ES2640563T3 - Formulaciones de liposomas mejoradas de compuestos lipófilos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la fabricación de una preparación liposomal que comprende: a) proporcionar una primera preparación liposomal que comprende una suspensión de liposomas en una fase acuosa, en la que los liposomas comprenden al menos una membrana, en la que la membrana encierra un volumen liposomalmente encapsulado de la fase acuosa y la fase acuosa comprende al menos una sustancia osmóticamente activa y presenta una osmolaridad total inicial, O1, en la que la primera preparación liposomal comprende al menos un agente activo en la membrana liposomal, b) generar después un gradiente osmolar en la fase acuosa de dicha preparación, en la que la osmolaridad de la fase acuosa exterior al volumen liposomalmente encapsulado, Oext, es menor que la osmolaridad de la fase acuosa interior al volumen liposomalmente encapsulado, Oint, para proporcionar una segunda preparación liposomal y en la que se incorpora al menos un agente activo en la membrana liposomal de la segunda preparación liposomal, c) opcionalmente deshidratar la segunda preparación liposomal para obtener una preparación deshidratada y d) opcionalmente rehidratar la preparación deshidratada, en el que dicho agente activo presenta un log P mayor que 1 y en el que dicho agente activo es un taxano.

Description

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DESCRIPCION

Formulaciones de liposomas mejoradas de compuestos lipofilos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a la preparacion de liposomas con capacidad de carga mejorada para agentes farmaceuticamente y/o diagnosticamente activos y/o agentes cosmeticos que son solubilizados sustancialmente por las membranas liposomales, a dispersiones de liposomas con estabilidad mejorada con respecto a la liberacion del agente activo y/o agente cosmetico de los liposomas que se pueden obtener por el procedimiento y a composiciones farmaceuticas o cosmeticas que comprenden dichas dispersiones de liposomas estabilizadas. La preparacion puede implicar etapas de deshidratacion y rehidratacion de dispersiones de liposomas que pueden llevarse a cabo por secado por pulverizacion.

Antecedentes

Los liposomas son estructuras vesiculares artificiales constituidas por membranas unicas o multiples encerrando un compartimento acuoso. Lo mas ffpicamente, las membranas de liposomas estan formadas de bicapas de lfpidos, pero pueden consistir tambien en otros compuestos anfifflicos monomericos y polimericos, incluyendo otros tipos de anfifilos, poffmeros y polipeptidos (Antonietti y Forster 2003). Los liposomas se forman de manera espontanea cuando los lfpidos se dispersan en un entorno acuoso en condiciones adecuadas. La mayona de los liposomas no son toxicos, no son antigenicos y son biodegradables por naturaleza, puesto que presentan las caractensticas moleculares de las membranas de mairnferos. Pueden incorporarse farmacos y compuestos lipofilos o anfifflicos a la membrana liposomal, pueden encapsularse farmacos y compuestos hidrofilos en los nucleos acuosos de los liposomas.

En los ultimos anos, los liposomas han llegado a ser una herramienta importante en la industria farmaceutica para el suministro de farmacos (Gregoriadis 1995). Los liposomas pueden influir en la farmacocinetica mediante una liberacion prolongada del farmaco al cuerpo o reducir los efectos secundarios limitando la concentracion libre de un farmaco. Uniendo los ligandos al liposoma o haciendo su carga, los liposomas facilitan un suministro fijado como objetivo de farmacos a un sitio de accion deseado. Ademas del uso farmaceutico, los liposomas tambien se usan con frecuencia para productos cosmeticos.

Si se usan liposomas para la administracion de agentes activos en un uso farmaceutico o cosmetico, es importante controlar y optimizar la eficacia de carga del compuesto activo para la formulacion liposomal y la estabilidad de la formulacion liposomal cargada con el principio activo o compuesto cosmetico. La estabilidad de la formulacion es una caractenstica crucial durante la fabricacion, almacenamiento y aplicacion de la formulacion. En muchos casos, la estabilidad ffsica o qmmica de los productos de liposomas esta limitada, que tiene que ser considerado para planear los procedimientos de fabricacion (tiempo de retencion), almacenamiento (estabilidad de vida util) y aplicacion del producto (estabilidad en uso).

Para aplicacion farmaceutica, con frecuencia se administran formulaciones de liposomas por inyeccion. Asf, los liposomas deben estar presentes en una fase acuosa en condiciones adecuadas para administracion intravenosa (iv) o intraperitoneal (ip).

Las formulaciones de liposomas farmaceuticas se someten a criterios de calidad extremadamente rigurosos. La mayona de los productos de liposomas ffquidos, presentes, no son estables durante un periodo de almacenamiento prolongado, debido a que pueden experimentar una variedad de procedimientos de degradacion qmmicos y ffsicos. Sin embargo, para productos farmaceuticos es deseable tener formulaciones finales que sean estables durante al menos seis meses a dos anos a temperatura ambiente o a la temperatura de refrigeracion. Estos factores restringen el uso de los liposomas como portadores practicos de compuestos biologicamente activos. Para los liposomas, se han desarrollado tecnicas para deshidratacion para satisfacer estos requerimientos.

La estabilidad a largo plazo de las formulaciones de liposomas mejora enormemente cuando se deshidratan y se almacenan como formulaciones secas en vez de ffquidas. Antes de la inyeccion, los productos liposomales secos tienen que ser rehidratados en un medio acuoso adecuado generando suspensiones acuosas para administracion. Debido a que la estabilidad de las formulaciones de liposomas rehidratadas puede estar limitada de nuevo por procedimientos de degradacion qmmicos y ffsicos, el incremento de la estabilidad en uso de dicha suspension liposomal lista para uso es otro importante objetivo de la tecnologfa de las formulaciones farmaceuticas.

Un metodo de estabilizacion comunmente usado para suspensiones acuosas de liposomas por secado por congelacion se describe en las patentes de EE. UU. numeros 4 229 360 y 4 247 411. En el procedimiento de secado por congelacion, se congela una suspension liposomal y se somete con posterioridad a presion reducida, lo que conduce a eliminacion del agua congelada por sublimacion. Normalmente, la suspension acuosa comprende un excipiente, tal como un azucar, para evitar o minimizar la formacion de defectos inducida por congelacion y deshidratacion. El procedimiento de secado por congelacion da como resultado liposomas en una matriz protectora de excipiente a partir de la cual, despues de rehidratacion, se tiene que obtener el producto lfquido antecedente. Como se describe en la patente de EE. UU. 4 880 635, los liposomas pueden ser protegidos de efectos perjudiciales

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de las etapas de deshidratacion y rehidratacion por la presencia de un azucar protector, no solo en el exterior, sino tambien en el interior del liposoma.

El metodo de secado por congelacion, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5 089 181, proporciona un procedimiento alternativo para preparar una formulacion liposomal deshidratada, estable. El procedimiento ha sido adaptado de la industria alimentaria y emplea la atomizacion de suspensiones en pequenas gotitas mediante pulverizacion de dicha suspension y la posterior evaporacion del medio de las gotitas a temperaturas elevadas. Como en el procedimiento de secado por congelacion, la suspension liposomal puede comprender un excipiente, tal como un azucar, para proteger las membranas liposomales. En comparacion con el secado por congelacion, el procedimiento de secado por pulverizacion presenta considerables ventajas con respecto a la aplicacion industrial a gran escala, debido a que permite mayores capacidades de fabricacion a menor coste y con esfuerzos tecnologicos razonables. Sin embargo, las elevadas temperaturas implicadas en este metodo aplican tension al agente activo encapsulado, asf como a las membranas lipfdicas.

Para estabilizar las suspensiones que comprenden un farmaco soluble en agua encapsulado en liposomas para secado por pulverizacion, la patente de EE. Uu. 4 895 719 describe equilibrar una alta osmolaridad interna generada por una alta concentracion interna del farmaco soluble con una osmolaridad uniformemente alta del medio circundante.

Para estabilizar farmacos hidrofobos en la fase acuosa de liposomas, la patente internacional WO 2007/005754 describe la complejacion de tales farmacos por ciclodextrinas previamente a la encapsulacion. El farmaco hidrofobo complejado es retenido en el liposoma a altas concentraciones, incluso en presencia de un gradiente osmotico transmembrana producido por la ciclodextrina. Sin embargo, no se describe una estabilizacion para los agentes activos embebidos en la membrana liposomal.

La presencia de solutos que son osmoticamente activos, tales como azucares o iones, en el interior o exterior de las membranas liposomales genera fuerzas osmoticas. La manera como actuan los gradientes osmoticos transmembrana sobre la estructura y la dinamica de las membranas biologicas se ha investigado en la bibliograffa y se han propuesto modelos para describir fenomenos como la relacion tension-traccion y lisis (Ertel, Marangoni et al. 1993; Hallett, Marsh et al. 1993). En pocas palabras, los experimentos por los autores y los analisis adjuntos subrayan que el hinchamiento de los liposomas a una tension osmotica determinada depende de su tamano. Se describio hinchamiento hasta un tamano dependiente del lfmite de elasticidad critico al cual tuvo lugar lisis (fuga). Se proporcionaron condiciones en las que se espera que los liposomas residan en un estado consistentemente forzado.

Con respecto a la produccion de liposomas que comprende un farmaco lipofilo que presenta una vida util mejorada, la patente internacional WO 2004/002468 describe la preparacion de liposomas que comprende paclitaxel. Los liposomas se forman en un tampon acuoso que comprende trehalosa, que da como resultado una suspension liposomal con la misma osmolaridad en el interior y exterior del liposoma. La suspension liposomal acuosa se deshidrata con posterioridad. El procedimiento de deshidratacion puede ser realizado por secado por congelacion o secado por pulverizacion. La solicitud describe varios protocolos para el secado por congelacion de dichas suspensiones liposomales. Despues de deshidratacion, la preparacion liposomal puede rehidratarse por la adicion de agua o una disolucion acuosa. El documento no proporciona datos comparativos sobre la estabilidad en uso de preparaciones liposomales que se deshidrataron por secado por congelacion o por secado por pulverizacion previamente a su rehidratacion.

A la vista del estado descrito de la tecnica, el problema subyacente de la presente invencion fue la preparacion de liposomas, que comprende al menos un agente activo lipofilo y/o agente cosmetico con una alta relacion agente a lfpido y con estabilidad mejorada, especialmente considerando la estabilidad ffsica y la liberacion del agente del liposoma. Especialmente, la invencion se refiere al problema de proporcionar un procedimiento para fabricar dichas preparaciones de liposomas que presentan un tiempo de retencion prolongado durante la fabricacion y estabilidad en uso, en la que el procedimiento implica una etapa de deshidratacion rapida.

Asf, la solucion del problema anterior se consigue segun la presente invencion proporcionando realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y representadas ademas en la descripcion de la invencion.

Sumario de la invencion

La solucion del problema anterior se proporciona por preparaciones de liposomas donde se aplica tension de traccion en las membranas de liposomas por fuerzas osmoticas y un procedimiento para preparar dichos liposomas. Espedficamente, se proporciona la disolucion por un procedimiento para la preparacion de una suspension liposomal en una fase acuosa con al menos un agente activo y/o agente cosmetico presente en la membrana liposomal, en la que dicha suspension comprende al menos una sustancia osmoticamente activa en la fase acuosa y en la que la osmolaridad de la fase acuosa en el interior del volumen liposomalmente encapsulado, Oint, es mayor que la fase acuosa en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado, Oext. El agente activo presenta un log P mayor que 1 y dicho agente activo es un taxano. Los liposomas se caracterizan por la presencia de tension de traccion en las membranas de liposomas (liposomas sometidos a tension). Pueden obtenerse directamente durante la formacion de liposomas o en cualquier etapa de tratamiento despues de la formacion de los liposomas.

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Los liposomas sometidos a tension pueden obtenerse afectando directamente a la osmolaridad de la fase acuosa interior y/o exterior de los liposomas o cambiando las caractensticas de membrana, tales como empaquetamiento molecular, de la membrana liposomal donde los liposomas estan presentes en un medio de una osmolaridad determinada.

Los liposomas sometidos a tension pueden prepararse directamente con el agente activo y/o agente cosmetico presente en la membrana liposomal. Alternativamente, los liposomas sometidos a tension pueden prepararse sin el agente, que se anade con posterioridad a los liposomas.

Un aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para la fabricacion de una preparacion liposomal que comprende:

a) proporcionar una primera preparacion liposomal que comprende una suspension de liposomas en una fase acuosa, en la que los liposomas comprenden al menos una membrana, en la que la membrana encierra un volumen liposomalmente encapsulado de la fase acuosa y la fase acuosa comprende al menos una sustancia osmoticamente activa y presenta una osmolaridad total inicial, O1,

b) generar despues un gradiente osmolar en la fase acuosa de dicha preparacion en la que la osmolaridad de la fase acuosa en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado, Oext, es menor que la osmolaridad de la fase acuosa en el interior del volumen liposomalmente encapsulado, Oint, para proporcionar una segunda preparacion liposomal (sometida a tension),

c) opcionalmente deshidratar la segunda preparacion liposomal (sometida a tension) para obtener una preparacion deshidratada y

d) opcionalmente rehidratar la preparacion deshidratada.

El agente activo presenta un log P mayor que 1 y dicho agente activo es un taxano. La preparacion liposomal de la etapa a) comprende preferiblemente al menos un agente activo o agente cosmetico en la membrana liposomal. Alternativamente, el agente puede ser anadido en una fase a continuacion del procedimiento de fabricacion.

La etapa b) puede realizarse reduciendo la osmolaridad total inicial, Oi, de la suspension liposomal procedente de la etapa a) para proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension con una osmolaridad total, O2, que es menor que la osmolaridad Oi.

La etapa b) puede realizarse diluyendo la suspension liposomal procedente de la etapa a) con un medio acuoso con una osmolaridad que es menor que Oi o sometiendo a dialisis la suspension contra un medio acuoso con una osmolaridad que es menor que Oi. En el modo mas simple, la suspension liposomal se diluye con agua.

Segun el concepto general de la invencion, un gradiente osmolar puede generarse o modificarse en diferentes fases durante la fabricacion de la preparacion de liposomas. Tambien se puede modificar el gradiente osmolar una vez o multiples veces en varias fases del procedimiento de produccion. Esto puede conseguirse posiblemente por el mismo procedimiento o por procedimientos diferentes como se describe en lo siguiente. El procedimiento de produccion de la preparacion liposomal se refiere a todas las etapas realizadas antes de la aplicacion final de la suspension liposomal.

La etapa b) del procedimiento inventivo puede comprender las etapas de:

b1) deshidratar la preparacion liposomal en la etapa a) para obtener una preparacion liposomal deshidratada y

b2) rehidratar dicha preparacion liposomal deshidratada en condiciones para proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension, preferiblemente en un medio acuoso.

Preferiblemente, la deshidratacion se realiza por secado por pulverizacion de la suspension liposomal.

La invencion tambien se refiere a composiciones obtenidas o que se pueden obtener por los procedimientos anteriores.

Tambien, la invencion se refiere a una preparacion liposomal que comprende al menos un agente activo o un agente cosmetico en la membrana liposomal, en la que la membrana liposomal esta bajo tension de traccion.

Mas en particular, la invencion se refiere a una preparacion liposomal que comprende al menos un agente activo o agente cosmetico en la membrana liposomal en la que los liposomas estan presentes en una fase lfquida con una osmolaridad interior del volumen liposomalmente encapsulado (Oint) que es mayor que la osmolaridad de la fase lfquida exterior del volumen liposomalmente encapsulado (Oext).

Sorprendentemente, los autores han encontrado que las suspensiones liposomales que contienen liposomas, cuya membrana liposomal esta bajo tension de traccion, presentan una solubilidad mejorada para compuestos lipofilos.

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As^ la invencion tambien se refiere a un procedimiento para fabricar una preparacion liposomal que comprende al menos un farmaco lipofilo o compuesto cosmetico, que comprende las etapas de:

i) proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension, que comprende una suspension de liposomas en una fase acuosa,

ii) incubar dicha preparacion liposomal sometida a tension con al menos un agente activo lipofilo o agente cosmetico, opcionalmente en una forma no solubilizada y

iii) opcionalmente separar agente no solubilizado de la preparacion liposomal, preferiblemente por filtracion o centrifugacion,

iv) opcionalmente deshidratar la preparacion liposomal incubada y

v) opcionalmente rehidratar la preparacion liposomal deshidratada.

Los liposomas sometidos a tension pueden obtenerse por cualquiera de los procedimientos ya mencionados. Lo mas preferiblemente, esta presente al menos una sustancia osmoticamente activa en la fase acuosa de la suspension liposomal, en la que On es mayor que Oext.

El agente activo o agente cosmetico ya mencionado presenta preferiblemente una baja solubilidad en agua.

El agente activo o agente cosmetico ya mencionado es lipofilo y presenta un log P mayor que 1. El compuesto es un taxano, lo mas preferiblemente paclitaxel o un derivado del mismo.

Se ha encontrado sorprendentemente que puede mejorarse la eficacia de carga de compuestos deficientemente solubles en agua, lipofilos, tales como paclitaxel, para membranas liposomales y puede reducirse la liberacion de tales compuestos de las membranas liposomales, si se somete a tension la membrana liposomal, en particular, si esta comprendido un compuesto osmoticamente activo, soluble en agua, en la fase acuosa liposomalmente encapsulada en una concentracion mayor que en el exterior de la fase liposomalmente encapsulada. La mayor eficacia de carga del compuesto lipofilo para estos liposomas comparado con los liposomas sin un gradiente de concentracion permite fabricar formulaciones con mayor relacion molar de compuesto/lfpido y mejorar la estabilidad de formulaciones determinadas debido a que se reduce la tendencia a liberar el compuesto del liposoma.

Los liposomas que comprenden un agente lipofilo en el compartimento de membrana son menos susceptibles de la liberacion del compuesto al medio acuoso si esta presente dicho gradiente osmolar. La fraccion de equilibrio de dicha sustancia lipofila en el medio acuoso se reduce. De acuerdo con esto, el riesgo de que la concentracion del compuesto lipofilo en la fase acuosa exceda del lfmite de solubilidad y precipite tambien se reduce.

Ademas, se ha encontrado sorprendentemente que los liposomas vados que comprenden el gradiente descrito anteriormente presentan una mayor capacidad de carga para compuestos lipofilos, es decir, se solubiliza una mayor cantidad molar de compuesto lipofilo por la misma cantidad de liposomas (como se define por cantidad molar de lfpido) en comparacion con liposomas sin dicho gradiente. Esto puede realizarse, por ejemplo, por exposicion del compuesto lipofilo a liposomas vados.

