WO2011125607A1 - 親水性高分子修飾リポソームの製造方法 - Google Patents

親水性高分子修飾リポソームの製造方法 Download PDF

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WO2011125607A1
WO2011125607A1 PCT/JP2011/057640 JP2011057640W WO2011125607A1 WO 2011125607 A1 WO2011125607 A1 WO 2011125607A1 JP 2011057640 W JP2011057640 W JP 2011057640W WO 2011125607 A1 WO2011125607 A1 WO 2011125607A1
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hydrophilic polymer
liposome
modified
liposomes
dispersion
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恵 和地
宏司 中村
敬亮 吉野
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テルモ株式会社
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/20—After-treatment of capsule walls, e.g. hardening
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying

Definitions

  • the present invention relates to a method for modifying a liposome with a hydrophilic polymer useful for a drug delivery system, a method for producing a hydrophilic polymer-modified liposome using the method, and a hydrophilic high polymer produced using the method.
  • the present invention relates to a molecularly modified liposome.
  • DDS Drug Delivery System
  • liposomes are mainly composed of phospholipids, which are constituents of living organisms, and thus have low toxicity and antigenicity, and can contain various drugs such as water-soluble substances, fat-soluble substances, and polymers, Since it can be selectively accumulated in tumor tissues and inflamed sites, research has progressed as a major DDS technique.
  • retention in blood means, for example, a property in which a drug is present in blood in a state where the drug is encapsulated in a drug carrier (in the present invention, a liposome) in a host to which the drug carrier is administered. . Once released from the drug carrier, the drug quickly disappears from the blood and is exposed. “Exposure” means that the drug released to the outside of the drug carrier has an effect on the external environment.
  • Another problem is stabilization of the liposome particle size.
  • the reason why liposomes selectively accumulate in tumor tissues or inflamed sites is thought to be because leakage of liposomes from inside the blood vessel to outside the blood vessel occurs due to increased blood vessel permeability in such tissues. ing. That is, when the particle size of the liposome increases, the target selectivity is lowered. Therefore, it is necessary to strictly control the particle size by preventing aggregation of the liposome due to interaction with blood proteins and the like.
  • hydrophilic polymer-modified liposomes can obtain high blood retention and particle size stability. Therefore, it can be selectively delivered to a tissue with increased vascular permeability such as a tumor tissue or an inflammatory site, and its practical use is being promoted (Patent Documents 1 to 3, Non-Patent Documents 1 to 3).
  • hydrophilic polymer-modified liposomes those using liposomes modified with polyethylene glycol (hereinafter also simply referred to as “PEG”) as hydrophilic polymers (hereinafter referred to as “PEG-modified liposome”) are currently used. It has been put into practical use. For example, as such a PEG-modified liposome, Doxil (Doxyl, registered trademark) that is already on the market in Japan, the United States, and several tens of other countries is well known.
  • PEG polyethylene glycol
  • the production of liposome formulations is generally performed according to the following flow: (1) Step of homogenizing liposome membrane constituents (homogenization step); (2) A step of mixing a membrane lipid and an aqueous phase to produce a crude liposome having a particle size of several hundred nm to several tens of ⁇ m (crude liposome producing step); (3) a step of controlling the particle size and the like of the liposome (a granulating step) (4) In the case of drug-encapsulated liposomes, a step of removing unencapsulated drug (unencapsulated drug removal step); in the case of liposomes not containing a drug, the step of replacing the external aqueous phase (external liquid replacement step); and (5) A step of performing purification or aseptic filtration (sterilization step).
  • Non-Patent Document 4 One is a method of adding a hydrophilic polymer in the homogenization step and homogenizing at the same time with molecular lipid membrane constituents.
  • the hydrophilic polymer is oriented not only in the liposome outer surface which is originally required but also in the interior, so that the internal aqueous phase volume is narrowed and the amount of drug encapsulated is reduced.
  • the hydrophilic polymer increases the fluidity of the liposome membrane and enhances the permeability of the encapsulated drug. Therefore, the higher the content of the hydrophilic polymer, the greater the leakage of the encapsulated drug.
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 5.
  • an extra hydrophilic polymer is used at the time of production, there is a problem in both the formulation design and production technology such as an increase in production cost.
  • the other is a method of adding a hydrophilic polymer to naked liposomes that have been stored after finishing the sizing process (Patent Document 5).
  • Patent Document 5 a method of adding a hydrophilic polymer to naked liposomes that have been stored after finishing the sizing process.
  • this method there is a time lag between the formation of the naked liposome particles and the modification with the hydrophilic polymer, so that a problem arises that the increase in particle diameter due to aggregation of the liposomes is caused over time.
  • This time lag is not a big problem because it is relatively short in small-scale manufacturing at the laboratory level, but becomes a fatal problem as the time becomes longer for medium- and large-scale manufacturing.
  • the increase in the liposome particle size that occurs during the time lag is a problem before the decrease in target selectivity as described above, as a problem with the hollow fiber membrane and reverse osmosis membrane used in the subsequent unencapsulated drug removal step.
  • the production itself stops due to clogging of the sterile filtration membrane in the adsorption and sterilization process.
  • it is indispensable to heat the storage tank that stores naked liposomes so if there is a problem with equipment or power failure during liquid transfer to the storage tank, the liposome cannot be heated. The agglomeration proceeds rapidly and a situation occurs in which the lot must be discarded.
  • Liposomes are generally formed in the absence of an organic solvent using the thin film method in the homogenization process, taking advantage of the fact that the stability can be kept higher in the absence of an organic solvent than in the presence of an organic solvent. It has also been suggested that the problem of particle size increase can be solved to some extent (Patent Document 6). However, it is impractical to carry out such a method in actual medium and large-scale production, and the use of an organic solvent is inevitable. Thus, ensuring the stability of liposomes in medium and large-scale production is a very important issue.
  • the method for modifying liposomes described in Patent Document 5 with a hydrophilic polymer is a dispersion of naked liposomes (hereinafter referred to as “sized liposomes”) that have undergone a homogenization step, a coarse liposome formation step, and a granulation step.
  • the liquid is stored in the liquid storage part (storage process), and a predetermined amount of the hydrophilic polymer solution is mixed in the liquid storage part (mixing process).
  • the sized liposome is stored in the liquid storage tank for a relatively short time. Since the particle diameter greatly fluctuated, it was necessary to add a hydrophilic polymer as soon as possible.
  • the present inventors do not mix the hydrophilic polymer after the total amount of the granulated liposome dispersion is stored in the liquid storage tank, but the granulation step. Immediately after, a merging part and a mixing part for joining the granulated liposome dispersion and the hydrophilic polymer are provided, and the hydrophilic polymer is quickly joined and mixed without retaining the granulated liposome dispersion. Thus, it became possible to suppress the destabilization of the liposome particle size in the subsequent steps, and it was found that the above problems could be solved.
  • the present inventor has also made the merging and mixing of the granulated liposome dispersion and the hydrophilic polymer, the dispersion, and the mixture of the dispersion and the hydrophilic polymer into the liposome main membrane material. It has been found that if it is carried out while the temperature is higher than the phase transition temperature, a step of intentionally heating is unnecessary at the junction where the granulated liposome and the hydrophilic polymer are merged and thereafter.
  • the present invention is as follows.
  • a liquid feeding process for feeding liquid to the liquid storage part In the merging step, the temperature of the granulated liposome dispersion is equal to or higher than the phase transition temperature of the main membrane material constituting the liposome in which the average particle diameter is controlled within a predetermined range, and A method for producing a hydrophilic polymer-modified liposome, wherein, in the mixing step, the temperature of the mixed solution of the granulated liposome dispersion and the hydrophilic polymer is equal to or higher than the phase transition temperature.
  • a device for producing hydrophilic polymer-modified liposomes A sizing part for sizing coarse liposomes, a liquid storage part for storing a dispersion liquid containing hydrophilic polymer-modified liposomes, and a liquid feeding part for sending the liposome dispersion liquid from the sizing part to the liquid storage part.
  • a liquid pipe An apparatus for producing hydrophilic polymer-modified liposomes, wherein the liquid feeding tube has a merging portion for merging a hydrophilic polymer with a dispersion of sized liposomes.
  • the risk of aggregation between liposomes can be avoided, and hydrophilic polymer-modified liposomes having a stable particle size can be produced at an industrial level.
  • a liposome preparation with stable preparation quality such as the above can be provided.
  • clogging of the sterilizing filter occurs, and the risk that the manufacturing stops can be reduced.
  • the thermal exposure of liposomes during the manufacturing process may lead to the outflow of drugs due to degradation or destabilization of the lipids that make up the liposome membrane, and may affect the stability of the encapsulated drugs.
  • the present invention makes it possible to reduce the time required for the addition of the hydrophilic polymer in medium- and large-scale production and the heating time after the addition, thereby reducing such a risk.
  • the present invention can also provide a manufacturing apparatus using the method.
  • FIG. 3 is a diagram showing an outline of a liposome modifying apparatus used in Example 2. It is a figure which shows the particle size distribution of the hydrophilic polymer modification liposome manufactured with the modification method of this invention, and the conventional modification method (room temperature and 45 minutes, 45 degreeC and 45 minutes, 55 degreeC and 45 minutes). It is a conceptual diagram showing the flow of the conventional modification method.
  • Glycerophospholipids such as phosphatidylinositol; sphingophospholipids such as sphingomyelin; natural or synthetic diphosphatidyl phospholipids such as cardiolipin and their derivatives; those hydrogenated according to conventional methods (eg, hydrogenated) And soy phosphatidylcholine (HSPC)).
  • hydrogenated phospholipids such as HSPC, sphingomyelin and the like are preferable.
  • the liposome of the present invention can contain a single kind or plural kinds of phospholipids as a main membrane material.
  • a main membrane material having a phase transition temperature higher than the in-vivo temperature (35 to 37 ° C.), preferably 50 ° C. or more is preferably used. This is because by using such a phospholipid, it becomes possible to prevent the drug enclosed in the liposome from easily leaking out of the liposome during storage or in a living body such as blood. .
  • the amount of phospholipid which is the main component of the liposome membrane lipid of the present invention, is usually 20 to 100 mol%, preferably 40 to 100 mol% in the whole membrane lipid.
  • the amount of lipids other than phospholipids is generally 0 to 80 mol%, preferably 0 to 60 mol%, based on the total membrane lipid.
  • the hydrophilic polymer is not particularly limited.
  • polyethylene glycol (PEG), polyglycerin (PG), and polypropylene glycol (PPG) are preferable because they have an effect of improving the retention in the blood of the liposome preparation.
  • polyethylene glycol (PEG) is the most versatile and is particularly preferable because it has been confirmed to improve the retention in blood.
