CN103002876B - 亲脂性化合物的改进脂质体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对被脂质体膜显著溶解的药物和/或诊断活性剂和/或化妆剂具有增强的负载容量的脂质体的制备、具有关于可由该方法获得的脂质体中的活性剂和/或化妆剂的释放的增强稳定性的脂质体分散体，以及包含所述稳定化脂质体分散体的药物或化妆组合物。该制备可能涉及可通过喷雾干燥进行的脂质体分散体的脱水和再水化步骤。

Description

亲脂性化合物的改进脂质体制剂

发明领域

本发明涉及对被脂质体膜显著溶解的药物和/或诊断活性剂和/或化妆剂具有增强的负载容量的脂质体的制备、具有关于可由该方法获得的脂质体中的活性剂和/或化妆剂的释放的增强稳定性的脂质体分散体，以及包含所述稳定化脂质体分散体的药物或化妆组合物。该制备可能涉及可通过喷雾干燥进行的脂质体分散体的脱水和再水化步骤。

发明背景

脂质体是由封闭水性区室的单层或多层膜组成的人工囊状结构。最典型地，脂质体膜由脂质双层形成，但是它们还可以由包括其他类型的两亲物、聚合物和多肽在内的其他单体或聚合的两亲性化合物组成(Antonietti和Forster2003)。当脂质在合适的条件下分散在水性环境中时，脂质体自发地形成。大多数脂质体具有无毒、非抗原性和生物可降解特性，因为它们具有哺乳动物膜的分子特征。可以将亲脂性或两亲性药物和化合物掺入到脂质体膜中，可以将亲水性药物和化合物包封在脂质体的水性核中。

在最近几年中，脂质体已成为药物工业中用于递送药物的重要工具(Gregoriadis1995)。脂质体能够通过使药物在身体中持续释放来影响药物动力学，或者通过限制药物的游离浓度来减轻副作用。通过使配体附连至脂质体或赋予它们电荷，脂质体使得药物容易被靶向递送至期望作用部位。除了药物应用之外，脂质体还经常地用于化妆产品中。

如果在药物或化妆品应用内将脂质体用于活性剂的施用，则重要的是要控制和优化活性化合物在脂质体制剂上的负载效率(loadingefficacy)，以及负载有活性化合物或化妆化合物的脂质体制剂的稳定性。制剂的稳定性是制剂制造、储存和应用期间的关键特性。在许多情况下，脂质体产品的物理或化学稳定性受到限制，在计划产品的制造工艺(保持时间)、储存(架藏稳定性)和应用(使用期稳定性)时必须考虑到这一点。

对于药物应用，脂质体制剂常通过注射施用。因而，脂质体必须存在于处于适合于静脉内(iv)或腹膜内(ip)施用的条件下的水相中。

药物脂质体制剂需要达到极其严格的质量标准。大多数现存脂质体产品在较长的储存期内是不稳定的，因为它们会经历多种化学和物理降解过程。然而，对于药物产品，希望最终制剂在室温下或在冷藏温度下在至少六个月至两年内是稳定的。这些因素限制了脂质体作为生物活性化合物的实用载体的应用。为满足这些要求，已开发出对于脂质体的脱水技术。

当脂质体制剂被脱水并且作为干燥制剂形式而不是液体制剂形式储存时，它们的长期稳定性大大增强。在注射之前，必须使干燥脂质体产品在合适的水性介质中再水化，以产生用于施用的水性混悬液。因为再水化脂质体制剂的稳定性可能再次受到化学和物理降解过程的限制，所以所述即用型脂质体混悬液的使用期稳定性的增强是药物制剂技术的另一个重要目标。

通过冷冻干燥进行的水性脂质体混悬液的常用稳定方法描述于美国专利第4,229,360号和第4,247,411号中。在冷冻干燥方法中，脂质体混悬液被冷冻并随后经受减压，其导致冷冻水经由升华除去。通常，水性混悬液包含赋形剂如糖，以阻止由冷冻和脱水诱导的缺陷形成或者将由冷冻和脱水诱导的缺陷形成减至最低。冷冻干燥程序产生在保护性赋形剂基体中的脂质体，再水化之后从其获得先前的液体产品。如US4,880,635中公开的，通过使脂质体外部和内部都存在保护性糖，可以保护脂质体免受脱水和再水化步骤的有害影响。

如例如在US5,089,181中公开的喷雾干燥方法提供了用于制备稳定的脱水脂质体制剂的替代方法。该方法是由食品工业改造而来，并且采用了通过喷雾混悬液而使所述混悬液变成小液滴的雾化，以及随后在高温下进行的液滴中的介质的蒸发。与冷冻干燥方法中的一样，该脂质体混悬液可以包含赋形剂例如糖，以保护脂质体膜。与冷冻干燥相比较，喷雾干燥方法具有关于大规模工业应用的相当多的优点，因为它使得较大的制造能力能够利用可管理的技术成果以较低的成本实现。然而，这种方法中涉及的高温会对包封的活性剂以及给脂质体膜施加应力。

为了稳定用于喷雾干燥的、包含包封在脂质体中的水溶性药物的混悬液，US4,895,719公开了用周围介质的均匀高同渗容摩平衡由可溶性药物的高内部浓度产生的高内部同渗容摩。

为了稳定在脂质体水相中的疏水性药物，WO2007/005754公开了在包封之前使此类药物与环糊精络合。络合的疏水性药物以高浓度保留在脂质体中，甚至在存在由环糊精引起的跨膜渗透梯度的情况下亦是如此。但是，没有公开包埋在脂质体膜中的活性剂的稳定化。

在脂质体膜内部或外部的渗透活性溶质如糖或离子的存在产生渗透力。文献中已探讨跨膜渗透梯度作用于生物膜的结构和动力学的方式，并且已经提出用于描述诸如应力应变关系和裂解的现象的模型(Ertel,Marangoni等，1993；Hallett,Marsh等，1993)。简言之，该作者的实验和附随的分析强调了脂质体在给定渗透应力下的溶胀取决于它们的粒度。描述了直到粒度依赖性临界屈服点的溶胀，在粒度依赖性临界屈服点处裂解(泄漏)发生。给出有望使脂质体处于一致的应变状态的条件。

关于储存寿命得到延长的包含亲脂性药物的脂质体的生产，WO2004/002468公开了包含紫杉醇的脂质体的制备。该脂质体在包含海藻糖的水性缓冲液中形成，从而产生在脂质体内部和外部具有相同的同渗容摩的脂质体混悬液。随后使该水性脂质体混悬液脱水。该脱水过程可以通过冷冻干燥或喷雾干燥进行。该申请公开了用于冷冻干燥所述脂质体混悬液的数种方案。在脱水后，可以通过加入水或水溶液使脂质体制备品再水化。该文献没有提供关于通过冷冻干燥或喷雾干燥脱水的脂质体制备品在再水化之前的使用期稳定性的比较数据。

鉴于所描述的技术状态，构成本发明基础的问题是这样的脂质体制备品，其包含至少一种亲脂性活性剂和/或化妆剂、具有高的试剂脂质比，并且具有尤其关于物理稳定性和试剂从脂质体的释放的增强的稳定性。本发明尤其涉及有关提供用于制造在制造期间具有延长的保持时间并且具有使用期稳定性的所述脂质体制备品的方法的问题，其中所述方法涉及快速脱水步骤。

因而，上述问题根据本发明通过提供特征描绘在权利要求书中并进一步描述在本发明的说明书中的实施方案而得到解决。

发明概述

上述问题的解决方案由渗透力在脂质体膜上施加拉伸应力的脂质体制备品，和用于制备所述脂质体制备品的方法提供。

具体地，所述解决方案由用于制备在水相中的具有存在于脂质体膜中的至少一种活性剂和/或化妆剂的脂质体混悬液的方法提供，其中所述混悬液包含在水相中的至少一种渗透活性物质，并且其中在脂质体包封的体积内部的水相的同渗容摩O_内高于在脂质体包封的体积外部的水相的同渗容摩O_外。

该脂质体的特征在于脂质体膜上存在拉伸应力(受应力的脂质体)。拉伸应力可以在脂质体形成期间或者在脂质体形成之后的任何加工步骤中直接获得。

受应力的脂质体可以通过直接影响在脂质体内部和/或外部的水相的同渗容摩来获得，或者当脂质体存在于具有给定同渗容摩的介质中时通过改变脂质体膜的膜特征如分子堆积来获得。

受应力的脂质体可以直接被制备成含有存在于脂质体膜中的活性剂和/或化妆剂。或者，受应力的脂质体可以被制备成不含所述试剂，所述试剂随后被添加到脂质体中。

本发明的方面涉及用于制造脂质体制备品的方法，其包括：

a)提供包含脂质体在水相中的混悬液的第一脂质体制备品，其中该脂质体包含至少一层膜，其中该膜封闭脂质体包封的水相体积，并且该水相包含至少一种渗透活性物质并且具有初始总同渗容摩O₁，b)此后在所述制备品的水相中创建渗透梯度，其中在脂质体包封的体积外部的水相的同渗容摩O_外低于在脂质体包封的体积内部的水相的同渗容摩O_内，从而产生第二(受应力的)脂质体制备品，

c)任选地使第二(受应力的)脂质体制备品脱水从而获得脱水制备品，以及

d)任选地使脱水制备品再水化。

步骤a)的脂质体制备品优选在脂质体膜中包含至少一种活性剂或化妆剂。或者，该活性剂或化妆剂可以在该制造方法的后期添加。

步骤b)可以通过降低从步骤a)获得的脂质体混悬液的初始总同渗容摩O₁从而产生具有低于同渗容摩O₁的总同渗容摩O₂的受应力的脂质体制备品来进行。

步骤b)可以通过用具有低于O₁的同渗容摩的水性介质稀释从步骤a)获得的脂质体混悬液，或者通过针对具有低于O₁的同渗容摩的水性介质透析该混悬液来进行。在最简单的方式中，用水稀释该脂质体混悬液。

根据本发明的一般概念，可以在脂质体制备品制造期间的不同阶段创建或改变渗透梯度。此外，可以在该生产方法的数个阶段中一次或多次地改变渗透梯度。这可能可以通过如下面描述的相同或不同程序实现。脂质体制备品的生产方法涉及在脂质体混悬液最终应用之前进行的所有步骤。

本发明方法的步骤b)可以包括以下步骤：

b1)使步骤a)中的脂质体制备品脱水从而获得脱水脂质体制备品，和

b2)使所述脱水脂质体制备品在用于产生受应力的脂质体制备品的条件下，优选在水性介质中再水化。

优选通过喷雾干燥脂质体混悬液进行脱水。

本发明还涉及通过上述方法获得的或可通过上述方法获得的组合物。

此外，本发明涉及在脂质体膜中包含至少一种活性剂或化妆剂的脂质体制备品，其中该脂质体膜处于拉伸应力下。

更具体地，本发明涉及在脂质体膜中包含至少一种活性剂或化妆剂的脂质体制备品，其中该脂质体存在于液相中，该液相在脂质体包封的体积内部的同渗容摩(O_内)高于该液相在脂质体包封的体积外部的同渗容摩(O_外)。

惊人地，本发明人已发现含有脂质体膜处于拉伸应力下的脂质体的脂质体混悬液对亲脂性化合物有增强的溶解能力。

因而，本发明还涉及用于制造包含至少一种亲脂性药物或化妆化合物的脂质体制备品的方法，其包括以下步骤：

i)提供包含脂质体在水相中的混悬液的受应力的脂质体制备品，

ii)将所述受应力的脂质体制备品与任选地为不溶解形式的至少一种亲脂性活性剂或化妆剂一起温育，和

iii)任选地使不溶解试剂与脂质体制备品分离，优选通过过滤或离心进行，

iv)任选地使温育的脂质体制备品脱水，以及

v)任选地使脱水的脂质体制备品再水化。

受应力的脂质体可以通过上述程序中的任一程序获得。最优选地，至少一种渗透活性物质存在于脂质体混悬液的水相中，其中O_内高于O_外。

上述活性剂或化妆剂优选在水中具有低溶解度。

上述活性剂或化妆剂是亲脂性物质，并且优选具有大于1的logP。更优选该化合物是紫杉烷，最优选紫杉醇或其衍生物。

已惊人地发现，如果使脂质体膜受到应力，特别地，如果使水溶性的渗透活性化合物以比其在脂质体包封的水相的外部的浓度高的浓度包含在脂质体包封的水相中，则可以提高亲脂性的水溶性差的化合物如紫杉醇在脂质体膜上的负载效率，并且可以减少此类化合物从脂质体膜的释放。亲脂性化合物在这些脂质体上的负载效率与其在无浓度梯度的脂质体上的负载效率相比较高，这使得制造具有较高化合物/脂质摩尔比的制剂成为可能，并使得改进给定制剂的稳定性成为可能，因为该化合物从脂质体释放的趋势减小。

如果存在所述渗透梯度，那么在膜区室中包含亲脂性试剂的脂质体不太容易将该化合物释放到水性介质中。所述亲脂性物质在水性介质中的平衡分数降低。因此，亲脂性化合物在水相中的浓度超过溶解度极限并沉淀析出的风险也降低。

而且，已惊人地发现包含上述梯度的空脂质体对亲脂性化合物有较高的负载能力，即，相同量的脂质体(如通过脂质摩尔量定义的)与无此种梯度的脂质体相比能够溶解较高摩尔量的亲脂性化合物。这可以例如通过使亲脂性化合物暴露于空脂质体中来实现。