Se ha encontrado sorprendentemente tambien que las preparaciones liposomales obtenidas por rehidratacion de liposomas deshidratados previamente presentan una distribucion de tamano homogenea, como se indica por un bajo mdice de polidispersidad (IP). Con respecto al control de calidad, siempre es deseable obtener un producto homogeneo, especialmente para usos farmaceuticos. Ademas, las suspensiones liposomales de la presente invencion presentan un mdice de polidispersidad que permanece sustancialmente inalterado durante un periodo de tiempo prolongado. Esto indica que los liposomas en las suspensiones inventivas no forman agregados. Especialmente para suspensiones liposomales administradas por via intravenosa, tienen que evitarse los agregados, debido a que estos agregados pueden obstruir los vasos sangumeos y conducir asf a embolias.

La presente invencion mejora sustancialmente el estado de la tecnica proporcionando un procedimiento para estabilizar agentes lipofilos en las membranas liposomales de una preparacion liposomal, asf como mantener el tamano y la polidispersidad de una preparacion liposomal rehidratada. Como consecuencia, puede prolongarse la estabilidad en uso de una preparacion final que comprende liposomas con un compuesto lipofilo. Tambien puede prolongarse la estabilidad de dichos liposomas durante el tratamiento de dichas formulaciones.

En muchos casos el periodo de tiempo para tratar las formulaciones lfquidas durante la fabricacion (tiempo de retencion) de formulaciones de liposomas esta limitado debido al riesgo de liberacion no deseada del agente de los liposomas. La invencion reduce el riesgo de liberacion de farmaco y, por lo tanto, permite tratamiento continuo de liposomas durante la fabricacion para escalas de tiempo extendidas y permite un diseno mas flexible del procedimiento de produccion.

Mas espedficamente, la invencion permite la preparacion de las formulaciones ya mencionadas por secado por pulverizacion en vez de secado por congelacion. En el secado por congelacion los liposomas se congelan y se

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estabilizan as^ directamente despues de la fabricacion, por lo tanto, el riesgo de liberacion durante la fabricacion es bajo. En secado por pulverizacion las formulaciones Kquidas encuentran tiempos de retencion prolongados en la fase lfquida, debido a que la pulverizacion de un lote determinado puede llevar varias horas o dfas. Debido a que la invencion permite aumentar la estabilidad de una formulacion determinada, pueden realizarse sesiones de pulverizacion mas largas sin interrupcion. Puesto que el secado por pulverizacion presenta un rendimiento total mayor comparado con el secado por congelacion, se facilita la produccion a gran escala y pueden reducirse los costes de produccion, mientras se mantiene la calidad del producto.

Ademas, se reduce el riesgo de liberacion de farmaco y cristalizacion en el periodo entre la reconstitucion de la composicion liposomal deshidratada y la administracion a un paciente (estabilidad en uso). La cristalizacion puede fomentar la formacion de partfculas subvisibles que no deben estar presentes mas alla de ciertos lfmites en los productos para administracion iv. En muchos casos, solo se proporciona una estabilidad en uso de unas horas, que es un obstaculo en la practica clmica. Por lo tanto, es de gran importancia una estabilidad en uso suficiente para aplicacion practica de dichos productos farmaceuticos o cosmeticos.

La preparacion de liposomas emplea con frecuencia disolventes organicos, tales como etanol, que normalmente se encuentra en productos liposomales deshidratados y, de acuerdo con esto, en las suspensiones liposomales rehidratadas derivadas de ahT Este es especialmente el caso para preparaciones liposomales que fueron deshidratadas por secado por congelacion (liofilizacion). Sin embargo, es deseable que los productos liposomales usados para aplicacion a seres humanos comprendan tan poco disolvente organico como sea posible. La presente invencion permite la deshidratacion por secado por congelacion, que facilita la eliminacion de la mayona o todo el disolvente organico residual, mientras se obtienen liposomas con una alta estabilidad.

Mientras se proporcionan las ventajas ya mencionadas, la invencion puede ponerse en practica facilmente y no requiere alto coste. Ni requiere complicados dispositivos tecnicos ni la adicion de ingredientes adicionales a las composiciones ya mencionadas. Las sustancias osmoticamente activas, que se usan para poner en practica la invencion, son ya conocidas de composiciones liposomales que se deshidratan como se describe en la patente de EE. UU. 4 880 635 o la patente internacional WO 2004/002468.

Definiciones

"Aproximadamente" en el contexto de valores de cantidad se refiere a una desviacion promedio de maximo +/- 20 %, preferiblemente +/- 10 % basado en el valor indicado. Por ejemplo, una cantidad de aproximadamente 30 % en moles de lfpido cationico se refiere a 30 % en moles +/- 6 % en moles y preferiblemente 30 % en moles +/- 3 % en moles de lfpido cationico con respecto a la molaridad lfpido/anfifilo total.

"Compuesto activo" o "agente activo" se refiere a un compuesto o mezcla de compuestos, que tienen una actividad biologica o ffsica particular basado en que es util como agente para el diagnostico, la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o afeccion humana o animal. Los agentes terapeuticos tales como sustancias farmaceuticas y agentes de diagnostico son ejemplos importantes de agentes activos segun la presente invencion.

"Densidad anhidra" de liposomas dentro de la invencion actual significa la masa de todos los compuestos que constituyen dichos liposomas, incluyendo los compuestos encapsulados por los liposomas, pero excluyendo la masa de agua comprendida en dichos liposomas, dividido por el volumen del liposoma en una fase acuosa, basado en el tamano de partfcula liposomal zpromedio. En un ejemplo muy espedfico, la densidad anhidra de los liposomas puede referirse a la masa de DOTAP, DOFC, paclitaxel, acido dtrico y trehalosa comprendidos en un liposoma, dividido por el volumen del liposoma en una fase acuosa. Los liposomas de densidad anhidra pueden determinarse por metodos de ultracentrifugacion, como se describe en los ejemplos.

"Medio acuoso", "lfquido acuoso" o "fase acuosa" como se usan en la presente memoria se refieren a un material lfquido que comprende agua. En algunas realizaciones, el material lfquido comprende al menos 50% (p/p), al menos 70% (p/p) o al menos 90% (p/p) de agua. En otras realizaciones, el material lfquido esta exento de disolventes organicos. La fase acuosa puede contener uno o varios compuestos. Asf, una dispersion acuosa, suspension acuosa y una emulsion en que la fase continua es acuosa tambien son ejemplos de lfquidos acuosos. Un lfquido acuoso que contiene un material coloidal se refiere a veces de ahora en adelante como una dispersion o disolucion coloidal acuosa.

"Cationico" se refiere a un agente que presenta una carga positiva neta o potencial zeta positivo en las condiciones medioambientales respectivas. En la presente invencion, se refiere a condiciones medioambientales donde el pH esta en el intervalo entre 3 y 9, preferiblemente entre 5 y 8.

"Estabilidad qmmica" del compuesto lipofilo se refiere a un cambio significativo de su estructura qmmica original y se define como aproximadamente 5% de cambio de actividad a partir del valor inicial de la prueba (compuesto original), preferiblemente aproximadamente 2% o aparicion de productos de degradacion espedficos excediendo de sus criterios de aceptacion con respecto a los lfmites toxicologicos y los aspectos de seguridad. Para compuestos lipofilos tales como paclitaxel la estabilidad qmmica puede definirse por HPLC/LC MS/MS y significa tfpicamente menos de 5% de productos de degradacion de dicho compuesto. Los productos de degradacion tfpicos de paclitaxel

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son, por ejemplo, BaccatinIII, 7- Epi-Taxol etc. (Monography of Paclitaxel, USP26, [enero-marzo de 2003], USPC, Inc.).

"Compuesto cosmetico" se refiere a un compuesto que presenta un efecto sobre la piel o el cabello humano.

"Agente diagnosticamente activo" o "diagnostico" se refiere a un agente farmaceuticamente aceptable que puede usarse para visualizar una propiedad o estado biologico en un individuo o muestra por varios metodos. La visualizacion puede usarse para realizar un diagnostico.

"Deshidratacion" o "deshidratar" se refiere al procedimiento de retirada de agua de una composicion. En algunas realizaciones, el agua se retira de la composicion a un contenido residual menor que aproximadamente 10 % (p/p), preferiblemente menor que aproximadamente 5 % (p/p), basado en el contenido en agua presente antes del procedimiento de deshidratacion.

"Volumen encapsulado" o "fase encapsulada" se refiere a un volumen que esta encerrado por al menos una membrana liposomal. El volumen puede ser encerrado por una membrana en liposomas unilaminares o varias membranas en liposomas multilaminares. Asf, la fase encapsulada representa el espacio interior de un liposoma, mientras que el volumen exterior del volumen liposomalmente encapsulado o “fase libre (acuosa)” representa el espacio que rodea a un liposoma. En el caso de liposomas multilaminares, los terminos, encapsulado y fase libre, se refieren al volumen interior y exterior proximos a una membrana determinada del liposoma multilaminar.

"Tiempo de retencion" se refiere al periodo de tiempo para tratar las formulaciones lfquidas durante la fabricacion de formulaciones de liposomas.

"Homogeneidad de tamano" como se usa en la presente memoria se refiere a la distribucion de tamano de una poblacion de partfculas. Una alta homogeneidad de tamano o distribucion de tamano estrecha se caracteriza por un mdice de polidispersidad bajo.

"Lfpido" se refiere a su sentido convencional como un termino generico que incluye grasas, lfpidos, constituyentes solubles en alcohol-eter de protoplasma, que son insolubles en agua. Los lfpidos normalmente constan de un resto hidrofilo y uno hidrofobo. En el agua, los lfpidos pueden autoorganizarse para formar membranas de bicapa, donde los restos hidrofilos (grupos de cabeza) se orientan hacia la fase acuosa y los restos lipofilos (cadenas de acilo) estan embebidos en el nucleo de la bicapa. Los lfpidos pueden comprender tambien dos restos hidrofilos (bolaanfifilos). En ese caso, las membranas pueden estar formadas de una unica capa de lfpidos y no una bicapa. Ejemplos tfpicos para lfpidos en el presente en contexto son grasas, aceites grasos, aceites esenciales, ceras, esteroide, esteroles, fosfolfpidos, glucolfpidos, sulfolfpidos, aminolfpidos, cromolfpidos y acidos grasos. El termino incluye lfpidos tanto que se encuentran en la naturaleza como sinteticos. Los lfpidos preferidos en relacion con la presente invencion son: esteroides y esterol, en particular colesterol, fosfolfpidos, incluyendo fosfatidilo, fosfatidilcolinas y fosfatidiletanolaminas y esfingomielinas. En el caso de que haya acidos grasos, podfan ser cadenas de aproximadamente 12-24 carbonos de longitud, conteniendo hasta 6 dobles enlaces. Los acidos grasos se unen a la cadena principal, que puede proceder de glicerol. Los acidos grasos en un lfpido pueden ser diferentes (asimetricos) o pueden tener solo 1 cadena de acido graso presente, por ejemplo, lisolecitinas. Tambien son posibles formulaciones mixtas, en particular cuando los lfpidos no cationicos proceden de fuentes naturales, tales como lecitinas (fosfatidilcolinas) purificadas de yema de huevo, corazon bovino, cerebro, hugado o soja.

Los "liposomas" son estructuras vesiculares de autocierre, artificiales, de varios tamanos y estructuras, donde una o varias membranas encapsulan un nucleo acuoso. Lo mas tfpicamente, las membranas de liposomas se forman de membranas de bicapa de lfpidos, donde los grupos de cabeza hidrofila se orientan hacia el entorno acuoso y las cadenas de lfpidos estan embebidas en el nucleo lipofilo. Los liposomas pueden formarse tambien de otras moleculas monomericas y polimericas anfifflicas, tales como polfmeros, como copolfmeros de bloque o polipeptidos. Las vesfculas unilaminares son liposomas definidos por una unica membrana encerrando un espacio acuoso. Por el contrario, las vesfculas oligo- o multilaminares estan formadas de varias membranas. Tfpicamente, las membranas son de practicamente 4 nm de espesor y estan constituidas por lfpidos anfifflicos, tales como fosfolfpidos, de origen natural o sintetico. Opcionalmente, las propiedades de membrana pueden modificarse por la incorporacion de otros lfpidos tales como derivados de esteroles o acido colico. Los liposomas con membranas particularmente flexibles a base de fosfolfpidos con una baja temperatura de transicion de fase (es decir, por debajo de la temperatura corporal) se refieren a veces como transfersomas.

"Suspension liposomal" se refiere a una composicion que comprende liposomas en un medio acuoso.

"Preparacion liposomal" o "composicion liposomal" se refiere a cualquier composicion que comprende liposomas incluyendo una suspension liposomal o una composicion deshidratada obtenida de dicha suspension por deshidratacion.

"Lipofilo" se refiere a la propiedad de un compuesto para disolver preferentemente en una fase de tipo grasa (por ejemplo, hidrocarburo), tal como una fase que esta constituida sustancialmente por lfpidos. La propiedad lipofila de un compuesto puede describirse por el coeficiente de particion (log P). Los compuestos de interes en el presente contexto tienen un log P mayor que aproximadamente 1, mas preferiblemente mayor que aproximadamente 2, lo

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mas preferiblemente mayor que aproximadamente 3.

"Log P" se refiere al coeficiente de particion de un compuesto entre una fase de agua y una de octanol a 25 °C. Generalmente, un numero de log P superior significa que un agente es soluble mejor en octanol. El log P se define como ([concentracion del agente en octanol]/[concentracion del agente en agua]). Es conocido para el experto en la materia como puede determinarse el log P de un cierto compuesto de manera experimental.

"Baja solubilidad en agua" se refiere a una solubilidad de un compuesto que es menor que 0,1 mg/ml, mas preferiblemente menor que 0,01 mg/ml y lo mas preferiblemente menor que 0,001 mg/ml en agua a pH fisiologico a 25°C en ausencia de aditivos que faciliten la solubilidad.

La "osmolaridad total" de una suspension liposomal es la cantidad total de sustancias osmoticamente activas presentes en un cierto volumen de dicha suspension dividida por el volumen de la suspension. Para el calculo de la osmolaridad total, se consideran asimismo sustancias osmoticamente activas en el interior y exterior del volumen liposomalmente encapsulado de la suspension. En el presente contexto, las abreviaturas Oi y O2 se refieren a la osmolaridad total.

"Oint" y "Oext" se refiere a la osmolaridad interior y exterior de una membrana de liposomas de autocierre. Para liposomas unilaminares, Oext es la osmolaridad de la fase acuosa libre y Oint es la osmolaridad del volumen encapsulado. Para liposomas multilaminares Oint y Oext se refieren a las osmolaridades interiores y exteriores de cada membrana autocerrada individual. En el presente contexto, las situaciones donde Oint es mayor que Oext son de particular relevancia. Las relativas diferencias entre Oint y Oext pueden investigarse por tecnicas de centrifugacion, por ejemplo, por centrifugacion o ultracentrifugacion anafftica o preparativa. Debido a que normalmente un compuesto osmoticamente activo cambia la densidad de la fase acuosa, pueden reconocerse diferencias entre Ointy Oext del comportamiento de sedimentacion de los liposomas (Goormaghtigh y Scarborough 1986, Huang y Charlton 1971). Ademas, los gradientes osmolares pueden afectar a parametros estructurales de la membrana liposomal, tal como puede determinarse por metodos como dispersion de rayos X o de neutrones o tamano del liposoma, tal como puede determinarse por dispersion de luz y de rayos X.

Una “sustancia osmoticamente activa” en el presente contexto se refiere a una sustancia soluble en agua que no puede permear sustancialmente la membrana liposomal. Son ejemplos ffpicos, por ejemplo, iones o azucares, como glucosa o trehalosa que pueden ser atrapados de manera eficaz en los liposomas, mientras que las moleculas de agua muestran una alta permeabilidad y, por lo tanto, en el contexto actual, el agua no se considera una sustancia osmoticamente activa. La selectividad para la permeacion de diferentes compuestos es una caractenstica clave de los liposomas (Bangham et al., 1965). La permeabilidad de un compuesto a traves de una membrana depende de la composicion de membrana, el estado de la fase de otras condiciones de frontera.

"Osmolaridad" es la suma de las concentraciones molares de solutos presentes en la disolucion acuosa, incluyendo la sustancia biologicamente activa y cualquier molecula auxiliar, tal como excipientes osmoticos usados para retardar la velocidad de liberacion del agente activo. Si esta presente el soluto en una forma disociada, ionizada o agregada, la osmolaridad se define como la suma de las concentraciones molares de las formas disociadas, ionizadas o agregadas. La contribucion a la osmolaridad de una disolucion hecha por cualquier soluto en la disolucion es aproximadamente equivalente a la concentracion del soluto en la disolucion dividido por su peso molecular. Asf, como principio general, cuanto mayor el peso molecular de un soluto, menor la osmolaridad del soluto y menor la contribucion de ese soluto a la osmolaridad total de la disolucion. Las diferencias en osmolaridad pueden determinarse a partir de cambios en varios parametros fisicoqmmicos, tales como densidad, densidad electronica, mdice de refraccion o viscosidad, que pueden determinarse por metodos establecidos en qmmica ffsica.

"Lfpidos cargados negativamente" se refiere a ffpidos que presentan una carga neta negativa.

"Composicion farmaceutica" se refiere a una combinacion de dos o mas componentes diferentes con diferentes propiedades farmaceuticas que las posefdas por el componente. En la presente invencion, dos o mas componentes se refiere a un ffpido o dispersion coloidal y un agente activo, opcionalmente junto con un portador, diluyente y/o adyuvante farmaceuticamente aceptable.

"Estabilidad ffsica" de un liposoma se refiere al cambio de estado ffsico del liposoma. Un liposoma es estable cuando se mantiene el estado ffsico. Un aspecto importante de la estabilidad ffsica es la liberacion de compuesto embebido en la membrana liposomal al medio acuoso de suspension liposomal. La liberacion de compuesto es una caractenstica de inestabilidad ffsica. La liberacion de compuesto de la membrana puede conducir a concentracion elevada y agregacion del compuesto en el medio acuoso. En el caso de taxanos, la agregacion es visible por la formacion de agujas del taxano. La cristalizacion de un taxano puede medirse por inspeccion visual de formulacion liposomal ffquida, microscopfa de luz, medicion de bloqueo de la luz o dispersion de la luz. El tamano liposomal y la distribucion de tamano son tambien caractensticas del estado ffsico de la suspension liposomal.

"Polidispersidad" es la anchura de la distribucion del tamano de parffcula en una muestra de partmulas determinada, por ejemplo, una suspension liposomal. Una medida para la polidispersidad se proporciona por el mdice de polidispersidad (IP), cuando se obtiene de analisis acumulativo de datos de espectroscopia de correlacion fotonica

(PCS, por sus siglas en ingles).