  • such a hydrophilic polymer is preferably one in which one end is alkoxylated (for example, methoxylated, ethoxylated, propoxylated) from the viewpoint of storage stability.
  • the hydrophilic polymer has a portion (hereinafter referred to as “anchor”) for locking the other end to the liposome membrane.
  • anchor a hydrophobic moiety or a reactive functional group that can be covalently bonded to a liposome membrane constituent can be used.
  • the anchor is a hydrophobic part such as a lipid
  • the hydrophilic polymer is immobilized on the outer surface of the liposome in such a manner that the anchor is inserted into the liposome membrane.
  • the anchor is a reactive functional group that can be covalently bonded to the liposome membrane component
  • the hydrophilic polymer is bonded to the liposome membrane component such as phospholipid exposed on the outer surface of the liposome. Immobilized on the liposome outer surface.
  • Such a bond is preferably a covalent bond, and specific examples include an amide bond, an ester bond, an ether bond, and a disulfide bond, but are not particularly limited.
  • hydrophobic compound used as the anchor examples include phospholipids constituting mixed lipids described later, other lipids such as sterols, long-chain aliphatic alcohols, polyoxypropylene alkyls, glycerin fatty acid esters, and the like. Among them, phospholipid is one of the preferred embodiments. Moreover, it is more preferable to use a phospholipid having a reactive functional group that binds to a liposome membrane-constituting lipid (phospholipid). Specific examples of such phospholipids include phosphatidylethanolamine having an amino group, phosphatidylglycerol having a hydroxy group, and phosphatidylserine having a carboxy group. One preferred embodiment is to use phosphatidylethanolamine. It is.
  • the acyl chain contained in the phospholipid is desirably a saturated fatty acid.
  • the chain length of the acyl chain is preferably C 14 -C 20 and more preferably C 16 -C 18 .
  • Examples of the acyl chain include dipalmitoyl, distearoyl, and palmitoyl stearoyl.
  • the combination of the hydrophilic polymer and the lipid of the anchor is not particularly limited, and a combination appropriately combined according to the purpose can be used.
  • at least one selected from other lipids such as phospholipids and sterols, long-chain aliphatic alcohols, polyoxypropylene alkyls, glycerin fatty acid esters, and at least one selected from PEG, PG, and PPG Examples thereof include bonded hydrophilic polymer derivatives.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol (PEG), and phospholipid or cholesterol is selected as the lipid.
  • the lipid derivative of hydrophilic polymer can be selected from positive charge, negative charge, and electrical neutrality by selecting the lipid. For example, when distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE) is selected as the lipid, it becomes a lipid derivative that exhibits a negative charge due to the influence of the phosphate group, and when cholesterol is selected as the lipid, it becomes an electrically neutral lipid derivative.
  • DSPE distearoylphosphatidylethanolamine
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, but is preferably 500 to 10,000, more preferably 1,000 to 7,000, and still more preferably 2,000 to 5,000.
  • the molecular weight of PG is not particularly limited, but is preferably 100 to 10,000, preferably 200 to 7000, and more preferably 400 to 5000.
  • the molecular weight of PPG is not particularly limited, but is preferably 100 to 10000, more preferably 200 to 7000, and still more preferably 1000 to 5000.
  • phospholipid derivatives of PEG are mentioned as one of the most preferred embodiments.
  • examples of phospholipid derivatives of PEG include polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine (PEG-DSPE).
  • PEG-DSPE is preferred because it is a general-purpose compound and is easily available.
  • the form of the hydrophilic polymer is not particularly limited, but is preferably a powder or a liquid, and more preferably a liquid having a low viscosity, for ease of mixing in the mixing step.
  • the solvent is not particularly limited, but considering the necessity of mixing with water, water, alcohols, DMF, THF, or DMSO are preferable, and water is most preferable.
  • the solution concentration when the hydrophilic polymer is a solution is not particularly limited, but is preferably 0.01 mg / mL to 10 g / mL.
  • hydrophilic polymer when it is a liquid polymer, it can be added as it is.
  • the modification rate of the membrane lipid by the hydrophilic polymer (ratio of the amount of the hydrophilic polymer to the membrane lipid) is usually 0.1 to 20 mol%, preferably 0.1 to 5 mol%, more preferably 0.5 to 5 mol. %.
  • the granule sizing step is a step of obtaining a granulated liposome by controlling the particle size of the liposome using various known techniques including membrane emulsification and sustaining shearing force.
  • a membrane emulsification method in which a filter is forced to pass a plurality of times a high pressure emulsification method in which high pressure discharge is performed by a high pressure discharge type emulsifier, or the like can be used.
  • the average particle size of the sized liposome is preferably 20 nm to 2000 nm, more preferably 30 nm to 400 nm, and even more preferably 50 nm to 250 nm.
  • the granulated liposome of the present invention is not limited to the method exemplified here and can be obtained.
  • the merging step is a step of merging the hydrophilic polymer and the sized liposome dispersion.
  • the hydrophilic polymer and the granulated liposome dispersion are merged, that is, the hydrophilic polymer and the granulated liposome dispersion can be mixed, and the merging process is performed for a short time. Completed in house.
  • the merging step can be carried out continuously.
  • merging section The place where the merging process is performed is referred to as a merging section.
  • merging process since the merging process is completed in a very short time, it may be difficult to clearly distinguish it from the mixing section performing the mixing process.
  • merging and mixing cannot occur at the same time, the merging process and the mixing process may be performed continuously, but not simultaneously.
  • the merging step is a step in which the inflowing granulated liposome dispersion and the hydrophilic polymer are not retained or stored.
  • the time until it is combined with the hydrophilic polymer is preferably within 5 minutes after sizing, Within 3 minutes is more preferred, within 1 minute is more preferred, and within 30 seconds is even more preferred.
  • the method of merging is not particularly limited.
  • Examples of the merging method include a method of merging at a Y-shaped, T-shaped or other 2-in-1 out-shaped merging portion.
  • the merging step is performed in a state where the temperature of the sized liposome dispersion is equal to or higher than the phase transition temperature of the main membrane material of the sized liposome.
  • the temperature of the hydrophilic polymer is not particularly limited.
  • the joining portion may be intentionally heated, but may not be intentionally heated when it is not necessary to warm.
  • the modification method of the present invention can continuously carry out a granulating step, a merging step, and a mixing step. For example, at the moment when the granulated liposome dispersion and the hydrophilic polymer are mixed in the mixing section, the production of the granulated liposome dispersion in the granulating section and the granulated liposome in the mixing section. The dispersion and the hydrophilic polymer are merged simultaneously.
  • the amount of hydrophilic polymer added to ensure physicochemical stability such as particle size depends on the amount of solvent in the sized liposomes brought from the homogenization step to the merging step.
  • the amount of hydrophilic polymer added is adjusted so that the liposome membrane lipid is modified at the above-mentioned modification rate, and the larger the amount of granulated liposomes to be brought in, the greater the amount of hydrophilic polymer added.
  • ⁇ Mixing process> In the mixing step, the merged hydrophilic polymer and the granulated liposome dispersion are introduced and mixed, and the hydrophilic polymer-modified liposome dispersion (a dispersion containing the granulated liposome modified with the hydrophilic polymer) is mixed. It is a process of obtaining.
  • a method of temporarily retaining a mixture of a hydrophilic polymer and a sized liposome dispersion can be used, but in order to complete the modification as soon as possible, the mixture is not retained and the sized liposome. It is preferable to carry out while flowing a mixed liquid of the dispersion and the hydrophilic polymer.
  • the mixing method is not particularly limited.
  • the mixing part is preferably in the form of a pipe or a reservoir.
  • the pipe shape allows the liquid that has flowed into the mixing section to flow out without stagnation, allows the liquid to flow into the mixing section quickly, and allows the liquid to flow out of the mixing section quickly. It is what.
  • the reservoir shape temporarily retains the liquid flowing into the mixing section, and the flow speed of the liquid flowing into the mixing section and the flow speed of the liquid flowing out from the mixing section are balanced.
  • the liquid that has flowed into the mixing section flows from the inflow section toward the outflow section, but it is preferable that the liquid is intentionally stirred during the flow.
  • the mixing method is not particularly limited, but for example, a method in which the joined hydrophilic polymer and the granulated liposome dispersion are agitated with a screw or the like, or a turbulent flow with a plurality of protrusions provided inside the pipe. The method of forming can be mentioned.
  • the mixing is performed in a state where the temperature of the mixture of the sized liposome dispersion and the hydrophilic polymer is equal to or higher than the phase transition temperature of the main membrane material of the sized liposome.
  • the mixing step it is necessary to maintain the temperature of the mixture of the sized liposome dispersion and the hydrophilic polymer at a temperature higher than the phase transition temperature of the liposome main membrane material for a predetermined time. Therefore, intentional warming and / or intention may be performed as necessary or desired.
  • the time for performing is 1 to 180 minutes, preferably 5 to 120 minutes, more preferably 5 to 30 minutes.
  • the liquid feeding step is a step of feeding the hydrophilic polymer-modified liposome dispersion after the mixing step to the liquid storage part.
  • the method for feeding liquid is not particularly limited.
  • it is preferable not to intentionally warm or intentionally stir the hydrophilic polymer-modified liposome dispersion.
  • the hydrophilic polymer-modified liposome dispersion is rapidly cooled from the viewpoint of lipid stability, it may be configured to be cooled during the liquid feeding step.
  • the cooling method in this case is not particularly limited, and a known method such as using a cooling jacket tank can be selected.
  • the modification method of the present invention can further include steps other than those described above. Examples of such a process include the following processes. These will be described below.
  • the homogenization step is a pre-step of the crude liposome formation step.
  • a homogenization process shows the process of melt
  • a plurality of lipid components such as phospholipid and cholesterol are often present as liposome components.
  • a homogenization step is not necessarily essential, but it is desirable to take a homogenization step when manufacturing intended for practical use is assumed.
  • a thin film method is well known in which an organic solvent such as chloroform is completely dissolved and vacuum-dried for homogenization.
  • an organic solvent such as chloroform
  • a method using alcohol, particularly ethanol, as an organic solvent is widely used.
  • a liposome membrane component substance is heated and dissolved in a volatile organic solvent, preferably absolute ethanol, to prepare a lipid solution.
  • the heating temperature is usually not lower than the phase transition temperature.
  • hydrogenated soybean phosphatidylcholine it is 50 ° C. to 80 ° C., preferably 60 ° C. to 70 ° C.
  • an aqueous solution is prepared by dissolving an osmotic pressure adjusting agent, a pH adjusting agent and the like in water for injection. Further, if necessary, an antioxidant, a membrane stabilizer, and a substance encapsulated in liposomes can be added to the aqueous solution.
  • the method for carrying out the homogenization step is not limited to those listed here, and various methods known to those skilled in the art can be used.
