량% 이었으며 10 mM의 리포좀에 대해서는 10 중량% 이었다. 에탄올에 용해된 지질용액의 요구량은 10 mM 제형에 대해서는 2.5 ㎖/ℓ이었고 20 mM 제형의 경우는 5 ㎖이었다.

결과로 나온 다중분산 리포좀 제형을 200 ㎚의 기공크기를 가진 폴리카보네이트 막에 약 5 bar의 압력으로 통과시켜 5회 압출하였다.

분무 건조

분무 건조는 2종 유체 노즐을 구비한 Niro SD 마이크로 분무 건조기를 이용하여 실행하였다. 분무 조건은 다음과 같았다: 유출 온도 = 100℃, 유입 온도 = 145℃, 공급랑 = 340 g/시간, 분무기 기체량 2.3 ㎏/시간, 건조 기체량 30 ㎏/시간.

재구성

앞서의 10 mM 및 20 mM 제형으로부터 얻은 건조 분말에 물을 넣어 10 mM의 액상 농도로 재구성하였다.

파클리탁셀 장입 분석

다음에 기술하는 바와 같이, 리포좀에 대해 파클리탁셀을 장입하였다.

2.3 결과

재구성된 분말에 파클리탁셀을 장입하여 얻은 결과를 다음의 표 2에 나타낸다. 보는 바와 같이, 20 mM 지질농도로 분무 건조한 제형은 10 mM의 초기 지질농도를 가진 제형보다 훨씬 더 많은 파클리탁셀을 용해하였다. 따라서, 전자인 20 mM 제형에 대한 파클리탁셀 장입량 증대는 캡슐화 및 자유 수성상 간의 삼투 구배에 기인한 것으로서, 이는 10 mM 제형의 경우 나타나지 않은 결과인 것으로 판단된다. 분무 건조 및 건조 분말의 재구성은 수성상의 내부와 외부 간 트레할로스 평형을 유도하지 않았으며, 따라서, 상기의 20 mM 제형의 경우 캡슐화 수성상의 삼투질 농도가 더 높았다.

분무 건조 분말의 재구성으로 수득한 제형의 파클리탁셀 용해 지질 및 트레할로스 농도는 양측 경우 (10 mM 지질, 10 중량% 트레할로스)에서 동일하였으나, 분무 건조 전, 제형 중 하나는 10 mM 지질 및 10% 트레할로스이고 다른 하나는 20 mM 지질 및 20% 트레할로스였다
제형의 초기 지질농도	용해된 파클리탁셀의 농도
10 mM (PD_L_07030)	164 (μM)
20 mM (PD_L_07031)	340 (μM)

3. 장입된 리포좀의 안정성

3.1 개요

내부/외부 트레할로스 구배를 갖는 리포좀 조제물이 고 장입량과 함께 파클리탁셀 방출에 관하여 더 우수한 안정성을 갖는지 평가하기 위하여, 리포좀으로부터의 파클리탁셀의 방출을 시간에 대한 함수로서 추적하였다. 상대적으로 높은 파클리탁셀 비율, 즉, 5 몰% 및 0 중량% 내지 20 중량%의 상이한 트레할로스 구배를 가진 제형을 제조하였다. 트레할로스 구배를 가진 리포좀은 21일간의 시험기간 동안 실질적으로 파클리탁셀 방출을 나타내지 않았으며, 반면에 트레할로스 구배가 없는 리포좀의 경우, 파클리탁셀 보유 비율이 1% 미만으로 감소하였다.

3.2 방법

DOTAP/DOPC 제형

약 5 몰%의 파클리탁셀(정확한 값은 표를 참조), 10 내지 30 mM 지질, 및 9.8 중량% 내지 29.4 중량% 트레할로스를 포함하는 DOTAP/DOPC 리포좀을, 각각 소정량의 지질 및 파클리탁셀을 클로로포름 용액에 가함으로써 상술한 필름법에 따라 제조하였다. 그 후, 30 mM 배취에 물을 가하여 10 mM(총 트레할로스 농도 9.8 중량%)의 지질농도로 희석하였다.

시료는 4℃에서 보관했고, 여과 및 HPLC 분석을 이용한 상술한 방법에 따라 0, 1, 5, 14 및 21일에 리포좀의 파클리탁셀 함량을 측정하였다.

3.3 결과

이의 결과를 표 3에 요약한다. 리포좀에 존재하는 파클리탁셀의 농도(㎛)를 표에 나타낸다. 지질농도는 10 mM 이었으며 따라서 100 μM 의 파클리탁셀 농도는1 %의 지질에 대한 몰 농도에 해당한다.

트레할로스 구배가 없는 제형에서, 트레할로스 보유율은 21일 후 100 μM 미만(지질에 있어서 1 몰% 미만)으로 계속 감소하였다. 이와 대조적으로, 트레할로스 구배를 갖는 경우 파클리탁셀 보유량은 400 μM 아래로 떨어지지 않았다. 이 경우는 지속적 감소가 관찰되지 않았다. 다시 말하여, 약 400 μM 의 값은 리포좀 내의 파클리탁셀이 물리적으로 안정한 상태로 존재함을 나타낸다.

DOTAP/DOPC 리포좀의 파클리탁셀 보유율
	트레할로스 농도 구배
	0	10 %	20 %
	리포좀 내 파클리탁세 보유량(μM)
여과 전	470	444	425
여과후 시간 t(d)
0	453	446	411
1	438	428	407
5	391	429	420
14	90	427	412
21	79	409	400

최종 파클리탁셀 보유율은, 유사하게 처리된 리포좀의 장입량 분석에서 얻은 값과 비슷하다. 따라서, 장입량 분석의 데이터를 장입 리포좀의 안정도 한계 예측에 채택할 수 있다. 다른 영향이 없을 경우, 장입량 분석에서 얻은 수치는 소정 조건에서 리포좀이 보유하는 파클리탁셀의 양에 대한 정보를 제공할 것이다. 본 실시예에서 얻은 결론에 따르면, 트레할로스 구배 및 안정도 개선은 수일 동안 충분히 유지되는 것으로 나타난다. 본원에 있어서, 이 효과는 21일간 지속되었다.

4. 리포좀 조제물 자체의 트레할로스 구배를 결정하는 방법

4.1 개요

c₁ 농도의 트레할로스를 함유한 농축 리포좀 제형을 제조하여 물 또는 상이한 비율의 트레할로스 용액으로 희석함으로써 트레할로스 농도 (c₂,)의 매질을 수득하며 여기서 c₂≤c₁이다. 제형은 모두 동일하게 10 mM의 최종 지질농도을 갖는다. 광학 성질(굴절률)의 국소 변화에 근거하여 제형을 분석하였다. 동적 광산란 측정값의 수변화율은 산란 강도 변화를 나타낼 때 사용하였다. 트레할로스 구배, 즉 c₁-c₂가 증가하면, 동적 광산란(PCS) 측정값의 수변화율이 계속 증가하였다.

