CN1895223B - 一种新的脂质体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种新的脂质体制备方法，它解决了易氧化、易水解和易变性的药物制备成脂质体过程中出现的一些难题，并且能够有效地提高水溶性药物包封率。制备工艺包括如下步骤：a、将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相，将待包封的亲水性物质溶于水形成内水相，将油相、内水相混合并乳化形成W1/0型乳剂；b、W1/0型乳剂与适当的水溶液按合适的比例混合并乳化形成W1/0/W2型复乳；W1/0/W2型复乳冷冻干燥除去溶媒得到冻干产物；将冻干产物水化形成脂质体。本工艺过程简单，容易实施。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，确切的地说是一种新的脂质体制备方法。
背景技术：
脂质体是由磷脂双分子层形成的闭合囊泡状结构。脂质体根据其结构不同可分为单层脂质体(unilamellar vesicles)、多层脂质体(multilamellar vesicles)和多囊脂质体(multivesicular liposomes)。脂质体由英国人Alec D.Bangham在1965年首先发现。此后，人们发现脂质体作为物质载体，尤其是药物载体，有着巨大的应用价值，于是便对脂质体进行了系统的研究。
经过了二十多年的探索，科研人员已经提出了许多很有价值的脂质体制备方法。目前脂质体主要通过分散技术(dispersion technique)制备，其方法可分为三大类：1)以机械分散技术为基础。如薄膜分散法(filmdispersion)，即将用于形成脂质体的磷脂溶于有机溶媒中-通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之后在减压的条件下除去溶媒形成干燥的磷脂膜。将磷脂膜水化即可形成多层脂质体(multilamellar vesicles)。该方法虽是最经典、应用最广的方法，但是却存在一些缺点。例如：使用毒性很大的有机溶媒；无法实现工业化生产；当用含药水溶液水化时，形成的多层脂质体(multtiamellar vesicles)层与层之间药物分布不均一，必须通过反复冻融处理等。2)以表面活性剂分散技术为基础。如去污剂透析法，该方法不但难以工业化生产，且不适合包封水溶性药物。3)以溶剂或共溶剂(cosolvent)分散技术为基础。例如，逆相蒸发法(reverse evaporationvesicles，REV)，此种制备方法对水溶性药物的包封率及载药量相对较高；而复乳法制备多囊脂质体(multivesicular liposome)目前虽然可以实现大规模生产(请参见skyepharma的depofoam技术平台)，但是仅限于制备微米级具有缓释功能的多囊脂质体；乙醇注入法(ethanol injection)，虽已经实现大规模生产(请参见alza公司的技术和polymun的erossflow技术)，并可采用被动载药法制备脂质体，但包封率较低，且需要在较高温度下制备(60℃左右)，通常会引起易氧化、易水解和易变性的药物失去活性，而采用主动载药法制备脂质体，包封率虽有所提高，但不适用于对酸碱敏感的药物，同时也容易引起磷脂分解变性。
概括起来，目前脂质体制备方法主要存在如下缺陷：
1.稳定性问题。通过已有方法得到的脂质体制剂通常为液体制剂，往往不够稳定，主要表现在如下三个方面：
(1)脂质体混悬于水相时，属于热力学不稳定分散系，常常会出现聚集、融合等现象，导致粒径变大，严重的还可能出现分层。
(2)磷脂存在于水相时，通常容易出现水解、氧化等现象，可能会形成溶血磷脂，一方面增加制剂的毒性，另一方面也容易使脂质体解体，导致药物渗漏。
(3)脂质体混悬在水相中，在储存过程中，药物可能会渗漏，导致包封率改变，从而影响制剂疗效。如果药物本身容易水解，制剂的稳定性问题更显突出。
2.包封率问题。通过已有方法得到的脂质体制剂，水溶性药物包封率往往较低。包封率低不但会造成原料浪费，还可能达不到有效剂量，不能够体现脂质体制剂优势。目前常用主动载药法(remote loading)来提高水溶性药物包封率。但无论是pH梯度还是硫酸铵梯度主动载药法，均需要在脂质体膜内外提供较大差别的pH环境，这不仅不适用于对酸碱敏感的药物，也容易引起磷脂分解变性。此外，主动载药法仅适用于可离子化的药物，应用范围相对有限。