El "mdice de polidispersidad" (IP) es un numero adimensional cuando se obtiene de analisis denominado acumulativo de resultados de mediciones de espectroscopia de correlacion fotonica (PCS) (Koppel 1972). El analisis acumulativo permite ajuste libre de modelo de datos de PCS de los que se obtiene el Zpromedio, como una medicion 5 para el tamano de partfcula y el valor de IP, como una medida para la polidispersidad. Los calculos de estos parametros se definen en el documento 13321:1996 E de estandar iSo. En el contexto de las mediciones de tamano de partfcula, con frecuencia se usan los terminos PCS y Difusion Dinamica de Luz (DLS, por sus siglas en ingles), como sinonimos. Esta tecnica mide las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de luz dispersada que tiene lugar debido a que las partfculas estan experimentando movimiento Browniano. El analisis de estas 10 fluctuaciones de intensidad permite la determinacion de los coeficientes de difusion de las partfculas que se convierten en una distribucion de tamano. Dentro del significado de la presente invencion, se determinan el IP y Zpromedio como se describe en el Ejemplo 6.

"Espectroscopia de correlacion fotonica" es una tecnica que mide las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de luz dispersada que tienen lugar debido a que las partfculas estan experimentando movimiento 15 Browniano. El analisis de estas fluctuaciones de intensidad permite la determinacion de los coeficientes de difusion de las partfculas que se convierten en una distribucion de tamano. En el contexto de mediciones de tamano de partfcula, con frecuencia PCS y DLS se usan a modo de sinonimos.

"Lfpidos cargados de manera positiva" se usa como un sinonimo para lfpidos cationicos (para la definicion vease definicion de "lfpidos cationicos"). En la presente invencion, se refiere a entornos donde el pH esta en el intervalo 20 entre 3 y 9, preferiblemente entre 5 y 8.

"Estabilidad" puede referirse a estabilidad ffsica de un liposoma y a la estabilidad qrnmica de los unicos constituyentes (por ejemplo, lfpidos y compuesto activo) comprendidos en el liposoma.

"Liposomas sometidos a tension" o "preparaciones liposomales sometidas a tension" se refieren a liposomas en los que la membrana liposomal esta bajo tension de traccion y a preparaciones que comprenden tales liposomas.

25 "Tension de traccion" en la membrana liposomal en el contexto actual puede ejercerse por aplicacion de un gradiente de concentracion de un compuesto osmoticamente activo entre la fase acuosa en el interior y exterior de un volumen liposomalmente encapsulado. Si la osmolaridad interior Oint, es mayor que la osmolaridad exterior Oext, esto dara como resultado un incremento del gradiente de presion, AP, entre el volumen encapsulado y libre por fuerzas osmoticas. La presion en exceso se equilibra por la tension superficial, y, en la membrana liposomal, donde 30 la correlacion entre el gradiente de presion y la tension superficial se proporciona por la ecuacion de Young-Laplace conocida (Evans y Wennerstrom, 1994).

APr

imagen1

(Formula 1)

Para los presentes sistemas de liposomas tiene que tenerse en cuenta que la tension superficial ejercida conduce a 35 una expansion de area de la membrana liposomal que puede dar como resultado cambios del radio, volumen encapsulado, y, por consiguiente, a cambios de la osmolaridad de ese volumen encapsulado. La expansion del area, AA, como una funcion de la tension superficial depende del modulo elastico de la membrana, k, y se proporciona por la ecuacion de Young como:

AA _y A K

40 (Formula 2)

La formula 1 aclara, que la relacion entre tension superficial y presion es dependiente del radio. A un gradiente de presion determinado, la tension superficial aumenta con el radio creciente. El incremento del area y el correspondiente incremento de tamano de los liposomas es mayor para liposomas grandes que para los mas pequenos. Para los sistemas con tension superficial determinada, tales como burbujas de jabon, el gradiente de 45 presion pinterior - pexterior aumenta con la disminucion del radio o, en otras palabras, con el aumento de curvatura.

"Agente terapeuticamente activo" o "agente terapeutico" se refiere a un agente que evita o reduce la extension de un estado patologico en un animal, en particular en un mairnfero, preferiblemente en seres humanos.

"Molecula pequena" se refiere a una molecula con un peso molecular menor que aproximadamente 2000 Da.

"Potencial zeta" se refiere a potencial electrostatico medido de una partfcula coloidal en entorno acuoso, medido 50 como un instrumento tal como un Zetasizer 3000 usando microelectroforesis Laser Doppler en disolucion de KCI

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aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente pH 7,5. El potencial zeta describe el potencial en la frontera entre la disolucion volumetrica y la region de cizallamiento hidrodinamico o capa difusa. El termino es sinonimo con "potencial electrocinetico" debido a que es el potencial de las partfculas que actuan externamente y es responsable del comportamiento electrocinetico de la partfcula.

Descripcion detallada

Un procedimiento inventivo para la fabricacion de una preparacion liposomal puede realizarse por las siguientes etapas:

a) proporcionar una primera preparacion liposomal que comprende una suspension de liposomas en una fase acuosa, en la que los liposomas comprenden al menos una membrana, en la que la membrana encierra un volumen liposomalmente encapsulado de la fase acuosa y la fase acuosa comprende al menos una sustancia osmoticamente activa y presenta una osmolaridad total inicial, Oi, despues

b) generar un gradiente osmolar en la fase acuosa de dicha preparacion en la que la osmolaridad de la fase acuosa exterior del volumen liposomalmente encapsulado, Oext, es menor que la osmolaridad de la fase acuosa interior del volumen liposomalmente encapsulado, Oint, para proporcionar una segunda preparacion liposomal (sometida a tension),

c) opcionalmente deshidratar la segunda preparacion liposomal (sometida a tension) para obtener una preparacion deshidratada y

d) opcionalmente rehidratar la preparacion deshidratada.

El agente activo presenta un log P mayor que 1 y dicho agente activo es un taxano. La preparacion liposomal de la etapa a) comprende preferiblemente al menos un agente lipofilo presente en la membrana liposomal. Los agentes lipofilos, sin embargo, tambien pueden anadirse en etapas mas adelante del procedimiento de produccion.

La etapa b) puede realizarse reduciendo la osmolaridad total inicial, Oi, de la preparacion liposomal procedente de la etapa a) para proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension con la osmolaridad total, O2, que es menor que la osmolaridad Oi.

En el contexto de la presente invencion, reducir la osmolaridad total Oi se refiere a un procedimiento en el que se reduce inicialmente la osmolaridad del medio acuoso exterior del volumen liposomalmente encapsulado, Oext. Si se asume inicialmente una concentracion identica en todos los compartimentos, Oi = Oext= Oint, la dilucion afecta primero de todo a solo la fase acuosa libre, Oext, que da como resultado Oext< Oint. Por consiguiente, se genera un gradiente osmotico entre el interior y el exterior del volumen liposomalmente encapsulado. Se entiende que, en presencia de un gradiente osmotico, los liposomas pueden hincharse, debido a que las membranas son permeables para las moleculas de agua. Por lo tanto, como un efecto secundario de dilucion, tambien puede disminuir en cierta extension la osmolaridad del medio acuoso encapsulado, O2. Los cambios absolutos de osmolaridad dependen de varios factores como, fraccion de volumen encapsulado, tamano del liposoma, elasticidad de la membrana (modulo de Young) etc. Asi, la relacion entre Oi y O2, no es necesariamente identica a la relacion entre Ointy Oext despues de dilucion.

Sin embargo, la reduccion de la osmolaridad en la fase acuosa no encapsulada, libre, conducira a un incremento del gradiente de osmolaridad Oint-Oext entre el exterior y el interior de la fase encapsulada. Si tiene lugar hinchamiento como respuesta a la tension osmotica mas alla de un cierto factor, pueden formarse defectos de membrana, permitiendo la liberacion de soluto de la fase de mayor osmolaridad a la fase de menor osmolaridad. Esto reducira el gradiente osmolar y la tension osmolar. Las membranas pueden volver a sellarse en condiciones de maxima tension de traccion y maximo Kmite critico de gradiente osmotico para formacion de poros. Por lo tanto, el sistema puede considerarse autoestabilizante, en el sentido, de que si se aplica un gradiente en exceso, sin tener en cuenta las condiciones detalladas, el sistema adoptara el estado de maximo gradiente osmotico. Dicho efecto puede ser considerado favorable para asegurar condiciones reproducibles durante la fabricacion.

Los liposomas usados dentro del contexto de la presente invencion pueden comprender lfpidos neutros, anionicos y/o cationicos. Pueden seleccionarse lfpidos neutros o anionicos, de esteroles o lfpidos tales como colesterol, fosfolfpidos, lisolfpidos, lisofosfolfpidos, esfingolfpidos o lfpidos pegilados con una carga neta neutra o negativa. Los lfpidos neutros y anionicos utiles incluyen de ese modo: fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol (no limitado a un azucar espedfico), acidos grasos, esteroles, conteniendo un grupo acido carboxflico, por ejemplo, colesterol, i,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, incluyendo, pero no limitado a, i,2-dioleilfosfoetanolamina (DOFE), i,2- dihexadecilfosfoetanolamina (DHFE), i,2-diacil-glicero-3-fosfocolinas, i,2-diestearilfosfosfatidilcolina (DEFC), i,2- dipalmitiltfosfosfatidilcolina (DPFC), i,2-dimiristiltfosfosfatidilcolina (DMFC), fosfatidilcolina preferiblemente FC de huevo, FC de soja y esfingomielina. Los acidos grasos ligados a la cadena principal de glicerol no estan limitados a una longitud espedfica o numero espedfico de dobles enlaces. Los fosfolfpidos tambien pueden presentar dos acidos grasos diferentes. Preferiblemente, los lfpidos adicionales estan en el estado cristalino lfquido a temperatura ambiente y son miscibles (es decir, puede formarse una fase uniforme y no tiene lugar separacion de fases o formacion de dominios) con el lfpido cationico usado, en la relacion como se aplican. En una realizacion preferida, el

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Kpido neutro es 1,2-dioleilfosfosfatidilcolina (DOFC).

Los Kpidos cationicos preferidos de la preparacion liposomal son sales de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N- trimetilamonio, por ejemplo, la sal de metilsulfato. Compuestos representativos preferidos de la familia de Kpidos - TAP (metilsulfato de trimetilamonio) son DOTAP (dioleoil-), DMTAP (dimiristoil-), DPTAP (dipalmitoil-) o DsTAP (diestearoil-). Otros lfpidos utiles para la presente invencion pueden incluir: BDDA, bromuro de dimetil dioctadecilamonio; 1,2-diaciloxi-3-trimetilamoniopropanos, (incluyendo, pero no limitado a: dioleoflo, dimiristoMo, dilauroMo, dipalmitoMo y diestearoMo; tambien pueden unirse dos cadenas de acilo diferentes a la cadena principal de glicerol); N-[1-(2,3-dioloiloxi)propil]-N,N-dimetilamina (DODAP); 1,2-diaciloxi-3-dimetilamoniopropanos, (incluyendo, pero no limitado a: dioleoflo, dimiristono, dilauroMo, dipalmitoflo y diestearoMo; tambien pueden unirse dos cadenas de acilo diferentes a la cadena principal de glicerol); cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA); 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamoniopropanos, (incluyendo, pero no limitado a: dioleflo, dimiristilo, dilaurilo, dipalmitilo y diestearilo; tambien pueden unirse dos cadenas alqmlicas diferentes a la cadena principal de glicerol); dioctadecilamidoglicilespermina (DOGE); 3p-[N-(N'N'-dimetilamino-etano)carbamoil]colesterol (DC-Col); trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N-(2-(esperminocarboxamido)-etil)-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOEPA); p- alanilcolesterol; bromuro de cetil trimetilamonio (BCTA); diC14-amidina; N-terc-butil-N'-tetradecil-3-tetradecilamino- propionamidina; 14Dea2; cloruro de N-(alfa-trimetilamonioacetil)didodecil-D-glutamato (TMAG); cloruro de O,O'- ditetradecanoil-N-(trimetilamonio-acetil)dietanolamina; 1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida

(DOESPER); yoduro de N,N,N',N'-tetrametil-N,N'-bis(2-hidroxiletil)-2,3-dioleoiloxi-1,4-butanodiamonio; derivados de cloruro de 1-[2-(aciloxi)etil]2-alquil(alquenil)-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio, como se describe por Solodin et al. (Solodin et al., 1995), tales como cloruro de 1-[2-(9(Z)-octadecenoiloxi)etil]-2-(8(Z)-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), cloruro de 1-[2-(hexadecanoiloxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DPTIM), derivados de compuestos de 2,3-dialquiloxipropilamonio cuaternario, que contienen un resto hidroxialquilo en la amina cuaternaria, como se describe, por ejemplo, por Felgner et al. (Felgner et al., 1994) tal como: bromuro de 1,2- dioleoil-3-dimetilhidroxietilamonio (DORI), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio (DORIE), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetilhidroxipropilamonio (DORIE-HP), bromuro de 1,2-dioleil-oxi-propil-3-dimetil- hidroxibutilamonio (DORIE-HB), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetilhidroxipentilamonio (DORIE-Hpe), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxiletilamonio (DMRIE), bromuro de 1,2-dipalmitiloxipropil-3- dimetilhidroxietilamonio (DPRIE), bromuro de 1,2-diesteriloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio (DERIE); esteres cationicos de acilcarnitinas como indica Santaniello et al. (patente de EE.UU. 5 498 633); triesteres cationicos de fosfatidilcolina, es decir, 1,2-diacil-sn-glicerol-3-etilfosfocolinas, donde las cadenas hidrocarbonadas pueden ser saturadas o insaturadas y ramificadas o no ramificadas con una longitud de cadena de C12 a C24, no siendo necesariamente identicas las dos cadenas de acilo.

Los liposomas pueden tener diferentes tamanos, laminaridad y estructura. Preferiblemente, los liposomas tienen un diametro promedio Zpromedio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 500 nm. Lo mas preferido es un tamano Zpromedio de aproximadamente 1O0 a aproximadamente 200 nm. Los liposomas pueden ser liposomas uni-, oligo- o multilaminares. Preferiblemente, los liposomas son liposomas unilaminares.

El agente activo o agente cosmetico empleado en las diferentes realizaciones del compuesto de la invencion presenta preferiblemente un log P mayor que 1, mas preferiblemente mayor que aproximadamente 2, lo mas preferiblemente mayor que aproximadamente 3.

El agente activo o agente cosmetico empleado en las diferentes realizaciones de la invencion presenta preferiblemente una baja solubilidad en agua. Preferiblemente, el compuesto presenta una solubilidad menor que 0,1 mg/ml, mas preferiblemente menor que 0,01 mg/ml y lo mas preferiblemente menor que 0,001 mg/ml en agua a pH fisiologico a temperatura normal.

Preferiblemente, el agente activo comprendido en los liposomas de la presente invencion es un agente terapeuticamente o diagnosticamente activo. Lo mas preferiblemente, el compuesto es terapeuticamente activo.

Preferiblemente, el agente activo o agente cosmetico es una molecula con un peso molecular menor que 2000 Da, mas preferiblemente menor que 1000 Da.

En un aspecto, el agente activo puede seleccionarse del grupo que comprende: abarelix, altretamina, anastrozol, aprepitant, bicalutamida, camptotecinas, capecitabina, clorotrianiseno, estrogenos conjugados, ciclosporina, dactinomicina, dietilestilbestrol, docetaxel, dolasetron, dromostanolona, epirrubicina, epotilones, por ejemplo, epotilon B, epotilon D o derivados de epotilon, por ejemplo, como se describe en las patentes internacionales WO2004048372, WO2004007492, WO2005051947 y WO2005030767 (cuyo contenido se incorpora en la presente memoria por referencia), suberlotinib, etinilestradiol, exemestano, fentanilo, flavopiridol, fluoximesterona, fulvestrant, gefitinib, granisetron, hesperetina, hidromorfona, irinotecan, ketoconazol lapatinib, letrozol, leuprolida, lomustina, lucantona, marinol, masoprocol, megestrol, nabilona, nilutamida, palonosetron, porfimer, quinestrol, quinestrol, tamoxifeno, taxanos, temsirolimus, testolactona, topotecan, toremifeno, trimetrexato, valrubicina, vinblastina, vitamina E y derivados de estos compuestos. El compuesto mencionado en las reivindicaciones es un taxano, lo mas preferiblemente paclitaxel o un derivado del mismo.

En un cierto aspecto de la invencion, el agente activo no es una molecula de nucleotido o polinucleotido como una

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molecula de ADN o ARN.

En otro aspecto, el alcance de la invencion no comprende agentes activos que se ionicen durante la formulacion y/o agentes activos que sean compuestos muy solubles en agua como, por ejemplo, adriamicina.

Preferiblemente, los liposomas de la invencion comprenden entre aproximadamente 2,5 % en moles y aproximadamente 4,5 % en moles de paclitaxel en las membranas liposomales. Asf, el paclitaxel puede representar preferiblemente una cantidad de entre aproximadamente 2,5 % en moles y aproximadamente 4,5 % en moles de la cantidad de todas las moleculas presentes en las membranas tales como ftpidos y moleculas relacionadas y paclitaxel. Mas preferiblemente, estos liposomas muestran una liberacion de farmaco impedida como una suspension y/o despues de rehidratacion y/o no forman sustancialmente cristales durante el almacenamiento, como se define en la presente memoria a continuacion.

En una realizacion especialmente preferida de la invencion, los liposomas son liposomas cationicos, por ejemplo, liposomas cationicos que comprenden DOTAP, DOFC y paclitaxel en una relacion molar de aproximadamente 50:47:3. Las formulaciones de esta composicion son conocidas en la tecnica como MBT-0206 o EndoTAG-1. La fabricacion de preparaciones liposomales que comprenden DOTAP, DOFC y paclitaxel se describe en la patente internacional WO 2004/002468, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.

En general, los liposomas pueden prepararse por metodos que son conocidos para el experto en la materia. Varios metodos para preparar liposomas son descritos por New et al. (1990).

Preferiblemente, los liposomas empleados en la presente invencion se preparan por inyeccion de etanol.

En una realizacion especial de la invencion, los liposomas presentan un potencial zeta positivo, mas preferiblemente a potencial zeta mayor que aproximadamente + 30 mV.

La sustancia osmoticamente activa empleada en el metodo inventivo o comprendida en las composiciones inventivas es una sustancia soluble que no puede permear sustancialmente de una bicapa de ftpidos. Preferiblemente, la sustancia osmoticamente activa esta presente en el interior y exterior de los liposomas.