4.2 방법

동적 광산란은 측각기 BI-200SM(미국 홀트스빌에 소재한 Brookhaven Instruments사 제품)를 이용하여 측정하였다. 90° 각도에서 641 ㎚의 파장을 갖는 30 mW 레이저를 이용하여 측정하였다. 데이터 분석시 최적 정규화 기법을 수반한 역 라플라스 변환을 실시하였다.

4.3 시료

총 지질농도가 30 mM인 DOTAP/DOPC(몰비 1:1) 리포좀을 30% 트레할로스 용액으로 조제하였다. 30 mM 지질 30% 트레할로스 리포좀 조제물을 200개의 압출막에 통과시켜 압출하였다. 그 후, 리포좀을 물, 30% 트레할로스 용액 또는 이의 혼합물을 이용하여 표에 나타낸 비율로 희석하였다.

A: 30% 트레할로스에 용해된 30 mM 리포좀

B: 물에 용해된 30% 트레할로스

C: 물

10 중량% 내지 30 중량% 범위의 트레할로스 농도를 가진 수성상 내의 10 mM 지질 제형에 대한 희석 프로토콜
#	부피 A	부피 B	부피 C	최종 조성
1	1	2	-	30% 트레할로스 내의 10mM 리포좀
2	1	1.5	0.5	25% 트레할로스 내의 10mM 리포좀
3	1	1	1	20% 트레할로스 내의 10mM 리포좀
4	1	0.5	1.5	15% 트레할로스 내의 10mM 리포좀
5	1	-	2	10% 트레할로스 내의 10mM 리포좀

최종 조제물의 지질농도는 항상 10 mM 이었으나, 총 트레할로스 농도는 10%(물로 희석) 내지 30%(30% 트레할로스 용액으로 희석)의 범위에서 변화하였다. 초기 트레할로스 농도가 30% 일 때, 트레할로스 농도 구배의 수치값은 0%(총 농도 = 30%) 내지 20%(총 농도 = 10%) 사이에서 결정되었다. 희석 뒤, 동적 광산란 측정을 실시하였다.

4.4 결과

도 2는 동적 광산란 측정의 결과를 도시한다. 수변화율은 트레할로스 구배의 함수값으로 나타낸다. 수변화율은 트레할로스 증가에 따라 지속적으로 증가하였다. 이러한 결과는 굴절률 구배의 증가 및 트레할로스 구배 증가 대한 팽창 효과와 상호 관계가 있을 수 있다. 리포좀이 이상적인 삼투계 역할을 할 수 있고 또한 삼투 구배를 적절한 조건하에 광산란 및 광흡수 성질에 근거하여 결정할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다(de Gier 1993; Cabral, Hennies et al. 2003). 준-탄성 광산란에 따른 강도 이외에도, 기타의 광산란 기술 및 흡수 혹은 탁도계 측정 등도 이용할 수 있다. 본원의 관찰 결과, 동적 광산란 측정에서 수변화율을 분석하는 방법은 어떤 제형에 있어서 트레할로스 구배의 연속 형성을 제어하는 수단이 될 수 있다. 그 밖에도, 리포좀 현탁물 내의 수성상의 삼투질 농도가 리포좀에 물리적 성질을 부여한다는 사실을 데이터를 통해 확인할 수 있다.

5. 파클리탁셀의 액상 DOTAP/DOPC 리포좀 제형의 물리적 안정성에 미치는 트레할로스 구배의 영향

5.1 개요

본 실시예에서, 실시예 3으로 나타낸 바와 같이, 파클리탁셀의 DOTAP/DOPC 리포좀 제형에 대한 트레할로스 구배의 안정화 효과를 추가로 연구하였다. 리포좀은 30 mM의 농도(32 중량%의 트레할로스 용액 내의)로 조제하고 상이한 트레할로스/물 용액으로 희석한 뒤 기계적 응력을 인가한 후의 파클리탁셀 방출을 측정하였다. 물리적 안정성이 트레할로스 구배의 증가에 따라 증가하는 것으로 확인되었다. 이러한 발견을 통해, 시험운전 규모로 처리하는 경우에도 파클리탁셀 함유 리포좀에 미치는 트레할로스 구배의 안정화 효과를 입증하였다.

5.2 방법과 재료

리포좀 제조

에탄올 주입 기술로 리포좀을 제조하였다. 요약하면, 200 mM DOTAP 및 188 mM DOPC(총 지질농도 388 mM)의 용액을 2 내지 8℃의 온도에서 교반하에 수성상(100 ㎖의 수성상에 대하여 에탄올에 용해된 8.11 ㎖의 지질 용액)에 주입함으로써 30 mM의 지질농도를 갖는 다중분산형 리포좀을 수득하였다. 수성상으로, 184.5 μM 시트르산이 함유된 32.1 중량%의 트레할로스 2수화물 용액을 선택하였다.

지침에 따라 3 bar의 압력에서 220 ㎚의 기공크기를 갖는 폴리카보네이트 막을 이용하여 압출하였다. 역시 지침에 따라, 밀리파크 20 멸균 필터 혹은 2중 기공 막(프랑스 몰샤임에 소재한 Millipore)을 이용하여 멸균 여과를 실시하였다.

농도 구배

30 중량% 트레할로스 용액(PD-L-09111)에 담긴 초기농도 30 mM의 리포좀 제형을 물로 희석하여 상이한 최종 지질농도 및 트레할로스 농도를 갖도록 준비하였다.

시험 시료의 희석
명칭	PD-L-09111 (㎖)	물 (㎖)	C_액상 (mM)	C 트레할로스 (중량%)	△c 트레할로스 (중량%)
PD-L-09111	100	0	30	30	0
PD-L-09112	70	70	15	15	15
PD-L-09113	90	54	18.8	18.8	11.2
PD-L-09114	100	0	30	30	0
PD-L-09115	80	64	16.7	16.7	13.3
PD-L-09116	100	40	21.4	21.4	8.6
PD-L-09119	100	24	25	25	5

안정성 시험

시료를 진탕기에 넣고 150 rpm 및 각각 25℃ 혹은 2 내지 8℃의 온도에서 교반하였다. 24시간 및 48시간 후, 시료를 분석하여 리포좀에 존재하는 파클리탁셀의 양을 측정하였다.