还惊人地发现通过使先前脱水的脂质体再水化获得的脂质体制备品具有均质粒度分布，如低的多分散性指数(PI)所指示的。就质量控制而言，总是希望获得均质产品，尤其对于药物应用而言更是如此。此外，本发明的脂质体混悬液显示出在延长的一段时间内基本上保持不变的多分散性指数。这指示本发明混悬液中的脂质体没有形成聚集体。尤其对于静脉内施用的脂质体混悬液而言，必须避免聚集体，因为这些聚集体可以阻塞血管并因而导致栓塞(embolies)。

本发明通过提供用于使在脂质体制备品的脂质体膜中的亲脂性试剂稳定，以及维持再水化脂质体制备品的粒度和多分散性的方法而显著改进了现有技术状态。因此，可以延长包含具有亲脂性化合物的脂质体的最终制备品的使用期稳定性。此外，可以延长所述脂质体在此类制剂的加工期间的稳定性。

在许多情况下，在脂质体制剂的制造期间用于加工液体制剂的时间(保持时间)受到限制，因为存在试剂从脂质体中不期望地释放的风险。本发明降低了药物释放的风险，因此使得能够在制造期间连续地加工脂质体延长的时间尺度，并且使得该生产方法能够具有更灵活的设计。

更具体地，本发明使得能够通过喷雾干燥而不是冷冻干燥制备上述制剂。在冷冻干燥中，脂质体在制造后立即被冷冻并因而被稳定化，因此在制造期间释放的风险低。在喷雾干燥中，液体制剂要经受在液相中的延长的保持时间，因为给定批料的喷雾可能需要数个小时或数日。因为本发明使得能够增加给定制剂的稳定性，所以可以实现较长时间的喷雾而无需中断。因为喷雾干燥与冷冻干燥相比具有较高的总产量，所以有利于大规模生产并且在维持产品质量的同时可以降低生产成本。

进一步地，降低了在介于脱水脂质体组合物的复水和患者施用之间的时间段中的药物释放和结晶(使用期稳定性)的风险。结晶可能会促进在显微镜下才能看到的颗粒的形成，这种颗粒在用于静脉内施用的产品中的存在量不得超出某些极限值。在许多情况下，仅提供了几个小时的使用期稳定性，这是临床实践中的障碍。因此，足够长的使用期稳定性对于此类药物或化妆产品的实际应用极为重要。

脂质体的制备经常采用有机溶剂，如乙醇，其通常存在于脱水脂质体产品中，并因此存在于由脱水脂质体产品获得的再水化脂质体混悬液中。这在通过冷冻干燥(冻干)脱水的脂质体制备品的情况下尤其如此。然而，希望用于应用于人的脂质体产品包含尽可能少的有机溶剂。本发明使得能够通过喷雾干燥脱水，喷雾干燥有利于除去大部分或所有残留有机溶剂，同时使脂质体具有高稳定性。

在提供上述优点的同时，本发明可以容易地实践并且不是成本密集型。它既不需要复杂的技术设备，也不需要向上述组合物中添加进一步的成分。用于实践本发明的渗透活性物质可从如US4,880,635或WO2004/002468中公开的脱水的脂质体组合物中得知。

定义

与量值结合的“约”是指基于指示值的最高+/-20%，优选+/-10%的平均偏差。例如，约30mol%阳离子脂质的量是指相对于总脂质/两亲物摩尔浓度的30mol%+/-6mol%，优选30mol%+/-3mol%的阳离子脂质。

“活性化合物”或“活性剂”是指具有特定生物或物理活性的化合物或化合物的混合物，该化合物或化合物的混合物基于所述生物或物理活性可以用作用于诊断、预防或治疗人或动物疾病或病状的试剂。诸如药物物质的治疗剂和诊断剂是根据本发明的活性剂的重要实例。

在本发明内的脂质体的“无水密度”意指包括被所述脂质体包封的化合物在内的构成所述脂质体的所有化合物的质量(但不包括包含在此类脂质体中的水的质量)除以基于脂质体粒度z_平均的水相中的脂质体体积。在非常具体的实例中，脂质体的无水密度可以指包含在脂质体中的DOTAP、DOPC、紫杉醇、柠檬酸和海藻糖的质量除以水相中的脂质体的体积。脂质体的无水密度可以通过如实施例中公开的超速离心法确定。

如本文使用的“水性介质”、“水性液体”或“水相”是指包含水的液体材料。在一些实施方案中，该液体材料包含至少50%(w/w)、至少70%(w/w)或至少90%(w/w)的水。在其他实施方案中，该液体材料不含有机溶剂。该水相可以含有一种或数种化合物。因而，水性分散体、水性混悬液以及连续相为水相的乳液也是水性液体的实例。含有胶体材料的水性液体在后文有时称为水性胶体分散体或溶液。

“阳离子的”是指在各自的环境条件下具有净正电荷或正zeta电位的试剂。在本发明中，它是指pH在介于3和9之间，优选介于5和8之间的范围内的环境条件。

亲脂性化合物的“化学稳定性”是指它的原始化学结构的显著变化，并且被定义为与初始测定值(原始化合物)相比的约5%，优选约2%的活性变化，或者超出其在毒理学限制和安全方面的验收标准的特定降解产物的出现。对于亲脂性化合物如紫杉醇，化学稳定性可以通过HPLC/LCMS/MS定义，并且通常是指所述化合物的少于5%的降解产物。紫杉醇的典型降解产物是例如巴卡亭III(Baccatinlll)、7-表紫杉醇等(MonographyofPaclitaxel,USP26,[2003年1月-3月],USPC,Inc)。

“化妆化合物”是指对人皮肤或毛发具有影响的化合物。

“诊断活性剂”或“诊断的”是指可用来通过各种方法预见在受试者或样品中的生物学特性或状态的药学上可接受的试剂。该预见可以用来作出诊断。

“脱水”或“使……脱水”是指从组合物中抽出水的方法。在一些实施方案中，从组合物中抽出水直至残留量小于基于在脱水程序之前存在的水含量的约10%(w/w)，优选小于基于在脱水程序之前存在的水含量的约5%(w/w)。

“包封体积”或“包封相”是指被至少一层脂质体膜封闭的体积。该体积可以被单层脂质体中的一层膜或多层脂质体中的数层膜封闭。因而，包封相代表在脂质体内部的空间，而在脂质体包封的体积外部的体积或“游离(水)相”代表围绕脂质体的空间。在多层脂质体的情况下，术语包封相和游离相是指与来自多层脂质体的给定膜相邻的内部和外部体积。

“保持时间”是指在脂质体制剂的制造期间用于加工液体制剂的时间段。

如本文使用的“粒度均一性”是指粒群的粒度分布。高的粒度均一性或窄的粒度分布以低的多分散性指数为特征。

“脂质”是指它作为包括脂肪、脂质、原生质的不溶于水的醇-醚可溶成分的总称的常规含义。脂质通常由亲水性部分和疏水性部分组成。在水中，脂质可以自我组织从而形成双层膜，在该双层膜中，亲水性部分(头基)朝向水相，而亲脂性部分(酰基链)包埋在双层核中。脂质还可以包含两个亲水性部分(双头基两亲物(bolaamphiphile))。在该情况下，膜可以由单脂质层，而不是双层形成。在本发明上下文中的脂质的典型实例为脂肪、脂肪油、精油、蜡、类固醇、甾醇、磷脂、糖脂、硫脂、氨基脂、色脂，和脂肪酸。该术语包括天然存在的脂质和合成的脂质。与本发明有关的优选脂质为：类固醇和甾醇，特别是胆固醇、磷脂，包括磷脂酰基、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，以及鞘磷脂。若存在脂肪酸，则它们的长度可以为含有多达6个双键的约12-24碳链。该脂肪酸连接至主链，该主链可以源自甘油。在一种脂质内的脂肪酸可以不同(不对称)，或者可能仅存在1个脂肪酸链，例如溶血卵磷脂。混合的制剂也是可能的，特别是当非阳离子脂质源自天然来源如从蛋黄、牛心脏、脑、肝或大豆中纯化的卵磷脂(磷脂酰胆碱)时更是如此。

“脂质体”是具有各种尺寸和结构的人工的自封闭式囊状结构物，其中一层或多层膜包封水性核。最典型的脂质体膜由脂质双层膜形成，其中亲水性头基朝向水性环境，而脂质链包埋在亲脂性核中。脂质体也可以由其他两亲性单体和聚合分子如诸如嵌段共聚物的聚合物，或多肽形成。单层囊泡是由封闭水性空间的单层膜界定的脂质体。相比之下，寡层或多层囊泡是由数层膜组成的。通常，该膜大约4nm厚，并且由天然或合成来源的两亲性脂质如磷脂构成。任选地，可以通过掺入其他脂质如甾醇或胆酸衍生物来修改该膜的特性。具有基于具有低相转变温度(即，低于体温)的磷脂的特别柔性的膜的脂质体有时称为传递体。

“脂质体混悬液”是指包含在水性介质中的脂质体的组合物。

“脂质体制备品”或“脂质体组合物”是指包含脂质体的任何组合物，其包括脂质体混悬液或通过脱水从所述混悬液获得的脱水组合物。

“亲脂性”是指化合物优先溶解在类似脂肪(例如烃)的相如基本上由脂质构成的相中的特性。化合物的亲脂特性可以通过分配系数(logP)描述。在本发明上下文中，目标化合物具有大于约1，更优选大于约2，最优选大于约3的logP。

“logP”是指在25℃下化合物在水与辛醇相之间的分配系数。一般而言，较高的logP数值意味着试剂较容易溶于辛醇中。logP被定义为([试剂在辛醇中的浓度]/[试剂在水中的浓度])。本领域技术人员熟知某种化合物的logP可以如何通过实验确定。

“低的水中溶解度”是指在不存在促进溶解性的添加剂的情况下在25℃在生理pH下化合物在水中的溶解度低于0.1mg/ml，更优选低于0.01mg/ml，最优选低于0.001mg/ml。

脂质体混悬液的“总同渗容摩”等于存在于一定体积的所述混悬液中的渗透活性物质的总量除以所述混悬液的体积。对于总同渗容摩的计算，同样要考虑在混悬液中的脂质体包封的体积内部和外部的渗透活性物质。在本发明上下文中，缩写O₁和O₂是指总同渗容摩。

“O_内”和“O_外”是指在自封闭式脂质体膜内部和外部的同渗容摩。对于单层脂质体，O_外是游离水相的同渗容摩，而O_内是包封体积的同渗容摩。对于多层脂质体，O_内和O_外是指在每个单独自封闭式膜的内部和外部的同渗容摩。在本发明上下文中，O_内大于O_外的情形特别重要。O_内与O_外的相对差可以通过离心技术，例如通过分析或制备离心或超速离心探查。因为通常渗透活性化合物会改变水相的密度，所以O_内与O_外的差值可以由脂质体的沉降行为来确认(Goormaghtigh和Scarborough1986,Huang和Charlton1971)。另外，渗透梯度会影响脂质体膜的结构参数，例如可以通过诸如X射线或中子散射的方法，或脂质体粒度来确定，例如可以通过光和X射线散射确定。

在本发明上下文中的“渗透活性物质”是指可溶于水、不能显著地透过脂质体膜的物质。典型的实例是例如可被有效地捕获在脂质体中的离子或糖，如葡萄糖或海藻糖，而水分子展现出高透过率，因而在本发明上下文中，水不被认为是渗透活性物质。对不同化合物的透过选择性是脂质体的关键特征(Bangham等，1965)。化合物穿过膜的透过率取决于膜组成、相态和其他边界条件。

“同渗容摩”是存在于水溶液中的溶质的摩尔浓度总和，所述溶质包括生物活性物质和任何辅助物分子，如用来减慢活性剂的释放速率的渗透赋形剂。如果该溶质以解离形式、离子化形式或聚集形式存在，则同渗容摩被定义为解离形式、离子化形式或聚集形式的摩尔浓度总和。溶液中的任何溶质对溶液的同渗容摩的贡献近似等于溶质在溶液中的浓度除以它的分子量。因而，作为一般原则，溶质的分子量越大，该溶质的同渗容摩就越小，而且该溶质对溶液的总同渗容摩的贡献就越小。同渗容摩的差值可以根据可通过物理化学中的既定方法确定的各种物理化学参数，如密度、电子密度、折射率或粘度来确定。

“带负电荷的脂质”是指具有负净电荷的脂质。

“药物组合物”是指两种或更多种不同组分的组合，该组合具有与任一组分所具有的药物特性不同的药物特性。在本发明中，该两种或更多种组分是指任选地与药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂合并在一起的脂质分散体或胶体分散体和活性剂。

脂质体的“物理稳定性”是指脂质体物理状态的变化。当物理状态得到维持时，脂质体是稳定的。物理稳定性的一个重要方面是包埋在脂质体膜中的化合物向脂质体混悬液的水性介质中的释放。化合物的释放是物理不稳定性的特征。化合物从膜的释放可以导致该化合物在水性介质中的浓度和聚集增加。在紫杉烷的情况下，通过紫杉烷针状物的形成可以看到聚集。紫杉烷的结晶可以通过液体脂质体制剂的目视检查、光学显微术、光阻测量或光散射来测量。脂质体粒度和粒度分布也是脂质体混悬液的物理状态的特征。