  • a coarse liposome formation process is a post process of an above-described homogenization process, and is a pre-process of an above-described granulation process.
  • the coarse liposome forming step indicates a step of forming coarse liposomes using homogenized lipids.
  • a hydration method Boangham method
  • an ultrasonic treatment method a reverse phase evaporation method and the like.
  • a heating method Japanese Patent Laid-Open No. 60-7933
  • a lipid dissolution method Japanese Patent Laid-Open No.
  • a DRV method Dehydrated / Rehydrated Vesicles
  • a freeze-thaw method and the like
  • the method for carrying out the crude liposome formation step is not limited to those described here, and various methods known to those skilled in the art can be used.
  • a storage process is a post process of an above-described liquid feeding process.
  • a storage process is a process of storing the dispersion liquid containing the hydrophilic polymer modification liposome sent to the liquid storage part.
  • the storage method is not particularly limited. The same liquid reservoir as in the conventional method can be used.
  • the next process is a process performed after the storage process. That is, it is a process performed on hydrophilic polymer-modified liposomes.
  • Examples of the next step include an external liquid replacement step, an unencapsulated drug removal step, and a sterilization step.
  • the hydrophilic polymer that has not been bound in the mixing step can be removed in the unencapsulated drug removal step. Therefore, it is desirable that there is an unencapsulated drug removal step after the mixing step.
  • the liposome since the liposome is already modified with a hydrophilic polymer, it can be treated stably.
  • the external liquid replacement step, the unencapsulated drug removal step, the sterilization step and the like can be performed by various known methods.
  • liposomes after the addition of hydrophilic polymers do not need to undergo particle size fluctuations due to destabilization of the liposomes, so the outer membrane replacement process, unencapsulated drug removal process and sterilization process undergo phase transition of the main membrane material. It is preferable to carry out below the temperature.
  • the phase transition temperature of the main film material is around 50 ° C., it is preferably about 0 to 40 ° C., more specifically, about 5 to 30 ° C. is preferable.
  • a method for carrying out the sterilization process methods such as heat sterilization, ethylene oxide gas sterilization, ⁇ -ray sterilization, hydrogen peroxide sterilization, electron beam sterilization, and filtration sterilization are known, but heat sterilization, ethylene oxide gas Sterilization methods such as sterilization, ⁇ -ray sterilization, hydrogen peroxide sterilization, and electron beam sterilization can cause irreversible structural changes in lipids and hydrophobic drugs, and thus are not preferable for sterilization of liposomes. From this viewpoint, filtration sterilization is suitable as a method for sterilizing liposomes.
  • the liposome filtration sterilization system can vary widely depending on the volume, density, temperature, filter material and filter size of the composition, but is not limited, but filtration using the indicator bacterium Brevundimonas diminuta, which is the standard for filter sterilization.
  • a filter having a pore size of 0.2 ⁇ m is generally used in order to stably secure the LRV (Log Reduction Value / logarithmic decrease value) 7 or more bacteria capture performance.
  • Liposomes that have undergone the sterilization step can be stored by refrigeration at room temperature of 21 ° C. to 30 ° C., preferably 0 to 8 ° C., from the viewpoints of lipid stability and physicochemical stability such as particle size. .
  • the liposome modifying apparatus of the present invention regulates the size of coarse liposomes.
  • a sizing part, a storage part for storing the hydrophilic polymer-modified liposome dispersion, a sizing part and the storage part are connected to each other, and a liquid feeding tube for feeding the liposome dispersion is provided.
  • the liquid feeding tube has a merging portion for merging the granulated liposome and the hydrophilic polymer.
  • the joining part and the mixing part are not intentionally heated.
  • the liposome modifying apparatus 20 of the present invention will be described based on FIG.
  • the coarse liposome is supplied from the coarse liposome dispersion supply unit 21 to the granulation unit (extruder) 23 by the constant speed pump 22, and the particle size is controlled to produce the granulated liposome dispersion.
  • the sized liposome dispersion is merged with the hydrophilic polymer supplied from the hydrophilic polymer supply unit 24 by the constant speed pump 25 at the merging unit 26 and sent to the mixing unit 27 without staying there. Is done.
  • a dispersion liquid containing hydrophilic polymer-modified liposomes is generated in the mixing unit 27, passes through the liquid feeding unit 28, is sent to the liquid storage unit 29, and is stored.
  • the hydrophilic polymer solution is sent to the joining portion 26 at the same time that the liposome just after the sizing is sent to the joining portion 26 through the pipe.
  • the hydrophilic polymer is always added at a constant volume ratio immediately after the formation of the granulated liposome.
  • the feeding speed of the sized liposome and the feeding speed of the hydrophilic polymer solution are adjusted according to the substance concentration of each solution so that the sized liposome is modified at a predetermined modification rate.
  • the liposome modifying apparatus shown in FIG. 3 measures the liquid feeding speed of the sized liposome dispersion with the flow rate measuring device 32, and the hydrophilic polymer solution at the liquid feeding speed calculated by the flow rate ratio control device 31 from that speed. By controlling the liquid feeding speed with the flow rate adjusting device 33, a more highly controlled mixing method can be realized. Compared with the liposome modification apparatus shown in FIG. 2, this modification apparatus has an advantage that it can cope with a change in the flow rate of the sized liposome.
  • the method for producing a liposome preparation of the present invention includes a homogenization step, a coarse liposome formation step, a granulation step, a merging step, a mixing step, a liquid feeding step, a storage step, an unencapsulated drug removal step, and a sterilization step in this order.
  • a specific process may be included twice or more, and a process not listed here may be included.
  • the modification method of the present invention can be used for the production of a hydrophilic polymer-modified liposome preparation.
  • the “liposome preparation” is a general term for a substance in which a liposome is used as a carrier and a drug is supported thereon.
  • “Supported” as used herein means a state in which a drug is contained in a carrier.
  • the liposome preparation produced by the production method of the present invention hereinafter referred to as “the liposome preparation of the present invention”
  • the drug may be present in the inner aqueous phase of the liposome, and is statically deposited on the surface of the lipid layer, which is a component of the carrier.
  • the liposome preparation of the present invention includes those carrying various drugs.
  • therapeutic drugs include nucleic acids, polynucleotides, genes and analogs thereof, anticancer agents, antibiotics, enzyme agents, antioxidant agents, lipid uptake inhibitors, hormone agents, anti-inflammatory agents, steroid agents, Vasodilator, Angiotensin converting enzyme inhibitor, Angiotensin receptor antagonist, Smooth muscle cell proliferation / migration inhibitor, Platelet aggregation inhibitor, Anticoagulant, Chemical mediator release inhibitor, Vascular endothelial cell proliferation promotion or suppression Agents, aldose reductase inhibitors, mesangial cell growth inhibitors, lipoxygenase inhibitors, immunosuppressants, immunostimulators, antiviral agents, Maillard reaction inhibitors, amyloidosis inhibitors, nitric oxide synthesis inhibitors, AGEs (Advanced glycation) endproducts) inhibitors, radical scavengers, Proteins, peptides, glycosaminoglycans and
  • corticosteroids such as prednisolone, methylprednisolone, and dexamethasone and their derivatives
  • non-steroidal anti-inflammatory agents such as aspirin, indomethacin, ibuprofen, mefenamic acid, and phenylbutazone
  • mesangial cell proliferation such as heparin and low molecular weight heparin.
  • immunosuppressive agents such as cyclosporine, ACE (angiotensin converting enzyme) inhibitors such as captopril, AGE (advanced glycation endoproduct) inhibitors such as methylguanidine, TGF- ⁇ antagonist pK such as biglycan and decorin, teC C) inhibitors, prostaglandin preparations such as PGE 1 and PGI 2 , papaverine drugs, nicotinic acid drugs, tocopherol drugs, and C Peripheral vasodilators such as a antagonists, phosphodiesterase inhibitors, antithrombotic agents such as ticlopidine and aspirin, anticoagulants such as warfarin, heparin and antithrombin agents, thrombolytic agents such as urokinase, chemical mediator release inhibitors, antibiotics Substances, antioxidants, enzyme agents, lipid uptake inhibitors, hormone agents, radical scavengers such as vitamin C, vitamin E, and SOD, antis
  • diagnostic drug examples include in-vivo diagnostic agents such as an X-ray contrast agent, an ultrasonic diagnostic agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, and a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis.
  • in-vivo diagnostic agents such as an X-ray contrast agent, an ultrasonic diagnostic agent, a radioisotope-labeled nuclear medicine diagnostic agent, and a diagnostic agent for nuclear magnetic resonance diagnosis.
  • the liposome preparation of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable stabilizer and / or antioxidant and / or osmotic pressure adjusting agent and / or pH adjusting agent depending on the administration route.
  • the stabilizer is not particularly limited, and examples thereof include saccharides such as glycerol, mannitol, sorbitol, lactose, or sucrose.
  • saccharides such as glycerol, mannitol, sorbitol, lactose, or sucrose.
  • sterols such as cholesterol described above as other lipids of membrane constituents act as this stabilizer.
  • the additives are appropriately selected or used in combination, but are not limited thereto.
  • a liposome preparation containing these additives can be provided as a pharmaceutical composition.
  • the form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and the liposome preparation may be dispersed or suspended in a liquid, or may be lyophilized.
  • the pharmaceutical composition is preferably packed with nitrogen. Further, it may be housed in a gas permeable container and hermetically packaged with a packaging material having gas barrier properties together with an oxygen scavenger.
  • Such a pharmaceutical composition can be stored in a usual manner, for example, refrigeration at 0 to 8 ° C. or 1 to 30 ° C. at room temperature.
  • the particle size and particle size distribution of the drug-encapsulated liposomes prepared in each example were measured by a laser diffraction method (Beckman Coulter LS230, Beckman Coulter).
  • HSPC hydrogenated soybean lecithin, molecular weight 790
  • Chl cholesterol, molecular weight 386.66
  • PEG 5000 -DSPE polyethylene glycol 5000 - phosphatidylethanolamine, molecular weight 6123
  • TRX-20 3,5-Dipentadecylbenzamide Hydrochloride, molecular weight 609.41
  • PSLP prednisolone sodium phosphate, molecular weight 484.39
  • Example 1 Preparation of PEG-modified liposomes A dispersion of PEG-modified liposomes was prepared according to the following procedure. (1) Homogenization 6.5168 g of HSPC, 2.6785 g of Chl, and 0.8045 g of TRX-20 were weighed, and absolute ethanol (10 mL) was added and dissolved.
  • Example 2 Preparation of PEG-modified liposomes A dispersion of PEG-modified liposomes was prepared according to the following procedure. (1) Homogenization 6.5168 g of HSPC, 2.6785 g of Chl, and 0.8045 g of TRX-20 were weighed, and absolute ethanol (10 mL) was added and dissolved. (2) Crude liposome formation 6.7815 g of PSLP, 0.0100 g of sodium sulfite, and 0.2101 g of citric acid monohydrate were added, 80 mL of RO water was added, and after dissolution, 1 mol / L sodium hydroxide was added.