리포좀 조제물의 파클리탁셀 보유/방출 측정

리포좀 조제물을 여과하여 파클리탁셀 결정을 리포좀 산물로부터 제거함으로써, 리포좀의 파클리탁셀 보유력을 조사하였다(실시예 3 참조). 잔류하는 파클리탁셀을 HPLC 분석으로 정량분석하였다. 또한, 파클리탁셀 결정에 대해 시료를 조사하기 위해 광학 현미경법을 이용하였다.

5.3 결과

이의 결과를 표 6 내지 12에 수록한다. 편의를 위해, 트레할로스의 초기농도는 대략 30 중량%로 한다. 도시한 바와 같이 농도 구배는 초기 트레할로스 농도와 희석비율에 기초하여 계산한다. 캡슐화와 자유 활성상 간의 실제 농도 구배는 동일한 경향을 나타내지만 절대값은 표에 주어진 것과 약간 다를 수 있다.

표에 나타낸 바와 같이, 안정성을 트레할로스 구배의 증가에 따라 증가한다.

T리포좀 보유 파클리탁셀의 양이 증가하며 파클리탁셀 결정은 감소하는 것으로 관측된다, 안정성은 25℃ 보다 5℃에서 더 높았다.

0% 트레할로스 구배에서의 안정성
입자수			온도 (℃)	시간 (시간)	여과시 손실된 PXL (%)	현미경 측정시의 결정
> 1 μM	> 1μM	> 25 μM
PD-L-09111	30	0	5	24	<5	없음
PD-L-09111	30	0	5	24	8	있음
PD-L-09111	30	0	5	48	8	있음
PD-L-09111	30	0	5	48	19	있음
PD-L-09111	30	0	25	24	86	있음
PD-L-09111	30	0	25	24	86	있음
PD-L-09111	30	0	25	48	85	있음
PD-L-09111	30	0	25	48	85	있음

5% 트레할로스 구배에서의 안정성
시료	C_지질 (mM)	△C_tre (중량%)	온도 (℃)	시간 (시간)	여과시 손실된 PXL(%)	연미경 측정시의 결정
PD-L-09119	25	5	5	24	<5	없음
PD-L-09119	25	5	5	24	<5	없음
PD-L-09119	25	5	5	48	<5	없음
PD-L-09119	25	5	5	48	<5	없음
PD-L-09119	25	5	25	24	29	있음
PD-L-09119	25	5	25	24	44	있음
PD-L-09119	25	5	25	48	70	있음
PD-L-09119	25	5	25	48	69	있음

8.6% 트레할로스 구배에서의 안정성
시료	C_지질 (mM)	△C_tre (중량%)	온도 (℃)	시간 (h)	여과시 손실된 PXL (%)	현미경 측정시의 결정
PD-L-09116	21.4	8.6	5	24	<5	없음
PD-L-09116	21.4	8.6	5	24	<5	엾음
PD-L-09116	21.4	8.6	5	48	<5	없음
PD-L-09116	21.4	8.6	5	48	<5	없음
PD-L-09116	21.4	8.6	40	24	<5	없음
PD-L-09116	21.4	8.6	40	24	<5	없음
PD-L-09116	21.4	8.6	40	48	<5	있음
PD-L-09116	21.4	8.6	40	48	<5	있음

11.2% 트레할로스 구배에서의 안정성
시료	C_지질(mM)	△C_tre (중량%)	온도 (℃)	시간 (h)	여과시 손실된 PXL (%)	현미경 측정시의 결정
PD-L-09113	18.8	11.2	5	24	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	5	24	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	5	48	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	5	48	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	40	24	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	40	24	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	40	48	<5	없음
PD-L-09113	18.8	11.2	40	48	<5	없음

13.3% 트레할로스 구배에서의 안정성
시료	C_지질(mM)	△C_tre (중량%)	온도 (℃)	시간 (h)	여과시 손실된 PXL (%)	현미경측정시의 결정
PD-L-09115	16.7	13.3	5	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	5	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	5	48	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	5	48	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	48	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	48	<5	없음

13.3% 트레할로스 구배에서의 안정성
시료	C_지질(mM)	△C_tre (중량%)	온도 (℃)	시간 (h)	여과시 손실된 PXL (%)	현미경 측정시의 결정
PD-L-09115	16.7	13.3	5	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	5	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	5	48	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	5	48	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	24	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	48	<5	없음
PD-L-09115	16.7	13.3	40	48	<5	없음

15% 트레할로스 구배에서의 안정성
시료	C_지질(mM)	△C_tre (중량%)	온도 (℃)	시간 (h)	여과시 손실된 PXL (%)	현미경 측정시의 결정
PD-L-09112	15	15	5	24	<5	없음
PD-L-09112	15	15	5	24	<5	없음
PD-L-09112	15	15	5	48	<5	없음
PD-L-09112	15	15	5	48	<5	없음
PD-L-09112	15	15	40	24	<5	없음
PD-L-09112	15	15	40	24	<5	없음
PD-L-09112	15	15	40	48	<5	없음
PD-L-09112	15	15	40	48	<5	없음

6. 분무-건조된 파클리탁셀 장입 리포좀의 안정성

6.1 방법과 재료

상기 실시예에서 기술한 바와 같이 재료를 이용하였다.

DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀(몰비 50/47/3)로 구성된 리포좀을 상술한 바와 같이 에탄올 주입법으로 형성하였다. 파클리탁셀은 에탄올 용액의 지질에 용해되었다. 20 중량%의 트레할로스에 함유된 20 mM 지질농도의 리포좀(배취 PD-L-09031) 및 10 중량%의 트레할로스에 함유된 10 mM 지질농도의 리포좀(배취 MDG09.108-08-001 및 PD-L-09032)을 제조하였다. 이들 각 리포좀은 200 ㎚ 기공크기의 폴리카보네이트 막을 통해 5회 압출한 뒤 상술한 바와 같이 멸균 여과하였다.

리포좀 현탁물 제조후, 리포좀을 탈수하였다. 배취 PD-L-09031 및 PD-L-09031을 상기 실시예 2에서 기술한 분무 건조 변수와 함께 Niro SD-Micro 분무 건조기를 이용하여 분무 건조하였다.

배취 MDG09.108-08-001는 Epsilon 2-12D(Christ) 냉동 건조장치를 이용하여 냉동건조법에 따라 탈수처리하였다. 리포좀 현탁물은 4℃에서 1시간 동안 유지한 후-40℃에서 5시간 동안 냉동시켰다. 냉동 후, 온도를 -16℃로 상승시키고 1차 건조를 0.1 bar의 압력에서 90시간 동안 실행하였다. 2차 건조에서, 온도는 20℃로 증가하는 한편 0.01 bar로 감압하였다.