“多分散性”是在给定颗粒样品，例如脂质体混悬液中的粒度分布宽度。多分散性的一个量度由如通过光子相关光谱法(PCS)数据的累积分析获得的多分散性指数(PI)提供。

“多分散性指数”(PI)是如从来自光子相关光谱法(PCS)测量的结果的所谓累积分析获得的无量纲数(Koppel1972)。累积分析能够实现PCS数据的无模型拟合，从该拟合获得作为粒度的量度的Z_平均，和作为多分散性的量度的PI值。这些参数的计算定义在ISO标准文档13321:1996E中。在粒度测量的上下文中，术语PCS和动态光散射(DLS)经常作为同义词使用。这种技术测量由于颗粒作布朗运动而发生的散射光强度的时间依赖性波动。这些强度波动的分析能够确定转化成粒度分布的颗粒扩散系数。在本发明的含义内，PI和Z_平均按实施例6中公开的方法确定。

“光子相关光谱法”是测量由于颗粒作布朗运动而发生的散射光强度的时间依赖性波动的一种技术。这些强度波动的分析能够确定转化成粒度分布的颗粒扩散系数。在粒度测量的上下文中，PCS和DLS经常作为同义词使用。

“带正电荷的脂质”用作阳离子脂质的同义词(其定义参见“阳离子脂质”的定义)。在本发明中，它是指pH在介于3与9之间，优选介于5与8之间的范围内的环境。

“稳定性”可以指脂质体的物理稳定性以及包含在脂质体中的单一组分(例如，脂质和活性化合物)的化学稳定性。

“受应力的脂质体”或“受应力的脂质体制备品”是指脂质体膜处在拉伸应力下的脂质体和包含此类脂质体的制备品。

在本发明上下文中的在脂质体膜上的“拉伸应力”可以通过应用介于在脂质体包封的体积内部的水相和在脂质体包封的体积外部的水相之间的渗透活性化合物的浓度梯度来施加。如果内部同渗容摩O_内高于外部同渗容摩O_外，则这将导致由渗透力引起的介于包封体积和游离体积之间的压力梯度ΔP增加。过剩压力被在脂质体膜处的表面张力γ平衡，其中压力梯度与表面张力之间的相关性由熟知的Young-Laplace方程(Evans和1994)给出。

$\mathrm{\γ}=\frac{\mathrm{\ΔP}\·r}{2}$

(式1)

对于本发明的脂质体系统，必须要考虑到施加的表面张力会导致脂质体膜的面积扩大，所述脂质体膜的面积扩大可以导致半径、包封体积的变化，并因此导致包封体积的同渗容摩的变化。作为表面张力的函数的面积扩大值ΔA取决于该膜的弹性模量κ，并由Young方程得出：

$\frac{\mathrm{\ΔA}}{A}=\frac{\mathrm{\γ}}{\mathrm{\κ}}$

(式2)

式1明确指出，表面张力与压力之间的关系是半径依赖性的。在给定压力梯度下，表面张力随着半径的增大而增大。在大脂质体中的面积增加量以及相应的脂质体的粒度增加量比较小脂质体中的大。对于具有给定表面张力的系统，如肥皂泡，压力梯度p_内部–p_外部随着半径的减小而增大，或者，换言之，随着曲率的增大而增大。

“治疗活性剂”或“治疗剂”是指阻止动物，特别是哺乳动物，优选人中的病理病状，或者减轻动物，特别是哺乳动物，优选人中的病理病状的程度的试剂。

“小分子”是指具有小于约2000Da的分子量的分子。

“Zeta电位”是指测得的在水性环境中的胶体颗粒的静电位，该静电位是利用诸如Zetasizer3000的仪器使用LaserDoppler微电泳在pH约为7.5的约0.05mMKCl溶液中测量的。Zeta电位描述了在介于本体溶液与具有水流剪切力的区域或扩散层之间的界面处的电位。该术语与“电动电位”同义，因为它是向外起作用(actoutwardly)并且引起颗粒电动行为的颗粒的电位。

发明详述

用于制造脂质体制备品的本发明方法可以通过下列步骤进行：

a)提供包含脂质体在水相中的混悬液的第一脂质体制备品，其中该脂质体包含至少一层膜，其中该膜封闭脂质体包封的水相体积，并且该水相包含至少一种渗透活性物质并且具有初始总同渗容摩O₁，此后

b)在所述制备品的水相中创建渗透梯度，其中在脂质体包封的体积外部的水相的同渗容摩O_外低于在脂质体包封的体积内部的水相的同渗容摩O_内，从而产生第二(受应力)脂质体制备品，

c)任选地使第二(受应力)脂质体制备品脱水从而获得脱水制备品，以及

d)任选地使脱水制备品再水化。

步骤a)的脂质体制备品优选包含至少一种存在于脂质体膜中的亲脂性试剂。但是，该亲脂性试剂也可以在生产方法的后期添加。

步骤b)可以通过降低从步骤a)获得的脂质体制备品的初始总同渗容摩O₁从而产生具有低于同渗容摩O₁的总同渗容摩O₂的受应力的脂质体制备品来进行。

在本发明的上下文内，降低总同渗容摩O₁涉及初始降低在脂质体包封的体积外部的水性介质的同渗容摩O_外的方法。如果初始在所有区室中采用相同的浓度，O₁=O_外=O_内，则稀释首先仅影响游离水相O_外，导致O_外<O_内。因此在脂质体包封的体积内部与外部之间产生渗透梯度。很容易理解，在渗透梯度的存在下，脂质体可以溶胀，因为水分子可以透过该膜。所以，作为稀释的次级效应，包封的水性介质的同渗容摩O₂也可能会降低至一定程度。同渗容摩的绝对变化取决于各种因素，诸如包封体积的分数、脂质体粒度、膜弹性(杨氏模量)等。因而，在稀释之后，O₁与O₂之间的比率和O_内与O_外之间的比率不一定相同。

然而，游离的非包封水相中的同渗容摩的降低将会导致介于包封相的外部和内部之间的同渗容摩梯度O_内-O_外增大。如果响应于渗透应力的溶胀发生至超出一定倍数(factor)，则可能会形成膜缺陷，从而允许溶质从具有较高同渗容摩的相释放到具有较低同渗容摩的相中。这将会降低渗透梯度和渗透应力。该膜可以在最大拉伸应力和对于孔形成的渗透梯度的最大临界极限的条件下重新密封。所以，从某种意义上来说该系统可以被认为是自我稳定的，即，如果不考虑具体情况而应用过大的梯度，则该系统将会采用最大渗透梯度状态。此种影响可以被认为对于制造期间的可再现条件的确保是有利的。

在本发明上下文内使用的脂质体可以包含中性脂质、阴离子脂质和/或阳离子脂质。中性或阴离子脂质可以选自带有中性或负净电荷的甾醇或脂质，如胆固醇、磷脂、溶血脂质、溶血磷脂、鞘脂或聚乙二醇化脂质。有用的中性和阴离子脂质因此包括：磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇(不限于特定糖)，脂肪酸，含有羧酸基团的甾醇，例如胆固醇，1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，包括但不限于1,2-二油基磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-双十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1,2-二酰基-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二硬脂基磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈基磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(DMPC)，优选蛋PC、大豆PC的磷脂酰胆碱，以及鞘磷脂。连接至甘油主链的脂肪酸不限于特定的长度或双键数目。磷脂也可以具有两种不同的脂肪酸。优选进一步的磷脂在室温下处于液体结晶状态，并且它们与所使用的阳离子脂质以它们被应用的比率混溶(即，可以形成均匀相并且没有发生相分离或域(domain)形成)。在优选的实施方案中，中性脂质是1,2-二油基磷脂酰胆碱(DOPC)。

脂质体制备品的优选阳离子脂质为N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵盐，例如甲基硫酸盐。TAP(三甲基铵甲基硫酸盐)脂质家族的优选代表物为DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)，或DSTAP(二硬脂酰基-)。对于本发明有用的其他脂质可以包括：DDAB、二甲基双十八烷基溴化铵；1,2-二酰氧基-3-三甲基铵丙烷，(包括但不限于：二油酰基、二肉豆蔻酰基、二月桂酰基、二棕榈酰基和二硬脂酰基；两条不同的酰基链也可以连接至甘油主链)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N-二甲基胺(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷，(包括但不限于：二油酰基、二肉豆蔻酰基、二月桂酰基、二棕榈酰基和二硬脂酰基；两条不同的酰基链也可以连接至甘油主链)；N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；1,2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷，(包括但不限于：二油基、二肉豆蔻基、二月桂基、二棕榈基和二硬脂基；两条不同的烷基链也可以连接至甘油主链)；双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)；3β-[N-(N',N'-二甲基氨基-乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2,3-二油酰氧基-N-(2-(精胺羧酰胺基)-乙基)-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)；β-丙氨酰胆固醇；鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)；双C14-脒；N-叔丁基-N'-十四烷基-3-十四烷基氨基-丙酸脒；14Dea2；N-(α-三甲基铵基乙酰基)双十二烷基-D-谷氨酸氯化物(TMAG)；O,O'-双十四烷酰基-N-(三甲基铵基-乙酰基)二乙醇胺氯化物；1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基(spermyl))-丙基酰胺(DOSPER)；N,N,N',N'-四甲基-N,N'-双(2-羟乙基)-2,3-二油酰氧基-1,4-丁烷二铵碘化物；如Solodin等(Solodin等，1995)描述的1-[2-(酰氧基)乙基]2-烷基(烯基)-3-(2-羟乙基)-咪唑啉氯化物衍生物，如1-[2-(9(Z)-十八烯酰氧基)乙基]-2-(8(Z)-十七烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DOTIM)、1-[2-(十六烷酰氧基)乙基]-2-十五烷基-3-(2-羟乙基)咪唑啉氯化物(DPTIM)，如例如Felgner等(Felgner等，1994)描述的在季胺上含有羟烷基部分的2,3-二烷基氧基丙基季铵化合物衍生物，例如：1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORI)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵(DORIE-HP)、1,2-二油基-氧基-丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵(DORIE-HB)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵(DORIE-Hpe)、1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、1,2-二棕榈基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DPRIE)、1,2-二硬脂基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DSRIE)；如Santaniello等(US5,498,633)报道的酰基肉碱的阳离子酯；磷脂酰胆碱的阳离子三酯，即，1,2-二酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱，其中该烃链可以是链长为C₁₂至C₂₄的饱和或不饱和的支化或未支化烃链，该两条酰基链不必相同。

该脂质体可以具有不同的粒度、层状组织(lamellarity)和结构。优选该脂质体的平均直径Z_平均为约50nm至约500nm。最优选该脂质体的粒度Z_平均为约100nm至约200nm。该脂质体可以为单层、寡层或多层脂质体。优选该脂质体是单层脂质体。

在本发明化合物的不同实施方案中采用的活性剂或化妆剂优选具有大于1，更优选大于约2，最优选大于约3的logP。

在本发明的不同实施方案中采用的活性剂或化妆剂优选具有低的水中溶解度。优选该化合物在室温下在生理pH下在水中的溶解度低于0.1mg/ml，更优选低于0.01mg/ml，最优选低于0.001mg/ml。

优选包含在本发明脂质体中的活性剂是治疗活性剂或诊断活性剂。最优选该化合物具有治疗活性。

优选该活性剂或化妆剂是分子量小于2000Da，更优选小于1000Da的分子。

在一方面，该活性剂可以选自包含下列的组：阿巴瑞克(abarelix)、六甲蜜胺(altretamine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿瑞吡坦(aprepitant)、比卡鲁胺(bicalutamide)、喜树碱(camptothecin)、卡培他滨(capecitabine)、氯烯雌醚(chlorotrianisene)、结合雌激素(conjugatedestrogen)、环孢霉素(cyclosporine)、更生霉素(dactinomycin)、二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、多拉司琼(dolasetron)、屈他雄酮(dromostanolone)、表柔比星(epirubicin)、埃博霉素(epothilone)(例如埃博霉素B、埃博霉素D，或埃博霉素衍生物，例如如在WO2004048372、WO2004007492、WO2005051947和WO2005030767(其内容以引用方式并入本文)中公开的埃博霉素衍生物)、suberlotinib、乙炔雌二醇、依西美坦(exemestane)、芬太尼(fentanyl)、夫拉平度(flavopiridol)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟维司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、格拉司琼(granisetron)、橙皮素(hesperetin)、氢吗啡酮(hydromorphone)、伊立替康(irinotecan)、酮康唑(ketoconazole)、拉帕替尼(lapatinib)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprolide)、洛莫司汀(lomustine)、硫蒽酮(lucanthone)、麻林酚(marinol)、马索罗酚(masoprocol)、甲地孕酮(megestrol)、大麻隆(nabilone)、尼鲁米特(nilutamide)、帕洛诺司琼(palonosetron)、卟吩姆(porfimer)、炔雌醚(quinestrol)、炔雌醚、它莫西芬(tamoxifen)、紫杉烷、替西罗莫司(temsirolimus)、睾酮内酯、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、曲美沙特(trimetrexate)、戊柔比星(valrubicin)、长春碱(vinblastine)、维生素E、以及这些化合物的衍生物。优选该化合物是紫杉烷，最优选紫杉醇或其衍生物。

在本发明的某些方面，该活性剂不是诸如DNA或RNA分子的核苷酸或多核苷酸分子。

在另一方面，本发明的范围不包含在配制期间离子化的活性剂和/或为高度水溶性化合物的活性剂如阿霉素(adriamycin)。

优选地，本发明脂质体在脂质体膜中包含约2.5mol%至约4.5mol%的紫杉醇。因而，紫杉醇的量可以优选占据存在于该膜中的所有分子如脂质和相关分子及紫杉醇的量的约2.5mol%至约4.5mol%。更优选地，这些脂质体作为混悬液和/或在再水化之后表现出受到抑制的药物释放，和/或在如本文下面定义的储存期间没有显著地形成晶体。