3.灭菌问题。由于磷脂本身的性质，一般不能够对最终脂质体制剂加热灭菌，从而要求整个生产过程必须采用无菌操作。这对某些脂质体制备工艺来说可能无法实现。
4.脂质体的粒径控制问题。获得小粒径脂质体(小于200nm)通常有利于静脉给药。这是因为：
(1)大粒径的脂质体很容易被体内的单核巨噬系统所吞噬，从而被迅速清除。
(2)小粒径的脂质体可以被动靶向肿瘤组织和缺血心肌。为了获得小粒径脂质体，通常需要对已得到的脂质体进行超声、研磨或挤出。这往往又会导致药物进一步渗漏，影响制剂质量。
发明内容：
为了克服上述脂质体制备技术的不足，我们发明了一种新的脂质体制备方法。通过此方法，可以解决目前脂质体制剂所面临的一些难题。将该方法称为复乳冻干法(lyophilization of double emulsions)。
该制备方法包括以下步骤：
a、将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相(0)，将待包封的亲水性物质溶于水形成内水相(W1)，将油相(0)、内水相(W1)按合适的比例混合并乳化得到W1/0型乳剂；
b、将W1/0型乳剂与适当的水溶液(外水相，W2)按合适的比例混合并乳化，得到W1/0/W2型复乳；
c、将W1/0/W2型复乳冷冻干燥除去溶媒得到冻干产物；
d、将冻干产物水化形成脂质体。
下面我们将就该技术的具体操作进行详细的描述。
步骤a优选的有机溶媒为环已烷、氯仿、乙醚与水不混溶易挥发除去的有机溶剂，或其混合物，优选与水凝固点接近的有机溶剂。用于形成脂质体的脂类物质主要包括磷脂，如磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油，和调节磷脂膜性质的胆固醇(cholesterol)；也可以为具有类似磷脂性质的其它两性物质，以及不同脂类适当配比的混合物；可用于形成脂类质体(niosome)。此外，为了提高特包封物质的包封率，可加入适量的荷电脂类物质：在包封荷负电物质时，可加入荷正电的脂类物质，如1，2-二酰基-SN-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱等。在包封荷正电的水溶性药物时，可加入荷负电的脂类物质，如磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸等。为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂如vitaminE等。
本发明的成功实施，要求步骤a中必须得到稳定的W1/0型乳剂。步骤a中制备的W1/0型乳剂通常内水相与油相体积比小于1；步骤b中制备W1/0/W2型复乳通常初乳与外水相体积比小于1。步骤a和b中的乳化指的是搅拌，或振荡，或涡旋振荡，或匀乳，或高压匀乳，或超声机械做功操作，或为搅拌、涡旋振荡、匀乳、高压匀乳、超声组合操作，或为处方成分自动乳化。W1/0型乳剂指的是澄明或乳白色均一稳定乳剂，如果环已烷溶液和水溶液的比例不合适，则乳剂不稳定，分层沉淀，可能会出现相反0/W1型乳剂，无法将待包封物质包封于内水相，从而导致形成的脂质体包封率大大下降。
步骤c优选的去除溶媒的方法为冷冻干燥法，W1/0/W2复乳可以先置于液氮或低温度装置中迅速冻结，然后在冻干机中冻干。
步骤d为水化冻干产物以形成脂质体，可采用蒸馏水或合适的缓冲液在适宜的温度下完成，为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡，如采用被动载药法时，水化时可以采用水或合适的缓冲液；如采用硫酸铵或醋酸钠或醋酸钙梯度法主动载药时，可以用水水化形成脂质体后，加入待包封的药物孵育形成含药脂质体。如采用PH梯度法主动载药时，用水水化形成脂质体后，再加入药物孵育得到含药脂质体。。
为了得到无菌制剂，可将步骤b中得到的W1/0/W2复乳滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。
实施本发明的时候，通过步骤a、b得到的W1/0/W2型复乳，内水相(W1)和外水相(W2)中可加入冻干保护剂，包括二糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖，或单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖，或其它寡聚糖，如三糖、四糖、五糖，或甘露醇；或者为几种冻干保护剂的混合物。冻干保护剂与脂类物质的质量比通常大于1。加入这些物质，有如下几个作用：1、可以作为冻干保护剂，确保形成的脂质体具有合适的粒径及较高的包封率。2、使得到的冻干产物不易吸潮，可以长期储存，临用前再水化形成脂质体。3、显著加快冻干产物的水化速度，使冻干产物可以立即水化形成脂质体。4、使冻干产物具有良好的形态。