건조 분말은 물을 이용하여 10.5 중량%의 트레할로스에서 10 mM의 지질농도로 재구성하였다. 결과로 나온 액상 리포좀 산물을 재구성뒤 1시간 후 및 24시간 후에 각각, Malvern Zetasizer 1000 HSA, Series DTS5101(설정: 분석 = mono modal, 확장 = 1.2; 다항수 = 3; 제1점 선택 = 18; 종점 선택 = By Number 22; 가중점 = quatric; 감쇠기 = x16; 점도 1.200 cp; 굴절률 = 1,348; 측정횟수 = 3; 측정간 지연 = 0; 측정기간 = 자동)를 이용하여 광산란 측정법에 따라 조사함으로써 Z_평균 및 PI을 측정하였다. 측정에 앞서, 0.5 중량%의 트레할로스 탈수 용액을 이용하여 시료를 10배로 희석하였다.

6.2 결과

이의 결과를 표 13에 수록한다.

재수화 산물과 동일한 지질농도 및 트레할로스 농도로 분무 건조한 제형에 관한 확인 결과는, 2중 농축 액상 공급물로부터 분무된 산물과는 실질적으로 상이하였으며, 트레할로스 구배는 재수화 과정에서 발생하였다. 농도 구배가 없는 제형은 매우 큰 Z_ave 및 PI 값을 나타냈으며 재구성 후 24시간 내에 증가한 반면, 농도 구배를 가진 제형은 이러한 증가 현상을 나타내지 않았다. Z_평균 및 PI의 증가는 농도 구배가 없고 안정성이 떨어지는 제형에서 파클리탁셀이 방출되는 것과 관계가 있을 것으로 판단된다. 이 데이터는 실시예 2의 결과에 따른 것으로서, 2중 농도에서의분무 건조 및 후속으로 트레할로스 구배를 생성한 후에 수득한 리포좀에 더 많은 파클리탁셀이 장입될 수 있다. 고 트레할로스 농도의 파클로탁셀 리포좀 제형을 분무 건조하고 그 후 트레할로스 구배를 생성하면 재구성 후의 제형의 안정성이 개선된다.

분무 건조된 시료와 비교하여, 상술한 냉동건조 제형은 재구성 후에 벌써 훨씬 높은 PI를 나타냈다.

탈수 및 재수화 방법의 비교
배취	△C_{트레할로스}	1 시간		24 시간
배취	△C_{트레할로스}	Z_평균(nm)	PI	Z_평균(nm)	PI
MDG09.108-08-001	0%	170.3	0.480	175.4	0.493
PD-L-09032	0%	167	0.331	260	0.65
PD-L-09031	10 %	160.8	0.203	160.5	0.199

7. 대규모 제조 및 분무 건조

7.1 재료

7.1.1 기본 재료

- USP 반합성 파클리탁셀 API, Phyton Biotech, Lot CP209N0014

- DOTAP-CI, Merck Eprova AG, Lot MBA-020

- DOPC, 아반티 폴라 리피드사 GN181PC-12

- α,α-트레할로스 2수화물 고순도(저 엔도톡신), Ferro Pfanstiehl, Lot 33205A

- 무수 에탄올 EP, Nova Laboratories Art.-Nr. A4478B

- 시트르산 1수화물 EP/USP, Nova Laboratories Art.-Nr. V290

- 주입용수, Nova Laboratories Art.-Nr. A15210C

7.1.2 장비

- 주입 모세관 ID: 2 ㎜

- 필터 카트리지 멤트릭스 PC 0.2 pm, GE사, 제품번호 MPC92O5FHV, 로트 60240937

- 멸균 필터 Opticap XL4, 0.22 pm Durapore 막, Millipore사, 제품번호 KVGLAO4TT3, 로트: COCA1 0972

- 제형-용기(Nova Laboratories Ltd.)

- 압출기-용기(Nova Laboratories Ltd.)

- 생균수 시험-환원-용기(Nova Laboratories Ltd.)

- 저장 용기(Nova Laboratories Ltd.)

- 연동 펌프(Nova Laboratories Ltd.)

- 급수관 탑재의 20 ℓ-압력 용기(Nova Laboratories Ltd.)

- 버터플라이식 통풍구(Nova Laboratories Ltd.)

- ASD-1 무균 분무건조기(GEA Niro S/A, Copemhagen Denmark)

7.2 방법

7.2.1 액상 제형의 제조

7.2.1.1 유기용액의 조제

배취(001)에 대해, 349.3g DOTAP-CL을 700g의 무수에탄올에 용해시키고 이를 대략 4시간 동안 교반하였다. 369.5 g의 DOPC를 700g의 무수에탄올에 용해시키고 다시 대략 3시간 동안 교반하였다. 후속으로, 2개의 지질 용액을 혼합하여 25.617 g 파클리탁셀에 가하였다. 결과로 나온 유기용액을 약 2시간 동안 교반하고 마지막으로 무수에탄올을 총 중량인 2122.5 g이 될 때까지 가하였다. 배취(002 내지 004) 역시 이와 마찬가지로 준비하였다.

7.2.1.2 수용액의 제조

배취(001)에 대해, 10819g의 트레할로스 2수화물을 제형에 주입하기 위해 약 20 ㎏의 물에 첨가한 뒤 700 rpm에서 90분간 교반하였다. 그 뒤, 1.28 g의 시트르산 1수화물을 더 가하고 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 수용액의 최종 부피를 34.53 ㎏로 조정하여 추가로 10분간 교반하였다. 배취(002 내지 004) 역시 이와 마찬가지로 준비하였다.

7.2.1.3 에탄올 주입

배취(001)에 대해, 연동펌프를 이용하여 약 250 g/분의 주입량으로 유기용액을 수용액에 주입하였다. 주입시, 용액을 약 500 rpm으로 교반하였다. 주입 완료후, 용액을 600 rpm으로 2분간 교반한 뒤 다시 700 rpm으로 1분간 교반하였다. 총 주입 공정에서 온도는 8℃ 이하로 유지하였다. 배취(002 내지 004)는 주입시 550 rpm으로 교반하며 그 후에 추가 교반할 필요는 없다.

7.2.1.4 압출

5" 필터 카트리지에서 0.2 pm 폴리카보네이트 막으로 8회에 걸쳐 압출하였다. 필터 카트리지는 각각 0.4 내지 0.5 bar의 압력으로 통기하고 3.0 bar의 압력으로 압출하였다. 온도를 8℃ 이하로 유지하였다.

