CN1444927A - 一种制备脂质体的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种制备脂质体的新方法，它解决了易氧化、易水解和易变性的药物制备成脂质体过程中出现的难题。制备工艺过程包括如下步骤：a、将用于形成脂质体的脂类物质溶于叔丁醇形成的溶液；b、将待包封的水溶性药物溶于水中形成溶液；c、将上述两种溶液按合适的比例混合得到单相溶液；d、将得到的单相溶液冷冻干燥除去溶媒；e、将得到的冻干产物水化即得到包裹水溶性药物的脂质体。本工艺过程简单，实现容易，且非常容易放大，适合工业化生产。

Description

一种制备脂质体的新方法

技术领域：

本发明涉及生物医药技术领域，确切地说它是一种制备脂质体的新方法。

背景技术：

脂质体是由磷脂双分子层形成的闭合囊泡状结构。脂质体根据其结构的不同可以分为单层脂质体(unilamellar vesicles)、多层脂质体(multilamellar vesicles)和多室脂质体(multivesicular liposomes)。脂质体由英国人Bangham在1965首先发现。此后，人们发现脂质体作为药物的载体有着巨大的价值，于是便对脂质体进行了系统的研究。

经过了二十多年的探索，科研人员已经提出了许多很有价值的脂质体制备方法。目前看来，脂质体的制备方法主要可分为四大类：1)以薄膜分散法为基础的，即将用于形成脂质体的磷脂溶于有机溶媒中——通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之后在减压的条件下除去溶媒形成干燥的磷脂膜。将磷脂膜水化即可形成多层脂质体(multilamellar vesicles)。此方法虽是最经典的方法，但是却存在许多缺点。例如：使用毒性很大的有机溶媒；无法应用于工业化生产；当用含药水溶液水化时，形成的多层脂质体(multilamellar vesicles)层与层之间药物浓度不均一，必须通过反复冻融处理等等。2)以w/o乳或w/o/w复乳为基础的。此种制备方法虽然可以实现大规模生产(请参见skyepharma的depofoam技术平台)，但是仍存在一些问题。比如除去成乳时的毒性溶媒需要特殊的技术；由于有机溶媒的存在，包裹蛋白类或核酸类药物常常会导致药物丧失活性。3)去污剂透析法，很难工业化生产，不适合包封水溶性药物。4)以注入法为基础的，如乙醇注入法。可以大规模生产(请参见alza公司的技术和polymun的crossflow技术)。但是如果采用被动载药法制备脂质体，对于水溶性药物通常包封率比较低，而且由于常在较高温度下制备(60度左右)，通常会引起易氧化、易水解和易变性的药物失去活性。

此外，由于通过上述方法得到的脂质体制剂通常为液体制剂。制剂的稳定性常常无法解决。制剂的不稳定主要表现在如下三个方面：

1、脂质体属于热力学不稳定的分散系。脂质体混悬于水相时，常常会出现聚集、融合等现象，导致粒径变大。严重的还有可能出现分层。由于粒径的变化，就有可能导致用于静脉给药的制剂无法使用。

2、由于磷脂本身的特性，磷脂存在于水相时，很容易出现水解、氧化等现象。由于磷脂水解后会形成溶血磷脂，一方面增加制剂的毒性，另一方面也容易使脂质体解体，造成被包封药物的渗漏。

3、脂质体如混悬在水相中，在储存过程中，药物会缓慢渗漏，导致药物包封率的改变。如果药物的包封率发生变化，必定要影响制剂的疗效。

当然，如果药物本身很容易水解，那么制剂的稳定性就更成问题了。

脂质体制剂如何灭菌也是一个大问题。由于磷脂本身的特性，对最终制剂加热灭菌通常被认为是不可接受的。这样就要求整个生产过程必须采用无菌操作。这在有些脂质体制备工艺中是无法实现的。

脂质体的粒径控制也是很重要的。获得小粒径脂质体(小于200nm)一直是科研人员追求的目标。这是因为：

1、大粒径的脂质体很容易被体内的单核巨噬系统所吞噬，从而被迅速清除。

2、小粒径的脂质体可以被动靶向肿瘤区和缺血心肌。由于肿瘤生长较快，瘤区的血管通透性好，可以允许小粒径的脂质体通过。心肌缺血时，血管通透性增加，也可使小粒径的脂质体被动靶向增加。为了获得小粒径脂质体，通常需要对已得到的脂质体进行超声、研磨或挤出。这往往造成生产工艺的复杂。而且，这些手段产生的热量也会造成磷脂的氧化和水解。