  • the pH was adjusted to 7.2, and RO water was added to make 100 mL, which was used as the inner aqueous phase.
  • the dispersion obtained by adding the lipid solution obtained through the homogenization step to the heated inner aqueous phase was stirred to obtain a crude liposome dispersion.
  • (3) Sizing The liposome modification experiment apparatus 40 was prepared (see FIG. 4). The obtained crude liposomes were put into a crude liposome dispersion supply unit 41 heated to about 70 ° C., and sent to a granulating unit (extruder) 43 heated to about 70 ° C. using a constant speed pump 42. .
  • a polycarbonate membrane filter having a pore size of 200 nm was passed three times and a polycarbonate membrane filter having a pore size of 100 nm was passed ten times to produce a sizing granulated liposome dispersion, which was immediately fed to the joining part 46.
  • the piping between the outflow part of the sizing part (extruder) 43 and the merging part 46 was short, and the temperature of the dispersion liquid passing therethrough did not drop below 65 ° C.
  • a PEG 5000 -DSPE solution (15.19 g / 400 mL (RO water)) is supplied at a constant speed from the hydrophilic polymer supply unit 44 heated to about 70 ° C. to the confluence unit 46 heated to about 70 ° C. It pumped in using the pump 45 and was made to merge with the said granulated liposome. The combined granulated liposome and PEG 5000 -DSPE solution were fed into the mixing section 47 without staying in the confluence section 46.
  • the mixing portion 47 is a long tube, and the entire loop-shaped portion exists in the thermostatic chamber 50 heated to about 70 ° C.
  • the space between the joining portion 46 and the loop portion of the mixing portion 47 (the joining portion connecting portion of the mixing portion 47) is short, and the temperature of the liquid mixture passing through the inside does not drop below 65 ° C.
  • the mixed solution of the granulated liposome and the PEG 5000 -DSPE solution sent to the mixing unit 47 was passed through the mixing unit 47 over about 15 minutes.
  • (5) Liquid feeding / storage The liquid mixture of the sized liposome and the PEG 5000 -DSPE solution that passed through the mixing section 47 was stored in the liquid storage section 49 through the liquid feeding section 48. As a result, a dispersion of PEG-modified liposomes was obtained.
  • the average particle size and particle size distribution (frequency volume (% by volume)) of the liposomes were measured.
  • the measurement results of the average particle diameter are shown in Table 2 [Comparative Example 1]
  • the measurement results of the particle size distribution are shown in FIG. 5 [Conventional method (room temperature)].
  • FIG. 5 will be described.
  • the particle size distribution of the PEG-modified liposome obtained in Example 1 [labeled “addition method at 0 time”. ] Is a single dispersion having a peak top of 0.1 ⁇ m.
  • Comparative Examples 1 to 3 coarse particles having a particle size exceeding 0.4 ⁇ m were confirmed, but in Example 1, they were not confirmed.
  • Comparative Example 3 [conventional method (55 ° C.)], the particle size distribution was monodispersed, but the tail of the particle size peak was observed to increase to 0.2 ⁇ m or more.
  • the filter sterilization filter When performing filtration sterilization, if particles having a pore size of 0.2 ⁇ m or more, which is the pore size of the filter sterilization filter, are formed, the filter sterilization filter may be clogged, and the process will be adversely affected.
  • the modification method of the present invention it was revealed that the generation of coarse particles can be avoided, and as a result, the risk of clogging occurring in the sterilization process can be reduced.

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Abstract

本発明は、平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを含む整粒化リポソーム分散液を得る整粒化工程と、上記整粒化リポソーム分散液と親水性高分子とを合流する合流工程と、上記整粒化リポソーム分散液と上記親水性高分子とを混合して親水性高分子修飾リポソームを含む親水性高分子修飾リポソーム分散液を得る混合工程と、上記親水性高分子修飾リポソーム分散液を貯液部に送液する送液工程とを有し、上記合流工程において、上記整粒化リポソーム分散液の温度が、上記平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを構成する主膜材の相転移温度以上であり、かつ、上記混合工程において、上記整粒化リポソーム分散液と上記親水性高分子との混合液の温度が上記相転移温度以上である親水性高分子修飾リポソームの製造方法及び装置に関するものであり、親水性高分子修飾リポソームの工業的レベルでの製造を可能とするものである。

Description

親水性高分子修飾リポソームの製造方法
　本発明は、ドラッグデリバリーシステムに有用な、親水性高分子でリポソームを修飾する方法、その方法を利用する親水性高分子修飾リポソームの製造方法およびその製造方法を使用して製造される親水性高分子修飾リポソームに関する。
　近年、ドラッグデリバリーシステム（Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＤＳ）が盛んに研究されている。その目的としては、薬物の持続的な放出（徐放）、体内半減期が短い薬物の寿命の延長、種々の病巣部位での薬物の吸収促進、または薬物の標的組織・細胞への選択的送達等が挙げられる。
　そして、その目的を達成する方法としては、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフィア、ナノパーティクル等の閉鎖小胞を利用するものがある。特に、リポソームは生体の構成成分であるリン脂質を主成分としているため毒性や抗原性が低いこと、水溶性物質や脂溶性物質、高分子等様々な薬物の内封が可能であること、また、腫瘍組織や炎症部位へ選択的に集積させることが可能であることなどから、主要なＤＤＳ技術として研究が進んできた。
　リポソームを利用したＤＤＳ技術の実用化に際しては、克服すべき様々な課題がある。一つは、生体側の異物認識機構からの回避である。すなわち、リポソームを標的部位に送達させるためには、血液中のオプソニン蛋白質やその他の血漿蛋白質等との相互作用を防止して、肝臓や脾臓等の細網内皮組織（ＲＥＳ）での取り込みを回避し、血中滞留性を高めることが必要である。
　ここで、「血中滞留性」とは、例えば、薬物担体が投与された宿主において、薬物が薬物担体（本発明においてはリポソーム）に内封された状態で血液中に存在する性質を意味する。薬物は、薬物担体から放出されると速やかに血中から消失し、暴露する。「暴露」とは、薬物担体の外部へ放出された薬物が外部環境に対し作用を及ぼすことを意味する。
　もう一つの課題は、リポソーム粒子径の安定化である。腫瘍組織や炎症部位などへリポソームが選択的に集積するのは、こうした組織においては血管透過性が亢進しているために、血管内から血管外へのリポソームの漏出が起こるためであると考えられている。つまり、リポソームの粒子径の増大が起こると標的選択性が低下するため、血中タンパク質等との相互作用によるリポソームの凝集等を防止し、粒子径を厳密に制御することが必要である。
　これらの課題を解決する方法として、親水性高分子によりリポソームを修飾するものが知られている。親水性高分子で修飾されたリポソーム（以下「親水性高分子修飾リポソーム」という。）は、高い血中滞留性および粒子径安定性を得ることができる。そのため、腫瘍組織や炎症部位等の血管透過性が亢進した組織への選択的な送達が可能であり、その実用化が進められている（特許文献１～３、非特許文献１～３）。
　親水性高分子修飾リポソームとしては、現在、親水性高分子としてポリエチレングリコール（以下、単に「ＰＥＧ」ともいう。）で修飾されたリポソーム（以下、「ＰＥＧ修飾リポソーム」という。）を用いたものが実用化されている。例えば、そのようなＰＥＧ修飾リポソームとしては、わが国をはじめ米国その他数十カ国で既に上市されているＤｏｘｉｌ（ドキシル、登録商標）がよく知られている。
　リポソーム製剤の製造は、一般に、以下の流れに従って行われる：
（１）リポソーム膜構成成分を均一化する工程（均一化工程）；
（２）膜脂質と水相とを混合して粒子サイズ直径数百ｎｍ～数十μｍの粗リポソームを生成する工程（粗リポソーム生成工程）；
（３）リポソームの粒子径等を制御する工程（整粒化工程）；
（４）薬物封入型リポソームにあっては未封入薬物を除去する工程（未封入薬物除去工程）、薬物を含まないリポソームにあっては外水相を置換する工程（外液置換工程）；および
（５）精製または無菌ろ過等をする工程（無菌化工程）。
　ところで、親水性高分子修飾によるリポソームの修飾方法は、大きく２つの方法が知られている。
　一つは、上記均一化工程において親水性高分子を添加し、分子脂質膜構成成分と同時に均一化する方法である（特許文献４）。しかし、この方法では、本来必要なリポソーム外部表面のみならず、内部にも親水性高分子が配向されることになり、内水相容積を狭め、薬物封入量を低下させる。また、親水性高分子は、リポソーム膜の流動性を上げ、内封した薬物の透過性を亢進させるため、親水性高分子の含有率が高くなるほど、内封した薬物の漏れが増大するという報告がある（非特許文献４、非特許文献５）。さらに、製造時に余分な親水性高分子を用いることとなるため製造コストの上昇を招く等、製剤設計・生産技術の両面で問題を抱えている。
　もう一つは、整粒化工程を終えて貯留した裸リポソームに親水性高分子を添加する方法である（特許文献５）。しかし、この方法では裸リポソーム粒子が形成されてから親水性高分子の修飾を受けるまでタイムラグが生じるため、リポソームの凝集による粒子径の増大が経時的に惹起されるという問題が発生する。このタイムラグは、実験室レベルの小規模製造では比較的短いため大きな問題にはならないが、中・大規模製造を行うにあたり長時間化するに従って致命的な問題となる。すなわち、タイムラグの間に起こるリポソーム粒子径の増大は、上述したような標的選択性の低下を引き起こす以前の問題として、後の未封入薬物除去工程で使用される中空糸膜や逆浸透膜への吸着、無菌化工程における無菌ろ過膜での目詰まりを引き起こし、製造自体が停止してしまうという問題が生じる。また、この方法では裸リポソームを貯留する貯液タンクの加温が不可欠であるため、貯液タンクへの送液中に設備トラブルや停電が発生して加温ができなかった場合に、リポソームの凝集が急激に進み、そのロットを破棄せざるを得ないような事態が生じる。
　リポソームは一般的に、有機溶媒非存在下では有機溶媒存在下に比べて安定性を高く保つことができることを利用し、均一化工程に薄膜法を用い、有機溶媒非存在下でリポソーム形成を行うことにより粒子径増大の問題をある程度解消しうることも示唆されている（特許文献６）。しかし、実際の中・大規模製造においてこのような方法を行うということは現実的でなく、有機溶媒の使用は不可避である。このように、中・大規模製造におけるリポソームの安定性の確保は非常に重要な課題となっている。
特表平５－５０５１７３号公報 特開平２－１４９５１２号公報 特表平５－５０１２６４号公報 米国特許第５０１３５５６号明細書 特開２００６－２７３８１２号公報 特公平７－２０８５７号公報
Park, J. W. et al. (1997) Cancer Letters. 118(2): 153-160. Suzuki, S. et al. (1997) British Journal of Cancer. 76(1): 83-89. Lasic, D. D. (1993) "Liposomes: From Physics to Application", Elsevier, Amsterdam, 580 pages. Nikolova, A. N. & Jones, M. N. (1996) Biochimica et Biophysica Acta - Lipids and Lipid Metabolism. 1304(2): 120-128. Nicholas, A. R. et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1463(1): 167-178.