7.2.1.5 희석

8회차 압출이 종료된 후, 제형의 중량을 측정하였다. 1.106 g/㎖의 제형 밀도를 기준으로, 20 mM의 제형을 수득하기 위해 필요한 물의 양을 계산했으며(총 지질농도 기준), 이 양은 1:1.5의 희석률에 대응한다. 배취(001)에 대하여, 주입에 필요한 양의 물을 연동펌프를 이용하여 2 ㎜ ID의 모세관을 통해 1.66 ℓ/분의 유량으로 첨가했고, 이 용액을 약 500 rpm으로 교반하였다. 주입용으로 첨가하는 물은 제형에 첨가하기 앞서서 8℃ 이하로 냉각하였다. 배취(002 내지 004)의 경우, 0.62 ℓ/분 내지 0.83 ℓ/분의 양으로 또한 약 600 rpm의 교반속도로 희석처리하였다.

7.2.1.6 생균수 환원

생균수 환원(1차 멸균 여과)에 앞서, OpticapXL4 필터를 약 0.5 bar의 압력으로 20ℓ의 주입용 물로 세정하였다. 여과 및 필터의 통기를 중력측정 방식으로 수행하였다. 여과는 2.5 bar의 압력으로 수행했으며 이때의 압력은 신속히 인가되었다. 제형의 온도는 8℃ 이하로 유지하였다.

7.2.1.7 멸균 여과

멸균 여과 전에, OpticapXL4 필터를 약 0.5 bar의 압력으로 20 ℓ의 주입용 물로 세정하였다. 0.5 bar의 압력으로 필터의 통기를 수행하였다. 2.5 bar의 압력으로 여과를 수행하고, 이때의 압력은 신속히 인가하였다. 제형의 온도는 8℃ 이하로 유지하였다.

7.2.2 분무-건조

리포좀 제형을 ASD-1 무균 분무-건조기에서 분무 건조하였다(GEA Niro S/A, Copenhagen 덴마크). 배취(001)를 단일 배취로서 건조시켰고(실험 1), 반면에 (배취(002 내지 004)는 연속식으로 순차대로 분무하였다(실험 2). 분무-건조에 있어서, 2종 유체 노즐, 건조 기체인 질소, 및 하기와 같은 변수를 사용하였다:

분무 건조 설정값
변수	설정점
건조 기체량	80 ㎏/시간
분무기-기체압	3 bar
분무기-기체량	3 ㎏/시간
유출 온도	95℃
공급량	2 ℓ/시간
공급온도	0℃ 내지 30℃

7.3. 리포좀 안정성

7.3.1. 방법

실험 1에서 얻은 탈수 리포좀 조성물을 주입용 물에 재수화시켜 총 지지 농도인 10 mM에 도달함으로써 재구성 조건에서, 탈수 전에 20 mM 이었더 조제물의 삼투 구배가 증가하였다. 비교를 위해, 이에 상응하는 리포좀 조성물(기준 배취)을 희석 없이 제조하고 냉동건조 방식으로 탈수처리하였다(예컨대, WO 2004/002468에 개시된 바와 같다). 리포좀이 보유한 파클리탁셀(파클리탁셀 분해산물)의 양을 실시예 1.3에서 설명한 방법에 따라 리포좀 재구성 후에 또한 25℃에서 24시간 후에 측정하였다. 보유된 파클리탁셀 및 여과가능한 (결정화된) 파클리탁셀의 백분율을 조제물에 존재하는 파클리탁셀의 총량을 기준으로 계산하였다.

7.3.2. 결과

반응 산물로부터 파클리탁셀 방출
제조	T0		25℃에서 24시간후
시간	리포솜 내 보유된 파클리탁셀[%]	여과성 파클리탁셀 [%]	리포좀 내 보유된 파클리탁셀[%]	여과성 파클리탁셀 [%]
실험 1	99.56	0.44	99.89	0.11
	99.93	0.07	100.09	-0.09
	99.67	0.33	99.87	0.13
기준 배취	99.63	0.37	98.88	1.12
	99.48	0.52	98.68	1.32
	99.72	0.28	99.16	0.84

상기 데이터는, 삼투 구배 없이 제조된 리포좀 조제물이 파클리탁셀을 신속히 방출하는 것을 보여준다. 이는 24시간의 비교적 단기간 후에 관측할 수 있었다.

7.4. 입자크기 및 다중분산성 분석

7.4.1. 방법

입자크기(평균) 및 다중분산 지수(PI)을 제타사이저 Nano ZS(Malvern Insstruments)를 이용하여 PCS(173°회절)에 따라 측정하였다. 요약하면, 실험 1(배취 1에 대응) 및 실험 2(배취 2 내지 4에 대응)과 또한 시료형 기준 배취(상기 참조)에서 시료를 취해 물에 재현탁하여 10 mM의 총 지질농도를 얻었다. 측정시 시료는 10.5 중량%의 트레할로스 탈수액을 이용하여 10배로 희석하였다. 시료를 25℃에서 24시간 동안 보관한 후 다시 측정하였다.

다음의 설정치를 측정 및 데이터 분석에 이용하였다:

측정 방식 = 크기; 시료: 재료 = 폴리스티렌 지수, RI: 1.590; 흡수율: 0.01; 분산제 = 10.5% 트레할로스, 온도 25℃, 점도 1.200 cP, RI: 1.342; 일반 조건 = Mark-Houwink 변수; 온도 = 25℃, 평형 시간: 5 분; 셀 = DTS0012 - 1회용 사이징 큐벳; 측정: 실험 횟수 = 15; 실험 기간(초) = 100; 측정 횟수 = 3; 측정간 지체; 진행 = 고정위치 4.65, 감쇠기 6; 분석 변수: 분석 모드 = 일반; 누적분석: 다항차수 = 3; 가중치 기법 = 2차원; 누적점 선택: 제1점 자동선택 = Yes; 종점 선택법 = 컷오프; 신호발생 비율 = 0.1; 확장 = 1.2; 표시범위: 하한값 = 0.6; 상한값 = 10000; 필터링: 필터 인자 = 75; 다중방식-분석: 결과 변환 = Mie; 사용 결과 변환 = Yes; 가중치 기법 = 2차원; 해상도 = 정상; 다중모드 - 점선택; 제1점 자동선택 = Yes; 종점 선택법 = 컷오프 신호발생 비율 = 0.01; 확장 = 1.2; 크기군: 크기군의 수 = 70; 하한값 = 0.4; 상한값 = 10000; 임계치: 하한 임계치= 0.05; 상한 임계치 = 0.01; 필터 인자 = 디폴트.