在本发明的特别优选的实施方案中，该脂质体是阳离子脂质体，例如包含摩尔比为约50:47:3的DOTAP、DOPC和紫杉醇的阳离子脂质体。这种组合物的制剂在本领域中作为MBT-0206或EndoTAG-1为人们所知。包含DOTAP、DOPC和紫杉醇的脂质体制备品的制造公开在WO2004/002468中，该申请的内容以引用的方式并入本文。

一般而言，脂质体可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。New等(1990)中公开了用于制备脂质体的各种方法。

在本发明中采用的脂质体优选通过乙醇注入法制备。

在本发明的具体实施方案中，脂质体具有正的zeta电位，更优选大于约+30mV的zeta电位。

在本发明方法中采用的或者包含在本发明组合物中的渗透活性物质是不能显著地透过脂质双层的可溶物质。该渗透活性物质优选存在于脂质体的内部和外部。

该渗透活性物质可以是有机分子如糖类，例如单糖、二糖、寡糖或多糖，糖醇，氨基酸，肽，蛋白质，水溶性聚合物，有机或无机盐，离子，或它们的组合。

有用的糖类包括糖和糖醇、寡糖、水溶性多糖，以及它们的衍生物。根据本发明的优选糖类包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽五糖(maltopentose)、棉子糖、糊精、葡聚糖、菊粉、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、壳聚糖，以及最优选的海藻糖。

水溶性聚合物的实例为聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯，或聚乙烯基吡咯烷酮。

在某一方面，渗透活性物质在本发明方法或组合物中的使用排除了促进具有低的水中溶解度的化合物溶解的络合剂的使用。此类络合剂的实例为环糊精，如Zhang等在WO2007/005754中或者MacLachlan等在WO2007/012191中公开的。

在本发明上下文内使用的水性介质或水相可以包含与水至少部分混溶的一种或多种进一步的成分，如醇(例如，C_1-4醇如乙醇)或酮(例如，C_1-4酮如丙酮)。在本发明的优选实施方案中，该水相含有乙醇。

该水相可以进一步包含缓冲物质或其他稳定剂。合适的缓冲物质选自例如乙酸、Tris、Bis、磷酸、乳酸等，优选柠檬酸。该缓冲物质可以将水性介质的pH设定在约3和7之间，优选在约4和约5之间。

优选地，步骤a)的脂质体制备品通过使包含脂质和任选的活性剂或化妆剂的有机溶液(例如，乙醇溶液)混合到以总同渗容摩O₁为特征的包含至少一种渗透活性物质的水性介质中来制造。

渗透梯度O_内-O_外的优选范围为10mOsm至2000mOsm，更具体地为50mOsm至1000mOsm，甚至更具体地为100mOsm至1000mOsm。

渗透梯度也可以用介于在脂质体包封的体积内部的渗透活性物质的浓度/重量和在脂质体包封的体积外部的渗透活性物质的浓度/重量之间的浓度/重量差值表示。渗透梯度的优选范围为5重量%至30重量%的浓度/重量差值，即，介于0重量%至30重量%的在包封体积外部的渗透活性物质和10重量%至40重量%的在包封体积内部的渗透活性物质之间的梯度。

从步骤a)获得的脂质体制备品可以经受均质化步骤，所述均质化步骤可以通过挤出、经由膜过滤器的过滤、高压均质化和/或高速度均质化进行，最优选通过经由例如孔尺寸为约200nm的膜在加压下挤出来进行。具有本领域中熟知的其他孔尺寸如50nm、100nm、150nm、400nm的膜也可以使用。经由膜过滤器的过滤可以通过经由由PVDF、PES、尼龙过滤器组成的膜过滤来进行，但是如果确定合适，也可以使用其他材料。膜的孔尺寸优选在约200nm至450nm的范围内，但孔尺寸不限于提及的尺寸。不同的材料和不同的孔尺寸可以某种方式结合以获得可通过灭菌级过滤加工的溶液。在优选的实施方案中，在创建渗透梯度之前，对从步骤a)获得的脂质体进行均质化。

因为无菌是药物产品的强制性特征，所以在本发明方法中采用的脂质体混悬液可以在该工艺期间的某些阶段加以灭菌。优选地，通过经由灭菌级无菌过滤膜(0.22pm)过滤来对混悬液进行灭菌。在优选的实施方案中，在根据本发明的步骤b)创建渗透梯度之后，通过过滤来对脂质体混悬液进行灭菌。

根据本发明的一般概念，可以在脂质体制备品的生产工艺期间的不同阶段一次或数次地创建或改变介于包封体积和游离体积之间的渗透梯度。这可能可以通过如在下面描述的相同或不同程序实现。

在本发明的优选实施方案中，本发明方法的步骤b)可以包括以下步骤：

b1)使从步骤a)获得的脂质体制备品脱水从而获得脱水的脂质体制备品，和

b2)使所述脱水的脂质体制备品再水化，优选在水性介质中在获得受应力的脂质体制备品的条件下再水化。

在本发明的含义内，“从步骤a)获得的脂质体制备品”是指在步骤a)中制备的脂质体制备品，或者可经由不同的加工步骤由在步骤a)中制备的脂质体制备品获得的任何脂质体制备品。这些加工步骤可以例如包括如上所述的均质化和/或灭菌。

在优选的实施方案中，在步骤a)中的第一脂质体制备品的制造之后并且在将从步骤a)获得的所述脂质体制备品的脱水之前，至少一次地创建或改变渗透梯度。优选渗透梯度的创建或改变在挤出步骤之后和/或在无菌过滤之后进行。如上所述，渗透梯度增强经受该加工步骤的脂质体混悬液的稳定性。

优选脱水在高于室温的温度下进行。

在本发明的尤其优选的实施方案中，步骤b1)的脱水通过喷雾干燥脂质体混悬液来进行。在喷雾干燥方法中，首先通过喷雾脂质体混悬液使所述混悬液雾化成小液滴。随后通过在高温下蒸发液滴中的介质来干燥脂质体。在液滴形成之后的脂质体干燥可以通过使该液滴与提供的干燥且可能加热的气体流接触从而获得固体颗粒来实现。可能的气体流可以为惰性气体或空气。该干燥气体可以优选为含有少于0.1体积%，优选少于0.05体积%的氧气的低氧气体，或者不含氧气的气体。惰性气体增加含有高度易燃溶液的加热的干燥系统的安全性，这可通过泵送氮气、二氧化碳、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气和氡气或一些其他惰性气体以置换氧气来实现。这些系统的作用是完全除去氧气，或者将氧气减少至可忽略水平。在优选的实施方案中，氮气用作惰性气体。在本发明的另一个实施方案中，该惰性气体保护包含在制剂中的活性成分和赋形剂。优选该喷雾干燥在用于喷雾干燥的合适的设备中进行。使脱水脂质体与气体流分离并收集脱水脂质体。该喷雾干燥可以在超压、正常压力或部分真空下进行。如果在最高容许系统温度下以及在最大容量下利用干燥气体产生符合规格的粉末，则可能存在有利的工艺压力范围。对于干燥条件的选择，必须考虑诸如液体进料速率、干燥气体速率、干燥气体温度、赋形剂的热动力学参数，以及化合物的稳定性极限的参数组合。重要参数是干燥气体的进口温度T_进，以及存在于喷雾干燥器内部的出口温度T_出。由于蒸发时的绝热冷却，T_出显著地低于T_进。颗粒表面的实际温度可以显著地低于T_出，这取决于局部蒸发速率。因此，没有通用的喷雾干燥参数可以被定义。对于干燥脂质体，工艺室内部的温度可以在10℃至200℃的范围内。更典型地，通过本发明的方法用30℃至150℃，更优选约60℃至约120℃的温度干燥混悬液。用于喷雾干燥方法的设备可以从Büchi(Flawil,Switzerland)，或GEANiro(Soeborg,Denmark)获得，或者可以定制。本领域技术人员可以根据待干燥混悬液、所使用的设备和所需规格，选择干燥方法的条件，例如进料速率和温度。

尤其，可以对脱水步骤的条件加以选择以获得具有非常低的量的有机溶剂的脱水脂质体组合物。喷雾干燥脱水尤其适合于获得低量的残留有机溶剂。

此外，如本文描述的喷雾干燥脱水产生可浇注粉末形式的脱水脂质体组合物。与通过冷冻干燥获得的具有饼样结构的脱水组合物相比，此类粉末具有改进的处理性能，例如有关此类脱水组合物的灌装的性能。

在本发明的一方面，将已经受喷雾干燥的脂质体混悬液中的包封活性化合物和游离渗透活性化合物之间的比率与在水中再水化后的喷雾干燥制备品中的所述比率相比时发现，脱水没有显著地影响所述比率。

在本发明的某一方面，冷冻脂质体混悬液并随后使其经受减压从而抽出水分子的冻干或冷冻干燥脱水不包括在本发明的范围内。

例如如在步骤b1)或c)中获得的脱水组合物可以灌装到合适的容器中，并且可以储存一定的时间。优选在无菌条件下灌装和储存该组合物。储存时间可以为数日至数个月或甚至数年。该组合物可以储存在室温下、在2℃至8℃的温度下或低于0℃的温度下。

在使用脱水脂质体组合物之前，例如在用作药物组合物的脂质体组合物情况下将脱水脂质体组合物给患者施用之前，或者对脱水脂质体组合物进一步加工之前，根据步骤b2)或c)使脱水组合物再水化。为此，将如上面所述的那样获得的脱水组合物与水性介质混合。为了增强再水化，可以搅拌或涡旋该混合物。

用于再水化的水性介质的同渗容摩低于已经受脱水步骤的混悬液的总同渗容摩O₁。优选用于再水化的水性介质基本上不含渗透活性物质。最优选将注射用医药级水用于再水化。

在一些实施方案中，用于再水化的水性介质的体积可以大于已经脱水从而获得相应量的脱水脂质体组合物的脂质体混悬液的体积。

根据本发明，将用于再水化的水性介质的同渗容摩和用于再水化的所述介质的体积组合在一起加以选择，以便获得具有低于已经受脱水步骤的混悬液的同渗容摩O₁的总同渗容摩O₂的再水化混悬液。

在本发明的另一方面，步骤b)通过稀释从步骤a)获得的脂质体混悬液从而产生具有低于O₁的总同渗容摩O₂的水性介质来进行。

脂质体混悬液用如上所述的水性介质稀释。在优选的实施方案中，脂质体混悬液用水稀释。在一个实施方案中，用来稀释脂质体混悬液的水性介质不包含活性剂，尤其不包含将被包封在脂质体中的活性剂。

在本发明的优选实施方案中，O₂比O₁低至少10mOsm，更优选O₂比O₁低至少50mOsm，甚至更优选O₂比O₁低至少100mOsm。

在本发明的另一方面，步骤b)通过使用具有低于O₁的总同渗容摩的水性介质透析从步骤a)获得的脂质体混悬液来进行。

优选在用于产生介于O₁和用来进行透析的水性介质的同渗容摩之间的渗透梯度的条件下进行透析，所述渗透梯度为至少10mOsm，更优选至少50mOsm，甚至更优选至少100mOsm。

或者，步骤b)可以采用其他合适的方法进行。例如，可以采用诸如离子交换层析或亲和层析的合适的层析方法降低渗透活性物质的浓度。

在本发明的进一步方面，使根据步骤b)，即如上面描述的方法获得的受应力的脂质体混悬液脱水。所述受应力的脂质体混悬液的脱水可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来进行。合适的干燥程序为例如冷冻干燥、喷雾冷冻干燥或喷雾干燥。在优选的实施方案中，喷雾干燥脱水可以按上面针对步骤b₁)描述的方法进行。在本发明的进一步方面，如上面所述的那样，使由此产生的脱水脂质体制备品再水化。

在具体实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中在水性海藻糖相中制备初始脂质体混悬液，优选所述初始脂质体混悬液包含含有作为脂质的DOTAP和任选的DOPC的阳离子脂质体，并且进一步在脂质体膜中包含亲脂性活性剂，优选紫杉醇。与由该方法产生的最终使用，例如施用给人的脂质体混悬液相比，脂质体混悬液的成分的浓度以约三倍浓度存在。优选初始脂质体混悬液具有含约30mM脂质和约30mg/ml，更优选29.4mg/ml海藻糖的浓度。初始脂质体混悬液任选地通过在下一步骤经由膜的挤出来均质化。随后，优选通过用水将该脂质体混悬液的体积稀释至1.5倍体积来降低该脂质体混悬液的总同渗容摩，优选降低1.5倍。随后，任选地对该脂质体混悬液进行灭菌，优选通过过滤灭菌。在下一步骤中，优选通过喷雾干燥使该脂质体混悬液脱水，从而获得脱水的脂质体混悬液。最后使脱水的脂质体混悬液再水化从而产生用于其相应目的，如施用给人的脂质体混悬液。用于施用给人的脂质体混悬液优选具有含约10mM脂质和约10mg/ml，优选9.79mg/ml海藻糖的浓度。

在另一方面，本发明涉及用于制造脂质体制备品的方法，其包括：

i)提供脂质体混悬液，其中至少一种渗透活性物质包含在该混悬液的水相中，其中在脂质体包封的体积内部存在较脂质体包封的体积外部高的同渗容摩，

ii)将所述脂质体混悬液与任选地为不溶解形式的亲脂性化合物一起温育，和

iii)任选地例如通过过滤、离心或其他合适的方法使任何不溶解化合物与脂质体混悬液分离，

iv)任选地使该脂质体制备品脱水，以及

v)任选地使脱水的脂质体制备品再水化。

优选介于脂质体包封的体积的内部和外部之间的渗透梯度为10mOsm至2000mOsm，更具体地为50mOsm至1000mOsm，甚至更具体地为100mOsm至1000mOsm。