　特許文献５に記載されたリポソームを親水性高分子で修飾する方法は、均一化工程、粗リポソーム形成工程、整粒化工程を経た裸リポソーム（以下、「整粒化リポソーム」という。）の分散液を貯液部に貯留し（貯留工程）、貯液部の中で親水性高分子溶液を所定量混合する（混合工程）ものである。
　しかし、工業化スケールでは整粒化リポソームの分散液が貯液タンクに貯留されるまでに長時間を要するため、リポソームの不安定化のリスクが高かった。特に、リポソームの構成成分や担持する薬剤等の電気的性質によっては非常に凝集し易い場合があり、このような場合には整粒化リポソームが貯液タンクで貯留されている比較的短い時間のうちにも粒子径が大きく変動してしまうため、一刻も早い親水性高分子の添加が必要であった。
　また、この方法では貯液部等を加温することが必要であるが、工程の全段階において厳密な温度制御を行うことは困難なため、工程中の温度変動が避けられず、凝集等のリポソームの不安定化を生じる原因となっていた。さらに、貯液タンクに整粒化リポソームを回収している最中に設備トラブルや停電等が発生した場合には、貯液タンク中の温度が低下し、整粒化リポソームが凝集する可能性があった。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、整粒化リポソーム分散液の全量が貯液タンクに貯留されてから親水性高分子を混合するのではなく、整粒化工程の直後に整粒化リポソーム分散液と親水性高分子を合流させる合流部および混合部を設け、整粒化リポソーム分散液を滞留させることなく、速やかに親水性高分子を合流・混合することで、以後の工程においてリポソーム粒子径の不安定化を抑えることが可能となり、上記課題を解決し得ることを知得した。
　本発明者は、また、整粒化リポソーム分散液と親水性高分子との合流および混合を、その分散液、およびその分散液と親水性高分子との混合液が、リポソームの主膜材の相転移温度以上であるうちに行うと、整粒化リポソームと親水性高分子とを合流する合流部およびそれ以後において、意図的に加温する工程が不要であることを知得した。
　すなわち、本発明は、以下に掲げるものである。
（１）平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを含む整粒化リポソーム分散液を得る整粒化工程と、上記整粒化リポソーム分散液と親水性高分子とを合流する合流工程と、上記整粒化リポソーム分散液と上記親水性高分子とを混合して親水性高分子修飾リポソームを含む親水性高分子修飾リポソーム分散液を得る混合工程と、上記親水性高分子修飾リポソーム分散液を貯液部に送液する送液工程とを有し、
　上記合流工程において、上記整粒化リポソーム分散液の温度が、上記平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを構成する主膜材の相転移温度以上であり、かつ、
　上記混合工程において、上記整粒化リポソーム分散液と上記親水性高分子との混合液の温度が上記相転移温度以上である親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（２）上記合流工程が滞留させることなく流出させる工程である、上記（１）に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（３）上記混合工程が滞留することなく流出させる工程である、上記（１）または（２）に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（４）上記整粒化工程の終了からから合流工程の開始までの時間が３分以内である、上記（１）～（３）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（５）上記混合工程が１～１８０分間行われる、上記（１）～（４）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（６）上記合流工程において、上記整粒化リポソーム分散液を意図的に加温する工程を含まない、上記（１）～（５）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（７）上記混合工程において、上記整粒化リポソーム分散液と上記親水性高分子との混合液を意図的に加温する工程を含まない、上記（１）～（６）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（８）上記送液工程では親水性高分子を含まないリポソーム分散液を送液しない、上記（１）～（７）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（９）上記整粒化リポソーム分散液が有機溶媒を含有する、上記（１）～（８）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（１０）上記親水性高分子がポリエチレングリコールである、上記（１）～（９）のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
（１１）親水性高分子修飾リポソームの製造装置であって、
　粗リポソームを整粒化する整粒化部と、親水性高分子修飾リポソームを含む分散液を貯留する貯液部と、リポソーム分散液を上記整粒化部から上記貯液部に送液する送液管とを備え、
　上記送液管が親水性高分子を整粒化リポソームの分散液に合流させる合流部を有する、親水性高分子修飾リポソームの製造装置。
（１２）上記送液管が上記親水性高分子と上記整粒化リポソームの分散液とを混合する混合部を有する、上記（１１）に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造装置。
（１３）上記合流部および上記混合部が意図的に加温されていない、上記（１１）または（１２）に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造装置。
　本発明の方法によれば、リポソーム間の凝集リスクを回避し、粒子径の安定した親水性高分子修飾リポソームを工業的レベルで製造することができ、血中滞留性、標的部位への到達性等の製剤品質が安定したリポソーム製剤を提供することができる。同時に、製造工程の無菌化工程で、滅菌フィルターの目詰まりが発生し、製造が停止するリスクを軽減することができる。
　また、製造工程中におけるリポソームの熱曝露は、リポソーム膜を構成する脂質の分解や不安定化による薬剤の流出をもたらす可能性や、封入する薬剤の安定性に影響を及ぼす可能性が考えられるが、本発明によって中・大規模製造での親水性高分子の添加に要する時間や添加後の加温時間の短縮が可能となることで、このようなリスクを低減することができる。
　本発明はまた、その方法を使用する製造装置を提供することができる。
本発明の修飾方法の流れを表す概念図である。 本発明のリポソーム修飾装置を表す概念図である。 本発明のリポソーム修飾装置の別の態様を表す概念図である。 実施例２で使用したリポソーム修飾装置の概要を表す図である。 本発明の修飾方法と従来の修飾方法（室温・４５分、４５℃・４５分、５５℃・４５分）で製造した親水性高分子修飾リポソームの粒度分布を示す図である。 従来の修飾方法の流れを表す概念図である。
[リポソームの構成成分]
　本発明のリポソームの構成成分について、以下に説明する。
〈リポソーム膜構成脂質〉
　本発明の製造方法で製造されるリポソーム（以下、「本発明のリポソーム」という。）を構成するリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールのようなグリセロリン脂質；スフィンゴミエリンのようなスフィンゴリン脂質；カルジオリピンのような天然または合成のジホスファチジル系リン脂質およびこれらの誘導体；これらを常法に従って水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等を挙げることができる。これらのうちでも、ＨＳＰＣ等の水素添加されたリン脂質、スフィンゴミエリン等が好ましい。また、本発明のリポソームは、主膜材として単一種、または複数種のリン脂質を含むことができる。
　本発明のリポソームを構成するリン脂質は、主膜材として相転移温度が生体内温度（３５～３７℃）より高いもの、望ましくは５０℃以上のものを用いることが好適である。なぜなら、このようなリン脂質を用いることにより、保存時に、または血液中等の生体中で、リポソーム内に封入された薬物がリポソームから外部へ容易に漏出しないようにすることが可能となるからである。
　本発明のリポソーム膜脂質の主要構成成分であるリン脂質の量は、膜脂質全体中、通常、２０～１００ｍｏｌ％であり、好ましくは４０～１００ｍｏｌ％である。
　またリン脂質以外の他の脂質類の量は、膜脂質全体中、通常、０～８０ｍｏｌ％であり、好ましくは０～６０ｍｏｌ％である。
〈親水性高分子〉
　親水性高分子は、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアスパルトアミド、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。これらの親水性高分子は、１種類を単独でまたは２種類以上を組み合わせて使用することができる。
　これらの中でも、リポソーム製剤の血中滞留性を向上させる効果があることから、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）が好ましい。これらの中でも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は最も汎用であり、血中滞留性を向上させる効果が確認されていることから、特に好ましい。なお、このような親水性高分子は、保存安定性の観点から、一端がアルコキシ化（例えば、メトキシ化、エトキシ化、プロポキシ化）されているものが好ましい。
　親水性高分子は、他端がリポソーム膜に係止するための部位（以下、「アンカー」という。）を有していることが好ましい。アンカーとしては、疎水性部分や、リポソーム膜構成成分と共有結合しうる反応性官能基を用いることができる。アンカーが脂質等の疎水性部分である場合は、アンカーがリポソーム膜に挿入される形で親水性高分子がリポソーム外表面上に固定化される。一方、アンカーがリポソーム膜構成成分と共有結合しうる反応性官能基である場合は、リポソームの外表面に露出しているリン脂質等のリポソーム膜構成成分と結合することにより、親水性高分子がリポソーム外表面上に固定化される。このような結合としては共有結合が望ましく、具体的にはアミド結合、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合等が挙げられるが特に限定されない。
　アンカーとして使用される疎水性化合物としては、例えば、後述する混合脂質を構成するリン脂質や、ステロール等の他の脂質類、あるいは、長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられ、中でも、リン脂質が好ましい態様の一つである。また、リポソーム膜構成脂質（リン脂質）と結合する反応性官能基を有するリン脂質を用いることがさらに好ましい。このようなリン脂質の具体例としては、アミノ基を有するホスファチジルエタノールアミン、ヒドロキシ基を有するホスファチジルグリセロール、カルボキシ基を有するホスファチジルセリンが挙げられ、ホスファチジルエタノールアミンを使用するのが好適な態様の１つである。
　上記リン脂質に含まれるアシル鎖は、飽和脂肪酸であることが望ましい。アシル鎖の鎖長は、Ｃ１４－Ｃ２０が望ましく、さらにはＣ１６－Ｃ１８であることが望ましい。アシル鎖としては、例えば、ジパルミトイル、ジステアロイル、パルミトイルステアロイルが挙げられる。
　上記の親水性高分子とアンカーの脂質との組み合わせは、特に限定されず、目的に応じて適宜組み合わせたものを使用することができる。例えば、リン脂質、ステロール等の他の脂質類、長鎖脂肪族アルコール、ポリオキシプロピレンアルキル、グリセリン脂肪酸エステルの中から選ばれる少なくとも１つと、ＰＥＧ、ＰＧ、ＰＰＧの中から選ばれる少なくとも１つとが結合した親水性高分子の誘導体が挙げられる。親水性高分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、脂質としてリン脂質またはコレステロールを選択するのが好適な態様の１つである。