本发明中提到的待包封物质，可以是药物也可以是其它物质，如核酸。若为水溶性药物，则将药物溶于内水相(W1)，冻干保护剂溶于内水相(W1)及外水相(W2)，脂类物质溶于有机相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前水化形成脂质体制剂。
待包封物质若为脂溶性药物，则与脂类物质溶于有机相，冻干保护剂溶于内、外水相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前水化形成脂质体制剂。
本发明也可以采用主动载药法，待包封物质可以为硫酸铵、醋酸钠等物质。例如，采用硫酸铵梯度法进行主动载药时，可以将硫酸铵溶于内水相，冻干保护剂溶于内、外水相，脂类物质溶于有机相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，待到使用时，加水水化形成包封硫酸铵的脂质体，之后加入药物，即实现主动载药过程。
采用PH梯度法进行主动载药时，可以将柠檬酸溶于内水相，冻干保护剂溶于内、外水相，脂类物质溶于有机相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干。得到的冻干产物可长期贮存，临用前先加水水化形成包封柠檬酸的脂质体，之后加入生物碱类药物，孵育得到含药脂质体，实现主动载药过程。
本发明的制备工艺具有如下优点：
该制备工艺适用于大规模生产。脂质体工业化生产必须解决几个问题，例如：灭菌、除热源、生产工艺简单便于放大，保证脂质体在储藏期内稳定等。我们发明的制备工艺可以解决上述问题：1)可以将b步骤得到的W1/0/W2型复乳过滤灭菌，其他步骤采用无菌操作，得到无菌制剂；2)工艺相对简单，只需乳化、超声及冻干等常用设备，易于放大；3)为了保证脂质体在储藏期内稳定，可以将冻干物在使用前水化形成脂质体，实验表明得到的冻干物可以长期储存，使用时水化立即形成脂质体。
本制备方法的显著特点是可以明显提高水溶性药物包封率。由于水溶性药物始终包含于复乳内水相、有序磷脂内部、形成的脂质体内部，因此有较高包封率。
另外本发明可以有效地控制脂质体粒径。如前所述，通过调整冻干保护剂、脂类物质的比例及乳化过程等操作，可以有效地控制脂质体的粒径。由于可以得到粒度均一的小粒径脂质体，增加了本发明的应用价值。
同时，我们的制备工艺可以充分保证某些敏感药物的活性。由于制备工艺在低温下完成，避免了药物的水解和氧化。水溶性药物在W1/0/W2型复乳中仅存在于内水相，不接触有机溶剂，且存在的时间较短，可以避免有机溶媒使药物变性失活。脂溶性药物在W1/0/W2型复乳中虽存在于油相，但有机溶媒对于脂溶性药物一般无变性失活作用。
可以彻底除去溶媒残留也是本发明的一个优点。由于冻干机的真空度很低(小于10pa)，所以得到的冻干产物中几乎无溶媒残留。
简而言之，本发明不同于传统的脂质体制备工艺(如REV)，其实质是通过冻干的手段去除W1/0/W2型复乳中的有机溶媒并得到冻干产物，再水化形成脂质体，从而具备了上述显著优势。
通过下列实例举例说明本发明的具体制备方法，但本发明的保护范围，不局限于此。
具体实施方式：
实施例1：
冻干保护剂蔗糖与甘露醇合用对冻干特性的影响：以蔗糖(5％)-甘露醇(5％)水溶液为内、外水相，环已烷为油相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干，发现蔗糖与甘露醇的加入明显改善冻干产物的形态，加快水化速率。并且得到的冻干产物可以长期储存而不发生吸潮。
实施例2：
冻干保护剂蔗糖对脂质体粒径的影响：以蔗糖水溶液为内、外水相，环已烷为油相，通过两步乳化法得到W1/0/W2型复乳后冻干，冻干产物中磷脂/蔗糖的质量比分别为1：1，1：2.5，1：5，1：10。加水后形成磷脂浓度均为1％的脂质体。用LS 32(Beckmann公司)测定粒径。脂质体的平均粒径分别为198 nm，126 nm，108 nm(number mean diameter)。这说明添加冻干保护剂蔗糖可以改变脂质体粒径。
实施例3：
用透射电子显微镜观察实施例1和2中得到的脂质体。采用负染法进行观察。即将脂质体用1％，PH为7的磷钨酸染色。在电子显微镜下发现脂质体为近球体，大小与用粒度仪测定的结果相吻合。