在本发明的优选实施方案中，步骤i)的脂质体混悬液不包含活性剂或化妆剂。

包含步骤i)中的渗透梯度的脂质体可以如上面所述的那样制备。在本发明的优选实施方案中，在制造步骤i)的脂质体混悬液时没有添加活性剂或化妆剂。活性剂或化妆剂的不溶解形式可以为，例如，例如具有不同的形态和尺寸的结晶形式，或粉末形式。

在本发明的一个实施方案中，在温育后使不溶解试剂与分散体分离。在优选的实施方案中，通过离心或过滤分离不溶解化合物。过滤可以在针筒过滤器中进行。

在另一方面，本发明涉及通过如上所述的方法获得或者可通过如上所述的方法获得的脂质体制备品。该制备品可以为脱水形式或者为水性混悬液形式。

本发明的脂质体制备品优选用在药品中，例如用在人用或兽用药品中。该制备品优选静脉内施用。更优选该制备品用于治疗癌症，如膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌，并用于治疗儿童癌症，如脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、尤文氏肉瘤/尤文氏家族肿瘤、生殖细胞瘤、颅外癌(extracranial)、霍奇金病、白血病、急性淋巴母细胞白血病、急性髓性(acutemyeloid)、肝癌、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、不寻常的儿童癌症、视觉通路和下丘脑胶质瘤、肾母细胞瘤和其他儿童肾脏肿瘤，并用于治疗不太常见的癌症，包括急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓性白血病、成人非霍奇金淋巴瘤、脑肿瘤、宫颈癌、儿童癌症、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、食道癌、毛细胞白血病、肾癌、肝癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、胰腺癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、头颈部癌、胆囊和胆管癌、胃癌、胃肠道癌、卡波济氏肉瘤、尿路上皮细胞癌、甲状腺癌、睾丸癌、阴道癌、血管肉瘤、软组织肉瘤、间皮瘤和肝细胞癌。特别地，该癌症可以是转移性癌症和/或标准(化疗)治疗抵抗性癌症。本发明组合物的施用可以减慢或中止疾病进展，或者可以导致人体内的部分或完全缓解。最优选治疗胰腺癌或乳腺癌，尤其是三受体阴性乳腺癌。本发明的脂质体制备品可以以约11mg/m²的紫杉醇至约44mg/m²的紫杉醇的单位剂量，优选以约22mg/m²的紫杉醇的单位剂量施用。优选该制备品每周施用一次或两次。该脂质体制备品可以如WO2005/039533、WO2006/117220，和WO2007/107305中公开的那样使用。

此外，本发明的脂质体制备品可以用作诊断或化妆制备品。

此外，本发明涉及在脂质体膜中包含活性或化妆化合物的脂质体混悬液，其中该脂质体所包封的水性介质的同渗容摩高于在该脂质体包封的体积外部的水性介质的同渗容摩。该混悬液的水性介质包含至少一种渗透活性物质。介于在脂质体内部的介质的同渗容摩和在脂质体外部的介质的同渗容摩之间的差值优选为至少10mOsm，优选至少50mOsm。

在脂质体内部和外部的同渗容摩的差异诱导导致脂质体膜上受到拉伸应力的渗透压梯度，如Hallet等，1993中描述的。因此，本发明涉及在脂质体膜中包含活性或化妆化合物的脂质体混悬液，其中该脂质体膜处在拉伸应力下。

脂质体膜处在拉伸应力下的脂质体可以通过应用如上所述的渗透梯度来获得。

数种物理化学表征方法可以用来确定在脂质体制备品中的渗透梯度和拉伸应力。在许多情况下，渗透活性组分的溶液具有比水的密度高的密度，并且该密度随着该化合物的浓度单调变化。如果脂质体包封体积的同渗容摩高于游离体积的同渗容摩，则这影响脂质体密度。对于在水中的浓度为5%(150mOsm)的海藻糖，该密度比纯水的密度高出约0.02g/l(HandbookofChemistryandPhysics,CRCPress,BocaRaton,Florida)。因此，在脂质体内部和外部的同渗容摩的差异导致在脂质体包封的体积内部的基质与在脂质体包封的体积外部的介质具有不同的密度。

因而，本发明的进一步方面公开了脂质体混悬液，其中脂质体包封的体积的密度高于在脂质体包封的体积外部的介质的密度。密度差值由优选的渗透梯度和相应渗透活性化合物的溶液的密度得出。诸如脂质体的胶体颗粒的密度可以例如通过超速离心方法确定。

包含渗透梯度的本发明脂质体混悬液的特别优选的实施方案是这样的脂质体混悬液，其包含的脂质体含有摩尔比优选为50:47:3且总脂质浓度为约10mM的DOTAP、DOPC和紫杉醇，以及海藻糖和任选的柠檬酸，所述脂质体混悬在包含约10mg/ml，尤其9.79mg/ml海藻糖，和任选的约0.011mg/ml柠檬酸的水相中，其中所述脂质体的无水密度为至少约1.1g/ml，尤其至少约1.15g/ml、至少约1.17g/ml，或至少约1.17g/ml。优选所述脂质体的z_平均为约140nm。

上述方法能够制备包含如上所述的脂质体的脂质体混悬液，该脂质体混悬液此外以受控的粒度分布为特征，其中该制造方法没有显著地增宽粒度分布谱的宽度，如例如通过多分散性指数(PI)的变化表征的。优选包含渗透梯度的本发明脂质体混悬液的PI不会因该渗透梯度的产生而增加大于0.2，更优选它不会因该渗透梯度的产生而增加大于0.1。

在本发明的进一步方面，活性或化妆化合物基本上仅包含在本发明的脂质体制备品中的脂质体的膜区室中。因而，存在于该制备品中的所有活性或化妆化合物的摩尔量的至少约98%，优选至少约99%包埋在脂质体膜的油脂相中。仅剩余量可以溶解在该制备品的水相中，或者可以以结晶的活性或化妆化合物形式存在。

可通过所公开的方法获得的本文公开的混悬液与在不存在渗透梯度的情况下制备的相当的常规脂质体混悬液相比在药物释放方面更稳定。关于脂质体中的药物释放的时间稳定性较高，并且该制剂在受到机械应力和/或其他应力时不太容易释放药物。优选地，与无渗透梯度的混悬液相比，在25℃下药物释放可以被抑制至少6小时，优选至少12小时，至少24小时，至少2d，至少7d，或至少14d或更长。药物释放的测定取决于药物类型。对于紫杉醇负载的脂质体，药物释放可以通过测定在释放后形成的药物颗粒(晶体)来灵敏地监测。颗粒可以例如通过X射线衍射测量或光散射技术来测定。

在本发明的一个实施方案中，被脂质体膜溶解的活性或化妆化合物的量的至少约90%，优选至少约95%，最优选99%在室温下在至少约24小时内维持在脂质体中，并且没有释放到该混悬液的水相中。因为在所述水相中具有低溶解度的亲脂性活性或化妆化合物的释放可以导致晶体形成，所以在25℃下在24小时内本发明混悬液基本上没有形成对应于所溶解材料的多于约10%，优选多于约5%，最优选多于约1%的量的晶体。

此外，通过使如上所述的脱水脂质体组合物再水化获得的本发明脂质体混悬液在25℃下在至少约24小时的时间段内没有形成聚集体。聚集体的形成可以通过经由光子相关光谱法(PCS)测量Z_平均和PI的变化来确定。本发明混悬液以在24小时内Z_平均的变化不大于约1.5倍，优选不大于1.25倍，以及PI值的变化不大于约2倍，优选不大于约1.5倍，最优选不大于约1.25倍为特征。优选具有这些特性的脂质体混悬液从脱水脂质体组合物的再水化获得。

因为有机溶剂经常用于脂质体的制备，例如如上面针对乙醇注入法描述的，残留有机溶剂如乙醇通常存在于脱水脂质体产品中，并因此存在于由脱水脂质体产品获得的再水化脂质体混悬液中。这在通过冷冻干燥(冻干)脱水的脂质体制备品的情况下尤其如此。然而，希望用于应用于人的脂质体产品包含尽可能少的有机溶剂。本发明使得能够通过喷雾干燥脱水，喷雾干燥有利于除去大部分或所有残留有机溶剂，同时获得具有高稳定性的脂质体。因此，本发明的另一方面公开了如上所述的脱水脂质体制备品，其包含约少于1%w/w，更优选约少于0.5%w/w，最优选约少于0.1%w/w的有机溶剂，基于该脱水制备品的总重量计。通过使这些脱水脂质体制备品再水化，获得脂质体混悬液，其包含约少于1mg/mL，更优选约少于0.5mg/mL，最优选约少于0.1mg/mL的有机溶剂。优选该有机溶剂是乙醇。

此外，通过使如上所述的脱水脂质体组合物再水化获得的本发明脂质体混悬液与如上所述的经受脱水的原始脂质体混悬液具有非常相似的粒度分布谱。更具体地，脂质体粒度维持得良好，并且没有遇到如从PCS测量确定的脂质聚集体的显著形成。在本发明的一个实施方案中，经受脱水的脂质体混悬液和如上所述的通过再水化获得的脂质体混悬液以Z_平均的差异小于1.5倍和PI值的差异小于2倍(从PCS测量)为特征。在复水后1小时，再水化脂质体混悬液的PI优选小于0.4，更优选小于0.3，最优选小于0.25。优选所述混悬液的PI如上所述的那样在25℃下在24小时内仅稍有变化。

在具体实施方案中，本发明涉及再水化水性脂质体混悬液，其包含含有在脂质体膜中的多达约5摩尔%，优选多达约3摩尔%的紫杉醇的阳离子脂质体，其中在复水后1小时，该脂质体混悬液的PI小于0.4，更优选小于0.3，最优选小于0.25，并且此外以在25℃下在24小时内Z_平均的变化不大于约1.5倍，优选不大于1.25倍，以及PI值的变化不大于约2倍，优选不大于约1.5倍，最优选不大于约1.25倍为特征。

优选上述再水化脂质体混悬液的脂质体在25℃下在24小时内从脂质体膜释放到水性介质中的紫杉醇不多于约2重量％，优选不多于约1重量%(基于紫杉醇的总重量计)。

附图简述

图1：被具有10mM的脂质浓度和10%(w/w)的总海藻糖浓度的脂质体制备品溶解的紫杉醇的量。该脂质体通过用水稀释浓缩的前体制剂获得。横坐标示出初始浓度，即，在10%海藻糖处的数据是从未被稀释的混悬液获得的，而在40%海藻糖处的数据是从初始具有40%(w/w)海藻糖和40mM脂质并用水以1+3稀释的未稀释混悬液获得。

图2：从具有30mM30%(w/w)海藻糖中的脂质的浓缩制剂获得的10mMDOTAP/DOPC脂质体的计数率。该溶液用水/海藻糖混合物稀释至介于30%(w/w)和10%(w/w)之间的不同的总海藻糖浓度。所有制剂都具有相同的最终脂质浓度，即10mM，介于包封水相和游离水相之间的海藻糖浓度梯度由x轴表示。

实施例

紫杉醇在具有不同海藻糖梯度的脂质体上的负载

概述

研究渗透梯度对紫杉醇在与饱和水相处于平衡状态的脂质体中的分配的影响。制备具有不同渗透梯度的脂质体，并将其与紫杉醇晶体温育。所有制剂都具有相同的组成；更精确地，脂质浓度和海藻糖浓度为c_脂质=10mM和c_海藻糖=10%(w/w)。其中的一些制剂以较高的脂质和海藻糖浓度制备和挤出，并在挤出后用水稀释至最终浓度。这样，游离水相被稀释，但包封水相未被稀释(忽略溶胀效应以及通过缺陷的溶质交换)。建立介于包封水相与游离水相之间的渗透梯度，该渗透梯度随着稀释度的增加而增加。将如此形成的脂质体与干紫杉醇一起温育，并确定被该脂质体溶解的紫杉醇的量。发现溶解的紫杉醇随着稀释度(浓度梯度)的增加而单调增加。该结果表明分配在处于平衡状态的脂质体膜中的紫杉醇量随着渗透梯度的增加而增加。

材料

膜：乙酸纤维素

HPLC系统1100Agilent

除气器(G1379A)

二元泵(G1312A)

温控自动进样器(AutoinjektorG1329A,ThermostatG1330B)

温控柱室(G1316A)

二极管阵列检测器(G1315B)或可变波长检测器(G1314A)

ChemStationforLC3D,Rev.A.09.01

挤出器，10mlNorthernLipids

Zetasizer3000MalvernInstruments

方法

空脂质体的制备

通过薄膜法制备DOTAP/DOPC-制剂(1:1比例)或包含单独的DOTAP或DOPC的制剂。称取所需量的脂质置于圆底烧瓶中并将其溶解在氯仿中。在约40℃的温度在约150mbar的压力下在旋转蒸发仪(Heidolph,Germany)中蒸发该溶剂约15分钟。将该薄膜在10mbar下干燥超过60分钟，随后通过轻轻地振荡烧瓶使该膜在海藻糖水溶液中水化。对脂质的量、海藻糖浓度和海藻糖溶液的体积加以选择，以便产生的混悬液在DOTAP/DOPC-制剂情况下包含介于10mM至40mM之间的脂质浓度以及介于9.8%(w/v)和39.2%(w/v)之间的海藻糖浓度，而在单独的DOTAP或DOPC制剂情况下包含介于10mM至30mM之间的脂质浓度以及介于9.8%(w/v)和29.4%(w/v)之间的海藻糖浓度。在约5bar的压力下将由此产生的多层脂质体混悬液从孔尺寸为200nm的聚碳酸酯膜中挤出五次。挤出后，用水稀释该混悬液从而获得具有10mM的脂质浓度和9.8%(w/v)的总海藻糖浓度的混悬液。