综上所述，只有真正解决了上述问题，才能获得有效的脂质体制剂。

发明内容：

为了克服上述脂质体制备技术的不足，我们发明了一种全新的脂质体制备技术。通过我们发明的新技术，可以解决目前脂质体制剂所面临的难题。我们也将该技术称为叔丁醇/水单相溶液冻干法。

该制备方法包括以下步骤：

a、将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的物质或将用于形成脂质体的脂类物质、待包封的物质和载体物质溶于叔丁醇/水混合溶剂系统中，得到单相溶液；

b、将得到的单相溶液冷冻干燥除去溶媒；

c、将得到的冻干产物水化得到脂质体。

下面我们将就该技术的具体操作和优势进行详细描述。

具体操作：步骤a优选的有机溶媒为叔丁醇，用于形成脂质体的脂类物质主要包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)和调节磷脂膜性质的胆固醇(cholesterol)。此外，为了提高待包封物质的包封率，可加入适量的带电荷脂类物质：在包裹负电荷物质时，可加入荷正电的脂类物质，如1，2-二酰基-SN-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱等。在包裹正电荷水溶性药物时，可加入荷负电的脂类物质，如磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸等。为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂如vitamin E等。步骤a中的单相溶液可通过如下方法得到：

a：

(1)将用于形成脂质体的脂类物质溶于叔丁醇，得到溶液A，

(2)如待包封的物质溶于叔丁醇，将其溶于溶液A

如待包封的物质溶于水，将其溶于水得到溶液B，如加入载体物质，载体物质可溶于水中，

(3)将溶液A和溶液B混合得到单相溶液，或将溶液A和水混合得到单相溶液。

b：

(1)将叔丁醇和水混合得到混合溶剂，

(2)将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的物质或将用于形成脂质体的脂类物质、待包封的物质和载体物质，加入上述混合溶剂系统中，使其溶解得到单相溶液。

本发明的成功实施，要求步骤a中必须得到单相溶液。单相溶液指的是澄明的均一溶液，如叔丁醇溶液和水溶液的比例不合适，则会出现浑浊或沉淀无法形成单相溶液，无法保证得到待包封物质/脂的共分散物。叔丁醇溶液和水溶液应按合适的比例混合以形成单相溶液。溶液中叔丁醇和水的体积比通常应大于1∶3。为此我们推荐在考察处方时制备相图。

步骤b优选的去除溶媒的方法为冷冻干燥法，单相溶液应在液氮或低温装置迅速冻结，然后在冻干机中冻干。

步骤c为水化冻干产物以形成脂质体，可采用蒸馏水或合适的缓冲液在适宜的温度下完成，为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡等。

为了得到无菌制剂，可将步骤a中得到的单相溶液可滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。或者将用于形成单相溶液的叔丁醇溶液和水溶液分别滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。

实施本发明的时候，步骤a中得到的单相溶液中，除了脂类物质和待包封的物质，还可以包括蔗糖、乳糖或甘露醇等载体物质。这些载体物质的加入，有如下几个优点：1、可以作为冻干保护剂，使得到的冻干产物具有良好的形态。2、载体物质的加入，使得到的冻干产物不易吸潮，可以长期储存。待到需要使用时，再进行水化形成脂质体。3、载体物质的加入，大大加快了冻干产物水化形成脂质体的速度。如载体物质的比例合适，加入水后，冻干产物可以立即水化形成脂质体。4、通过调整载体物质的比例，可以改变脂质体的粒径。当载体物质的量较少或不加入载体物质时，水化后得到的脂质体通常为光学显微镜下可见的多层脂质体，粒径为微米级。当载体物质的比例较大，可形成小粒径脂质体。例如选用蔗糖为载体物质，当蔗糖/脂类物质大于2时，即可得到小于200nm的脂质体。

本发明中提到的待包封物质，可以是药物也可以是其它物质。在采用被动载药法时，待包封物质为药物。即将药物、脂类物质和载体物质溶于叔丁醇/水混合溶剂系统中，得到单相溶液后冻干。得到的冻干产物可长期贮存。待到使用时，水化形成脂质体制剂。

如果采用主动载药法，待包封物质可以为硫酸氨、醋酸钠等物质。例如采用硫酸氨梯度法进行主动载药时。可以将硫酸氨、脂类物质和载体物质溶于叔丁醇/水混合溶剂系统中，得到单相溶液后冻干。得到的冻干产物可长期贮存。待到使用时，加入水水化形成包封有硫酸氨的脂质体。然后将脂质体稀释，使得脂质体内外的硫酸氨浓度不同，进而造成H+梯度。之后将药物加入，实现主动载药过程。