实施例4：
钙黄绿素脂质体的制备：将1.5ml5％的磷脂酰胆碱环已烷溶液与1ml含5％蔗糖的0.1mM钙黄绿素水溶液混合乳化，得到W1/0初乳，加入4ml5％蔗糖溶液，混合乳化得到W1/0/W2型复乳，分装2ml/瓶冻干。用2ml蒸馏水水化，用LS32(Beckmann公司)测定粒径，脂质体的平均粒径为102nm(number mean di ameter)。用荧光猝灭法测包封率，为79.6％。
实施例5：
本实施例是将非甾体抗炎药物Flurbiprofen制成脂质体。将1.5ml含Flurbiprofen(10mM)的5％磷脂酰胆碱(PC)环已烷溶液与1ml5％蔗糖水溶液混合乳化，得到W1/0初乳，加入4ml5％蔗糖溶液，混合乳化得到W1/0/W2型复乳，分装2ml/瓶冻干。用2ml蒸馏水水化，用LS32(Beckmann公司)测定粒径。脂质体的平均粒径为122nm(number meandiameter)。用柱分离法分离脂质体和游离药物，测得包封率为96.2％。
实施例6：
本实施例是将拓扑替康采用主动载药法制成脂质体。将1.5ml5％磷脂酰胆碱(PC)环已烷溶液与1ml含硫酸铵的5％蔗糖水溶液混合乳化，得到W1/0初乳，加入4ml5％蔗糖溶液，混合乳化得到W1/0/W2型复乳，分装2ml/瓶冻干，用2ml蒸馏水水化，得到小粒径脂质体，加入拓扑替康，在55℃保温10分钟，得到包封拓扑替康的脂质体。用柱分离法分离脂质体和游离药物，测得包封率为82.1％。
Claims (10)
1.一种新的脂质体制备方法，其特征在于：
a.将用于形成脂质体的脂类物质和待包封的脂溶性物质溶于有机溶剂形成油相O，将待包封的水溶性物质溶于水形成内水相W1，将油相、内水相混合并乳化形成W1/O型乳剂，其中内水相W1与油相O体积比小于1；
b.将W1/O型乳剂与水溶液W2混合并乳化形成W1/O/W2型复乳，W1/O与W2体积比小于1；
c.将W1/O/W2型复乳冷冻干燥除去溶媒得到冻干产物；
d.将冻干产物水化形成脂质体；
其中，步骤a中的有机溶剂指与水不混溶易挥发除去的有机溶剂中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自环己烷、氯仿、乙醚。
3.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤a和b中的乳化指的是搅拌，或振荡，或匀乳，或超声机械做功中的一种或几种组合。
4.根据权利要求3所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：所述的振荡为涡旋振荡，匀乳为高压匀乳。
5.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤a中用于形成脂质体的脂类物质为磷脂、胆固醇或两性物质中的一种或几种，所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油。
6.根据权利要求5所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：包封负电荷物质时，加入荷正电的脂类物质，包封正电荷物质时，加入荷负电的脂类物质。
7.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：加入脂溶性抗氧化剂。
8.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：在步骤a和b中的内水相W1与W2中含有冻干保护剂，所述的冻干保护剂选自海藻糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖，或其它寡聚糖中的一种或几种，所述的其它寡聚糖选自三糖、四糖、五糖，或甘露醇；所述的冻干保护剂与脂类物质的质量比大于1。
9.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：为了得到无菌制剂，将步骤b中得到的W1/O/W2型复乳滤过灭菌，其它步骤在无菌条件下完成。
10.根据权利要求1所述的一种新的脂质体制备方法，其特征在于：步骤c中W1/O/W2型复乳在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机中冻干；或直接在冻干机中冷冻干燥。
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