상기의 결과를 표 16에 나타낸다:

시료		z 평균 (nm)	PI
기준 배취		133	0.337
실험 1	배취 1	143	0.16
실험 2	배취 2	138	0.15
	배취 3	143	0.17
	배취 4	144	0.19

삼투 구배를 갖고 제조되며 분무-건조에 의해 탈수된 제형(실험 1 및 2)은, 삼투 구배 없이 제조되고 냉동건조로 탈수처리된 기준 시료와 비교시, 매우 유사한 Z_평균을 나타낸 반면 PI값은 훨씬 작았다. 따라서, 상술한 방법에 따라 제조한 산물이 공지 방법에 따라 제조한 산물보다 더 균질하다.

7.5. 초원심분리 특성화

7.5.1. 방법

초원심분리의 분석은 Nanolytics사(Potsdam, 독일)에서 수행하였다.

각 시료는 H₂O 및 H₂O:D₂O의 1:1 혼합물에서 재구성하여 10 mM의 지질농도를 얻었고 실온에서 1시간 동안 평형화하였다. 그 수, 시료를 각종 용매로 1:1로 희석하였다. 다시 1시간 평형화한 후 시료를 초원심분리하였다. 400㎕의 각종 리포좀 분산물을 광경로가 12 ㎜인 티타늄 초원심분리 큐벳에 넣었다. Rayleigh 간섭 광학기가 장착된 An50Ti 8-플레이스 로터(Beckmann-Coulter, Palo Alto)를 사용하는 Optima XL-I 분석형 원심분리기(Beckmann-Coulter, Palo Alto)로 20000 rpm 및 25℃에서 시료를 원심분리하였다. 원심분리 과정에서 반경 좌표에 따른 농도 프로파일은 용액 내 굴절률 구배에 의해 결정되었다. 시료는 중복 측정하였다.

7.5.2. 데이터 분석

7.5.2.1 침전계수의 정의

분석형 원심분리에서 초기 지표는 다음과 같이 정의되는 침전계수이다:

(1)

여기서 u는 입자의 침전속도이며, m은 입자의 질량이고,

는 비용적이고,

는 마찰 항이고

는 용매의 밀도이다.

침전계수의 결정

침전계수는 다음과 같이 별도의 가정 없이, 측정된 데이터로부터 직접 계산한다:

(2)

여기서

은 회전축에 대한 거리이고,

은 매니스커스이다. 실행 시간 적분

는 측정창치로 결정한다.

7.5.2.3 침전계수 분포

특정 반경에서의 단일 침전계수 대신, 전체 r-축을 s-축으로 변환할 수 있다. 각 위치에서의 프린지 위상(fringe shift)은 여기에 존재하는 입자 종류의 질량 농도에 비례하므로 측정된 진폭을 y-좌표로 채택할 수 있다. 단, 방사형 희석에 관하여 y-좌표를 보정해야 한다. 보정항을 포함하면 다음과 같은 함수 g(s)를 얻으며 이것으로 속도 s로 침전하는 상기 입자 종류의 질량 농도를 구할 수 있다:

(3)

농도 c, 각각의 c0은 프린지 위상 단위로 부여되며 각 프린지는 전체 상과 동등하므로 간섭패턴의 명암선이 생긴다. 크기는 g/ℓ 단위의 농도와 직접 비례하며 이 경우 굴절률 증분은 모든 종류의 입자에서 동등한 것으로 가정할 수 있다. 본원의 시료가 화학적으로 균일한 물질인 경우 다음과 같이 다분산 분포로 간단히 나타낸다:

(4)

여기서 φ는 프린지 위상 단위의 농도이며, λ는 레이저 파장이고, l은 큐벳의 폭이며, 또한

는 소정 용매에 함유된 용질의 굴절률 증분이다. 이와 같은 비례성 때문에, 식(3)에서의 농도는 질량 농도로 직접 명시할 수 있다.

(혹은 이의 적분형

)를 기본적으로 스캔 좌표변환 및 식(3)에 따른 y-좌표 계산을 통해 산출할 수 있으며; 전체 결과는 주로 반복되는 스캔을 평균화 하여 구한다. 따라서, 모든 스캔에 대해 전체 데이터 피팅을 행하는 것이 타당하다. 따라서, 시간 및 공간 독립적 노이즈를 분리하고, 추가로 통계적 노이즈는 분할하여 전제 측정 데이터로부터 최상의

를 얻는다. Peter Schuck의 SedFit v12.4. 소프트웨어를 피팅 작업에 사용하였다.

7.5.2.4 침전계수 분포의 해석

함수

형태의 침전계수 분포는 상기 분포의 정보를 이미 제공하고 있으며, 대개는 1차 측정 변수 s 를 입자의 직경이나 질량으로 변환하는 것이 바람직하다. 침전계수는 다음의 스베드베리(SVEDBERG) 식과 같이:

(5)

확산계수를 통해 몰 질량과 관계가 있다. 본 발명의 리포좀과 같이 구형 물체의 경우 확산계수는 구체의 직경으로 대체할 수 있으며, 따라서 리포좀에 물을 충전하면, 침전이 아니라 마찰에 영향을 미치게 될 것으로 예상된다. 상기 식(5)에서 확산계수를 다음과 같은 스톡스-아인슈타인(STOKES-EINSTEIN)-식으로 대체하고,

(6)

구체의 직경을 d=2Rh, 물의 용적률을

라고 할 경우; 상기의 스베드베리 식은 다음과 같다:

(7)

여기서 η 는 용매의 점도이며

는 용질의 밀도이다.

침전계수 분포를 크기 분포로 전환할 때, 리포좀의 팽윤과 밀도는 일정하게 유지하거나 침전계수에 의존하는 분포로 특정한다. 이에 따라, 밀도 값을 실험적으로 구한다.

7.5.2.5 밀도 변화의 분석

침전하는 입자의 밀도는 상이한 밀도를 갖는 2개의 용매를 이용하여 분석형 초원심분리법으로 측정할 수 있다. 저밀도를 갖는 용매는, 주변 용매에 대한 밀도차가 감소할 경우, 입자는 보통 s-값이 작을수록 입자 침전이 느려지는 것을 볼 수 있다. 동일한 입자를 가리키는 양쪽 s-값은, 각종 용매에 관한 변수와 함께 식(7)을 만족한다. 2종의 용매 (목록 1 및 2)에 대해서는 다음의 식을 적용한다:

(8)

상기 식의 양변에 있는 입자의 무수밀도

및 팽창 변수

는 같은 물체를 말하므로 동일하다. 동일한 입자들은 동일한 y-좌표

를 갖는 침전계수 분포의 성분으로 정의한다.