La sustancia osmoticamente activa puede ser una molecula organica como un sacarido, por ejemplo, un mono-, di-, oligo- o polisacarido, un alcohol de azucar, un aminoacido, un peptido, una protema, un poftmero soluble en agua, una sal organica o inorganica, ion o una combinacion de los mismos.

Los sacaridos utiles incluyen azucar y alcoholes de azucar, oligosacaridos, polisacaridos solubles en agua y derivativos de los mismos. Los sacaridos preferidos segun la invencion incluyen glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, celobiosa, galactosa, maltotriosa, maltopentosa, rafinosa, dextrina, dextrano, inulina, manitol, sorbitol, xilitol, quitosan y lo mas preferiblemente trehalosa.

Ejemplos de poftmeros solubles en agua son polietilenglicoles, alcohol polivimlico, poliacrilatos o polivinilpirrolidona.

En un cierto aspecto, el uso de una sustancia osmoticamente activa en el metodo inventivo o composiciones inventivas excluye el uso de agentes complejantes que faciliten la solubilizacion de compuestos que presentan una baja solubilidad en agua. Ejemplos de tales agentes complejantes son ciclodextrinas como describen Zhang et al., en la patente internacional Wo 2007/005754 o MacLachlan et al., en la patente internacional WO 2007/012191.

El medio acuoso o la fase acuosa usados en el contexto de la presente invencion pueden comprender uno o mas constituyentes adicionales que sean al menos parcialmente miscibles con agua, tales como alcoholes (por ejemplo, alcoholes C1-4 tales como etanol) o cetonas (por ejemplo, cetonas C1-4 tales como acetona). En una realizacion preferida de la invencion, la fase acuosa contiene etanol.

La fase acuosa puede comprender ademas una sustancia tampon u otros agentes estabilizantes. Las sustancias tampon adecuadas se seleccionan de, por ejemplo, acido cftrico, Tris, Bis, acido fosforico, acido lactico y similares, preferiblemente acido cftrico. La sustancia tampon puede estabilizarse a pH del medio acuoso entre aproximadamente 3 y 7, preferiblemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5.

Preferiblemente, la preparacion liposomal de la etapa a) se fabrica mezclando una disolucion organica (por ejemplo, etanol) que comprende ftpidos y opcionalmente un agente activo o agente cosmetico en un medio acuoso que comprende al menos una sustancia osmoticamente activa caracterizada por una osmolaridad total O1.

El intervalo preferido de gradientes osmoticos, Oint-Oext, es entre 10 mOsm y 2000 mOsm, mas espedficamente entre 50 mOsm y 1000 mOsm e incluso mas espedficamente entre 100 mOsm y 1000 mOsm.

Los gradientes osmoticos tambien pueden indicarse por la diferencia de concentracion/peso entre la concentracion/peso de la sustancia osmoticamente activa interior del volumen liposomalmente encapsulado y la concentracion/peso de la sustancia osmoticamente activa exterior del volumen liposomalmente encapsulado. El intervalo preferido de gradientes osmoticos es una diferencia de concentracion/peso entre 5% y 30% en peso, es decir, un gradiente entre 0% y 30% en peso de la sustancia osmoticamente activa exterior al volumen encapsulado y

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entre 10% y 40% en peso de la sustancia interior al volumen encapsulado.

La preparacion liposomal procedente de la etapa a) puede someterse a una etapa de homogenizacion, que puede realizarse por extrusion, filtracion por filtros de membrana, homogenizacion de alta presion y/u homogenizacion de alta velocidad y lo mas preferido por extrusion a traves de una membrana, por ejemplo, con un tamano de poro de aproximadamente 200 nm bajo presion. Tambien pueden usarse membranas con otros tamanos de poro tales como 50 nm, 100 nm, 150 nm, 400 nm, conocidos en la tecnica. Puede realizarse filtracion a traves de filtros de membrana por filtracion por membranas constituidas por filtros de PVDF, PES, nailon, pero tambien pueden usarse otros materiales si se define que sean adecuados. El tamano de poro de las membranas esta preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 200 nm a 450 nm, pero el tamano de poro no esta limitado a los tamanos mencionados. Pueden combinarse diferentes materiales y diferentes tamanos de poro de una manera para obtener una disolucion que pueda tratarse por una filtracion de grado esterilizacion. En una realizacion preferida, los liposomas procedentes de la etapa a) son sometidos a homogenizacion antes de que se genere un gradiente osmolar.

Puesto que la esterilidad es una caractenstica imperativa para los productos farmaceuticos, las suspensiones liposomales empleadas en el procedimiento inventivo pueden ser esterilizadas en alguna fase durante el procedimiento. Preferiblemente, las suspensiones son esterilizadas por filtracion a traves de la membrana de filtracion esteril de grado esterilizacion (0,22 pm). En una realizacion preferida, las suspensiones liposomales son esterilizadas por filtracion despues de que se genera un gradiente osmolar segun la etapa b) de la invencion.

Segun el concepto general de la invencion, el gradiente osmotico entre el volumen encapsulado y el volumen libre puede generarse o modificarse una vez o varias veces en diferentes fases durante el procedimiento de produccion de una preparacion liposomal. Esto puede conseguirse posiblemente por los mismos procedimientos o diferentes como se describe en lo que sigue.

En una realizacion preferida de la invencion, la etapa b) del procedimiento inventivo puede comprender las etapas de:

b1) deshidratar la preparacion liposomal procedente de la etapa a) para obtener una preparacion deshidratada liposomal y

b2) rehidratar dicha preparacion deshidratada liposomal, preferiblemente en un medio acuoso en condiciones, en las que se obtiene una preparacion liposomal sometida a tension.

Dentro del significado de la presente invencion "preparacion liposomal procedente de la etapa a)" se refiere a una preparacion liposomal preparada en la etapa a) o cualquier preparacion liposomal que pueda obtenerse de la preparacion liposomal preparada en la etapa a) por diferentes etapas del procedimiento. Estas etapas del procedimiento pueden incluir, por ejemplo, homogenizacion y/o esterilizacion como se describio anteriormente.

En una realizacion preferida, la generacion o alteracion de un gradiente osmotico se realiza al menos una vez despues de la fabricacion de la primera preparacion liposomal en la etapa a) y antes de la deshidratacion de dicha preparacion liposomal procedente de la etapa a). Preferiblemente, la generacion o alteracion del gradiente osmolar se realiza despues de una etapa de extrusion y/o despues de filtracion esteril. Como se menciono anteriormente, el gradiente osmolar mejora la estabilidad de la suspension liposomal sometida a las etapas del procedimiento.

Preferiblemente, la deshidratacion se realiza a temperaturas por encima de la temperatura ambiente.

En una realizacion especialmente preferida de la invencion, la deshidratacion de la etapa b1) se realiza por secado por pulverizacion de la suspension liposomal. En el procedimiento de secado por pulverizacion, se atomiza primero la suspension liposomal en gotitas pequenas pulverizando dicha suspension. Con posterioridad, se secan los liposomas por la evaporacion del medio de las gotitas a temperaturas elevadas. El secado de los liposomas despues de la formacion de gotitas puede conseguirse poniendo en contacto las gotitas con una corriente gaseosa, posiblemente calentada, seca, proporcionada, para obtener partfculas solidas. La posible corriente gaseosa puede ser un gas inerte o aire. El gas de secado puede ser preferiblemente un gas pobre en oxfgeno que contenga menos de 0,1% en volumen, preferiblemente menos de 0,05% en volumen, oxfgeno o un gas exento de oxfgeno. Los gases inertes aumentan la seguridad de sistemas de secado caliente que contienen disoluciones muy inflamables, bombeando nitrogeno, dioxido de carbono, helio, neon, argon, kripton, xenon y radon o algunos otros gases inertes para desplazar el oxfgeno. El efecto de estos sistemas es eliminar completamente el oxfgeno o reducirlo a un nivel insignificante. En una realizacion preferida, se usa nitrogeno como un gas inerte. En otra realizacion de la invencion, el gas inerte protege los ingredientes activos y los excipientes contenidos en la formulacion. Preferiblemente, se realiza el secado por pulverizacion en un dispositivo adecuado para secado por pulverizacion. Los liposomas deshidratados se separan de la corriente gaseosa y se recogen. El secado por pulverizacion puede realizarse a presion en exceso, presion normal o vacfo parcial. Puede existir un intervalo de presion del procedimiento favorable si se produce polvo conforme a la memoria descriptiva con el gas de secado a la maxima temperatura del sistema permisible y a la maxima capacidad. Para la seleccion de condiciones de secado, tiene que tenerse en cuenta la combinacion de parametros como velocidad de alimentacion lfquida, velocidad de gas de secado, temperatura del

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gas de secado, parametros termodinamicos de los excipientes y Ifmites de estabilidad de los compuestos. Son parametros importantes la temperatura de entrada del gas de secado Tinterior y la temperatura de salida, Texterior, que esta presente en el interior del secador por pulverizacion. La Texterior es sustancialmente menor que la Tinterior debido a enfriamiento adiabatico en la evaporacion. La temperatura real de la superficie de las partfculas puede ser significativamente menor que Texterior, dependiendo de la velocidad de evaporacion local. Por lo tanto, no pueden definirse parametros de secado por pulverizacion genericos. Para secar liposomas, la temperatura en el interior de la camara del procedimiento puede oscilar entre 10°C y 200°C. Mas tfpicamente, la suspension se seca por el metodo de la invencion con 30°C a 150°C y mas preferiblemente de aproximadamente 60°C a aproximadamente 120°C.

El equipo para el procedimiento de secado por pulverizacion puede obtenerse de Buchi (Flawil, Suiza) o GEA Niro (Soeborg, Dinamarca) o fabricado por encargo. El experto en la materia puede seleccionar las condiciones del procedimiento de secado, por ejemplo, velocidades de alimentacion y temperaturas, dependiendo de la suspension que se tenga que secar, el equipo usado y las especificaciones deseadas.

Especialmente, las condiciones de la etapa de deshidratacion pueden elegirse para obtener una composicion liposomal deshidratada con una cantidad muy baja de disolvente organico. La deshidratacion por secado por pulverizacion es adecuada especialmente para obtener cantidades bajas de disolvente organico residual.

Tambien, la deshidratacion por secado por pulverizacion como se describe en la presente memoria da como resultado una composicion de liposomas deshidratada en forma de un polvo vertible. Dichos polvos presentan propiedades de manipulacion mejoradas, por ejemplo, con respecto a la carga de dichas composiciones deshidratadas, cuando se compara con composiciones deshidratadas obtenidas por secado por congelacion que presentan una estructura tipo tarta.

En un aspecto de la invencion, la deshidratacion no afecta sustancialmente a la relacion entre compuesto osmoticamente activo encapsulado y libre cuando se compara la relacion en la suspension liposomal que ha sido sometida a secado por pulverizacion y la relacion en la preparacion secada por pulverizacion despues de rehidratacion en agua.

En un cierto aspecto de la invencion, la deshidratacion por liofilizacion o secado por congelacion, en la que se congela una suspension liposomal y se somete con posterioridad a presion reducida para retirar moleculas de agua, no esta incluida dentro del alcance de la invencion.

La composicion deshidratada, por ejemplo, como se obtiene en la etapa b1) o c) puede ser cargada en contenedores adecuados y puede ser almacenada durante un cierto periodo de tiempo. Preferiblemente, la composicion es cargada y almacenada en condiciones esteriles. El tiempo de almacenamiento puede ser de varios dfas a varios meses o incluso anos. La composicion puede ser almacenada a temperatura ambiente, a temperaturas entre 2°C y 8°C o por debajo de 0°C.

Antes de que se use la composicion liposomal deshidratada, por ejemplo, administrada a un paciente en el caso de una composicion liposomal usada como composicion farmaceutica, o tratada adicionalmente, la composicion deshidratada se rehidrata segun la etapa b2 o c). Para este fin, la composicion deshidratada obtenida como se describio anteriormente se mezcla con un medio acuoso. Para mejorar la rehidratacion, la mezcla puede ser agitada o removida.

La osmolaridad del medio acuoso usado para rehidratacion es menor que la osmolaridad total O1 de la suspension que habfa sido sometida a la etapa de deshidratacion. Preferiblemente, en medio acuoso usado para rehidratacion no comprende sustancialmente sustancias osmoticamente activas. Lo mas preferiblemente, se usa agua de calidad farmaceutica para inyeccion para rehidratacion.

En algunas realizaciones, el volumen de medio acuoso usado para rehidratacion puede ser mayor que el volumen de suspension liposomal que ha sido deshidratada para obtener la cantidad perspectiva de composicion liposomal deshidratada.

Segun la invencion, la osmolaridad del medio acuoso usado para rehidratacion y el volumen del medio usado para rehidratacion se seleccionan en una combinacion para obtener una suspension rehidratada que presenta una osmolaridad O2 total que es menor que la osmolaridad O1 de la suspension que ha sido sometida a la etapa de deshidratacion.

En otro aspecto de la invencion, la etapa b) se realiza por dilucion de la suspension liposomal procedente de la etapa a) para proporcionar un medio acuoso con una osmolaridad O2 total que es menor que O1.

La suspension liposomal se diluye con un medio acuoso como se describio anteriormente. En una realizacion preferida, la suspension liposomal se diluye con agua. En una realizacion, el medio acuoso usado para diluir la suspension liposomal no comprende un agente activo, especialmente no un agente activo que tenga que estar encapsulado en los liposomas.

En una realizacion preferida de la invencion, O2 es al menos 10 mOsm menor que Oi, mas preferiblemente O2 es al

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menos 50 mOsm menor que O1 e incluso mas preferiblemente O2 es al menos 100 mOsm menor que O1.

En otro aspecto de la invencion, la etapa b) se realiza por dialisis de la suspension liposomal procedente de la etapa a) contra un medio acuoso con una osmolaridad total que es menor que Oi.

Preferiblemente, se realiza dialisis en condiciones para proporcionar un gradiente osmotico entre Oi y la osmolaridad del medio acuoso contra el que se realiza la dialisis de al menos 10 mOsm, mas preferiblemente al menos 50 mOsm e incluso mas preferiblemente al menos 100 mOsm.

Alternativamente, la etapa b) puede realizarse por otros metodos adecuados. Por ejemplo, la concentracion de la sustancia osmoticamente activa puede ser reducida por metodos cromatograficos adecuados, tales como cromatograffa de intercambio ionico o de afinidad.

En un aspecto mas de la invencion, puede deshidratarse la suspension liposomal sometida a tension obtenida segun la etapa b) el procedimiento descrito como anteriormente. La deshidratacion de dicha suspension liposomal sometida a tension puede realizarse por cualquier procedimiento adecuado conocido para el experto en la materia. Los procedimientos de secado adecuados son, por ejemplo, secado por congelacion, secado por pulverizacion y congelacion o secado por pulverizacion. En una realizacion preferida, puede realizarse deshidratacion por secado por pulverizacion como se describio anteriormente para la etapa b1). En un aspecto mas de la invencion, la preparacion liposomal deshidratada resultante se rehidrata como se describio anteriormente.

En una realizacion espedfica, la invencion se refiere a un procedimiento en el que una suspension liposomal inicial, que comprende preferiblemente liposomas cationicos que comprenden DOTAP y opcionalmente DOFC como lfpidos y que comprende ademas un agente activo lipofilo, preferiblemente paclitaxel, en la membrana liposomal, se prepara en una fase acuosa de trehalosa. La concentracion de los constituyentes de la suspension liposomal esta presente en una concentracion aproximadamente tres veces cuando se compara con la suspension liposomal producida por el procedimiento que se usa finalmente, por ejemplo, administrada a un ser humano. Preferiblemente, la suspension liposomal inicial presenta una concentracion de lfpidos aproximadamente 30 mM y aproximadamente 30 mg/ml, mas preferiblemente 29,4 mg/ml de trehalosa. La suspension liposomal inicial esta opcionalmente homogeneizada por extrusion por una membrana en la siguiente etapa. Con posterioridad, la osmolaridad total de la suspension liposomal es reducida, preferiblemente por un factor de 1,5, preferiblemente diluyendo el volumen de la suspension liposomal con agua, por ejemplo, al volumen de 1,5 veces. Con posterioridad, la suspension liposomal es esterilizada opcionalmente, preferiblemente por filtracion. En la siguiente etapa, la suspension liposomal se deshidrata, preferiblemente por secado por pulverizacion, para proporcionar una suspension liposomal deshidratada. La suspension liposomal deshidratada se rehidrata finalmente para proporcionar una suspension liposomal, que se usa para su respectivo proposito, tal como administracion a un ser humano. La ultima suspension liposomal presenta preferiblemente una concentracion de lfpidos aproximadamente 10 mM y aproximadamente 10 mg/ml, preferiblemente 9,79 mg/ml de trehalosa.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un procedimiento para fabricar una preparacion liposomal, que comprende:

i) proporcionar una suspension liposomal, en la que al menos una sustancia osmoticamente activa esta comprendida en la fase acuosa de la suspension, en la que esta presente una mayor osmolaridad en el interior del volumen liposomalmente encapsulado que en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado,

ii) incubar dicha suspension liposomal con un componente lipofilo, opcionalmente en una forma no solubilizada,

iii) opcionalmente separar cualquier compuesto no solubilizado de la suspension liposomal, por ejemplo, por filtracion, centrifugacion u otros metodos adecuados,

iv) opcionalmente deshidratar la preparacion liposomal y

v) opcionalmente rehidratar la preparacion liposomal deshidratada.

El agente activo presenta un log P mayor que 1 y dicho agente activo es un taxano.

Preferiblemente, el gradiente osmotico entre el interior y el exterior del volumen liposomalmente encapsulado esta entre 10 mOsm y 2000 mOsm, mas espedficamente entre 50 mOsm y 1000 mOsm e incluso mas espedficamente entre 100 mOsm y 1000 mOsm.

En una realizacion preferida de la invencion, la suspension liposomal de la etapa i) no comprende un agente activo o agente cosmetico.

Los liposomas que comprenden un gradiente osmotico de la etapa i) pueden prepararse como se describio anteriormente. En una realizacion preferida de la invencion, no se anade principio activo o agente cosmetico en la fabricacion de la suspension liposomal de la etapa i). La forma no solubilizada del agente activo o agente cosmetico puede ser, por ejemplo, una forma cristalina, por ejemplo, de diferente morfologfa y tamano o una forma de polvo.

En una realizacion de la invencion, se separa agente no solubilizado de la dispersion despues de la incubacion. En

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una realizacion preferida, el compuesto no disuelto se separa por centrifugacion o filtracion. La filtracion puede realizarse en un filtro de jeringa.

En otro aspecto, la invencion se refiere a una preparacion liposomal obtenida u obtenible por los procedimientos como se describio anteriormente. La preparacion puede ser en forma deshidratada o en forma de una suspension acuosa.