　親水性高分子の脂質誘導体は、脂質の選択により、正電荷、負電荷、電気的中性の選択が可能である。例えば、脂質としてジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を選択した場合、リン酸基の影響で負電荷を示す脂質誘導体となり、また脂質としてコレステロールを選択した場合、電気的中性の脂質誘導体となる。
　ＰＥＧの分子量は、特に限定されないが、５００～１０，０００であることが好ましく、１，０００～７，０００であることがより好ましく、２，０００～５，０００であることがさらに好ましい。
　ＰＧの分子量は、特に限定されないが、１００～１００００であることが好ましく、２００～７０００であることが好ましく、４００～５０００であることがより好ましい。
　ＰＰＧの分子量は特に限定されないが、１００～１００００であることが好ましく、２００～７０００であることがより好ましく、１０００～５０００であることがさらに好ましい。
　これらの中でも、ＰＥＧのリン脂質誘導体が最も好ましい態様の一つとして挙げられる。ＰＥＧのリン脂質誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）が挙げられる。ＰＥＧ－ＤＳＰＥは、汎用の化合物であり入手容易であることから好ましい。
　親水性高分子の形態は特に限定されないが、混合工程での混合のしやすさから粉末または液体であることが好ましく、粘度の低い液体であることがさらに好ましい。
　親水性高分子を溶媒に溶解して溶液とする場合、溶媒は特に限定されないが、水と混和する必要性を考えると、水、アルコール類、ＤＭＦ、ＴＨＦまたはＤＭＳＯが好ましく、水が最も好ましい。
　親水性高分子が溶液である場合の溶液濃度は、特に限定されないが、０．０１ｍｇ／ｍＬから１０ｇ／ｍＬとすることが好ましい。
　また、親水性高分子が液状高分子の場合、そのまま添加することもできる。
　親水性高分子による膜脂質の修飾率（膜脂質に対する親水性高分子の物質量比）は、通常０．１～２０ｍｏｌ％、好ましくは０．１～５ｍｏｌ％、より好ましくは０．５～５ｍｏｌ％である。
［リポソームの修飾方法］
　本発明の修飾方法が有する工程について、以下に説明する。
〈整粒化工程〉
　整粒化工程は、膜乳化および剪断力の持続を含む様々な公知の技術を用いてリポソームの粒子径を制御し、整粒化リポソームを得る工程である。
　この方法としては、例えば、フィルターを複数回強制通過させる膜乳化法、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させる高圧乳化法等を使用することができる。
　上記の方法は、Gregoriadis, G. (Ed.) (1993) "Liposome Technology, 2nd Edition", Volumes I-III, CRC press, Boca Raton, Florida.において公知である。
　また、近年の新しい方法としては、超高圧による圧縮からの速度変換を利用し、液相下でのジェット流により剪断乳化を行う方法（ジェット流乳化）（特開２００５－２０５５号公報）や、超臨界二酸化炭素を利用したリポソーム調製技術（Yokosuka, M. & Takebayashi, M. (2003) PHARM TECH JAPAN. 19(5): 819-828 (in Japanese).）がある。
　また、近年においては粒子径制御の工程を簡便化する改良型エタノール注入法等が登場している（Maitani, Y. et al. (2001) Journal of Liposome Research,11(1): 115-125.）。これらも本発明の整粒化工程に該当する。
　整粒化リポソームの平均粒子径は、球状粒子とした場合、直径で、２０ｎｍ～２０００ｎｍであることが好ましく、３０ｎｍ～４００ｎｍであることがより好ましく、５０ｎｍ～２５０ｎｍであることがさらに好ましい。
　本発明の整粒化リポソームは、ここに例示する方法に限定されず、得ることができる。
〈合流工程〉
　合流工程は、親水性高分子と整粒化リポソーム分散液とを合流させる工程である。
　合流工程は、親水性高分子と整粒化リポソーム分散液とを合流させることによって、すなわち、親水性高分子と整粒化リポソーム分散液とを混合することができる状態とすることによって微小時間のうちに完了する。本発明では、未合流の親水性高分子および整粒化リポソームが存在する間は、連続して合流工程を実施することができる。
　合流工程を行う場所を合流部というが、合流工程が微小時間のうちに完了することから、混合工程を行う混合部と明確に区別することが困難な場合がある。しかし、合流と混合は同時には起こりえないので、合流工程と混合工程とは、連続して実施されることはあっても、同時に実施されることはない。
　また、合流工程は、流入する整粒化リポソーム分散液および親水性高分子を、滞留させることも、貯留することもない工程である。
　整粒化リポソームは、リポソーム膜の表面状態、膜組成、温度、時間に依存して不安定化が起こることから、親水性高分子と合流させるまでの時間は整粒後５分以内が好ましく、３分以内がより好ましく、１分以内がさらに好ましく、３０秒以内がいっそう好ましい。
《合流の方法》
　合流の方法は特に限定されない。
　合流の方法としては、例えば、Ｙ字型、Ｔ字型またはその他の２イン１アウト型の合流部で合流させる方法等を挙げることができる。
　合流工程は、整粒化リポソーム分散液の温度が整粒化リポソームの主膜材の相転移温度以上である状態で実施される。親水性高分子の温度は特に限定されない。この場合、合流部を意図的に加温してもよいが、加温する必要がない場合には意図的に加温しなくてもよい。
　本発明の修飾方法は、整粒化工程と、合流工程と、混合工程とを連続的に実施することができる。例えば、混合部で整粒化リポソーム分散液と親水性高分子とが混合されている瞬間には、整粒化部での整粒化リポソーム分散液の生成と、混合部での整粒化リポソーム分散液と親水性高分子との合流が同時に行われている。
　粒子径等の物理化学的安定性を確保するために必要な親水性高分子の添加量は、均一化工程から合流工程に持ち込まれる整粒化リポソームの溶媒量に依存する。親水性高分子の添加量は上記の修飾率でリポソーム膜脂質が修飾されるように調節され、持ち込まれる整粒化リポソームの量が多いほど、親水性高分子の添加量は多く必要となる。また、持ち込まれる溶媒の種類によっても添加量を調整する必要がある。持ち込まれる溶媒が水である場合、親水性高分子の添加量を少なくすることができる。
〈混合工程〉
　混合工程は、合流した親水性高分子と整粒化リポソーム分散液とを流入させ、混合し、親水性高分子修飾リポソーム分散液（親水性高分子で修飾された整粒化リポソームを含む分散液をいう。）を得る工程である。
　本工程では、親水性高分子および整粒化リポソーム分散液の混合液を一時的に滞留させる方法をとることもできるが、できるだけ早く修飾を完了するためには、滞留させず、整粒化リポソーム分散液と親水性高分子との混合液を流しながら行うことが好ましい。
《混合の方法》
　混合の方法は特に限定されない。
　混合部はパイプ状またはリザーバー状であることが好ましい。
　パイプ状とは、混合部に流入した液体を滞留することなく流出させるものであり、速やかに混合部に液体を流入させることができ、かつ速やかに混合部から液体を流出することができることを特徴とするものである。
　一方、リザーバー状とは、混合部に流入した液体を一時的に滞留させるものであり、混合部に流入する液体の流速と、混合部から流出する液体の流速が均衡しているものである。
　混合部に流入した液体は流入部から流出部に向かって流れるが、流れる途中で意図的に撹拌されることが好ましい。混合の方法としては特に限定されないが、例えば、合流した親水性高分子と整粒化リポソーム分散液とをスクリュー等で撹拌することによって行う方法や、パイプの内側に複数の突起を設けて乱流を形成させる方法を挙げることができる。
　混合は、整粒化リポソーム分散液と親水性高分子との混合液の温度が整粒化リポソームの主膜材の相転移温度以上である状態で実施される。
　混合工程においては、整粒化リポソーム分散液と親水性高分子との混合液の温度を、リポソーム主膜材の相転移温度以上に所定時間以上維持されることが必要である。そのため、必要によりまたは所望により、意図的な加温および／または意図的が行われてもよい。
　意図的な加温および／または意図的な撹拌が行われる場合、その行われる時間は１～１８０分間、好ましくは５～１２０分間、より好ましくは５～３０分間である。
〈送液工程〉
　送液工程は、混合工程後の親水性高分子修飾リポソーム分散液を貯液部に送液する工程である。
　送液の方法は特に限定されない。
　送液工程においては、親水性高分子修飾リポソーム分散液に意図的な加温または意図的な撹拌を行わないことが好ましい。
　また、親水性高分子修飾リポソーム分散液は、脂質の安定性の観点から速やかに冷却することが望ましいため、送液工程中に冷却されるように構成してもよい。この場合の冷却方法は特に限定されず、冷却用ジャケットタンクを用いる等の既知の方法を選択することができる。
〈その他有することができる工程〉
　本発明の修飾方法は、さらに上記した以外の工程を有することができる。
　そのような工程としては、例えば、以下に掲げる工程を挙げることができる。
　これらについて、以下に説明する。
《均一化工程》
　均一化工程は、粗リポソーム形成工程の前工程である。
　均一化工程は、リポソーム膜構成成分を、有機溶媒等を用いて溶解し、均一化する工程のことを示す。一般的にリポソーム構成成分としては、リン脂質とコレステロールなど、複数の脂質構成成分が存在することが多い。複数の脂質構成成分が存在する場合、リポソーム膜形成時の脂質の不均一化を避けるため、均一化工程をとることが必須である。単一の脂質を用いる場合、均一化工程は必ずしも必須というわけではないが、実用化を目指した製造を想定する場合、均一化工程をとることが望ましい。均一化する方法としては、クロロホルム等の有機溶媒を用いて完全溶解させ、真空乾燥することにより均一化する薄膜法がよく知られている。実用化を目指した方法としては、有機溶媒としてアルコール、特にエタノールを用いる方法が広く用いられている。
　具体的には、例えば、リポソーム膜成分物質を揮発性有機溶媒、好ましくは無水エタノールに加温溶解し、脂質溶液を調整する。加温温度は通常相転移温度以上であり、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリンを用いた場合には５０℃～８０℃であり、好ましくは６０℃～７０℃である。一方、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤等を注射用水に溶解し水性溶液を調整する。また、必要に応じ水性溶液には酸化防止剤、膜安定化剤、リポソーム内に封入する物質を添加することもできる。
　本発明の修飾方法において、均一化工程を実施する方法はここに挙げたものに限定されず、当業者が知る種々の方法を使用することができる。
《粗リポソーム形成工程》
　粗リポソーム形成工程は、前記した均一化工程の後工程であり、前記した整粒化工程の前工程である。
　粗リポソーム形成工程は、均一化された脂質を用いて粗リポソームを形成する工程を示す。
　粗リポソーム形成工程の一般的な実施方法としては水和法（Ｂａｎｇｈａｍ法）、超音波処理法、逆相蒸発法等を用いた方法がある。また、実用化を指向した製造方法としては、加温法（特開昭６０－７９３３）、脂質溶解法（特開昭６０－１２１２７）等がある。また、内水相に保持する薬物量を多くするための方法として、ＤＲＶ法（Ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ／Ｒｅｈｙｄｒａｔｅｄ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）や凍結融解法等も報告されている。
　本発明の修飾方法において、粗リポソーム形成工程を実施する方法はここに挙げたものに限定されず、当業者が知る種々の方法を使用することができる。
《貯留工程》
　貯留工程は、前記した送液工程の後工程である。
　貯留工程は、貯液部に送液された親水性高分子修飾リポソームを含む分散液を貯留する工程である。