紫杉醇负载

在15mlFalcon管中将5ml如上面所述的那样制备的包含空脂质体的混悬液加入到2.6mg干紫杉醇(对应于600μM的理论紫杉醇浓度)中。将批料在室温下搅拌(磁力搅拌器)1小时。

搅拌后，通过经由针筒过滤器(Sartoriusminisart，0.2μm，乙酸纤维素膜)过滤每个批次的2ml来分离非脂质体结合的紫杉醇。随后通过HPLC分析由此产生的滤液中的紫杉醇和脂质浓度。

分析方法

紫杉醇含量的确定

将样品稀释在48/18/34(v/v/v)的ACN/THF/2mM乙酸铵中。

固定相：LiChrospher60，RP-selectB长250mm，ID：4mm，粒度5μm

流动相：32/12/56(v/v/v)的ACN/THF/2mM乙酸铵

流速：1ml/min

柱室温度：35℃

检测器波长：229nm

注入体积：10μl

运行时间：40min

脂质含量的确定

通过HPLC分析过滤前和过滤后的批料的脂质含量，从而监测由过滤方法造成的脂质体材料的潜在损失。将样品稀释在50/50的ACN/水中。

固定相：PhenomenexLuna5μC8(2)150mmx2mm

流动相：具有0.1%TFA的乙腈，具有0.1%TFA的水

梯度脂质确定；

流速：0.4ml/min

柱室温度：45℃

检测器波长：205nm

注入体积：5μl

运行时间：30min

结果

DOTAP/DOPC-制剂

在图1中，示出通过与不同的DOTAP/DOPC脂质体制剂一起温育而被溶解的紫杉醇的量。所有制剂都含有相同量的脂质(脂质体)和海藻糖。它们是通过用水稀释不同的较浓缩的制剂获得的。除了绝对浓度之外，所有起始制剂都是等效的，并且它们被同样地处理。横坐标给出在稀释之前的初始海藻糖浓度。因为在所有情况下最终总海藻糖浓度都为10%，所以海藻糖梯度随着横坐标的值的增大而增大。如可以看出的，被脂质体溶解的紫杉醇的量随着海藻糖梯度(稀释度)单调增加。该脂质体的负载能力随着海藻糖梯度的增加而增加。

DOTAP-制剂和DOPC-制剂

下表示出被DOTAP和DOPC脂质体制剂(单组分)溶解的紫杉醇的量，该量依赖于制备时使用的初始海藻糖浓度：

表1：DOTAP-制剂和DOPC-制剂

对于来自纯脂质的脂质体，同样发现溶解能力与海藻糖梯度的明确依赖关系。对于DOTAP制剂，观察到与DOPTAP/DOPC制剂的结果类似，紫杉醇负载能力随着在脂质体内部和外部的海藻糖浓度差值的增加而增加。对于由100%DOPC组成的脂质体，该影响不太明显。

2紫杉醇在喷雾干燥之后的具有不同海藻糖梯度的脂质体上的 负载

2.1概述

这个实施例的目的在于测试如果脂质体在海藻糖梯度的形成和调节之间被喷雾干燥，那么渗透梯度对紫杉醇在该脂质体上的负载的积极影响是否存在。制备两种不同浓度，即具有10mM10%(w/w)海藻糖溶液中的脂质和20mM20%(w/w)海藻糖溶液中的脂质的DOTAP/DOPC脂质体。将这两种制剂以各自的浓度喷雾干燥。用水将这两种喷雾干燥粉末都复水成具有10mM的脂质浓度和相应的10%(w/w)海藻糖浓度。如上面所述的那样，将该液体制剂暴露于紫杉醇中，并确定溶解的紫杉醇量。发现，由双倍浓缩态(20mM脂质/20%(w/w)海藻糖)制剂喷雾干燥获得的制剂溶解的紫杉醇多于由单倍浓缩态制剂(10mM脂质，10%w/w海藻糖)喷雾干燥获得的制剂溶解的紫杉醇。

该结果表明在脂质体内部/外部的海藻糖分布没有受到在所选条件下的喷雾干燥影响。在先前的双倍浓缩产品复水之后，获得具有海藻糖浓度梯度的脂质体，与该液体制剂的直接稀释的效果相当。

2.2方法

脂质体形成

通过乙醇注入法制备制剂。在搅拌条件下将合适量的乙醇中的脂质溶液(200mMDOTAP-Cl,188mMDOPC)注入到水中的海藻糖溶液中。海藻糖浓度对于20mM脂质体为20%(w/w)，而对于10mM脂质体为10%(w/w)。所需量的乙醇中的脂质溶液对于10mM制剂为约2.5ml/l，而对于20mM制剂为5ml。

在约5bar的压力下，将由此产生的多分散性脂质体制剂从孔尺寸为200nm的聚碳酸酯膜中挤出五次。

喷雾干燥

利用NiroSDmicro喷雾干燥机使用双流体喷嘴进行喷雾干燥。喷雾条件如下：出口温度=100℃，进口温度=145℃，进料速率=340g/h，雾化器气体速率2.3kg/h，干燥气体速率30kg/h。

复水

用水将来自先前的10mM制剂和先前的20mM制剂的干燥粉末复水至脂质浓度为10mM。

紫杉醇负载测定

如所述的那样，进行紫杉醇在脂质体上的负载的测定。

2.3结果

从紫杉醇在复水粉末上的负载获得的结果在表2中示出。如可以看出的，以20mM脂质浓度喷雾干燥的制剂溶解的紫杉醇比初始脂质浓度为10mM的制剂溶解的紫杉醇多得多。结论是：先前的20mM制剂的紫杉醇负载量增多是由于介于包封水相和游离水相之间的渗透梯度所引起，而先前的10mM制剂中不存在所述渗透梯度。喷雾干燥和干燥粉末的复水没有导致介于内部水相和外部水相之间的海藻糖平衡，因此包封水相的同渗容摩在先前20mM制剂的情况下较高。

表2：通过复水喷雾干燥粉末获得的制剂对紫杉醇的溶解。脂质和海藻糖浓度在这两种情况下是相等的(10mM脂质，10%w/w海藻糖)，但是在喷雾干燥前，一种制剂具有10mM脂质、10%海藻糖，而另一种制剂具有20mM脂质、20%海藻糖。

3.被负载的脂质体的稳定性

3.1概述

为了评价具有内部/外部海藻糖梯度的脂质体制备品是否不仅具有较高的负载能力，而且具有关于紫杉醇释放的较高稳定性的问题，作为时间的函数追踪脂质体中的紫杉醇释放。制备具有相对高的紫杉醇分数，即5mol%，并具有介于0%和20%(w/w)之间的不同的海藻糖梯度的制剂。包含海藻糖梯度的脂质体在21天的测试期内没有表现出任何显著的紫杉醇释放，而在无海藻糖梯度的脂质体中，保留的紫杉醇分数减少至少于1%。

3.2方法

DOTAP/DOPC制剂

根据上述膜方法，通过将相应量的脂质和紫杉醇加入到氯仿溶液中制备包含约5mol%紫杉醇(确切的值参见表格)、10-30mM脂质，和9.8%-29.4%(w/v)海藻糖的DOTAP/DOPC脂质体。随后用水将30mM批料稀释至脂质浓度为10mM(总海藻糖浓度9.8%w/v)。

将该样品储存在4℃下，并且在0、1、5、14和21天后按照上述方法使用过滤和HPLC分析确定脂质体的紫杉醇含量。

3.3结果

结果概述在表3中。该表示出保留在脂质体中的紫杉醇浓度(μm)。该脂质浓度为10mM，所以100μM的紫杉醇浓度对应于相对于1%的脂质的摩尔浓度。

在无海藻糖梯度的制剂中，在21天后，保留的海藻糖分数单调地衰减至少于100μM的值(少于相对于脂质的1mol%)。相比之下，在具有海藻糖梯度的情况下，保留的紫杉醇没有降低到低于400μM。在该情况下没有观察到单调衰减，换言之，约400μM的值似乎代表紫杉醇在脂质体中的物理稳定状态。

表3:紫杉醇在DOTAP/DOPC脂质体中的保留

被保留的紫杉醇的最终分数与从经等效处理的脂质体的负载测定获得的值类似。因此，来自负载测定的数据可以当作被负载的脂质体的稳定性极限的预测指标。如果没有产生其他影响，则来自负载测定的数值将会给出关于在给定条件下被脂质体保留的紫杉醇量的信息。本实施例的进一步结论是，海藻糖梯度以及增强的稳定性似乎能被充分维持数天。在当前情况下，该效果被维持21天。

4原位确定脂质体制备品中的海藻糖梯度的方法

4.1概述

制备在c₁浓度的海藻糖中的浓缩脂质体制剂，并用水或者用海藻糖溶液以不同的比例稀释从而获得具有海藻糖浓度c₂的介质，其中c₂≤c₁。所有制剂都具有相同的最终脂质浓度，即10mM。基于光学性质(折射率)的局部变化分析该制剂。使用动态光散射测量的计数率证明散射强度的变化。随着海藻糖梯度c₁-c₂的增加，动态光散射(PCS)测量的计数率单调地增加。

4.2方法

利用来自BrookhavenInstruments(HoltsvilleUSA)的goniometerBI-200SM测量动态光散射。以90°的角利用具有641nm波长的30mW激光进行测量。对于数据分析，进行利用优化正则化技术的逆拉普拉斯变换。

4.3样品

在30%海藻糖溶液中制备具有30mM总脂质浓度的DOTAP/DOPC(摩尔比1:1)脂质体。将该30mM脂质30%海藻糖脂质体制备品从200挤出膜中挤出。随后，用水、30%海藻糖溶液或其混合物以该表中指示的比率稀释该脂质体。

A:30mM在30%海藻糖中的脂质体

B:30%在水中的海藻糖

C:水

表4：在具有浓度介于10%(w/w)和30%(w/w)之间的海藻糖的水相中的10mM脂质制剂的稀释方案

虽然在最终制备品中的脂质浓度总是10mM，但是总海藻糖浓度在10%(用水稀释)和30%(用30%海藻糖溶液稀释)之间变化。与30%的初始海藻糖浓度相比，这导致介于0%(总浓度=30%)和20%(总浓度10%)之间的用数字表示的(numerical)海藻糖浓度梯度。在稀释后的1小时，进行动态光散射测量。

4.4结果

图2示出动态光散射测量结果。计数率作为海藻糖梯度的函数给出。计数率随着海藻糖梯度的增加而单调地增加。这可能与在增加海藻糖梯度时发生的折射率梯度和溶胀效应的增加相关。众所周知，脂质体可以用作理想的渗压剂，并且渗透梯度可以由在合适条件下的光散射和光吸收特性确定(deGier1993；Cabral,Hennies等，2003)。除了来自准弹性光散射的强度之外，还可以使用其他光散射技术以及吸收或比浊法测量。当前的观察结果表明分析动态光散射测量中的计数率可以用作控制给定制剂的海藻糖梯度形成是否成功的工具。此外，该数据证实，脂质体混悬液的水性介质的同渗容摩的改变展示出该脂质体的物理特性。

5海藻糖梯度对紫杉醇的液体DOTAP/DOPC脂质体制剂的物 理稳定性的影响

5.1概述

在这个实施例中，进一步研究了海藻糖梯度对如实施例3所示的紫杉醇的DOTAP/DOPC脂质体制剂的稳定作用。制备浓度为30mM(在32%w/w的海藻糖溶液中)的脂质体，用不同的海藻糖/水溶液稀释，并确定在机械应力后的紫杉醇释放。

发现，物理稳定性随着海藻糖梯度的增加而增加。该研究结果证实海藻糖梯度对包含紫杉醇的脂质体的稳定作用也适合于在中试规模上的加工。

5.2方法和材料

脂质体制造

通过乙醇注入技术生产脂质体。简言之，在2-8℃的温度下在搅拌下将具有200mMDOTAP和188mMDOPC(总脂质浓度388mM)的溶液注入到水相中(对于100ml水相，使用8.11ml乙醇中的脂质溶液)从而产生具有约30mM的脂质浓度的多分散性脂质体。对于水相，选择具有32.1%w/w海藻糖二水合物和184.5μM柠檬酸的溶液。

如所指出的那样，在3bar的压力下利用具有220nm孔尺寸的聚碳酸酯膜进行挤出。如所指出的那样，使用milipak20无菌过滤器或微孔滤膜(Millipore,Molsheim,France)进行无菌过滤。

浓度梯度

用水将初始30mM30%(w/w)海藻糖溶液中的脂质体制剂(PD-L-09111)稀释至不同的最终脂质和海藻糖浓度。

表5：测试样品的稀释

稳定性测试

将该样品放在振荡器上并在25℃下或在2-8℃下以150rpm搅动。24小时和48小时后，分析该样品并确定保留在脂质体中的紫杉醇的量。

确定脂质体制备品中的紫杉醇的保留/释放

通过过滤脂质体制备品以便从脂质体产品中除去紫杉醇晶体来研究紫杉醇在脂质体中的保留(如实施例3中描述的)。剩余的紫杉醇通过HPLC分析来量化。另外，使用光学显微术针对紫杉醇晶体研究该样品。