又如采用传统的PH梯度法包封生物碱时，可以将柠檬酸、脂类物质和载体物质溶于叔丁醇/水混合溶剂系统中，得到单相溶液后冻干。得到的冻干产物可长期贮存。待到使用时，先加入水水化形成包裹柠檬酸的脂质体。然后再用碳酸氢钠调节外相PH值，造成脂质体内外的PH值梯度。之后加入生物碱类药物，孵育得到含药脂质体，实现主动载药过程。

从上述步骤中我们可以看出，我们发明的制备工艺具有如下优点：

该制备工艺非常适合大规模生产。脂质体工业化生产必须解决几个问题，例如：灭菌、除热源、生产工艺简单便于放大，保证脂质体在储藏期内稳定等。我们发明的制备工艺完全可以解决上述问题。1)我们可以将a步骤得到的溶液滤过灭菌，其他步骤采用无菌操作，得到无菌制剂。2)我们的工艺非常简单并且除了冻干机之外，几乎不需要其他的设备，且非常容易放大。3)为了保证脂质体的储藏期内稳定，我们可以将冻干物在使用前水化形成脂质体。实验表明如用于冻干的单相溶液含有载体物质，且载体物质与脂类物质的质量比大于1∶1，则得到的冻干物可以长期储存；如用于冻干的单相溶液中不含有载体物质，冻干物不可长期贮存，冻干后应立即水化。因此当加入适量的载体物质以后，冻干产物可以长期贮存。当需要使用时，加入水后可以立即水化形成脂质体。

另外本发明找到了一种有效的控制脂质体粒径的方法。如前所述，通过调整载体物质和脂类物质的比例，可以有效的控制脂质体的粒径。由于可以粒度均一的小粒径脂质体，大大增加了本发明的应用价值。

同时，我们的制备工艺可以充分保证某些敏感的药物活性。由于制备工艺在低温下完成，这样就避免了药物的水解和氧化。通过制备叔丁醇/水/脂三相相图我们发现，叔丁醇的比例在低到30％的情况下仍可形成单相溶液，由于叔丁醇的比例很低，加之药物在单相溶液中存在的时间很短，几乎完全避免了药物的变性失活。

可以避免有害溶媒的应用并彻底除去溶媒残留也是本发明的一个优点。叔丁醇是一个毒性较低的溶媒，通常认为它只是一个对人体有轻微毒害的溶媒，它的毒性要远远低于氯仿和甲醇。另外由于冻干机的真空度很低(小于10pa)，所以得到的冻干产物中叔丁醇几乎无残留。

本制备方法还可以提高水溶性药物的包封效率。对于水溶性药物提高包封率一个较好的办法就是将水溶性药物在较高的磷脂浓度下制备脂质体然后再稀释。但是采用传统的制备方法，脂浓度大于10％就比较难形成脂质体。而采用本方法，在磷脂浓度大于12％时，仍可制成脂质体。

本发明明显不同于传统的制备工艺，本发明其实是通过冻干的手段使得药物均匀分散的磷脂中，再水化形成脂质体。因此当不加入载体物质时，形成的多层脂质体(multilamellar vesicles)层与层之间不存在药物浓度不均一的现象。事实上本发明也提供了一种制备药物/脂共分散物(或药物/脂/载体物质)的方法，得到的共分散物如不水化，也可用于制备其他剂型。

本发明的具体制备方法，由下列实施实例举例说明，但本发明的保护范围，不局限于此。

具体实施方式：

实施例1：

叔丁醇/水/脂三相相图的制备。将脂溶于预热的叔丁醇中，得到不同浓度的脂/叔丁醇溶液，将不同浓度的溶液用不同量的水稀释，在恒温下放置，记录相分界点，制成相图。发现在10度，20度，35度时，在磷脂/叔丁醇溶液浓度小于250mg/ml，相分界点基本在叔丁醇/水等于3/7左右。

实施例2：

载体物质蔗糖对冻干物特性的影响：将脂/叔丁醇溶液和蔗糖/水溶液混合得到单相溶液冻干，发现蔗糖的加入明显改善冻干物形态，加快水化。并且得到的冻干产物可以长期储存而不吸潮。

实施例3：

载体物质蔗糖对脂质体粒径的影响：将脂/叔丁醇溶液和蔗糖/水溶液混合得到单相溶液冻干。冻干产物中磷脂/蔗糖的质量比分别为1∶1，1∶2.5，1∶5，1∶7.5。加入水后形成磷脂浓度均为1％的脂质体。用ZETASIZER(malvern公司)测定粒径。脂质体的粒径分别为304.3nm，146.0nm，131.6nm，129.8nm(intensity mean)。这说明添加载体物质蔗糖可以改变脂质体制备液的粒径。

实施例4：

用透射电子显微镜观察实施例3中得到的脂质体。采用负染法进行观察。即将脂质体用1％，PH＝7的磷钨酸染色。在电子显微镜下发现脂质体为透明圆球，大小与用粒度仪测定的结果相吻合。