La preparacion liposomal de la presente invencion se usa preferiblemente en medicina, por ejemplo, en medicina humana o veterinaria. La preparacion se administra preferiblemente por via intravenosa. Mas preferiblemente, la preparacion es usada para el tratamiento de cancer, tal como cancer de vejiga, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de endometrio, leucemia, cancer de pulmon, linfoma, melanoma, cancer de pulmon no microdtico, cancer de ovario, cancer de prostata y a tumores malignos infantiles tales como glioma del tronco encefalico, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, ependimoma, sarcoma de Ewing/familia de tumores, tumor germinal, extracraneal, enfermedad de Hodgkin, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, cancer de Idgado, meduloblastoma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido blando, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales y pineales, tumores malignos poco comunes de la ninez, glioma de la via visual e hipotalamico, tumor de Wilms y otros tumores de rinon infantiles y a tumores malignos menos comunes incluyendo leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda del adulto, linfoma no Hodgkin de adulto, tumor cerebral, cancer cervical, tumores malignos infantiles, sarcoma infantil, leucemia linfodtica cronica, leucemia mieloide cronica, cancer esofagico, leucemia de celulas pilosas, cancer de rinon, cancer hepatico, mieloma multiple, neuroblastoma, cancer oral, cancer pancreatico, linfoma del sistema nervioso central primario, cancer de piel, cancer de pulmon microdtico, cancer de cabeza y cuello, cancer de la vesfcula biliar y de conductos biliares, cancer de estomago, cancer gastrointestinal, sarcoma de Kaposi, carcinoma de celulas uroteliales, carcinoma de la glandula tiroides, carcinoma testicular, cancer vaginal, angiosarcoma, sarcoma de tejido blando, mesotelioma y carcinoma hepatocelular. En particular, el cancer puede ser un cancer metastasico y/o un cancer resistente a (quimio)terapia clasica. La administracion de la composicion de la invencion puede retardar o detener el progreso de la enfermedad o puede conducir a una remision parcial o completa en un ser humano. Lo mas preferiblemente, se trata el cancer pancreatico o de mama, especialmente cancer de mama triple receptor negativo. La preparacion liposomal de la presente invencion puede administrarse en una dosis unitaria de aproximadamente l1 mg/m2 de paclitaxel a aproximadamente 44 mg/m2 de paclitaxel, preferiblemente en una dosis unitaria de aproximadamente 22 mg/m2 de paclitaxel. Preferiblemente, las preparaciones se administran una vez o dos veces a la semana. Las preparaciones liposomales pueden usarse como se describe en las patentes internacionales WO2005/039533, WO 2006/117220 y WO 2007/107305.

Ademas, la preparacion liposomal de la presente invencion puede usarse como una preparacion de diagnostico o cosmetica.

Ademas, la invencion se refiere a una suspension liposomal que comprende un principio activo o compuesto cosmetico en las membranas liposomales, en la que los liposomas encapsulan un medio acuoso de una osmolaridad que es mayor que la osmolaridad del medio acuoso en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado. El medio acuoso de la suspension comprende al menos una sustancia osmoticamente activa. La diferencia entre osmolaridad del medio en el interior del liposoma y en el exterior del liposoma es preferiblemente al menos 10 mOsm, preferiblemente al menos 50 mOsm.

La diferencia de osmolaridad en el interior y en el exterior del liposoma induce un gradiente de presion osmotica que conduce a tension de traccion en la membrana liposomal, tal como se describe en Hallet et al., 1993. De acuerdo con esto, la invencion se refiere a una suspension liposomal que comprende un principio activo o compuesto cosmetico en la membrana liposomal, en la que la membrana liposomal esta bajo tension de traccion.

Los liposomas en los que la membrana liposomal esta bajo tension de traccion pueden obtenerse por aplicacion de gradientes osmoticos como se describio anteriormente.

Pueden aplicarse varios metodos de caracterizacion fisicoqmmica para determinar los gradientes osmolares y la tension de traccion en preparaciones de liposomas. En muchos casos, las disoluciones de componentes osmoticamente activos presentan una densidad mayor que la del agua y la densidad cambia de manera invariable con la concentracion del compuesto. Si la osmolaridad del volumen encapsulado del liposoma es mayor que el del volumen libre, esto afecta a la densidad de liposomas. Para trehalosa a una concentracion de 5 % (150 mOsm) en agua la densidad es aproximadamente 0,02 g/l mayor que la del agua pura (Handbook of Chemistry and Physics, CRC Press, Boca Raton, Florida). Por consiguiente, la diferencia de osmolaridad en el interior y en el exterior del liposoma conduce a una densidad diferente del medio en el interior del volumen liposomalmente encapsulado y el medio en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado.

Asf, es un aspecto mas de la invencion describir suspensiones liposomales, en las que el volumen liposomalmente encapsulado presenta una densidad mayor que el medio en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado. La diferencia en densidad se proporciona por el gradiente osmolar preferido y la densidad de la disolucion del respectivo compuesto osmoticamente activo. La densidad de las partfculas coloidales, tales como liposomas, puede determinarse por ejemplo por metodos de ultracentrifugacion.

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Una realizacion espedficamente preferida de las suspensiones liposomales inventivas que comprende un gradiente osmolar es una suspension liposomal que comprende liposomas que comprenden DOTAP, DOFC y paclitaxel, preferiblemente en una relacion molar de 50:47:3, a una concentracion total de ftpidos de aproximadamente 10 mM, trehalosa y opcionalmente acido cftrico, suspendidos en una fase acuosa que comprende aproximadamente 10 mg/ml, especialmente 9,79 mg/ml de trehalosa y opcionalmente aproximadamente 0,011 mg/ml de acido cftrico, en la que dichos liposomas presentan una densidad anhidra de al menos aproximadamente 1,1 g/ml, especialmente al menos aproximadamente 1,15 g/ml, al menos aproximadamente 1,17 g/ml o al menos aproximadamente 1,17 g/ml. Preferiblemente, dichos liposomas tienen un Zpromedio de aproximadamente 140 nm.

El procedimiento ya descrito permite la preparacion de suspensiones liposomales que comprenden liposomas como se describio anteriormente que se caracterizan ademas por una distribucion de tamano de partfcula controlado, donde la anchura del perfil de distribucion de tamanos no se ensancha sustancialmente por el procedimiento de fabricacion, como se caracteriza por ejemplo, por cambios del mdice de polidispersidad (IP). Preferiblemente, el IP de la suspension liposomal inventiva que comprende un gradiente osmolar no se eleva por mas de 0,2, mas preferiblemente no se eleva por mas que 0,1, por la generacion del gradiente osmolar.

En un aspecto mas de la invencion, el principio activo o compuesto cosmetico solo esta sustancialmente comprendido en el compartimento de membrana de los liposomas en las preparaciones liposomales inventivas. Asf, al menos aproximadamente 98 %, preferiblemente al menos aproximadamente 99 % de la cantidad molar de todo principio activo o compuesto cosmetico presente en la preparacion esta embebido en la fase lipfdica de las membranas liposomales. Solo puede solubilizarse la cantidad restante en la fase acuosa de la preparacion o puede estar presente en forma de principio activo o compuesto cosmetico cristalizado.

Las suspensiones descritas en la presente memoria que pueden obtenerse por el procedimiento descrito son mas estables con respecto a liberacion de farmaco que las suspensiones liposomales convencionales comparables que se preparan sin un gradiente osmotico. La estabilidad temporal con respecto a liberacion de farmaco de los liposomas es mayor y la formulacion es menos susceptible de liberacion de farmaco cuando se somete a tension mecanica y/u otras tensiones. Preferiblemente, la liberacion de farmaco puede ser impedida al menos durante 6 horas, preferiblemente al menos durante 12 horas, al menos durante 24 horas, al menos durante 2 dfas, al menos durante 7 dfas o al menos durante 14 dfas o mas a 25°C, comparado con una suspension sin un gradiente osmotico. La determinacion de la liberacion de farmaco depende del tipo de farmaco. Para liposomas cargados de paclitaxel, la liberacion de farmaco puede ser controlada de manera sensible determinando partfculas de farmaco (cristales) que se forman despues de la liberacion. Las partfculas pueden determinarse, por ejemplo, por mediciones de difraccion de rayos X o tecnicas de dispersion de la luz.

En una realizacion de la invencion, al menos aproximadamente 90 %, preferiblemente al menos aproximadamente 95 %, lo mas preferiblemente 99% de la cantidad de principio activo o compuesto cosmetico solubilizado por las membranas liposomales es mantenido en los liposomas durante al menos aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente y no es liberado a la fase acuosa de las suspensiones. Puesto que la liberacion de principio activo o compuestos cosmeticos lipofilos, que presentan una baja solubilidad en dicha fase acuosa, pueden conducir a formacion de cristal, las suspensiones inventivas no forman sustancialmente cristales en una cantidad correspondiente a mas de aproximadamente 10%, preferiblemente mas de aproximadamente 5%, lo mas preferiblemente mas de aproximadamente 1 % del material solubilizado en 24 horas a 25°C.

Tambien, las suspensiones liposomales inventivas obtenidas por rehidratacion de una composicion liposomal deshidratada, como se describio anteriormente, no forman agregados durante un periodo de al menos aproximadamente 24 horas a 25 °C. La formacion de agregados puede determinarse midiendo cambios en el Zpromedio e IP por espectroso^a de correlacion fotonica (PCS, por sus siglas en ingles). Las suspensiones inventivas se caracterizan por cambios del Zpromedio por no mas de un factor de aproximadamente 1,5, preferiblemente no mayor que 1,25 y cambios del valor del IP por no mas de un factor de aproximadamente 2, preferiblemente no mayor que aproximadamente 1,5, lo mas preferiblemente no mayor que aproximadamente 1,25 durante 24 horas. Preferiblemente, las suspensiones liposomales con estas propiedades proceden de la rehidratacion de una composicion liposomal deshidratada.

Puesto que los disolventes organicos se usan con frecuencia en la preparacion de liposomas, por ejemplo, como se describio anteriormente para el metodo de inyeccion de etanol, se encuentra normalmente disolvente organico residual, tal como etanol, en el producto liposomal deshidratado y, de acuerdo con esto, en la suspension liposomal rehidratada procedente de ahT Este es especialmente el caso para preparaciones liposomales que han sido deshidratadas por secado por congelacion (liofilizacion). Sin embargo, es deseable para producto liposomal usado para aplicacion a seres humanos comprender tan poco disolvente organico como sea posible. La presente invencion permite la deshidratacion por secado por pulverizacion, que facilita la eliminacion de la mayona o todo el disolvente organico residual, mientras se obtienen liposomas con una alta estabilidad. De acuerdo con esto, es otro aspecto de la invencion, describir preparaciones liposomales deshidratadas, como se describio anteriormente, que comprenden aproximadamente menos de 1 % p/p, mas preferiblemente aproximadamente menos de 0,5 % p/p, lo mas preferiblemente aproximadamente menos de 0,1 % p/p de disolvente organico basado en el peso total de la preparacion deshidratada. Por rehidratacion de estas preparaciones liposomales deshidratadas, se obtienen suspensiones liposomales, que comprenden aproximadamente menos de 1 mg/ml, mas preferiblemente

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aproximadamente menos de 0,5 mg/ml, lo mas preferiblemente aproximadamente menos de 0,1 mg/ml de disolvente organico. Preferiblemente, el disolvente organico es etanol.

Ademas, las suspensiones liposomales inventivas, que se obtienen por rehidratacion de una composicion liposomal deshidratada como se describio anteriormente, presentan un perfil de distribucion de tamano muy similar comparado con las suspensiones liposomales originales que fueron deshidratadas como se describio anteriormente. Mas espedficamente, se mantiene bien el tamano de los liposomas y no se encuentra una formacion significativa de agregados lipfdicos cuando se determina a partir de medicion de PCS. En una realizacion de la invencion, la suspension liposomal sometida a deshidratacion y la suspension liposomal obtenida por rehidratacion como se describio anteriormente se caracterizan por un Zpromedio que difiere por menos de un factor de 1,5 y un valor de IP que difiere por menos de un factor de dos (de mediciones de PCS). El IP de la suspension liposomal rehidratada 1 hora despues de reconstitucion es preferiblemente menor que 0,4, mas preferiblemente menor que 0,3, lo mas preferiblemente menor que 0,25. Preferiblemente, el IP de dichas suspensiones solo cambia ligeramente durante 24 horas a 25°C, como se describio anteriormente.

En una realizacion especial, la invencion se refiere a una suspension liposomal acuosa rehidratada que comprende liposomas cationicos que comprenden hasta aproximadamente 5 % en moles, preferiblemente hasta aproximadamente 3 % en moles de paclitaxel en las membranas liposomales, en la que el IP de la suspension liposomal 1 hora despues de reconstitucion es menor que 0,4, mas preferiblemente menor que 0,3, lo mas preferiblemente menor que 0,25 y ademas se caracteriza por cambios del Zpromedio por no mas de un factor de aproximadamente 1,5, preferiblemente no mayor que 1,25 y cambios en el valor del IP por no mas que un factor de aproximadamente 2, preferiblemente no mayor que aproximadamente 1,5, lo mas preferiblemente no mayor que aproximadamente 1,25 durante 24 horas a 25°C.

Preferiblemente, los liposomas de la suspension liposomal rehidratada descrita anteriormente no liberan mas de aproximadamente 2% en peso, preferiblemente no mas de aproximadamente 1% en peso, de paclitaxel (basado en el peso total de paclitaxel) de las membranas liposomales en el medio acuoso en 24 horas a 25°C.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Cantidad de paclitaxel solubilizado por preparaciones de liposomas con una concentracion lipfdica de 10 mM y una concentracion total de trehalosa de 10 % (p/p). Los liposomas fueron obtenidos de formulaciones de precursor concentradas por dilucion con agua. La abscisa muestra la concentracion inicial, es decir, los datos en trehalosa al 10% fueron obtenidos a partir de una suspension que no fue diluida y los datos en trehalosa al 40% fueron obtenidos a partir de una suspension no diluida que era originalmente 40% (p/p) en trehalosa y 40 mM en lfpido y que fue diluida 1+3 con agua.

Figura 2: Tasa de recuento de liposomas DOTAP/DOFC 10 mM obtenido de una formulacion concentrada de lfpido 30 mM en 30% (p/p) de trehalosa. La disolucion fue diluida con mezclas de agua/trehalosa para diferente concentracion total de trehalosa entre 30% y 10 % (p/p). Todas las formulaciones tuvieron la misma concentracion final de lfpidos de 10 mM, pero el gradiente de concentracion de trehalosa entre fase acuosa encapsulada y libre fue como se indica mediante el eje x.

Ejemplos

Carga de paclitaxel a liposomas con diferentes gradientes de trehalosa Sumario

Se investigo el efecto de los gradientes osmolares sobre el reparto de paclitaxel en los liposomas en equilibrio con una fase acuosa saturada. Se produjeron liposomas con diferentes gradientes osmolares y se incubaron para cristales de paclitaxel. Todas las formulaciones tuvieron la misma composicion; mas precisamente, la concentracion de lfpidos y la concentracion de trehalosa fueron Cnpid0= 10 mM y Ctrehalosa = 10% (p/p). Algunas de las formulaciones se prepararon y se extruyeron a mayor concentracion de lfquidos y trehalosa y se diluyeron con agua despues de extrusion a la concentracion final. De esta manera, se diluyo la fase acuosa libre, pero no se diluyo la fase acuosa encapsulada (despreciandose los efectos de hinchamiento e intercambio de soluto por los defectos). Se establecio un gradiente osmolar entre la fase acuosa encapsulada y la libre, que aumento al aumentar la dilucion. Se incubaron los liposomas asf formados con paclitaxel seco y se determino la cantidad de paclitaxel que era solubilizada por los liposomas. Se encontro un incremento invariable de paclitaxel solubilizado con dilucion creciente (gradiente de concentracion). Los resultados indican que la cantidad de paclitaxel que se reparte en la membrana de liposomas en equilibrio aumenta con el aumento de gradiente osmolar.

Materiales

Paclitaxel, Lote 06/150

Cedarburg Pharmaceuticals

DOTAP, Lote MBA 113

Merck Eprova

DOFC, Lote G181 PC49

Avanti Polar Lipids

Agua, Milli-Q -Smtesis

Millipore

Trehalosa-Dihidratada, altamente pura

Senn Chemicals

Cloroformo, p.a.

Merck

Acetonitrilo, grado HPLC (ACN)

Merck

Tetrahidrofurano, grado HPLC (THF)

Merck

Acetato de amonio, p.a.

Merck

Acido trifluoroacetico, p.a.

Merck

Filtro de jeringa minisart

Sartorius

Tamano de poro 0,2 pm, diametro 25 mm

Membrana: Acetato de celulosa

HPLC System 1100

Agilent

Desgasificador (G1379A)

Bomba binaria (G1312A)

Automuestreador termostatizado (Autoinjektor G1329A, Thermostat G1330B)

Compartimento de columna termostatizado (G1316A)

Detector de red de diodos (G1315B) o detector de longitud de onda variable (G1314A)

ChemStation para LC 3D, Rev. A.09.01

Extrusora, 10 ml

Northern Lipids

Zetasizer 3000

Malvern Instruments

Metodos

Preparacion de liposomas vados

Las formulaciones de DOTAP/DOFC (relacion 1:1) o formulaciones que comprenden solo DOTAP o DOFC, se 5 prepararon por el metodo de pelfcula. Se pesaron las cantidades requeridas de l^pidos en un matraz redondo y se disolvieron en cloroformo. Se evaporo el disolvente a sequedad en un evaporador rotatorio (Heidolph, Alemania) a una presion de aproximadamente 15 kPa (150 mbar) a una temperatura de aproximadamente 40°C durante aproximadamente 15 minutos. Se seco la pelfcula a 1 kPa (10 mbar) durante 60 minutos y se hidrato con posterioridad en una disolucion de trehalosa en agua agitando suavemente el matraz. Se eligieron cantidades de 10 kpidos, concentracion de trehalosa y volumen de disolucion de trehalosa para dar como resultado suspensiones

comprendiendo concentraciones de lfpidos entre 10 mM y 40 mM y concentraciones de trehalosa entre 9,8% y 39,2% (p/v) para formulaciones de DOTAP/DOFC y concentracion de lfpido entre 10 mM y 30 mM y concentraciones

de trehalosa entre 9,8% y 29,4% (p/v) para DOTAP o DOFC solo formulaciones. Las suspensiones resultantes de liposomas multilaminares se extruyeron cinco veces por una membrana de policarbonato de un tamano de poro de 200 nm a una presion de aproximadamente 500 kPa (5 bar). Despues de extrusion, se diluyeron las suspensiones con agua para proporcionar suspensiones con concentraciones de lfpido de 10 mM y una concentracion total de 5 trehalosa de 9,8% (p/v).