5.3结果

结果在表6-12中给出。为了简便起见，将初始海藻糖浓度近似为30%(w/w)。所示出的浓度梯度是根据初始海藻糖浓度和稀释倍数计算的。介于包封水相和游离水相之间的实际浓度梯度将具有相同的趋势，但是绝对值可能与表中所给的那些略有不同。

如可以看出的，该稳定性随着海藻糖梯度的增加而增加。脂质体保留的紫杉醇的量增加并且观察到较少的紫杉醇晶体。与25℃相比，该稳定性在5℃下较高。

表6：在0%海藻糖梯度下的稳定性

表7：在5%海藻糖梯度下的稳定性

表8：在8.6%海藻糖梯度下的稳定性

表9：在11.2%海藻糖梯度下的稳定性

表10：在13.3%海藻糖梯度下的稳定性

表11：在13.3%海藻糖梯度下的稳定性

表12：在15%海藻糖梯度下的稳定性

6喷雾干燥的紫杉醇负载的脂质体的稳定性

6.1方法和材料

如前面实施例中所述的那样使用材料。

通过如上所述的乙醇注入技术形成由DOTAP、DOPC和紫杉醇(摩尔比50/47/3)组成的脂质体。将紫杉醇与脂质一起溶于乙醇溶液中。制备浓度为20mM20%w/w海藻糖中的脂质的脂质体(批次PD-L-09031)，和浓度为10mM10%海藻糖中的脂质的脂质体(批次MDG09.108-08-001和PD-L-09032)。将该脂质体从具有200nm孔尺寸的聚碳酸酯膜中挤出五次，并如上所述的那样进行无菌过滤。

在脂质体混悬液的制备之后，使脂质体脱水。在NiroSD-Micro喷雾干燥器机中使用如实施例2中所述的喷雾干燥参数喷雾干燥批次PD-L-09031和PD-L-09031。

使用Epsilon2-12D(Christ)冷冻干燥单元，通过冷冻干燥使批次MDG09.108-08-001脱水。将该脂质体混悬液保存在4℃下1小时，并冷冻在-40℃下约5小时。冷冻后，将温度升高至-16℃，并在0.1bar的压力下进行初步干燥90小时。对于二次干燥，将温度升高至20℃，同时将压力降低至0.01bar。

用水将干燥粉末复水至10mM10.5%(w/w)海藻糖中的脂质浓度。在复水后1小时和在复水后24小时，使用MalvernZetasizer1000HSA，SeriesDTS5101(设置：分析=单模态(monomodal)，膨胀度=1.2；配合阶数=3；第一点选择(PointselectionFirst)=18；最后一点选择(LastPointSelection)=在22号之前；点加权=二次方程式；衰减器=x16；粘度1.200cp；折射率=1,348；测量次数=3；测量间的延迟时间=0；测量持续时间=自动)用动态光散射测量探查由此产生的液体脂质体产品，从而确定Z_平均和PI。在测量前，用10.5%(w/w)海藻糖脱水物溶液将该样品稀释10倍。

6.2结果

该结果在表13中示出。

对于以与再水化产品中的脂质和海藻糖浓度相同的脂质和海藻糖浓度喷雾干燥的制剂的研究结果，与对由双倍浓缩液体进料喷雾并且在再水化后产生海藻糖梯度的产品的研究结果显著不同。无浓度梯度的制剂显示出显著较高的Z_平均和PI值，并且在复水后在24小时内增加，而具有浓度梯度的制剂没有显示出此种增加。Z_平均和PI值的增加被认为与无浓度梯度的制剂中的紫杉醇的释放相关，无浓度梯度的制剂不太稳定。该数据与实施例2的结果一致，在实施例2的结果中，较多的紫杉醇可以负载到在以双倍浓度喷雾干燥后获得并且随后产生海藻糖梯度的脂质体上。以较高的海藻糖浓度进行并且随后产生海藻糖梯度的紫杉醇脂质体制剂的喷雾干燥提高了该制剂在复水之后的稳定性。

与喷雾干燥样品相比，冷冻干燥制剂在复水后显示出高得多的PI。

表13：脱水和再水化方法的比较

7大规模制造和喷雾干燥

7.1材料

7.1.1基本材料

·USP半合成紫杉醇API，PhytonBiotech，批号CP209N0014

·DOTAP-CI，MerckEprovaAG，批号MBA-020

·DOPC，AvantiPolarLipidsInc.，批号GN181PC-12

·α,α-海藻糖二水合物，高纯度(低内毒素(LowEndotoxine))，FerroPfanstiehl，批号33205A

·无水乙醇EP，NovaLaboratoriesArt.-Nr.A4478B

·柠檬酸单水合物EP/USP，NovaLaboratoriesArt.-Nr.V290

·注射用水，NovaLaboratoriesArt.-Nr.A15210C

7.1.2设备

·注射毛细管ID:2mm

·滤芯(Filtercartridge)MemtrexPC0.2pm，得自GE，产品编号MPC92O5FHV，批号60240937

·具有0.22pm微孔滤膜的无菌过滤器OpticapXL4，得自Millipore，产品编号KVGLAO4TT3，批号：COCA10972

·配制容器(Formulation-Vessel)(NovaLaboratoriesLtd.)

·挤出容器(Extrusion-Vessel)(NovaLaboratoriesLtd.)

·生物负载降低容器(Bioburden-Reduction-Vessel)(NovaLaboratoriesLtd.)

·贮存容器(Holding-Vessel)(NovaLaboratoriesLtd.)

·蠕动泵(NovaLaboratoriesLtd.)

·具有竖管的20L-压力容器(NovaLaboratoriesLtd.)

·蝶形通气孔(Butterfly-vents)(NovaLaboratoriesLtd.)

·ASD-1无菌喷雾干燥机(GEANiroS/A，CopemhagenDenmark)

7.2方法

7.2.1液体制剂的生产

7.2.1.1有机溶液的制备

对于批次001，将349.3gDOTAP-CL溶解在700g无水乙醇中，并搅拌大约4小时。将369.5gDOPC溶解在700g无水乙醇中，并搅拌大约3小时。随后将这两种脂质溶液合并在一起，并加入到25.617g紫杉醇中。将由此产生的有机溶液搅拌约2小时，最后通过加入无水乙醇调节至2122.5g的总重量。相应地制备批次002至004。

7.2.1.2水溶液的制备

对于批次001，在配制容器中将10819g海藻糖脱水物加入到约20kg注射用水中，并以700rpm搅拌90min。随后加入1.258g柠檬酸单水合物，并搅拌至完全溶解。将水溶液的最终量调节至34.53kg，并再搅拌10min。相应地制备批次002至004。

7.2.1.3乙醇注入

对于批次001，借助蠕动泵以约250g/min的注入速率将有机溶液注入到水溶液中。在注入期间，将该溶液以约500rpm搅拌。注入完成后，将该溶液以600rpm搅拌2min，随后以700rpm搅拌1min。在整个注入过程中，将温度保持在8℃以下。批次002至004在注入期间以550rpm搅拌，而在此后无需再搅拌。

7.2.1.4挤出

在具有0.2pm聚碳酸酯膜的5”滤芯上进行8次挤出。每次均用0.4-0.5bar使滤芯通风，并且以3.0bar的压力进行挤出。将温度保持在8℃以下。

7.2.1.5稀释

在第8次挤出后，确定制剂的重量。基于1.106g/ml的制剂密度，计算获得对应于1:1.5稀释的20mM制剂(基于总脂质浓度)所需的水量。对于批次001，借助蠕动泵经由2mmID毛细管以1.66l/min的速率添加所需量的注射用水，同时以约500rpm搅拌该溶液。所添加的注射用水已在添加到该制剂中之前被冷却至8℃以下。对于批次002至004，在约600rpm的搅拌速度下以0.62l/min至0.83l/min的速率进行稀释。

7.2.1.6生物负载的降低

在降低生物负载(第1次无菌过滤)前，在约0.5bar的压力下用20L注射用水洗涤OpticapXL4过滤器。通过重量分析(gravimetrically)进行过滤器的灌装和通风。在2.5bar的压力下进行过滤，借此迅速地施加压力。将该制剂的温度保持在8℃以下。

7.2.1.7无菌过滤

在无菌过滤前，在约0.5bar的压力下用20L注射用水洗涤OpticapXL4过滤器。在0.5bar下进行过滤器的通风。在2.5bar的压力下进行过滤，借此迅速地施加压力。将该制剂的温度保持在8℃以下。

7.2.2喷雾干燥

在ASD-1无菌喷雾干燥机(GEANiroS/A,CopenhagenDenmark)中喷雾干燥脂质体制剂。批次001作为单个批次干燥(第1轮)，而批次002至004以连续方式按顺序喷雾(第2轮)。对于喷雾干燥，使用双流体喷嘴、作为干燥气体的氮气，和下列参数：

表14：喷雾干燥设置

7.3.脂质体稳定性

7.3.1方法

将来自第1轮的脱水脂质体组合物在注射用水中再水化至总脂质浓度为10mM，因而该复水条件进一步增加在脱水前为20mM的制备品的渗透梯度。为了比较，提供未经稀释制备并且通过冻干脱水的相应脂质体组合物(参考批次)(如例如WO2004/002468中公开的)。在脂质体复水后以及在25℃下24小时后，根据实施例1.3中描述的方法确定保留在脂质体中的紫杉醇(包括紫杉醇降解产物)的量。基于存在于该制备品中的总紫杉醇，计算保留的紫杉醇和可滤去(结晶)的紫杉醇的百分比。

7.3.2结果

表15：产品中紫杉醇的释放

该数据表明在不存在渗透梯度的情况下制备的脂质体制备品释放紫杉醇的速度较快。这可以很容易地在相对短的24小时时间间隔后观察到。

7.4.粒度和多分散性的分析

7.4.1.方法

使用ZetasizerNanoZS(MalvernInstruments)通过PCS(173°衍射)确定粒度(z_平均)和多分散性指数(PI)。简言之，将来自第1轮(对应于批次1)和第二轮(对应于批次2-4)的样品和来自参考批次(参见上面)的样品重悬在水中至总脂质浓度为10mM。为了测量，将该样品用10.5%的海藻糖脱水物溶液(w/w)稀释10倍。将该样品储存在25℃下24小时并再次测量。

下列设置用于测量和数据分析：测量类型=粒度；样品：材料=聚苯乙烯胶乳，RI：1.590；吸收：0.01；分散剂=10.5%海藻糖，温度：25℃，粘度1.200cPRI：1.342；一般选项=马克-霍温克参数(Mark-Houwinkparameter)；温度=25℃，平衡时间：5分钟；样品池(cell)=DTS0012-一次性定径比色杯(disposablesizingcuvette)；测量：运行次数=15；运行持续时间(秒)=100；测量次数=3；测量间的延迟时间；高级=固定的位置在位置4.65处，衰减器6；分析参数：分析模式=一般；累积量分析：配合阶数=3；加权方案=二次方程式；累积量点选择：自动第一点=是；最后一点选择方法=截止点(cut-off)；信号分量(Fractionofsignal)=0.1；膨胀度=1.2；显示范围：下限=0.6；上限=10000；滤波：滤波因子(Filterfactor)=75；多模态分析：结果转化=Mie；使用结果转化=是；加权方案=二次方程式；分辨率=正常；多模态点选择(Multimodal-pointsselection)；自动第一点=是；最后一点选择方法=截止点；信号分量=0.01；膨胀度=1.2；粒度等级：粒度等级数=70；下限=0.4；上限=10000；阈值：下限阈值=0.05；上限阈值=0.01；滤波因子=缺省值。

7.4.2.结果

该结果在表16中示出：

与在不存在渗透梯度的情况下制造并通过冻干脱水的参考样品相比，在存在渗透梯度的情况下制造并通过喷雾干燥脱水的制剂(第1和2轮)显示出非常相似的Z平均，但显示出显著较低的PI值。因而，由上述方法生产的产品比由常规方法生产的产品具有更好的均质性。

7.5.超速离心表征

7.5.1方法

采用Nanolytics(Potsdam,Germany)进行超速离心分析。

将每种样品复水在H₂O及H₂O:D₂O的1:1混合物中至脂质浓度为10mM，并在室温下平衡1小时。随后用相应溶剂1:1稀释该样品。在再平衡1小时后，对该样品进行超速离心。将400μl的各种脂质体分散体装入具有12mm光程的钛超速离心比色杯。在使用An50Ti8-place转子(Beckmann-Coulter，PaloAlto)、配备有Rayleigh干涉光学系统的OptimaXL-I分析超速离心机(Beckmann-Coulter，PaloAlto)中使该样品在25℃下以20000rpm离心。在离心期间，沿着径向坐标的浓度分布曲线是借助于溶液内的折射率梯度产生的。重复测量该样品两次。

7.5.2数据分析

7.5.2.1沉降系数的定义

分析超速离心中的主要指标是定义如下的沉降系数：

其中u是颗粒的沉降速度，m是颗粒的质量，是比容，f是摩擦项，并且是溶剂密度。

沉降系数的确定

该沉降系数直接由测量的数据根据下面的公式计算而无需进一步假设：

$\ln \frac{r}{\mathrm{rm}}=s\&Integral;w^2\mathrm{dt}---\left(2\right)$

其中r是到旋转轴的距离，并且r_m是到弯月面(meniscus)的距离。运行时间积分∫w²dt由测量设备确定。

7.5.2.3沉降系数分布

代替在特定半径处的单个沉降系数，整个r-轴可以转化成s-轴。在各自位置处的条纹移动量与存在于那里的颗粒粒种的质量浓度成比例，因此可以将振幅测量作为y坐标。然而，需要相对于径向稀释来校正y坐标。通过引入校正项获得下面的函数g(s)，得出以速度s沉降的颗粒粒种的质量浓度：