　貯留の方法は特に限定されない。従来の方法と同じ貯液部を使用することができる。
《次工程》
　次工程は、貯留工程の次に実施する工程である。すなわち、親水性高分子修飾リポソームに対して実施される工程である。
　次工程としては、例えば、外液置換工程、未封入薬物除去工程、無菌化工程等を挙げることができる。混合工程において結合されなかった親水性高分子は、未封入薬物除去工程において除去することができる。そのため、混合工程後に未封入薬物除去工程があることが望ましい。
　次工程では、リポソームは既に親水性高分子で修飾されているため、安定的に処理することができる。外液置換工程、未封入薬物除去工程、無菌化工程等は公知の様々な方法で実施することができる。
　また、親水性高分子添加後のリポソームは、リポソームの不安定化による粒子径変動が起こっては困ることから、外液置換工程、未封入薬物除去工程および無菌化工程は主膜材の相転移温度以下で行うことが好ましい。
　例えば、主膜材の相転移温度が５０℃付近である場合、０～４０℃程度が好ましく、より具体的には５～３０℃程度で行われることが好ましい。
　無菌化工程を実施する方法としては、熱滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、過酸化水素滅菌、電子線滅菌、およびろ過滅菌のような方法が公知であるが、熱滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、γ線滅菌、過酸化水素滅菌、電子線滅菌のような滅菌方法は、脂質および疎水性薬剤の不可逆的な構造変化を起こし得ることから、リポソームの無菌化としては、好ましくない。この観点から、リポソームの無菌化の方法としては、ろ過滅菌が好適である。
　リポソームのろ過滅菌のシステムは、組成物の容積、密度、温度、フィルター材質およびフィルターサイズに依存して広範囲に変わり得るため限定はできないが、ろ過滅菌の基準である指標菌Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ　ｄｉｍｉｎｕｔａを使ったろ過滅菌性能評価で、安定的にＬＲＶ（Ｌｏｇ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｖａｌｕｅ／対数減少値）７以上の菌捕捉性能を確保するためには孔径０．２μｍのフィルターを用いることが一般的である。
　無菌化工程を経たリポソームは、脂質の安定性および粒子径等の物理化学的安定性等の観点から、２１℃～３０℃の室温、好ましくは０～８℃での冷蔵で保存することができる。
［リポソーム修飾装置］
　本発明の平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを親水性高分子で修飾する方法を使用するための装置（以下「本発明のリポソーム修飾装置」という。）は、粗リポソームを整粒化する整粒化部と、親水性高分子修飾リポソーム分散液を貯留する貯液部と、整粒化部と貯液部とを接続し、リポソーム分散液を送液するための送液管とを有し、その送液管が整粒化リポソームと親水性高分子とを合流させる合流部を有するものである。
　また、合流させた整粒化リポソームと親水性リポソームを混合する混合部を有することが好ましい。
　また、合流部および混合部は意図的に加温されていないことが好ましい。
　図２に基づいて本発明のリポソーム修飾装置２０を説明する。
　粗リポソームは、粗リポソーム分散液供給部２１から定速ポンプ２２によって整粒化部（エクストルーダ）２３に供給され、粒子径の制御がされて整粒化リポソーム分散液が生成される。整粒化リポソーム分散液は、親水性高分子供給部２４から定速ポンプ２５によって供給される親水性高分子と合流部２６で合流させられ、滞留することなく混合部２７に送られ、そこで混合される。混合部２７で親水性高分子修飾リポソームを含む分散液が生成され、送液部２８を通過して貯液部２９に送られ、貯留される。
　図２に表されたリポソーム修飾装置は、整粒化直後のリポソームが配管を通し合流部２６へと送液されるのと同時に、親水性高分子溶液が合流部２６へと送液されることで、整粒化リポソーム形成直後から、常に一定の容量比で親水性高分子を添加することを特徴とする。この際、整粒化リポソームの送液速度と親水性高分子溶液の送液速度は、整粒化リポソームが所定の修飾率で修飾されるように、各溶液の物質量濃度に応じて調節される。
　図３に表されたリポソーム修飾装置は、整粒化リポソーム分散液の送液速度を流量測定装置３２で測定し、その速度から流量比率制御装置３１で算出した送液速度で親水性高分子溶液の送液速度を流量調節装置３３で制御することにより、より高度に制御された混合方法を実現することができる。この修飾装置は、図２に表されたリポソーム修飾装置と対比すると、整粒化リポソームの流量の変化に対応できるという優位点が存在する。
［リポソームの製造方法］
　本発明のリポソーム製剤の製造方法は、均一化工程、粗リポソーム形成工程、整粒化工程、合流工程、混合工程、送液工程、貯留工程、未封入薬物除去工程および無菌化工程をこの順に含むが、特定の工程を２回以上含んでもよいし、ここに挙げられていない工程を含んでもよい。
　例えば、薬物封入工程でイオン勾配を用いる方法等においては未封入薬物除去工程が２回入るものも存在する。また、凍結乾燥工程がさらに含まれる場合もある。
　本発明の要旨を変更しない限り、いかなる変形をしてもよく、それらはすべて本発明の範囲に属する。
［リポソーム製剤］
　本発明の修飾方法は、親水性高分子修飾リポソーム製剤の製造に利用することができる。
　「リポソーム製剤」とは、リポソームを担体とし、これに薬物を担持させたものの総称である。ここでいう「担持」とは、担体に薬物が含有された状態を意味する。本発明の製造方法で製造されるリポソーム製剤（以下、「本発明のリポソーム製剤」という。）、薬物がリポソームの内水相に存在するのでもよく、担体の構成成分である脂質層表層に静電的相互作用等で固定化された状態で存在するのでもよく、脂質層内に一部または全ての部分が含まれている状態であってもよい。また、薬物が担持される場所としては、リポソーム表面、脂質膜および内水相が挙げられるが、中でもリポソームの内水相は体積が大きく、担持できる量が多いため好ましい。
　本発明のリポソーム製剤には、種々の薬物を担持したものが含まれる。
　例えば、治療のための薬物としては、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗ガン剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、抗炎症剤、ステロイド剤、血管拡張剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成阻害剤、ＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）阻害剤、ラジカルスカベンジャー、タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖および多糖等が挙げられる。具体的には、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン等の副腎皮質ステロイドやその誘導体、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、メフェナム酸、フェニルブタゾン等の非ステロイド抗炎症剤、ヘパリン、低分子ヘパリン等のメザンギウム細胞増殖阻害剤、シクロスポリン等の免疫抑制剤、カプトプリル等のＡＣＥ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ）阻害剤、メチルグアニジン等のＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ　ｇｌｙｃａｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｐｒｏｄｕｃｔ）阻害剤、バイグリカン、デコリン等のＴＧＦ－β拮抗薬、ＰＫＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｃ）阻害剤、ＰＧＥ１やＰＧＩ２等プロスタグランジン製剤、パパベリン系薬、ニコチン酸系薬、トコフェロール系薬、およびＣａ拮抗薬等の末梢血管拡張薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、チクロピジン、アスピリン等の抗血栓薬、ワーファリン、ヘパリン、抗トロンビン剤等の抗凝固剤、ウロキナーゼ等の血栓溶解薬、ケミカルメディエーター遊離抑制剤、抗生物質、抗酸化剤、酵素剤、脂質取込抑制剤、ホルモン剤、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ＳＯＤ等のラジカルスキャベンジャ－、メサンギウム細胞の増殖抑制作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイ等が挙げられる。
　また、診断のための薬物としては、Ｘ線造影剤、超音波診断薬、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の体内診断薬が挙げられる。
　本発明のリポソーム製剤は、投与経路次第で医薬的に許容される安定化剤および／または酸化防止剤および／または浸透圧調整剤および／またはｐＨ調整剤をさらに含むものであってもよい。
　安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。また、膜構成成分の他の脂質として上述したコレステロール（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）等のステロールはこの安定化剤として作用する。
　添加物は、適宜選択され、あるいはそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の製造方法では、これら添加剤を含む態様のリポソーム製剤を、医薬組成物として供することができる。医薬組成物の形態は特に限定されず、リポソーム製剤が液体中に分散あるいは懸濁されてなる状態であってもよいし、凍結乾燥されている状態でも良い。
　また、酸化防止の観点からは、上記医薬組成物は窒素充填包装とすることが望ましい。さらに、ガス透過性を有する容器に収納し、脱酸素剤とともにガスバリア性を有する包材で密封包装しても良い。
　こうした医薬組成物は、通常の方法、例えば、０～８℃での冷蔵、あるいは１～３０℃の室温で保存することができる。
　以下、実施例および試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
　各例で調製された薬剤封入リポソームの粒子径および粒度分布はレーザー回折法（ベックマンコールターＬＳ２３０，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定した。
　以下に、使用した各成分の略称、名称および分子量を示す。
・ＨＳＰＣ（水素添加大豆レシチン、分子量７９０）
・Ｃｈｌ（コレステロール、分子量３８６．６６）
・ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ（ポリエチレングリコール５０００－ホスファチジルエタノールアミン、分子量６１２３）
・ＴＲＸ－２０（３，５－Ｄｉｐｅｎｔａｄｅｃｙｌｏｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、分子量６０９．４１）
・ＰＳＬＰ（リン酸プレドニゾロンナトリウム、分子量４８４．３９）
［実施例１］
１．ＰＥＧ修飾リポソームの調製
　以下の手順に従い、ＰＥＧ修飾リポソームの分散液を調製した。
（１）均一化
　ＨＳＰＣを６．５１６８ｇおよびＣｈｌを２．６７８５ｇ、ＴＲＸ－２０を０．８０４５ｇ秤量し、無水エタノール（１０ｍＬ）を添加し溶解した。
（２）粗リポソーム形成
　ＰＳＬＰを６．７８１５ｇ、亜硫酸ナトリウムを０．０１００ｇ、クエン酸一水和物を０．２１０１ｇ秤量し、ＲＯ水８０ｍＬを加え、溶解後、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを加え、ｐＨ７．２に調整し、ＲＯ水を加えて１００ｍＬとし、これを内水相とした。