Carga de paclitaxel

Se anadieron 5 ml de las suspensiones comprendiendo liposomas vados preparadas como se describio anteriormente a 2,6 mg de paclitaxel seco (que corresponde a una concentracion teorica de paclitaxel de 600 jM) en tubos Falcon de 15 ml. Se agitaron los lotes durante 1 h a temperatura ambiente (agitador magnetico).

10 Despues de agitacion, no se separo paclitaxel ligado liposomal por filtracion de 2 ml de cada lote por un filtro de jeringa (Sartorius minisart, 0,2 jm, membrana de acetato de celulosa). Se analizo con posterioridad la concentracion de paclitaxel y lfpidos en los lfquidos filtrados resultantes por HPLC.

Metodos analfticos

Determinacion de contenido de paclitaxel

15 Se diluyeron muestras en ACN/THF/acetato de amonio 2 mM 48/18/34 (v/v/v).

Fase estacionaria:

LiChroCART® 250-4; LiChrospher 60, RP-select B longitud 250 mm, DI: 4 mm, tamano de partfcula 5 jm

Fase movil:

ACN/THF/acetato de amonio 2 mM 32/12/56 (v/v/v)

Caudal:

1 ml/min

Temperatura compartimento de columna:

35°C

Longitud de onda del detector:

229 nm

Volumen inyectado:

10 jl

Tiempo de funcionamiento:

40 min

Determinacion de contenido en lfpidos

El contenido en lfpidos de los lotes antes y despues de filtracion fue analizado por HPLC para controlar una perdida potencial de material liposomal por el procedimiento de filtracion. Se diluyeron las muestras en ACN/agua 50/50.

Fase estacionaria:

Phenomenex Luna 5 j C8(2) 100 A, 150 mm x 2 mm

Fase movil:

Acetonitrilo con TFA al 0,1%, agua con TFA al 0,1%

20

Determinacion de lfpidos del gradiente;

tiempo (min)

ACN (%)

0

50

4,12

50

7,06

75

14,13

100

tiempo (min)

ACN (%)

21,20

100

23,56

50

30,00

50

Caudal:

0,4 ml/min

Temperatura compartimento de columna:

45°C

Longitud de onda del detector:

205 nm

Volumen inyectado:

5 Ml

Tiempo de funcionamiento:

30 min

Resultados

5 Formulaciones de DOTAP/DOFC

En la figura 1 se muestra la cantidad de paclitaxel que se solubilizo por incubacion con diferentes formulaciones de liposomas DOTAP/DOFC. Todas las formulaciones conteman la misma cantidad de Kpido (liposomas) y trehalosa. Se obtuvieron de diferentes formulaciones mas concentradas por dilucion con agua. Excepto de la concentracion absoluta, todas las formulaciones originales fueron equivalentes y se trataron de la misma manera. La abscisa 10 proporciona la concentracion de trehalosa inicial, antes de dilucion. Debido a que en todos los casos la concentracion final de trehalosa total fue 10%, el gradiente de trehalosa aumenta con valores crecientes de la abscisa. Como puede observarse, la cantidad de paclitaxel que fue solubilizada por los liposomas aumento de manera invariable con el gradiente de trehalosa (dilucion). La capacidad de carga de los liposomas aumento con el gradiente creciente de trehalosa.

15 Formulaciones de DOTAP y DOFC

La siguiente tabla muestra la cantidad de paclitaxel solubilizada por formulaciones de liposomas de DOTAP y DOFC (componentes unicos) dependiendo de la concentracion inicial de trehalosa usada para la preparacion:

Tabla 1: Formulaciones de DOTAP y DOFC

C0 trehalosa (%)

Concentracion de paclitaxel (mM)

DOTAP

DOFC

9,8

163 159

12,3

192 167

14,7

225 192

17,2

297 224

19,6

289 217

24,5

297 289

5

10

15

20

25

30

35

40

C0 trehalosa (%)

Concentracion de paclitaxel (pM)

DOTAP

DOFC

29,4

339 221

Tambien para los liposomas de l^pido puro se observo una clara de tendencia en la capacidad de solubilizacion del gradiente de trehalosa. Para formulaciones de DOTAP, se observo un incremento de la capacidad de carga de paclitaxel con una diferencia de concentracion de trehalosa creciente en el interior y en el exterior del liposoma comparable con los resultados para formulaciones de DOPTAF/DOFC. El efecto fue menos pronunciado para liposomas consistiendo en 100% DOFC.

2. Carga de paclitaxel para liposomas con diferentes gradientes de trehalosa despues de secado por pulverizacion

2.1 Sumario

El objetivo de este ejemplo fue ensayar si habfa el efecto positivo del gradiente osmotico sobre la carga de paclitaxel para los liposomas si los liposomas eran secados por pulverizacion entre la formacion y el ajuste del gradiente de trehalosa. Se prepararon liposomas de DOTAP/DOFC en dos concentraciones diferentes, es decir, lfpido 10 mM en disolucion de trehalosa al 10% (p/p) y lfpido 20 mM en disolucion de trehalosa al 20% (p/p). Las dos formulaciones fueron secadas por pulverizacion a la respectiva concentracion. Los polvos secados por pulverizacion fueron reconstituidos ambos con agua a una concentracion de lfpido de 10 mM y una correspondiente concentracion de trehalosa de 10% (p/p). Las formulaciones lfquidas fueron expuestas a paclitaxel como se describio anteriormente y se determino la cantidad de paclitaxel solubilizada. Se encontro que la formulacion que era secada por pulverizacion a partir de la doble formulacion de estado concentrado (lfpido 20 mM / trehalosa al 20% (p/p)) solubilizo mas paclitaxel que la que se seco por pulverizacion del estado concentrado unico (lipido 10 mM, trehalosa al 10 % p/p).

Los resultados indican que la distribucion de trehalosa en el interior/exterior de los liposomas no se vio afectada por el secado por pulverizacion en las condiciones seleccionadas. Despues de la reconstitucion del doble producto concentrado anteriormente, se obtuvieron liposomas con un gradiente de concentracion de trehalosa, correspondiendo al efecto de dilucion directa de la formulacion lfquida.

2.2 Metodos Formacion de liposomas

Las formulaciones fueron preparadas por inyeccion de etanol. Se inyectaron las cantidades apropiadas de disolucion de lfpidos en etanol (DOTAP-Cl 200 mM, DOFC 188 mM) con agitacion en una disolucion de trehalosa en agua. La concentracion de trehalosa fue 20% (p/p) para los liposomas 20 mM y 10 % (p/p) para los liposomas 10 mM. La cantidad requerida de disolucion de lfpidos en etanol fue aproximadamente 2,5 ml/l para la formulacion 10 mM y 5 ml para la formulacion 20 mM.

Se extruyeron las formulaciones de liposomas polidispersas resultantes cinco veces a traves de membranas de policarbonato de tamano de poro de 200 nm a una presion de aproximadamente 500 kPa (5 bar).

Secado por pulverizacion

Se realizo secado por pulverizacion con un secador por pulverizacion Niro SD micro usando una boquilla de dos fluidos. Las condiciones de pulverizacion fueron como sigue: Temperatura de salida = 100°C, temperatura de entrada = 145°C, caudal= 340 g/h, velocidad del gas del atomizador 2,3 kg/h, velocidad del gas de secado 30 kg/h.

Reconstitucion

Los polvos secos, ambos de la formulacion previamente 10 mM y la formulacion previamente 20 mM, fueron reconstituidos con agua a la concentracion de lfpidos de 10 mM.

Prueba de carga de paclitaxel

Se realizo carga de paclitaxel a los liposomas como se describe en

2.3 Resultados

Se muestran los resultados como se obtuvieron a partir de la carga de paclitaxel para los polvos reconstituidos en la tabla 2. Como puede observarse, la formulacion que fue secada por pulverizacion a una concentracion de lfpidos 20

5

10

15

20

25

30

35

mM solubilizo mucho mas paclitaxel que la formulacion con la concentracion inicial de Ifpidos de 10 mM. Se concluyo que la elevada carga de paclitaxel para la formulacion 20 mM anterior era debida a un gradiente osmolar entre la fase acuosa encapsulada y libre, que no estaba presente en la formulacion 10 mM anterior. El secado por pulverizacion y la reconstitucion del polvo seco no condujo a equilibracion de trehalosa entre la fase acuosa interior y la exterior y, por lo tanto, la osmolaridad de la fase acuosa encapsulada fue mayor en el caso de la formulacion 20 mM anterior.

Tabla 2: Solubilizacion de paclitaxel por formulaciones obtenidas por reconstitucion de polvos secados por pulverizacion. La concentracion de lfpidos y trehalosa fue identica en ambos casos (lfpido 10 mM, trehalosa al 10% p/p), pero antes de secar por pulverizacion una formulacion fue lfpido 10 mM, trehalosa al 10% y la otra formulacion fue lfpido 20 mM, trehalosa al 20%.

Concentracion inicial de lfpidos de la formulacion

Concentracion de paclitaxel solubilizado

10 mM (PD_L_07030)

164 (pM)

20 mM (PD_L_07031)

340 (pM)

3. Estabilidad de los liposomas cargados

3.1 Sumario

Para evaluar la cuestion, si las preparaciones de liposomas con un gradiente de trehalosa interior/exterior no presentaban solo una mayor capacidad de carga, sino tambien una mayor estabilidad con respecto a la liberacion de paclitaxel, la liberacion de paclitaxel de los liposomas fue seguida como una funcion del tiempo. Se prepararon formulaciones con una fraccion de paclitaxel relativamente alta, es decir 5% en moles y con diferentes gradientes de trehalosa entre 0 % y 20 % (p/p). Los liposomas que comprendfan un gradiente de trehalosa no mostraron liberacion de paclitaxel sustancial dentro del periodo ensayado de 21 dfas, mientras que en los liposomas sin un gradiente de trehalosa, la fraccion retenida de paclitaxel disminuyo a menos de 1%.

3.2 Metodo

Formulaciones de DOTAP/DOFC

Se prepararon liposomas DOTAP/DOFC que comprendfan aproximadamente 5% en moles de paclitaxel (para valores exactos vease la tabla), 10 a 30 mM de lfpidos y 9,8% a 29,4% (p/v) de trehalosa segun el metodo de pelfcula descrito anteriormente por adicion de la cantidad perspectiva de lfpidos y paclitaxel a la disolucion de cloroformo. Con posterioridad, se diluyeron los lotes 30 mM a una concentracion de lfpidos de 10 mM (concentracion de trehalosa total 9,8% p/v) con agua.

Se almacenaron las muestras a 4°C y se determino el contenido en paclitaxel de los liposomas despues de 0, 1, 5, 14 y 21 dfas por el metodo descrito anteriormente usando filtracion y analisis por HPLC.

3.3 Resultados

Los resultados se resumen en la Tabla 3. Se muestra la concentracion de paclitaxel (pm) retenido en los liposomas. La concentracion de lfpidos fue 10 mM, por lo tanto, la concentracion de paclitaxel de 100 pM corresponde a una concentracion molar con respecto a lfpido de 1 %.

En la formulacion sin gradiente de trehalosa, la fraccion de trehalosa retenida decayo invariablemente a un valor menor que 100 pM (menor que 1 % en moles con respecto a lfpido) despues de 21 dfas. Por el contrario, con gradiente de trehalosa el paclitaxel retenido no cayo por debajo de 400 pM. No se observo decaimiento invariable en ese caso, en otras palabras, parece que el valor de aproximadamente 400 pM representa un estado ffsicamente estable de paclitaxel en los liposomas.

5

10

15

20

25

30

Tabla 3: Retencion de paclitaxel en liposomas de DOTAP/DOFC.

gradiente de concentracion de trehalosa

0 10% 20%

Paclitaxel liposomalmente retenido (jM)

antes de filtracion

470 444 425

t (d) despues de filtracion

0

453 446 411

1

438 428 407

5

391 429 420

14

90 427 412

21

79 409 400

Las fracciones finales de paclitaxel retenido son similares a los valores como se obtienen a partir de la prueba de carga para liposomas tratados de manera equivalente. Por lo tanto, los datos de la prueba de carga pueden ser considerados como predictivos para el lfmite de estabilidad de liposomas cargados. Si no tienen lugar otros efectos, las cifras de la prueba de carga proporcionaran informacion acerca de la cantidad de paclitaxel que es retenido por los liposomas en las condiciones dadas. Como una conclusion adicional de los presentes ejemplos, parece que el gradiente de trehalosa y la estabilidad mejorada se mantiene completamente durante varios dfas. En el caso presente, el efecto se mantuvo durante 21 dfas.

4. Metodos para la determinacion de gradientes de trehalosa en preparaciones de liposomas in situ

4.1 Sumario

Se prepararon formulaciones concentradas de liposomas en trehalosa a una concentracion ci y se diluyeron con agua o con disolucion de trehalosa en diferentes relaciones para obtener medios con concentracion c2 de trehalosa, donde c2 ^ ci. Todas las formulaciones teman la misma concentracion final de lfpidos de 10 mM. Se analizaron las formulaciones basandose en cambios locales de propiedades opticas (mdice de refraccion). Se usaron tasas de recuento de mediciones de dispersion de luz dinamica para demostrar los cambios de dispersion de intensidad. Con el incremento del gradiente de trehalosa, ci-c2, la tasa de recuento de mediciones de dispersion de luz dinamica (PCS) aumentaron de manera invariable.

4.2 Metodo

Se midio la dispersion de luz dinamica con un goniometro BI-200SM de Brookhaven Instruments (Holtsville USA). Se realizaron mediciones con un laser de 30 mW de una longitud de onda de 641 nm a un angulo de 90°. Para el analisis de los datos se realizo transformacion de Laplace inversa con tecnicas de regularizacion optimizada.

4.3 Muestras

Se prepararon liposomas de DOTAP/DOFC (relacion molar 1:1) con una concentracion total de lfpidos de 30 mM en una disolucion de trehalosa al 30%. Se extruyo la preparacion de liposomas de lfpido 30 mM, trehalosa al 30% a traves de 200 membranas de extrusion. Con posterioridad, se diluyeron los liposomas con agua, disolucion de trehalosa al 30% o mezclas de las mismas en relaciones como se indica en la tabla.

A: liposomas 30 mM en trehalosa al 30%

B: trehalosa al 30% en agua

C: Agua

Tabla 4: Protocolo de dilucion para formulaciones de ffpido 10 mM en una fase acuosa con trehalosa a concentraciones entre 10 % y 30 % (p/p)

#

Vol. A Vol. B Vol. C Composicion final

1

1

2 - liposomas 10 mM en trehalosa al 30%

2

1 1,5 0,5 liposomas 10 mM en trehalosa al 25%

3

1 1 1 liposomas 10 mM en trehalosa al 20%

4

1 0,5 1,5 liposomas 10 mM en trehalosa al 15%

5

1 - 2 liposomas 10 mM en trehalosa al 10%

La concentracion de ffpidos en la preparacion final fue siempre 10 mM, pero la concentracion total de trehalosa vario 5 entre 10% (dilucion con agua) y 30% (dilucion con disolucion de trehalosa al 30%). Con la concentracion inicial de trehalosa de 30%, esto dio como resultado un gradiente numerico de concentracion de trehalosa entre 0% (concentracion total = 30%) y 20 % (concentracion total =10%). Una hora despues de la dilucion, se realizo medicion de dispersion de luz dinamica.

4.4 Resultados

10 La Figura 2 muestra los resultados de las mediciones de dispersion de luz dinamica. La tasa de recuento se proporciona como una funcion del gradiente de trehalosa. La tasa de recuento aumento invariablemente con el gradiente de trehalosa creciente. Esto puede correlacionarse con el aumento de gradiente de mdice de refraccion y los efectos de hinchamiento sobre el gradiente de trehalosa creciente. Se sabe que los liposomas pueden actuar como osmometros ideales y pueden determinarse gradientes osmolares a partir de propiedades de dispersion de la 15 luz y de absorcion de la luz en condiciones adecuadas (de Gier 1993; Cabral, Hennies et al. 2003). Ademas, la intensidad de la dispersion de luz cuasielastica, tambien pueden usarse otras tecnicas de dispersion de la luz, asf como mediciones de absorcion y turbidimetna. Las presentes observaciones indican que analizar la tasa de recuento en mediciones de dispersion de la luz dinamica puede usarse como una herramienta para controlar el exito de la formacion de gradiente de trehalosa para una formulacion determinada. Ademas, los datos confirman que el cambio 20 de la osmolaridad del medio acuoso de una suspension liposomal proporciona las propiedades ffsicas de los liposomas.

5. Influencia de un gradiente de trehalosa sobre la estabilidad ffsica de formulaciones ffquidas de liposomas de DOTAP/DOFC de paclitaxel

5.1 Sumario

25 En este ejemplo, se investigo ademas el efecto estabilizador de gradientes de trehalosa sobre formulaciones de liposomas de DOTAP/DOFC de paclitaxel como se muestra por el Ejemplo 3. Se prepararon liposomas a una concentracion de 30 mM (en disolucion de trehalosa al 32 % p/p), diluida con diferentes disoluciones de trehalosa/agua y se determino la liberacion de paclitaxel despues de tension mecanica.

Se encontro que la estabilidad ffsica aumentaba con el aumento del gradiente de trehalosa. Los hallazgos 30 confirmaron el efecto estabilizador de los gradientes de trehalosa sobre paclitaxel comprendiendo liposomas tambien para tratamiento a escala piloto.

5.2 Metodos y materiales Fabricacion de liposomas

Se produjeron liposomas por la tecnica de inyeccion de etanol. Brevemente, se inyecto una disolucion de DOTAP 35 200 mM y DOFC 188 mM (concentracion total de ffpidos 388 mM) con agitacion a una temperatura de 2-8°C en la

fase acuosa (8,11 ml de disolucion de ffpidos en etanol para 100 ml de fase acuosa) para proporcionar liposomas polidispersos con una concentracion de ffpidos de aproximadamente 30 mM. Para la fase acuosa se selecciono una disolucion de trehalosa dihidratada al 32,1 % p/p con acido citrico 184,5 pM.

Se realizo extrusion como se indica a una presion de 300 kPa (3 bar) con membranas de policarbonato de 220 nm 40 de tamano de poro. Se realizo filtracion esteril como se indica usando filtros esteriles milipak 20 o membranas durapore (Millipore, Molsheim, Francia).

Gradientes de concentracion

Se diluyeron con agua las formulaciones de liposomas 30 mM iniciales en disolucion de trehalosa al 30 % (p/p) (PD- L-09111) a diferentes concentraciones finales de lfpidos y trehalosa.