$g\left(s\right)=\frac{1}{c_0}\frac{\mathrm{dc}}{\mathrm{dr}}{\left(\frac{r}{r_m}\right)}^{2}r{\&Integral;w}^2\mathrm{dt}---\left(3\right)$

浓度c，相应地c0是以条纹移动量为单位(unit)给出的，其中条纹等于全相(fullphase)，因而等于干涉图的亮线和暗线。如果折射率增量可以被假设成对于所有颗粒粒种都相等，则粒度与以g/l给出的浓度成正比，作为简单地以多分散性分布存在的化学均匀材料的本发明样品就是这样：

$\mathrm{dc}=\mathrm{d\&phi;}\&CenterDot;\mathrm{\&lambda;}\&CenterDot;\frac{1}{l\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dc}}}--\left(4\right)$

其中φ是以条纹移动量为单位的浓度，λ是激光波长，l是比色杯宽度，是溶质在给定溶剂中的折射率增量。由于这种比例性，方程(3)中的浓度可以直接被陈述为质量浓度。

g(s)(或其积分形式G(s)原则上可以通过扫描坐标转化和根据方程(3)的y坐标的计算来进行计算；总结果将通过取主要扫描的平均值获得，所述主要扫描大部分是冗余的。因而，在所有扫描上进行全局数据拟合是合理的。因此，分离出时间和空间独立的噪音，并且分配进一步的统计噪音从而获得最佳g(s)，所述最佳g(s)是从整个测量数据获得的。使用得自PeterSchuck的SedFitv12.4.软件进行拟合。

7.5.2.4沉降系数分布的解释

函数g(s)形式的沉降系数分布已经给出有关分布形式的信息；通常希望将主要测量参数转化成颗粒的直径或质量。斯维德贝格方程(SVEDBERGEquation)

使沉降系数经由扩散系数与摩尔质量相关。对于全局目的，就本发明脂质体而论，扩散系数可以用球体直径替代，由此必须考虑到该脂质体填充有水，水对沉降没有帮助，但有助于摩擦。

如果将方程5中的扩散系数用斯托克斯-爱因斯坦方程(STOKES-EINSTEIN-Equation)

D＝6πηRh(6)

替代，并且考虑球体的直径d=2Rh和水的体积分数Φ；则斯维德贝格方程变成

其中η是溶剂粘度，是溶质密度。

为了将沉降系数分布转化成粒度分布，要求脂质体的溶胀和密度保持恒定或者作为依赖于沉降系数的分布给出。因而，通过实验确定该密度。

7.5.2.5密度变化分析

沉降颗粒的密度可以由在具有不同密度的两种溶剂中的分析超速离心确定。在具有较低密度的溶剂中，如果与周围溶剂的密度差减小，则颗粒正常情况下表现出较小的s-值—该颗粒沉降较慢。描述同一颗粒的两个s-值都满足具有针对相应溶剂的参数的方程(7)。对于这两种溶剂(标记1和2)，下式适用：

在方程两侧的颗粒无水密度和溶胀参数Φ相同，因为它们针对的是同一物体。相同的颗粒被定义为具有y坐标相同的沉降系数分布G(s)的单元体(element)。

可以重排和简化方程(8)从而获得无水密度：

该直径可以根据下面的方程获得：

为了求解方程(10)，需要诸如颗粒直径的独立信息，其可以根据如上所述的动态光散射实验根据实验确定。

7.5.3.结果

表17：脂质体制备品的无水密度

参考文献

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Claims (69)

1.一种用于制造脂质体制备品的方法，其包括：

a)提供包含脂质体在水相中的混悬液的第一脂质体制备品，其中所述脂质体包含至少一层膜，其中所述膜封闭脂质体包封的所述水相体积，并且所述水相包含至少一种渗透活性物质并且具有初始总同渗容摩O₁，其中所述第一脂质体制备品在所述脂质体膜中包含至少一种活性剂或化妆剂，其中所述活性剂或化妆剂具有大于1的logP，以及

b)此后在所述制备品的水相中创建渗透梯度，其中在所述脂质体包封的体积外部的所述水相的同渗容摩O_外低于在所述脂质体包封的体积内部的所述水相的同渗容摩O_内，从而产生第二脂质体制备品，并且其中将至少一种活性剂或化妆剂掺入到所述第二脂质体制备品的脂质体膜中。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述第二脂质体制备品脱水从而获得脱水制备品。

3.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括使所述脱水制备品再水化。

4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的创建渗透梯度通过降低步骤a)中的所述脂质体制备品的水相的初始总同渗容摩O₁从而产生具有低于所述同渗容摩O₁的总同渗容摩O₂的受应力的脂质体制备品来进行。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)中的创建渗透梯度通过用具有低于O₁的同渗容摩的水性介质稀释步骤a)中的所述脂质体制备品来进行。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)中的创建渗透梯度通过针对具有低于O₁的同渗容摩的水性介质透析步骤a)中的所述制备品来进行。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤b)中的创建渗透梯度通过下列进行：

b1)使步骤a)中的所述脂质体制备品脱水从而获得脱水脂质体制备品，和

b2)使所述脱水脂质体制备品在用于产生受应力的脂质体制备品的条件下再水化。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述再水化在水性介质中进行。

9.根据权利要求8所述的方法，其中用于再水化的水性介质的体积大于已被脱水从而获得相应量的脱水脂质体组合物的脂质体制备品的体积。

10.根据权利要求4所述的方法，其中O₂比O₁低至少10mOsm。

11.根据权利要求10所述的方法，其中O₂比O₁低至少50mOsm。

12.根据权利要求10所述的方法，其中O₂比O₁低至少100mOsm。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在所述脂质体制备品的生产工艺期间的不同阶段，一次或数次地改变介于在所述脂质体包封的体积外部的所述水相和在所述脂质体包封的体积内部的所述水相之间的所述渗透梯度。

14.根据权利要求2所述的方法，其中脱水在高于室温的温度下进行。

15.根据权利要求2所述的方法，其中脱水通过喷雾干燥进行。

16.一种用于制造包含至少一种亲脂性活性剂或化妆剂的脂质体制备品的方法，其中所述活性剂或化妆剂具有大于1的logP，所述方法包括：

i)提供受应力的脂质体制备品，以及

ii)将所述受应力的脂质体制备品与至少一种亲脂性活性剂或化妆剂一起温育，由此获得具有掺入到所述脂质体膜中的至少一种亲脂性活性剂或化妆剂的受应力的脂质体制备品。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种亲脂性活性剂或化妆剂为不溶解形式。

18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括使不溶解化合物与所述脂质体制备品分离。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述分离通过过滤或离心进行。

20.根据权利要求16所述的方法，其中步骤i)通过提供脂质体制备品进行，其中至少一种渗透活性物质包含在所述制备品的水相中，并且其中所述水相在所述脂质体包封的体积内部存在的同渗容摩高于在所述脂质体包封的体积外部存在的同渗容摩。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种渗透活性物质存在于所述脂质体的内部和外部。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述渗透活性物质选自有机和无机分子。

23.根据权利要求1所述的方法，其中所述渗透活性物质选自由下列组成的组：糖类、糖醇、氨基酸、肽、蛋白质、水溶性聚合物、有机或无机盐、离子及其组合。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述糖类选自单糖、二糖、寡糖或多糖。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述糖类为海藻糖。

26.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂是治疗或诊断活性化合物。

27.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂是亲脂性化合物。

28.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂具有大于2的logP。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂具有大于3的logP。

30.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂在25℃在水中的溶解度低于0.1mg/ml。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂在25℃在水中的溶解度低于0.01mg/ml。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂在25℃在水中的溶解度低于0.001mg/ml。

33.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂是紫杉烷或其衍生物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述活性剂是紫杉醇或其衍生物。

35.根据权利要求1所述的方法，其中所述活性剂或化妆剂基本上仅存在于所述脂质体的膜区室中。

36.一种通过根据权利要求33或34所述的方法获得的脂质体制备品。

37.一种脂质体制备品，其通过根据权利要求33或34所述的方法获得。

38.根据权利要求36或37所述的脂质体制备品，其为脱水形式或者为水性混悬液形式。

39.根据权利要求38所述的脱水脂质体制备品，其是可浇注粉末。

40.一种包含脂质体在水相中的混悬液的脂质体制备品，其中所述脂质体包含至少一层膜，其中至少一种活性剂或化妆剂存在于所述脂质体膜中并且至少一种渗透活性物质存在于所述水相中，其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外,其中所述活性剂或化妆剂具有大于1的logP。

41.根据权利要求40所述的脂质体制备品，其中介于O_内和O_外之间的差值为至少10mOsm以及多达2000mOsm。

42.根据权利要求41所述的脂质体制备品，其中介于O_内和O_外之间的差值为至少50mOsm以及多达2000mOsm。

43.一种包含脂质体在水相中的混悬液的脂质体制备品，其中所述脂质体包含至少一层膜，其中至少一种活性剂或化妆剂存在于所述脂质体膜中并且至少一种渗透活性物质存在于所述水相中，其中在所述脂质体包封的体积内部的所述水相的密度大于在所述脂质体包封的体积外部的所述水相的密度,其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外，其中所述活性剂或化妆剂具有大于1的logP。

44.一种包含脂质体在水相中的混悬液的脂质体制备品，其中所述脂质体包含至少一层膜，其中至少一种活性剂或化妆剂存在于所述脂质体膜中并且至少一种渗透活性物质存在于所述水相中，其中所述脂质体膜处于拉伸应力下，其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外，其中所述活性剂或化妆剂具有大于1的logP。

45.根据权利要求40所述的脂质体制备品，其中所述渗透活性物质如权利要求22至25中任一项所定义。

46.根据权利要求40所述的脂质体制备品，其中所述活性剂或化妆剂如权利要求26至34中任一项所定义。

47.根据权利要求36或37所述的脂质体制备品，其用作药物。

48.根据权利要求47所述的脂质体制备品，其用作用于癌症的治疗的药物。

49.根据权利要求40所述的脂质体制备品，其用作化妆制备品。

50.根据权利要求40所述的脂质体制备品，其用作诊断制备品。

51.一种通过使脱水脂质体制备品再水化获得的包含脂质体在水溶液中的混悬液的脂质体制备品，其特征在于与经受脱水从而获得所述脱水脂质体制备品的脂质体制备品的平均直径(Z_平均)差异小于1.5倍，并且多分散性指数(PI)的差异小于2倍，其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外。

52.根据权利要求51所述的脂质体制备品，其中在复水后1小时的PI优选小于0.4。

53.根据权利要求52所述的脂质体制备品，其中在复水后1小时的PI优选小于0.3。

54.根据权利要求52所述的脂质体制备品，其中在复水后1小时的PI优选小于0.25。

55.一种通过使脱水脂质体制备品再水化获得的包含脂质体在水相中的混悬液的脂质体制备品，其特征在于在25℃下在24小时内所述平均直径(Z_平均)的变化不大于1.5倍，并且所述多分散性指数(PI)的变化不大于2倍，其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外。

56.根据权利要求55所述的脂质体制备品，其中所述平均直径(Z_平均)的变化不大于1.25倍。

57.根据权利要求55所述的脂质体制备品，其中所述多分散性指数(PI)的变化不大于1.5倍。

58.根据权利要求55所述的脂质体制备品，其中所述多分散性指数(PI)的变化不大于1.25倍。

59.根据权利要求51至58中任一项所述的脂质体制备品，其中所述脂质体在所述脂质体膜中包含多达5摩尔％的紫杉醇。

60.根据权利要求51至58中任一项所述的脂质体制备品，其中所述脂质体在所述脂质体膜中包含多达3摩尔％的紫杉醇。

61.根据权利要求59所述的脂质体混悬液，其中所述脂质体包含摩尔比优选为50:47:3的DOTAP、DOPC和紫杉醇。

62.一种脂质体混悬液，其包含含有总脂质浓度为10mM的DOTAP、DOPC和紫杉醇的脂质体，以及海藻糖，所述脂质体混悬在包含10mg/ml海藻糖的水相中，其中所述脂质体的特征在于无水密度为至少1.1g/ml，其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外。

63.根据权利要求62所述的脂质体混悬液，其中包含的DOTAP、DOPC和紫杉醇的摩尔比为50:47:3。

64.根据权利要求62所述的脂质体混悬液，其中所述脂质体混悬液包含柠檬酸。

65.根据权利要求62所述的脂质体混悬液，其中所述脂质体的z_平均为140nm。

66.一种脂质体混悬液，其包含含有总脂质浓度为10mM的DOTAP、DOPC和紫杉醇的脂质体，以及海藻糖，所述脂质体混悬在包含9.79mg/ml海藻糖的水相中，其中所述脂质体的特征在于无水密度为至少1.1g/ml，其中在所述脂质体内部的水相的同渗容摩O_内高于在所述脂质体外部的水相的同渗容摩O_外。

67.根据权利要求66所述的脂质体混悬液，其中包含的DOTAP、DOPC和紫杉醇的摩尔比为50:47:3。

68.根据权利要求66所述的脂质体混悬液，其中所述脂质体混悬液包含柠檬酸。

69.根据权利要求66所述的脂质体混悬液，其中所述脂质体的z_平均为140nm。