상기의 식(8)은 무수밀도를 구하기 위해 다음과 같이 재정렬 및 간소화 할 수 있다:

(9)

직경은 다음의 식으로부터 유래할 수 있다:

(10)

상기 식(10)을 풀기 위해서는 입자 직경 등의 독립된 정보가 필요하며 이것은 상술한 동적광산란 실험에서 실험적으로 결정할 수 있다.

7.5.3. 결과

리포좀 조제물의 무수밀도
제조 실험	시료	무수밀도 (g/㎖)
실험 1	시료 1	1.183
실험 2	시료 1	1.174
	시료 2	1.154
	시료 3	1.223

참조 문헌

Antonietti, M. and S. Forster(2003). "Vesicles and liposomes: A self-assembly principle beyond lipids." Advanced Materials 15(16): 1323-1333.

Bangham A. D., Standish M. M., Watkins, J.C. (1965). "Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids" J. Mol. Biol. 13: 238-52.

Cabral, E. C. et al. (2003). "Preparation and characterization of diacetylene polymerized liposomes for detection of autoantibodies" J Liposome Res 13(3-4): 199-211.

De Gier, J. (1993). "Osmotic behaviour and permeability properties of liposomes." Chem Phys Lipids 64(1-3): 187-196.

Ertel, A., A. G. Marangoni, et al.(1993). "Mechanical properties of vesicles. I. Coordinated analysis of osmotic swelling and lysis." Biophysical Journal 64(2): 426-434.

Evans, D.F. and Wennerstr H.(1994). "The Colloidal Domain" VHC Publishers, Inc., New York, pp 48-49.

Goormaghtigh, E. and G. A. Scarborough(1986). "Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation." Anal Biochem 159(1): 122-31.

Gregoriadis G.(1995). "Engineering liposomes for drug delivery: Progress and problems" Trends in biotechnology 13(12): 527-537.

Hallett, F. R., J. Marsh, et al.(1993). "Mechanical properties of vesicles. II. A model for osmotic swelling and lysis." Biophysical Journal 64(2): 435-442.

Huang, C.H., Charlton, J.P.(1971) "Determination of partial specific volumes by sedimentation velocity method" The Journal of Biological Chemistry, 246(8): 2555-2560.

Koppel, D. E.(1972). "Analysis of macromolecular polydispersity in intensity correlation spectroscopy: the method of cumulants." Journal of Chemical Physics 57(11): 4814-4820.

New et al.(1990). Liposomes. A Practical Approach. Oxford University Press. Pages 33-104).