Tabla 5: Dilucion de muestras ensayadas

Nombre

PD-L-09111 (ml) Agua (ml) Clipido (mM) C trehalosa (% p/p) Ac trehalosa (% p/p)

PD-L-09111

100 0 30 30 0

PD-L-09112

70 70 15 15 15

PD-L-09113

90 54 18,8 18,8 11,2

PD-L-09114

100 0 30 30 0

PD-L-09115

80 64 16,7 16,7 13,3

PD-L-09116

100 40 21,4 21,4 8,6

PD-L-09119

100 24 25 25 5

5

Ensayo de estabilidad

Se pusieron las muestras en un agitador y se agitaron a 16 rad/s (150 rpm) a 25°C o a 2-8°C, respectivamente. Despues de 24 y 48 horas, se analizaron las muestras y se determino la cantidad de paclitaxel retenida en los liposomas.

10 Determinacion de retencion/liberacion de paclitaxel en las preparaciones de liposomas

Se investigo la retencion de paclitaxel en liposomas por filtracion de las preparaciones de liposomas para retirar cristales de paclitaxel del producto liposomal (como se describe en el Ejemplo 3). Se cuantifico el paclitaxel restante por analisis HPLC. Adicionalmente, se uso microscopfa optica para investigar en las muestras cristales de paclitaxel.

5.3 Resultados

15 Los resultados se proporcionan en las Tablas 6-12. Por simplicidad, la concentracion inicial de trehalosa se aproxima como 30% (p/p). Los gradientes de concentracion como se representan se calculan de la concentracion inicial de trehalosa y el factor de dilucion. Los gradientes de concentracion reales entre la fase acuosa encapsulada y libre tendran la misma tendencia, pero los valores absolutos pueden diferir ligeramente de los proporcionados en las tablas.

20 Como puede observarse, la estabilidad aumenta al aumentar el gradiente de trehalosa. La cantidad de paclitaxel liposomalmente retenido aumenta y se observan menos cristales de paclitaxel. La estabilidad es mayor a 5 °C comparado con 25 °C.

Tabla 6: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 0%

Numero de partfculas

Temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

> 1 |jM

> 1 jM > 25 jM

PD-L-09111

30 0 5 24 <5 No

PD-L-09111

30 0 5 24 8 Sf

PD-L-09111

30 0 5 48 8 Sf

PD-L-09111

30 0 5 48 19 Sf

Numero de partfculas

Temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

> 1 |jM

> 1 jM > 25 jM

PD-L-09111

30 0 25 24 86 Sf

PD-L-09111

30 0 25 24 86 S^

PD-L-09111

30 0 25 48 85 S^

PD-L-09111

30 0 25 48 85 Sf

Tabla 7: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 5%

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% P/P) Temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

PD-L- 09119

25 5 5 24 <5 No

PD-L- 09119

25 5 5 24 <5 No

PD-L- 09119

25 5 5 48 <5 No

PD-L- 09119

25 5 5 48 <5 No

PD-L- 09119

25 5 25 24 29 Sf

PD-L- 09119

25 5 25 24 44 Sf

PD-L- 09119

25 5 25 48 70 Sf

PD-L- 09119

25 5 25 48 69 Sf

Tabla 8: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 8,6%

Muestra

Clipido (mM) ACtre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

PD-L- 09116

21,4 8,6 5 24 <5 No

PD-L- 09116

21,4 8,6 5 24 <5 No

PD-L- 09116

21,4 8,6 5 48 <5 No

Muestra

Clipido (mM) ACtre (% P/P) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopia

PD-L- 09116

21,4 8,6 5 48 <5 No

PD-L- 09116

21,4 8,6 40 24 <5 No

PD-L- 09116

21,4 8,6 40 24 <5 No

PD-L- 09116

21,4 8,6 40 48 <5 Si

PD-L- 09116

21,4 8,6 40 48 <5 Si

Tabla 9: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 11,2%

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopia

PD-L- 09113

18,8 11,2 5 24 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 5 24 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 5 48 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 5 48 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 40 24 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 40 24 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 40 48 <5 No

PD-L- 09113

18,8 11,2 40 48 <5 No

Tabla 10: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 13,3%

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopia

PD-L-09115

16,7 13,3 5 24 <5 No

PD-L-09115

16,7 13,3 5 24 <5 No

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

PD-L-09115

16,7 13,3 5 48 <5 No

PD-L-09115

16,7 13,3 5 48 <5 No

PD-L-09115

16,7 13,3 40 24 <5 No

PD-L-09115

16,7 13,3 40 24 <5 No

PD-L-09115

16,7 13,3 40 48 <5 No

PD-L-09115

16,7 13,3 40 48 <5 No

Tabla 11: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 13,3%

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

PD-L- 09115

16,7 13,3 5 24 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 5 24 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 5 48 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 5 48 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 40 24 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 40 24 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 40 48 <5 No

PD-L- 09115

16,7 13,3 40 48 <5 No

Tabla 12: Estabilidad a gradiente de trehalosa al 15%

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

PD-L- 09112

15 15 5 24 <5 No

5

10

15

20

25

30

Muestra

Clipido (mM) A Ctre (% p/p) temp (°C) tiempo (h) Perdida PXL en filtracion (%) Cristales en microscopfa

PD-L- 09112

15 15 5 24 <5 No

PD-L- 09112

15 15 5 48 <5 No

PD-L- 09112

15 15 5 48 <5 No

PD-L- 09112

15 15 40 24 <5 No

PD-L- 09112

15 15 40 24 <5 No

PD-L- 09112

15 15 40 48 <5 No

PD-L- 09112

15 15 40 48 <5 No

6. Estabilidad de liposomas cargados de paclitaxel secados por pulverizacion

6.1. Metodos y materiales

Se usaron materiales como se describio en los ejemplos previos.

Se formaron liposomas que consistfan en DOTAP, DOFC y paclitaxel (relacion molar 50/47/3) por las tecnicas de inyeccion de etanol como se describio anteriormente. Se solubilizo el paclitaxel con los Kpidos en la disolucion de etanol. Se prepararon liposomas a una concentracion de lfpido 20 mM en trehalosa al 20% p/p (lote PD-L-09031) y Kpido 10 mM en trehalosa al 10% (lotes MDG09.108-08-001 y PD-L-09032). Se extruyeron los liposomas cinco veces a traves de membranas de policarbonato de 200 nm de tamano de poro y se filtraron esteriles como se describio anteriormente.

Despues de la preparacion de las suspensiones liposomales, se deshidrataron los liposomas. Se secaron por pulverizacion los lotes PD-L-09031 y PD-L-09031 en un secador de pulverizacion Niro SD-Micro con parametros de secado por pulverizacion como se describio en el Ejemplo 2.

Se deshidrato el lote MDG09.108-08-001 por secado por congelacion, usando una unidad de secado por congelacion Epsilon 2-12D (Christ). La suspension liposomal se mantuvo a 4°C durante 1 hora y se congelo a -40°C durante aproximadamente 5 horas. Despues de congelacion, se aumento la temperatura a -16°C y se realizo secado primario a una presion de 10 kPa (0,1 bar) durante 90 horas. Para un secado secundario, se aumento la temperatura a 20°C, mientras se reducfa la presion a 1 kPa (0,01 bar).

Se reconstituyeron los polvos secos con agua a una concentracion de lfpido de 10 mM en trehalosa al 10,5 % (p/p). Se investigaron los productos liposomales lfquidos resultantes una hora despues de la reconstitucion y 24 horas despues de la reconstitucion con mediciones de dispersion de la luz dinamica usando un Malvern Zetasizer 1000HSA, Serie DTS5101 (Ajustes: Analisis = monomodal, Dilatacion = 1,2; Orden de ajuste = 3; Seleccion de punto primera = 18; Seleccion de punto ultima = Por numero 22; Ponderacion puntual =cuadratica; Atenuador = x16; Viscosidad 1,2 Pa.s (1.200 cp); fndice de refraccion = 1,348; Numero de mediciones= 3; Retardo entre mediciones= 0; Duracion de la medicion = Auto) para determinar Zprom e IP. Antes de la medicion se diluyeron las muestras diez veces con disolucion de trehalosa deshidratada al 10,5 % (p/p).

6.2 Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Los hallazgos para la formulacion que se seco por pulverizacion a la misma concentracion de lfpido y trehalosa que en el producto rehidratado fueron sustancialmente diferentes de los resultados para el producto que habfa sido pulverizado de alimentacion lfquida doble concentrada y habfa sido generado un gradiente de trehalosa en la

5

10

15

20

25

30

rehidratacion. La formulacion sin gradiente de concentracion mostro valores significativamente mayores de Zprom e IP y aumentaron en 24 horas despues de la reconstitucion, mientras que la formulacion con gradiente de concentracion no mostro dicho incremento. Se considera que el incremento en Zprom e IP esta relacionado con la liberacion de paclitaxel de la formulacion sin gradiente de concentracion, que era menos estable. Los datos estan de acuerdo con los resultados del Ejemplo 2, donde podfa cargarse mas paclitaxel a los liposomas que habfan sido obtenidos despues de secado por pulverizacion a doble concentracion y posterior generacion de un gradiente de trehalosa. El secado por pulverizacion de las formulaciones de liposomas de paclitaxel a mayores concentraciones de trehalosa y posterior generacion de un gradiente de trehalosa mejora la estabilidad de la formulacion despues de la reconstitucion.

En comparacion con las muestras secadas por pulverizacion, la formulacion secada por congelacion mostro un IP mucho mayor ya despues de la reconstitucion.

Tabla 13: Comparacion de metodos de deshidratacion y rehidratacion

Lote

ACtrehalosa 1 h 24 h

Zprom (nm)

IP Zprom (nm) IP

MDG09.108-08-001

0% 170,3 0,480 175,4 0,493

PD-L-09032

0% 167 0,331 260 0,65

PD-L-09031

10% 160,8 0,203 160,5 0,199

7. Fabricacion a gran escala y secado por pulverizacion

7.1 Material

7.1.1 Materiales basicos

• Paclitaxel Semisintetico API USP, Phyton Biotech, Lote CP209N0014

• DOTAP-Cl, Merck Eprova AG, Lote MBA-020

• DOFC, Avanti Polar Lipids Inc., Lote GN181 PC-12

• a,a-Trehalosa Dihidratada Alta Pureza (Baja Endotoxina), Ferro Pfanstiehl, Lote 33205A

• Etanol absoluto EP, Nova Laboratories Art.-Num., A4478B

• Acido citrico monohidratado EP/USP, Nova Laboratories Art.- Num., V290

• Agua para inyeccion, Nova Laboratories Art.- Num., A15210C

7.1.2 Equipo

• DI capilar de inyeccion: 2 mm

• Cartucho de filtro Memtrex PC 0,2 pm de GE, Artfculo Num. MPC92O5FHV, Lote 60240937

• Filtro esteril Opticap XL4 con 0,22 pm membrana Durapore de Millipore, Artfculo Num. KVGLAO4TT3 Lote: COCA1 0972

• Recipiente-Formulacion (Nova Laboratories Ltd.)

• Recipiente-Extrusion (Nova Laboratories Ltd.)

• Recipiente-Reduccion Biocarga (Nova Laboratories Ltd.)

• Recipiente- Mantenimiento (Nova Laboratories Ltd.)

• Bomba peristaltica (Nova Laboratories Ltd.)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

• Recipiente de presion de 20 l con tubo vertical (Nova Laboratories Ltd.)

• Conductos de ventilacion de mariposa (Nova Laboratories Ltd.)

• Secador de pulverizacion aseptico ASD-1 (GEA Niro S/A, Copemhagen Dinamarca)

7.2 Metodos

7.2.1 Produccion de formulacion Kquida

7.2.1.1 Preparacion de disolucion organica

Para el lote 001, se disolvieron 349,3 g de DOTAP-CL en solucion en 700 g de etanol absoluto y se agito durante aproximadamente 4 h. Se disolvieron 369,5 g de DOFC en 700 g de etanol absoluto y se agito durante aproximadamente 3 h. Con posterioridad, se unieron las dos disoluciones de lfpidos y se anadieron a 25,617 g de paclitaxel. Se agito la disolucion organica resultante durante aproximadamente 2 horas y finalmente se ajusto a un peso total de 2122,5 g por la adicion de etanol absoluto. Se prepararon los lotes 002 a 004 de acuerdo con esto.

7.2.1.2 Preparacion de disolucion acuosa

Para el lote 001, se anadieron 10 819 g de trehalosa deshidratada a aproximadamente 20 kg de agua para inyeccion en un recipiente de formulacion y se agito a 73 rad/s (700 rpm) durante 90 min. Con posterioridad, se anadieron 1.258 g de acido cftrico monohidratado y se agito hasta disolucion completa. Se ajusto el volumen final de la disolucion acuosa a 34,53 kg y se agito durante otros 10 min. Se prepararon los lotes 002 a 004 de acuerdo esto.

7.2.1.3 Inyeccion de etanol

Para el lote 001, se inyecto la disolucion organica en la disolucion acuosa mediante una bomba peristaltica con una velocidad de inyeccion de aproximadamente 250 g/min. Durante la inyeccion, se agito la disolucion a aproximadamente 52 rad/s (500 rpm). Despues de que terminara la inyeccion se agito la disolucion durante 2 min a 63 rad/s (600 rpm) y con posterioridad durante 1 min a 73 rad/s (700 rpm). Durante el procedimiento total de inyeccion se mantuvo la temperatura por debajo de 8 °C. Se agitaron los lotes 002 a 004 a 58 rad/s (550 rpm) durante la inyeccion sin agitacion adicional despues.

7.2.1.4 Extrusion

Se realizaron 8 extrusiones por un cartucho de filtro de 13 cm (5") con una membrana de policarbonato de 0,2 pm. Se ventilo el cartucho de filtro con 40-50 kPa (0,4-0,5 bar) cada uno y se realizo extrusion con una presion de 300 kPa (3,0 bar). La temperatura se mantuvo por debajo de 8°C.

7.2.1.5 Dilucion

Despues de la 8a extrusion, se determino el peso de la formulacion. Basandose en la densidad de la formulacion de 1,106 g/ml se calculo la cantidad de agua que se requena para obtener una formulacion 20 mM (basado en concentracion total de lfpidos), que correspondfa a una dilucion 1:1,5. Para el lote 001, se anadio la cantidad de agua requerida para inyeccion a 1,66 l/min mediante una bomba peristaltica por un capilar de DI de 2 mm mientras se agitaba la disolucion a aproximadamente 52 rad/s (500 rpm). Se habfa enfriado el agua anadida para inyeccion a por debajo de 8°C antes de anadirla a la formulacion. Para los lotes 002 a 004 se realizo dilucion a 0,62 l/min a 0,83 l/min a una velocidad de agitacion de aproximadamente 63 rad/s (600 rpm).

7.2.1.6 Reduccion de biocarga

Antes de la reduccion de biocarga (1a filtracion esteril), se lavo el filtro OpticapXL4 con 20 l de agua para inyeccion a una presion de aproximadamente 50 kPa (0,5 bar). La carga y la ventilacion del filtro se realizaron de manera gravimetrica. Se realizo la filtracion a una presion de 250 kPa (2,5 bar), en la que se aplico la presion de inmediato. Se mantuvo la temperatura de la formulacion por debajo de 8°C.

7.2.1.7 Filtracion esteril

Antes de la filtracion esteril, se lavo el filtro OpticapXL4 con 20 l de agua para inyeccion a una presion de aproximadamente 50 kPa (0,5 bar). Se realizo ventilacion del filtro a 50 kPa (0,5 bar). Se realizo la filtracion a una presion de 250 kPa (2,5 bar), en la que se aplico la presion de inmediato. Se mantuvo la temperatura de la formulacion por debajo de 8°C.

7.2.2 Secado por pulverizacion

Se seco por pulverizacion la formulacion liposomal en un secador de pulverizacion aseptico ASD-1 (GEA Niro S/A, Copenhagen, Dinamarca). Se seco el lote 001 como unico lote (Realizacion 1), mientras que se pulverizaron los lotes 002 a 004 de manera secuencial de un modo continuo (Realizacion 2). Para secado por pulverizacion se uso

32

una boquilla de dos fluidos, nitrogeno como gas de secado y los siguientes parametros:

Tabla 14: ajustes de secado por pulverizacion

Parametro

Punto de ajuste

Velocidad del gas de secado

80 kg/h

Presion del gas del atomizador

300 kPa (3 bar)

Velocidad del gas del atomizador

3 kg/h

Temperatura de salida

95°C

Velocidad de alimentacion

2 l/h

Temperatura de la alimentacion

0°C - 30°C

5 7.3. Estabilidad de los liposomas

7.3.1. Metodo

Se rehidrataron las composiciones liposomales deshidratadas de la Realizacion 1 en agua para inyeccion a una concentracion total de lfpidos de 10 mM, as^ las condiciones de reconstitucion aumentaron ademas el gradiente osmolar de la preparacion que ha^a sido 20 mM antes de la deshidratacion. Por comparacion, una composicion 10 liposomal correspondiente (Lote de referencia) que se preparo sin dilucion y habfa sido deshidratada por liofilizacion (como se describe, por ejemplo, en la patente internacional WO 2004/002468). La cantidad de paclitaxel (incluyendo productos de degradacion de paclitaxel) retenida en los liposomas se determino segun el metodo descrito en el Ejemplo 1.3 despues de la reconstitucion de los liposomas y despues de 24 horas a 25° C. El porcentaje de paclitaxel retenido y paclitaxel filtrable (cristalizado) se calculo basandose en el paclitaxel total presente en las 15 preparaciones.

7.3.2. Resultados

Tabla 15: Liberacion de paclitaxel de los productos

Preparacion

T0 Despues de 24 h a 25°C

Tiempo

Paclitaxel liposomalmente retenido [%] Paclitaxel filtrable [%] Paclitaxel liposomalmente retenido [%] Paclitaxel filtrable [%]

Realizacion 1

99,56 0,44 99,89 0,11

99,93

0,07 100,09 -0,09

99,67

0,33 99,87 0,13

Lote Referencia

99,63 0,37 98,88 1,12

99,48

0,52 98,68 1,32

99,72

0,28 99,16 0,84

Los datos muestran que las preparaciones liposomales preparadas en ausencia de un gradiente osmolar liberan 20 paclitaxel mas rapido. Esto ya puede observarse despues de un periodo de tiempo relativamente corto de 24 h.