　加温した内水相に均一化工程を経て得られた脂質溶解液を添加することで得られた分散液を撹拌し粗リポソーム分散液を得た。
（３）整粒化
　得られた粗リポソーム分散液を７０℃付近に加温したエクストルーダを用い、孔径２００ｎｍのポリカーボネイトメンブランフィルターを３回、孔径１００ｎｍのポリカーボネイトメンブランフィルターを１０回通過させ、整粒化リポソーム分散液を得た。
（４）ＰＥＧ添加（合流・混合）
　整粒化リポソーム分散液がエクストルーダより排出されると同時に、ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液（１５．１９ｇ／４００ｍＬ（ＲＯ水））を添加し、ガラス容器に受け、その中で、６５℃で加温撹拌した。
（５）送液・貯留
　整粒化リポソームとＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液との混合液を、ガラス容器に流入する整粒化リポソーム分散液およびＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液の流入速度と同じ流出速度でそのガラス容器から流出させ、貯液タンクに送液および貯留した。
　これにより、ＰＥＧ修飾リポソームの分散液を得た。
２．平均粒子径、粒子径分布の測定
　貯液タンクに貯留されたＰＥＧ修飾リポソームの分散液から、５ｍＬを採取し、平均粒子径および粒度分布（頻度体積（体積％））を測定した。
　平均粒子径の測定結果を第１表［調製例１］に、粒度分布の測定結果を図５［０時添加法］に、それぞれ示す。
［実施例２］
１．ＰＥＧ修飾リポソームの調製
　以下の手順に従い、ＰＥＧ修飾リポソームの分散液を調製した。
（１）均一化
　ＨＳＰＣを６．５１６８ｇおよびＣｈｌを２．６７８５ｇ、ＴＲＸ－２０を０．８０４５ｇ秤量し、無水エタノール（１０ｍＬ）を添加し、溶解した。
（２）粗リポソーム形成
　ＰＳＬＰを６．７８１５ｇ、亜硫酸ナトリウムを０．０１００ｇ、クエン酸一水和物を０．２１０１ｇ秤量し、ＲＯ水８０ｍＬを加え、溶解後、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを加え、ｐＨ７．２に調整し、ＲＯ水を加えて１００ｍＬとし、これを内水相とした。
　加温した内水相に均一化工程を経て得られた脂質溶解液を添加することで得られた分散液を撹拌し粗リポソーム分散液を得た。
（３）整粒化
　リポソーム修飾実験装置４０を用意した（図４参照）。
　得られた粗リポソームを約７０℃に加温した粗リポソーム分散液供給部４１に入れ、定速ポンプ４２を用いて、約７０℃に加温された整粒化部（エクストルーダ）４３に送り込んだ。
　整粒化部（エクストルーダ）４３では、孔径２００ｎｍのポリカーボネイトメンブランフィルターを３回、孔径１００ｎｍのポリカーボネイトメンブランフィルターを１０回通過させ、整粒化リポソーム分散液を生成し、直ちに合流部４６に送り込んだ。整粒化部（エクストルーダ）４３の流出部と合流部４６との間の配管は短く、そこを通過する分散液の温度は６５℃以下には下がらなかった。
（４）ＰＥＧ添加（合流・混合）
　約７０℃に加温された合流部４６に、約７０℃に加温された親水性高分子供給部４４から、ＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液（１５．１９ｇ／４００ｍＬ（ＲＯ水））を、定速ポンプ４５を用いて送り込み、上記整粒化リポソームと合流させた。
　合流した整粒化リポソームおよびＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液は、合流部４６に滞留することなく混合部４７に送り込まれた。
　混合部４７は長いチューブであり、ループ状部分の全体が約７０℃に加温された恒温槽５０中に存在する。合流部４６と混合部４７のループ状部分との間（混合部４７の合流部接続部分）は短く、その内部を通過する混合液の温度は６５℃以下には下がらない。
　混合部４７に送り込まれた整粒化リポソームとＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液との混合液を、混合部４７を約１５分間かけて通過させた。
（５）送液・貯留
　混合部４７を通過した整粒化リポソームとＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液との混合液を、送液部４８を通り、貯液部４９に貯留した。
　これにより、ＰＥＧ修飾リポソームの分散液を得た。
［比較例１］
（リポソームの安定性試験：温度条件・保持時間）
　実施例１と同様にして得られた整粒化リポソーム分散液から１００ｍＬを採取し、直ちに、室温（２５℃）で静置した。
　整粒化開始から５分および４５分の時点で、上記温度で静置した整粒化リポソーム分散液から５ｍＬをそれぞれ採取し、これにＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ溶液（１５．１９ｇ／４００ｍＬ（ＲＯ水））を添加した。これを６５℃で加温し、ＰＥＧ修飾リポソームの分散液を得た。
　得られたＰＥＧ修飾リポソームの分散液を調製直後に氷冷した。冷却後、リポソームの平均粒子径および粒度分布（頻度体積（体積％））を測定した。
　平均粒子径の測定結果を第２表［比較例１］に、粒度分布の測定結果を図５［従来法（室温）］に、それぞれ示す。
［比較例２］
　静置した温度が４５℃である点を除き、比較例１と同様にして行った。
　平均粒子径の測定結果を第２表［比較例２］に、粒度分布の測定結果を図５［従来法（４５℃）］に、それぞれ示す。
［比較例３］
　静置した温度が５５℃である点を除き、比較例１と同様にして行った。
　平均粒子径の測定結果を第２表［比較例３］に、粒度分布の測定結果を図５［従来法（５５℃）］に、それぞれ示す。
［測定結果］
　第１表および第２表に示す結果から、本発明の修飾方法（０時添加法）によってＰＥＧ修飾をしたリポソーム（実施例１）と従来の修飾方法（従来法）によってＰＥＧ修飾をしたリポソーム（比較例１～３）を対比すると、実施例１のリポソームの平均粒子径は、比較例１～３のリポソームよりも小さいことがわかる。
　第２表に示す結果から、リポソームの粒子径は、整粒化開始後より経時的に増加することがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図５について説明する。
　実施例１で得られたＰＥＧ修飾リポソームの粒度分布［「０時添加法」とラベルしてある。］では、０．１μｍをピークトップとする単一分散である。
　これに対して、比較例１～３（静置時間４５分）のＰＥＧ修飾リポソームの粒度分布［それぞれ、「従来法（室温）」、「従来法（４５℃）」、［従来法（５５℃）］とラベルしてある。］では、粒子径の増大とともに０．２μｍ以上の粒子が確認されるようになり、比較例１［従来法（室温）］および比較例２［従来法（４５℃）］では、粒度分布は０．４μｍ付近の第二の粒子ピークを有する多分散となっている。
　このことから、ＰＥＧ修飾リポソームの粒度分布は、未修飾時の温度低下に依存して、単一分散から多分散へとシフトすることが明らかとなった。
　また、比較例１～３では、粒子径が０．４μｍを超える粗大粒子が確認されたが、実施例１では確認できなかった。比較例３［従来法（５５℃）］では粒度分布は単一分散となったが、粒子径ピークの裾が０．２μｍ以上に増大することが認められた。
　ろ過滅菌を行う場合、ろ過滅菌フィルターの孔径である０．２μｍ以上の粒子が形成されると、ろ過滅菌フィルターの目詰まりの原因となり、工程に悪影響を与える。本発明の修飾方法を用いることで粗大粒子発生を回避することが可能であり、その結果として無菌化工程で目詰まりが発生するリスクを軽減することができることが明らかになった。
　２０，３０　リポソーム修飾装置
　２１　　　　粗リポソーム分散液供給部
　２２，２５　定速ポンプ
　２３　　　　整粒化部（エクストルーダ）
　２４　　　　親水性高分子供給部
　２６　　　　合流部
　２７　　　　混合部
　２８　　　　送液部
　２９　　　　貯液部
　３１　　　　流量比率制御装置
　３２　　　　流量測定装置
　３３　　　　流量調節装置
　３４　　　　送液ポンプ
　４０　　　　リポソーム修飾実験装置
　４１　　　　粗リポソーム分散液供給部
　４２，４５　定速ポンプ
　４３　　　　整粒化部（エクストルーダ）
　４４　　　　親水性高分子供給部
　４６　　　　合流部
　４７　　　　混合部
　４８　　　　送液部
　４９　　　　貯液部
　５０　　　　恒温槽

Claims (13)

  1. 　平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを含む整粒化リポソーム分散液を得る整粒化工程と、前記整粒化リポソーム分散液と親水性高分子とを合流する合流工程と、前記整粒化リポソーム分散液と前記親水性高分子とを混合して親水性高分子修飾リポソームを含む親水性高分子修飾リポソーム分散液を得る混合工程と、前記親水性高分子修飾リポソーム分散液を貯液部に送液する送液工程とを有し、
    　前記合流工程において、前記整粒化リポソーム分散液の温度が、前記平均粒子径が所定範囲に制御されたリポソームを構成する主膜材の相転移温度以上であり、かつ、
    　前記混合工程において、前記整粒化リポソーム分散液と前記親水性高分子との混合液の温度が前記相転移温度以上である親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  2. 　前記合流工程が滞留させることなく流出させる工程である、請求項１に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  3. 　前記混合工程が滞留することなく流出させる工程である、請求項１または２に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  4. 　前記整粒化工程の終了からから合流工程の開始までの時間が３分以内である、請求項１～３のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  5. 　前記混合工程が１～１８０分間行われる、請求項１～４のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  6. 　前記合流工程において、前記整粒化リポソーム分散液を意図的に加温する工程を含まない、請求項１～５のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  7. 　前記混合工程において、前記整粒化リポソーム分散液と前記親水性高分子との混合液を意図的に加温する工程を含まない、請求項１～６のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  8. 　前記送液工程では親水性高分子を含まないリポソーム分散液を送液しない、請求項１～７のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  9. 　前記整粒化リポソーム分散液が有機溶媒を含有する、請求項１～８のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  10. 　前記親水性高分子がポリエチレングリコールである、請求項１～９のいずれかに記載の親水性高分子修飾リポソームの製造方法。
  11. 　親水性高分子修飾リポソームの製造装置であって、
    　粗リポソームを整粒化する整粒化部と、親水性高分子修飾リポソームを含む分散液を貯留する貯液部と、リポソーム分散液を前記整粒化部から前記貯液部に送液する送液管とを備え、
    　前記送液管が親水性高分子を整粒化リポソームの分散液に合流させる合流部を有する、親水性高分子修飾リポソームの製造装置。
  12. 　前記送液管が前記親水性高分子と前記整粒化リポソームの分散液とを混合する混合部を有する、請求項１１に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造装置。
  13. 　前記合流部および前記混合部が意図的に加温されていない、請求項１１または１２に記載の親水性高分子修飾リポソームの製造装置。
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