实施例5：

氧化苦参碱脂质体的制备，将150mg/ml磷脂酰胆碱/叔丁醇溶液350ul与10mg/ml氧化苦参碱水溶液650ul混合得到单相溶液，冻干。用1ml蒸馏水水化，在1000x油镜下观察，发现形成脂质体，粒径在2～3微米左右。用柱分离法分离脂质体和游离药，测包封率，为21％。

实施例6：

本实施例是将一甙类药物制成脂质体。调整水溶液的PH值，将甙类药物溶于水中。水中补加载体物质蔗糖。之后与磷脂的叔丁醇溶液混合后形成单相溶液冻干。冻干产物水化后，药物为5mg/ml，磷脂为3％，蔗糖的浓度为10％。得到的脂质体溶液为光学澄明溶液。粒径在150nm左右。用柱分离法分离脂质体和游离药，测包封率，为40％。

实施例7：

本实施例是将一抗癌药物采用主动载药法制成脂质体。将硫酸氨溶于水中，水中补加蔗糖。之后将水溶液和磷脂的叔丁醇溶液混合成单相溶液冻干。得到的冻干产物先用少量水水化，得到小粒径脂质体。将此小粒径脂质体稀释1000倍，加入抗癌药物。在55度保温15分钟。得到包裹抗癌药物的脂质体。用柱分离法分离脂质体和游离药，测包封率为99％。

Claims (10)

1、一种制备脂质体的新方法，其特征在于：

a、将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的物质或将用于形成脂质体的脂类物质、待包封的物质和载体物质溶于叔丁醇/水混合溶剂系统中，得到单相溶液；

b、将得到的单相溶液冷冻干燥除去溶媒；

c、将得到的冻干产物水化得到脂质体。

2、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：步骤a中的单相溶液可通过如下方法得到：

a：

(1)将用于形成脂质体的脂类物质溶于叔丁醇，得到溶液A；

(2)如待包封的物质溶于叔丁醇，将其溶于溶液A；

如待包封的物质溶于水，将其溶于水得到溶液B，如加入载体物质，载体物质可溶于水中；

(3)将溶液A和溶液B混合得到单相溶液，或将溶液A和水混合得到单相溶液。

b：

(1)将叔丁醇和水混合得到混合溶剂，

(2)将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的物质或将用于形成脂质体的脂类物质、待包封的物质和载体物质，加入上述混合溶剂系统中，使其溶解得到单相溶液。

3、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：单相溶液指的是澄明的均一溶液，溶液中叔丁醇和水的体积比通常应大于1∶3。

4、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：步骤a中用于形成脂质体的脂类物质主要包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)和调节磷脂膜性质的胆固醇(cholesterol)；为了提高待包封物质的包封率，可加入适量的带电荷脂类物质：在包裹负电荷物质时，可加入荷正电的脂类物质；

在包裹正电荷水溶性药物时，可加入荷负电的脂类物质；

为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂。

5、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：步骤a中待包封的物质可以为药物，也可以为其它物质，如采用被动载药时，待包封的物质应为药物；如采用主动载药(activeloading/remote loading)时，待包封物质可以为硫酸氨、醋酸钠或者是所需的内相物质。

6、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：为了得到无菌制剂，可将步骤a中得到的单相溶液可滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成；或者将用于形成单相溶液的叔丁醇溶液和水溶液分别滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。

7、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：步骤b单相溶液应在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机中冻干。

8、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：在步骤a得到的单相溶液中可以包含蔗糖、乳糖或甘露醇等载体物质；如用于冻干的单相溶液含有载体物质，且载体物质与脂类物质的质量比大于1∶1，则得到的冻干物可以长期储存；如用于冻干的单相溶液中不含有载体物质，冻干物不可长期贮存，冻干后应立即水化。

9、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：步骤c为水化冻干产物以形成脂质体，可采用水或合适的缓冲液在适宜的温度下完成，为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡等；

如采用被动载药法时，水化时可以采用水或合适的缓冲液；

如采用硫酸氨或醋酸钠或醋酸钙梯度法主动载药时，可以用水水化形成脂质体后，再将脂质体稀释，加入待包封的药物孵育形成含药脂质体；

如采用PH梯度法主动载药时，用水水化形成脂质体后，再用外相物质调节PH值，形成PH梯度后，再加入药物孵育得到含药脂质体。

10、根据权利要求1所述的一种制备脂质体的新方法，其特征在于：如冻干产物中含有载体物质，且载体物质与脂类物质的质量比大于2∶1，则水化后的脂质体粒径小于200nm，可以用于静脉注射。