7.4. Analisis de tamano de partfcula y polidispersidad

7.4.1. Metodos

Se determino el tamano de partfcula (zpromedio) y el mdice de polidispersidad (IP) por PCS (difraccion a 173°) usando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). En resumen, muestreado de la Realizacion 1 (que corresponde al Lote 1) y Realizacion 2 (que corresponde a las Realizaciones 2-4) y una muestra del Lote de referencia (vease 5 anteriormente) se resuspendieron en agua a una concentracion total de lfpidos de 10 mM. Para medicion, se diluyeron las muestras diez veces con disolucion de trehalosa deshidratada al 10,5% (p/p). Se almacenaron las muestras durante 24 horas a 25 °C y se midio de nuevo.

Se usaron los siguientes ajustes para la medicion y analisis de los datos: Tipo de medicion = Tamano; Muestra: Material = Latex de poliestireno, IR: 1,590; Absorcion: 0,01; Dispersante = Trehalosa al 10,5%, Temperatura: 25 °C, 10 Viscosidad 1,2 Pa.s (1.200 cp); IR: 1,342; Opciones generales = parametros de Mark-Houwink; Temperatura = 25 °C, Tiempo de equilibrio: 5 minutos; Celda = DTS0012 - Cubeta de tamano disponible; Medicion: Numero de realizaciones = 15; Duracion de la realizacion (segundos) = 100; Numero de mediciones= 3; Retardo entre mediciones; Avanzado = Posicion fijada en la posicion 4,65, Atenuador 6; Parametros del analisis: Modo del analisis = General; Analisis acumulativo: Orden de ajuste = 3; Esquema de ponderacion = Cuadratico; Seleccion de puntos 15 acumulativos: Primer punto automatico = Sf; Metodo de seleccion ultimo punto = Corte; Fraccion de senal = 0,1; Dilatacion = 1,2; Intervalo de visualizacion: Lfmite inferior = 0,6; Lfmite superior = 10 000; Filtracion: Factor de filtro = 75; Analisis multimodal: Transformacion del resultado = Mie; Uso transformacion del resultado = Sf; Esquema de ponderacion = Cuadratico; Resolucion = normal; Seleccion de puntos - Multimodal; Primer punto automatico = Sf; Metodo de seleccion ultimo punto = Corte, Fraccion de senal = 0,01; Dilatacion = 1,2; Clases de tamanos: Numero 20 de clases de tamano = 70; Lfmite inferior = 0,4; Lfmite superior = 10 000; Umbrales: Umbral inferior = 0,05; Umbral superior = 0,01; Factor de filtro = por defecto.

7.4.2. Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 16:

Muestra

zpromedio (nm) IP

Lote de referencia

133 0,337

Realizacion 1

Lote 1 143 0,16

Realizacion 2

Lote 2 138 0,15

Lote 3

143 0,17

Lote 4

144 0,19

25 Las formulaciones fabricadas con un gradiente osmotico y deshidratadas por secado por pulverizacion (Realizaciones 1 y 2) mostraron un zpromedio muy similar, pero valores de IP significativamente menores comparado con la muestra de referencia fabricada sin un gradiente osmotico y deshidratada por liofilizacion. Asf, el producto producido por el procedimiento descrito anteriormente es mas homogeneo que un producto producido por un procedimiento convencional.

30 7.5. Caracterizacion por ultracentrifugacion

7.5.1. Metodo

Se realizo analisis de ultracentrifugacion por Nanolytics (Potsdam, Alemania).

Cada muestra se reconstituyo en H2O y una mezcla 1:1 de H2O: D2O a una concentracion de lfpidos de 10 mM y se equilibro durante una hora a temperatura ambiente. Con posterioridad, se diluyeron las muestras 1:1 con el 35 respectivo disolvente. Despues de otra hora de equilibracion, las muestras fueron sometidas a ultracentrifugacion. Se sometieron 400 pl de la respectiva dispersion liposomal a una cubeta de ultracentrifugacion de titanio con un camino optico de 12 mm. Se centrifugaron las muestras en una ultracentnfuga analttica Optima XL-I (Beckmann- Coulter, Palo Alto) usando un rotor de 8 posiciones An50Ti (Beckmann-Coulter, Palo Alto) provisto de optica de interferencia Raileigh a 2094 rad/s (20 000 rpm) y 25°C. Durante la centrifugacion, el perfil de concentracion por la 40 coordenada radial fue mediante el gradiente de refractividad en la disolucion. Las muestras se midieron como duplicados.

7.5.2. Analisis de los datos

5

10

15

20

25

30

35

40

7.5.2.1 Definicion del coeficiente de sedimentacion

El indicador primario en la ultracentrifugacion analftica es el coeficiente de sedimentacion definido como sigue:

imagen2

En la que, u es la velocidad de sedimentacion de la particula, m la masa de la particula, v es el volumen especifico, / es el termino de friccion y £es la densidad del disolvente.

Determinacion del coeficiente de sedimentacion

El coeficiente de sedimentacion se calcula directamente a partir de los datos medidos sin mas suposiciones segun:

111 — — S to2 dt

rm J (2)

En la que T es la distancia al eje de rotacion y rm es el menisco. La integral del tiempo de realizacion Jcu2df se determina por el equipo de medida.

7.5.2.3 Distribucion de coeficientes de sedimentacion

En vez de un solo coeficiente de sedimentacion a un radio espedfico, se puede transformar el eje r total en un eje s. El desplazamiento de la franja en la respectiva posicion es proporcional a la concentracion masica de las especies particuladas presentes alli, de manera que la amplitud de las mediciones puede tomarse como coordenada y. Sin embargo, se requiere corregir la coordenada y con respecto a la dilucion radial. Incluyendo el termino de correccion se obtiene la siguiente funcion g(s), que proporciona la concentracion masica de las especies particuladas que sedimentan con velocidad s:

La concentracion c, respectivamente c0 se proporciona en unidades de desplazamiento de la franja, en que una franja es igual a una fase completa, asf una lmea clara y una oscura del patron de interferencia. El tamano es directamente proporcional a la concentracion proporcionada en g/l en el caso de que se pueda asumir que el incremento de mdice de refraccion sea igual para todas las especies particuladas, que es el caso para las muestras presentes que son material uniforme qmmico que esta presente simplemente en una distribucion polidispersa:

imagen3

dc = d(b • A ■ -7

1 dc (4)

En la que 9 es la concentracion en unidades de desplazamiento de la franja, A es la longitud de onda del laser, I la drt

anchura de la cubeta y dc es el incremento del indice de refraccion del soluto en un disolvente determinado. Debido a esta proporcionalidad, la concentracion en la ecuacion (3) puede indicarse directamente como concentracion masica.

g(s) (o su forma integrada G(s) puede calcularse en principio por transformacion de la coordenada barrido a barrido y el calculo de la coordenada y segun la ecuacion (3); el resultado total se obtendria promediando los barridos principales, que son principalmente redundantes. Asi, es razonable realizar un ajuste de datos global por todos los barridos. De ese modo, se afsla el ruido independiente del tiempo y el espacio y se reparte el ruido estadfstico adicional para obtener el mejor g(s) a partir de los datos de mediciones totales. Se uso el programa informatico SedFit vl2.4. de Peter Schuck para el ajuste.

7.5.2.4 Interpretacion de la distribucion de coeficientes de sedimentacion

35

5

10

15

20

25

30

35

La distribucion de coeficientes de sedimentacion en la forma de la funcion g(s) ya proporciona informacion sobre la forma de la distribucion; normalmente es deseable transformar el parametro s de medicion primaria en el diametro o masa de la partfcula. El coeficiente de sedimentacion se correlaciona con la masa molar por la ecuacion de SVEDBERG

imagen4

por el coeficiente de difusion. Para objetos globulares, en cuanto a los liposomas presentes, puede reemplazarse el coeficiente de difusion por el diametro de una esfera, a traves de lo cual tiene que considerarse, que el liposoma se carga con agua, que no contribuye a la sedimentacion sino a la friccion.

Si el coeficiente de difusion en la ecuacion 5 es reemplazado por la ecuacion de STOKES-EINSTEIN

imagen5

y considera el diametro d=2Rh para una esfera y una fraccion de volumen de agua O; la ecuacion de SVEDBERG se convierte en:

imagen6

en la que q es la viscosidad del disolvente y es la densidad del soluto

Para la conversion de la distribucion de coeficientes de sedimentacion en una distribucion de tamanos se requiere que el hinchamiento y la densidad de los liposomas permanezcan constantes o se proporcionen como una distribucion dependiente del coeficiente de sedimentacion. Asf, la densidad se determina de manera experimental.

7.5.2.5 Analisis de la variacion de la densidad

La densidad de sedimentacion de las partfculas puede determinarse por ultracentrifugacion analftica en dos disolventes con diferente densidad. En los disolventes que tienen una menor densidad, una partfcula normalmente presenta un valor de s mas pequeno, la partfcula sedimenta mas lentamente, si disminuye la diferencia de densidad para el disolvente circundante. Los dos valores de s, que describen la misma partfcula, satisfacen la ecuacion (7) con los parametros para el respectivo disolvente. Para los dos disolventes (mdice 1 y 2) se aplica lo siguiente:

imagen7

La densidad anhidra de la particula ~sy el parametro O de hinchamiento en ambos lados de la ecuacion son identicos, puesto que se refieren al mismo objeto. Se definen partfculas identicas como elementos de la distribucion de coeficientes de sedimentacion con identica coordenada y G(s).

Asf, la ecuacion (8) puede reorganizarse y simplificarse para obtener la densidad anhidra:

imagen8

El diametro puede ser derivado segun la siguiente ecuacion:

imagen9

Para resolver la ecuacion (10), se requiere informacion independiente tal como el diametro de las partfculas, que puede determinate de manera experimental por experimentos de dispersion de luz dinamica como se describio 5 anteriormente.

7.5.3. Resultados

Table 17: Densidad anhidra de preparacion liposomal

Realizacion de fabricacion

Muestra Densidad anhidra (g/ml)

Realizacion 1

Muestra 1 1,183

Realizacion 2

Muestra 1 1,174

Muestra 2

1,154

Muestra 3

1,223

10

15

20

REFERENCIAS

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New et al. (1990). Liposomes. A Practical Approach. Oxford University Press. Paginas 33-104).

Claims (32)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la fabricacion de una preparacion liposomal que comprende:

   a) proporcionar una primera preparacion liposomal que comprende una suspension de liposomas en una fase acuosa, en la que los liposomas comprenden al menos una membrana, en la que la membrana encierra un volumen liposomalmente encapsulado de la fase acuosa y la fase acuosa comprende al menos una sustancia osmoticamente activa y presenta una osmolaridad total inicial, O1, en la que la primera preparacion liposomal comprende al menos un agente activo en la membrana liposomal,

   b) generar despues un gradiente osmolar en la fase acuosa de dicha preparacion, en la que la osmolaridad de la fase acuosa exterior al volumen liposomalmente encapsulado, Oext, es menor que la osmolaridad de la fase acuosa interior al volumen liposomalmente encapsulado, Oint, para proporcionar una segunda preparacion liposomal y en la que se incorpora al menos un agente activo en la membrana liposomal de la segunda preparacion liposomal,

   c) opcionalmente deshidratar la segunda preparacion liposomal para obtener una preparacion deshidratada y

   d) opcionalmente rehidratar la preparacion deshidratada,

   en el que dicho agente activo presenta un log P mayor que 1 y en el que dicho agente activo es un taxano.
2. 2. El procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que la etapa b) se realiza reduciendo la osmolaridad total inicial, Oi, de la fase acuosa de la preparacion liposomal en la etapa a) para proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension con una osmolaridad total, O2, que es menor que la osmolaridad O1.
3. 3. El procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la etapa b) se realiza diluyendo la preparacion liposomal en la etapa a) con un medio acuoso que presenta una osmolaridad que es menor que O1.
4. 4. El procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la etapa b) se realiza por dialisis de la preparacion en la etapa a) contra un medio acuoso con una osmolaridad que es menor que O1.
5. 5. El procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la etapa b) se realiza por:

   b1) deshidratacion de la preparacion liposomal en la etapa a) para obtener una preparacion liposomal deshidratada y

   b2) rehidratacion de dicha preparacion liposomal deshidratada en condiciones para proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension, preferiblemente en un medio acuoso.
6. 6. El procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el volumen de medio acuoso usado para rehidratacion es mayor que el volumen de preparacion liposomal que ha sido deshidratado para obtener la respectiva cantidad de composicion liposomal deshidratada.
7. 7. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que O2 es al menos 10 mOsm menor que O1, mas preferiblemente O2 es al menos 50 mOsm menor que O1 e incluso mas preferiblemente O2 es al menos 100 mOsm menor que O1.
8. 8. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que gradiente osmotico entre la fase acuosa exterior al volumen liposomalmente encapsulado y la fase acuosa interior al volumen liposomalmente encapsulado es modificado una vez o varias veces en diferentes fases durante el procedimiento de produccion de la preparacion liposomal.
9. 9. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la deshidratacion se realiza a una temperatura por encima de temperatura ambiente.
10. 10. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la deshidratacion se realiza por secado por pulverizacion.
11. 11. Un procedimiento para la fabricacion de una preparacion liposomal que comprende al menos un agente activo lipofilo, que comprende:

    i) proporcionar una preparacion liposomal sometida a tension,

    ii) incubar dicha preparacion liposomal sometida a tension con al menos un agente activo lipofilo, opcionalmente en una forma no solubilizada, obteniendo de ese modo una preparacion liposomal sometida a tension con al menos un agente activo lipofilo incorporado a la membrana liposomal,

    en el que la etapa i) se realiza proporcionando una preparacion liposomal, en la que al menos una

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    sustancia osmoticamente activa esta comprendida en la fase acuosa de la preparacion y en la que la fase acuosa presenta una osmolaridad mayor en el interior del volumen liposomalmente encapsulado que en el exterior del volumen liposomalmente encapsulado y

    iii) opcionalmente separar compuesto no solubilizado de la preparacion liposomal, preferiblemente por filtracion o centrifugacion,

    en el que dicho agente activo presenta un log P mayor que 1 y en el que dicho agente activo es un taxano.
12. 12. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que esta presente al menos una sustancia osmoticamente activa en el interior y exterior de los liposomas.
13. 13. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sustancia osmoticamente activa se selecciona del grupo que consiste en moleculas organicas e inorganicas tales como sacaridos, alcoholes de azucar, aminoacidos, peptidos, protemas, polfmeros solubles en agua, sales organicas o inorganicas, iones y combinaciones de los mismos.
14. 14. El procedimiento segun la reivindicacion 13, en el que el sacarido se selecciona de mono-, di-, oligo- o polisacaridos, preferiblemente trehalosa.
15. 15. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente activo presenta un log P mayor que 2, lo mas preferiblemente mayor que 3.
16. 16. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente activo presenta una solubilidad menor que 0,1 mg/ml, mas preferiblemente menor que 0,01 mg/ml y lo mas preferiblemente menor que 0,001 mg/ml en agua a 25° C.
17. 17. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente activo es un taxano seleccionado de paclitaxel o un derivado del mismo.
18. 18. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente activo esta presente sustancialmente exclusivamente en el compartimento de membrana de los liposomas.
19. 19. Una preparacion liposomal obtenida u obtenible por el procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
20. 20. La preparacion liposomal segun la reivindicacion 19, que esta en forma deshidratada o en forma de una suspension acuosa.
21. 21. La preparacion liposomal deshidratada segun la reivindicacion 20, que es un polvo vertible.
22. 22. Una preparacion liposomal que comprende una suspension de liposomas en una fase acuosa, en la que los liposomas comprenden al menos una membrana, en la que esta presente al menos un agente activo en la membrana liposomal y esta presente al menos una sustancia osmoticamente activa en la fase acuosa, en la que la osmolaridad de la fase acuosa interior a los liposomas, On es mayor que la osmolaridad de la fase acuosa exterior a los liposomas, Oext.

    en la que dicho agente activo presenta un log P mayor que 1 y en la que dicho agente activo es un taxano.
23. 23. La preparacion liposomal segun la reivindicacion 22, en la que la diferencia entre On y Oext es al menos 10 mOsm, preferiblemente al menos 50 mOsm y hasta 2000 mOsm.
24. 24. La preparacion liposomal segun una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, para uso como un producto farmaceutico, preferiblemente para el tratamiento de cancer.
25. 25. La preparacion liposomal segun la reivindicacion 19, que comprende una suspension de liposomas en una disolucion acuosa obtenida por rehidratacion de una preparacion liposomal deshidratada, caracterizada por un diametro promedio (Zpromedio) que difiere por menos de un factor de 1,5 y un mdice de polidispersidad (IP) que difiere por menos de un factor de dos de la preparacion liposomal sometida a deshidratacion para obtener dicha preparacion liposomal deshidratada, en la que los liposomas comprenden hasta 5 % en moles de paclitaxel.
26. 26. La preparacion liposomal segun la reivindicacion 25, en la que el IP de 1 hora despues de reconstitucion es preferiblemente menor que 0,4, mas preferiblemente menor que 0,3, lo mas preferiblemente menor que 0,25.
27. 27. La preparacion liposomal segun la reivindicacion 19, que comprende una suspension de liposomas en una fase acuosa obtenida por rehidratacion de una preparacion liposomal deshidratada, caracterizada por cambios del diametro promedio (Zpromedio) por no mas de un factor de 1,5, preferiblemente no mayor que 1,25 y cambios del mdice de polidispersidad (IP) por no mas de un factor de 2, preferiblemente no mayor que 1,5, lo mas preferiblemente no mayor que 1,25 durante 24 horas a 25°C, en la que los liposomas comprenden hasta 5 % en

    moles de paclitaxel.
28. 28. La preparacion liposomal segun cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en la que los liposomas comprenden hasta 3 % en moles de paclitaxel en las membranas liposomales.
29. 29. La suspension liposomal segun cualquiera de las reivindicaciones 25-28, en la que los liposomas comprenden 5 DOTAP, DOFC y paclitaxel, preferiblemente en una relacion molar de 50:47:3.
30. 30. Una suspension liposomal que comprende un gradiente osmolar que comprende liposomas que comprenden DOTAP, DOFC y paclitaxel en una concentracion total de lfpidos de l0 mM y trehalosa, suspendidos en una fase acuosa que comprende aproximadamente 10 mg/ml, especialmente 9,79 mg/ml de trehalosa, en la que dichos liposomas se caracterizan por una densidad anhidra de al menos 1,1 g/ml.

    10 31. La suspension liposomal segun la reivindicacion 30, en la que DOTAP, DOFC y paclitaxel estan comprendidos

    en una relacion molar de 50:47:3.
31. 32. La suspension liposomal segun las reivindicaciones 30-31, en la que la suspension liposomal comprendfa acido cftrico.
32. 33. La suspension liposomal segun las reivindicaciones 30-31, en la que dichos liposomas presentan un Zpromedio de

    15 140nm.