Claims

리포좀 조제물의 제조방법으로서,
a) 수성상(aqueous phase)에 리포좀의 현탁물을 포함하는 제1 리포좀 조제물을 제공하는 단계로서, 상기 리포좀은 적어도 하나의 막을 포함하되, 상기 막은 상기 수성상의 리포좀으로 캡슐화된 부피를 둘러싸고, 상기 수성상은 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질을 포함하며 초기 총 삼투질 농도(O₁)를 갖고, 상기 제1 리포좀 조제물은 상기 리포좀 막 내 적어도 하나의 활성 작용제를 포함하는 것인, 제1 리포좀 조제물의 제공 단계;
b) 그 후, 상기 조제물의 수성상에서 삼투 구배(osmolar gradient)를 발생시키는 단계로서, 상기 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 상기 수성상의 삼투질 농도(O_out)는 상기 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 상기 수성상의 삼투질 농도(O_in)보다 낮아 제2 리포좀 조제물을 수득하고, 또한 적어도 하나의 활성 작용제는 상기 제2 리포좀 조제물의 리포좀 막 내에 함입되는 것인 삼투 구배 발생 단계;
c) 상기 제2 리포좀 조제물을 탈수처리하여 탈수된 조제물을 수득하는 단계; 및
d) 선택적으로, 상기 탈수된 조제물을 재수화 처리하는 단계;
를 포함하고,
상기 리포좀은 DOTAP 및 DOPC의 혼합물을 포함하고,
상기 삼투적으로 활성인 물질은 당류이고,
상기 활성 작용제는 1 초과의 log P 값을 가지는 탁산이고,
상기 탈수된 조제물은 분무 건조에 의해 탈수된 조제물인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)는 상기 단계 a)의 상기 리포좀 조제물의 상기 수성상의 상기 초기 총 삼투질 농도(O₁)를 감소시킴으로써 수행되어, 상기 삼투질 농도(O₁)보다 낮은 총 삼투질 농도(O₂)를 갖는 응력 리포좀 조제물을 수득하는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)는 단계 a)의 상기 리포좀 조제물을 O₁보다 낮은 삼투질 농도를 갖는 수성 매질로 희석함으로써 수행되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)는 단계 a)의 리포좀 조제물을 O₁보다 낮은 삼투질 농도를 가진 수성 매질에 투석처리함으로써 수행되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 b)는:
b1) 단계 a)의 상기 리포좀 조제물을 탈수처리하여 탈수된 리포좀 조제물을 수득하는 단계; 및
b2) 수성 매질 내에서, 응력 리포좀 조제물을 수득하기 위해 상기 탈수된 리포좀 조제물을 재수화하는 단계에 의해 수행되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제5항에 있어서, 제5항의 b2)에서의 재수화에 사용된 수성 매질의 부피는 제5항의 b1)에서의 소정량의 탈수된 리포좀 조성물을 수득하기 위해 탈수처리된 탈수 리포좀 조제물의 부피보다 더 큰 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제2항에 있어서, O₂는 O₁보다 적어도 10 mOsm 작은 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 리포좀으로 캡슐화된 부피 외부의 상기 수성상과 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부의 수성상 사이의 삼투 구배는 리포좀 조제물의 제조과정 중 여러 단계에서 1차 혹은 다수회 변경되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 탈수처리는 실온보다 높은 온도에서 수행되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
적어도 하나의 친유성 작용제를 포함하는 리포좀 조제물을 제조하는 방법으로서,
i) 응력 리포좀 조제물을 제공하는 단계;
ii) 상기 응력 리포좀 조제물을 적어도 하나의 친유성 활성 작용제와 함께 선택적으로 불용해 형태로 배양하여 상기 리포좀 막 내에 적어도 하나의 친유성 활성 작용제를 함입시켜 응력 리포좀 조제물을 수득하는 단계; 및
iii) 선택적으로, 불용해된 화합물을 리포좀 조제물로부터 분리하는 단계;
를 포함하고,
상기 단계 i)은 리포좀 조제물을 제공함으로써 수행되되, 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질이 상기 조제물의 수성상에 함유되며 또한 상기 수성상은 상기 리포좀으로 캡슐화된 부피의 외부보다 상기 리포좀으로 캡슐화된 부피 내부에서 더 큰 삼투질 농도를 갖는 것이고,
상기 리포좀은 DOTAP 및 DOPC의 혼합물을 포함하고,
상기 삼투적으로 활성인 물질은 당류이고,
상기 활성 작용제는 1 초과의 log P 값을 가지는 탁산인 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
삭제
제10항에 있어서, 상기 단계 iii)은 여과 또는 원심분리에 의해 수행되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질이 상기 리포좀의 내부 및 외부에 존재하는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 당류는 모노-, 다이-, 올리고- 혹은 다당류 중에서 선택되는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 당류는 트레할로스를 포함하는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 치료학적으로 혹은 진단학적으로 활성인 화합물인 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 친유성 화합물인 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 25℃의 물 중에서 0.1 ㎎/㎖ 이하의 용해도를 갖는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 상기 리포좀의 막 격실에 배타적으로 존재하는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 기재된 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 리포좀 조제물.
제21항에 있어서, 탈수된 형태 혹은 수성 현탁물 형태로 존재하는 것인, 리포좀 조제물.
제22항에 있어서, 유동성 분말인 것인, 탈수된 리포좀 조제물.
수성상에 리포좀 현탁물을 포함하는 리포좀 조제물로서, 상기 리포좀은 적어도 하나의 막을 포함하고, 적어도 하나의 활성 작용제가 상기 리포좀 막에 존재하며 적어도 하나의 삼투적으로 활성인 물질이 상기 수성상에 존재하되, 상기 리포좀 내부의 상기 수성상의 삼투질 농도(O_in)는 상기 리포좀 외부의 상기 수성상의 삼투질 농도(O_out)보다 높고,
상기 리포좀은 DOTAP 및 DOPC의 혼합물을 포함하고,
상기 삼투적으로 활성인 물질은 당류이고,
상기 활성 작용제는 1 초과의 log P 값을 가지는 탁산이며,
상기 O_in과 O_out의 차이는 50 내지 2000 mOsm인 것인, 리포좀 조제물.
제21항 또는 제24항에 있어서, 상기 삼투적으로 활성인 물질은 제15항 또는 제16항에서 정의된 것인, 리포좀 조제물.
제21항 또는 제24항에 있어서, 상기 활성 작용제는 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 정의된 것인, 리포좀 조제물.
제21항 또는 제24항에 있어서, 약제학적 용도로 사용되는 것인, 리포좀 조제물.
삭제
제21항 또는 제24항에 있어서, 진단용 조제물 용도를 위한 것인, 리포좀 조제물.
제21항에 있어서, 상기 리포좀 조제물은 탈수된 리포좀 조제물을 재수화하여 수득한 수성 용액 내 리포좀 현탁물을 포함하고, 상기 탈수된 리포좀 조제물을 얻기 위해 탈수처리를 거칠 상기 리포좀 조제물에 대해, 1.5배 미만의 상이한 평균직경(Z_평균) 및 2배 미만의 상이한 다중분산 지수(PI) 값을 특징으로 하고, 상기 탈수된 리포좀 조제물은 분무 건조에 의해 탈수된 리포좀 조제물인, 리포좀 조제물.
제30항에 있어서, 재구성 뒤 1시간 후의 상기 PI가 0.4 미만인 것인, 리포좀 조제물.
제21항에 있어서, 상기 리포좀 조제물은 탈수된 리포좀 조제물을 재수화하여 수득한 수성상에 리포좀 현탁물을 포함하고, 25℃에서 24시간에 걸쳐 1.5배 이하의 평균직경(Z_평균) 변화 및 2배 이하의 다중분산 지수(PI) 값의 변화를 특징으로 하고, 상기 탈수된 리포좀 조제물은 분무 건조에 의해 탈수된 리포좀 조제물인, 리포좀 조제물.
제30항 내지 제32항 중 어느 항에 있어서, 상기 리포좀은 상기 리포좀 막 내 최고 5 몰까지%의 파클리탁셀을 포함하는 것인, 리포좀 조제물.
제30항 또는 제32항에 있어서, 리포좀은 DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀을 50:47:3의 몰비로 포함하는 것인 리포좀 조제물.
10 mM의 총 지질농도에서 DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀을 포함하는 리포좀, 및 10 ㎎/㎖ 내지 9.79 ㎎/㎖의 트레할로스를 포함하는 수성상 내 현탁된 트레할로스 포함하되, 상기 리포좀은 적어도 1.1 g/㎖의 무수밀도를 가지며,
리포좀 내부의 수성상의 삼투질 농도(O_in)는 리포좀 외부의 수성상의 삼투질 농도(O_out)보다 높되, O_in과 O_out의 차이는 50 내지 2000 mOsm인, 리포좀 현탁물.
제35항에 있어서, DOTAP, DOPC 및 파클리탁셀이 50:47:3의 몰비로 포함되는 것인 리포좀 현탁물.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 리포좀 현탁물은 시트르산을 포함하는 것인 리포좀 현탁물.
제35항에 있어서, 상기 리포좀은 140 ㎚의 Z_평균을 갖는 것인 리포좀 현탁물.
제2항에 있어서, O₂는 O₁보다 적어도 50 mOsm 작은 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제2항에 있어서, O₂는 O₁보다 적어도 100 mOsm 작은 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 활성 작용제는 2 초과의 log P 값을 갖는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 활성 작용제는 3 초과의 log P 값을 갖는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 25℃의 물 중에서 0.01 ㎎/㎖ 이하의 용해도를 갖는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 25℃의 물 중에서 0.001 ㎎/㎖ 이하의 용해도를 갖는 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 활성 작용제는 파클리탁셀인 것인, 리포좀 조제물의 제조방법.
제21항 또는 제24항에 있어서, 암 치료 용도로 사용되는 것인, 리포좀 조제물.
제30항에 있어서, 재구성 뒤 1시간 후의 상기 PI가 0.3 미만인 것인, 리포좀 조제물.
제30항에 있어서, 재구성 뒤 1시간 후의 상기 PI가 0.25 미만인 것인, 리포좀 조제물.
제32항에 있어서, 25℃에서 24시간에 걸쳐 1.25배 이하의 상기 평균직경(Z_평균) 변화를 특징으로 하는, 리포좀 조제물.
제32항에 있어서, 25℃에서 24시간에 걸쳐 1.5배 이하의 다중분산 지수(PI) 값의 변화를 특징으로 하는, 리포좀 조제물.
제30항 내지 제32항 중 어느 항에 있어서, 상기 리포좀은 상기 리포좀 막 내 최고 3 몰까지%의 파클리탁셀을 포함하는 것인, 리포좀 조제물.