CN105943502A - 一种脂质体载药方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂质体载药的方法。操作步骤是：a、制备包封环糊精的空白脂质体，所述包封环糊精的空白脂质体是指没有包封待包封药物但包封有环糊精的脂质体，包封环糊精的量按质量比为环糊精：脂质体膜材料﹦1：5～15；b、去除游离环糊精；c、待包封药物与包封环糊精的空白脂质体共同孵育，即得到载药脂质体。本发明的方法除具备离子梯度法所有优势外，还具有适用范围广，不受药物解离或络合性质限制；稳定性高，溶液pH为中性，利于维持磷脂等易水解成分的稳定性；环糊精为多糖化合物，有利于维护实现冻干过程磷脂膜的完整性。

Description

一种脂质体载药方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，是一种新的脂质体主动载药方法。
背景技术
脂质体是由磷脂双分子层形成的闭合囊泡。脂质体根据其结构的不同分为单层脂质体（unilamellar vesicles）、多层脂质体（multilamellar vesicles）和多囊脂质体（multivesicular liposomes）。脂质体由英国人Alec D. Bangham在1960年代初首先发现。此后，人们发现脂质体作为物质载体，尤其是药物载体，有着巨大的应用价值，随即对脂质体进行了大规模的系统研究。
经过了六十余年探索，科研人员已经发展了许多很有价值的脂质体制备方法。目前，脂质体制备方法主要基于磷脂分散技术（dispersion technique），可归纳为以下三大类：（1）基于溶剂或共溶剂（cosolvent）分散技术例如，薄膜分散法将磷脂溶于有机溶媒中，之后在减压除去溶媒形成干燥的磷脂膜，水化即可形成多层脂质体，是最经典、应用最广的方法。逆相蒸发法对水溶性药物的包封率及载药量相对较高；而复乳法能够用于大规模制备微米级具有缓释功能的多囊脂质体。乙醇注入法简便、快速，且避免了毒性有机溶剂。（2）基于表面活性剂分散技术如去污剂透析法，优点是不使用有机溶剂，适于蛋白、肽类生物药物，除了以静电结合外，难以包封水溶性药物。（3）基于机械分散技术这种技术主要是通过机械做功，以降低或控制脂质体粒径大小，例如超声分散，挤出过膜分散，微射流冲击等。
以上脂质体制备方法，对于多数药物而言，包封率普遍较低。为了提高脂质体包封率，研究人员发展了主动载药法。该方法是先制备空白脂质体，再通过药物扩散透膜，将药物捕获于脂质体内部。目前，主动载药法主要为离子梯度法，即先制备载有离子（H+, OH+,Cu2+, Mn2+等）空白脂质体，再除去未包封离子，形成内外离子梯度，随后与待包封药物在高于膜相变温度条件下孵育，药物透过磷脂膜进入脂质体内部，随即与离子结合，形成离子化物或络合物，从而无法透膜而被捕获于脂质体，实现载药。这种方法能够成功包封两性药物，例如，已经上市的Doxil即为采用离子梯度法（即(NH4)2SO4梯度法）将阿霉素几近100%包入脂质体。很明显，离子梯度法适用范围有限，仅适于部分可解离的两性药物或能够与离子络合的药物，且不适于对酸、碱、金属离子敏感的药物；同时，脂质体内部偏高或偏低的pH值，也容易引发性质不稳定的磷脂发生分解、变质，甚至导致脂质体解体。因此，对多数药物而言，目前仍缺乏有效的载药方法，无法发展为具有临床使用价值的脂质体制剂。本发明提供一种新的技术，能够将不同类型药物有效地载入脂质体。
发明内容
为了解决部分药物脂质体包封率低问题，弥补离子主动载药法缺陷，本发明发展了一种新的脂质体主动载药方法，称为环糊精介导主动载药法（cyclodextrin-mediatedremote loading, CRL）。
该方法依据原理是，将分子量较大、亲水性强、磷脂膜通透性低的环糊精包封于脂质体，随后与待包封药物在高于脂质体相变温度下孵育，药物进入脂质体即与环糊精形成包合物，失去膜通透性而被包封于脂质体。本发明包括以下步骤：a、制备包封环糊精的空白脂质体；b、去除游离环糊精；c、待包封药物与载环糊精脂质体在适当温度下共同孵育，即得到载药脂质体。本工艺过程简单，容易实施。
本发明一种脂质体载药方法操作步骤如下：
a、制备包封环糊精的空白脂质体，所述包封环糊精的空白脂质体是指没有包封待包封药物但包封有环糊精的脂质体，包封环糊精的量按质量比为环糊精：脂质体膜材料>1:100；
b、去除游离环糊精；
c、待包封药物与包封环糊精的空白脂质体共同孵育，即得到载药脂质体。
进一步限定的技术条件如下：
步骤a中所述包封环糊精的空白脂质体的制备方法为薄膜分散法或乙醇注入法或逆向蒸发法或乳化法或去污剂透析法。
步骤a中所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、聚乙二醇PEG化环糊精、糖基化环糊精。
步骤a中所述空白脂质体的材料为不同磷脂、不同磷脂混合或磷脂与胆固醇混合为膜材制备的脂质体、司盘类制备的囊泡、GIMINI表面活性剂制备的囊泡、磷脂酰胆碱（PC）与胆固醇（cholesterol）制备的包封环糊精的中性脂质体、环境条件敏感材料制备的敏感脂质体。
所述PC与胆固醇（cholesterol）制备的包封环糊精的中性脂质体为不同荷电状态的单层中性脂质体。
步骤a所述包封环糊精的空白脂质体的粒径为20-1000纳米。
步骤b中所述去除游离环糊精的方法为离心法、柱层析法、透析法、超滤法。
步骤c中所述待包封药物为非解离药物、化学药物和小分子肽。
步骤c中的孵育温度为高于脂质体脂质材料相变温度3°C以上，孵育时间小于2 h。
本发明的有益技术效果体现在：除具备离子梯度法所有优势外，还具有适用范围广，不受药物解离或络合性质限制；稳定性高，溶液pH为中性，利于维持磷脂等易水解成分的稳定性；环糊精为多糖化合物，有利于维护实现冻干过程磷脂膜的完整性。
附图说明
图1为本发明的CRL脂质体主动载药原理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
以300 mM α-环糊精（α-CD）为水相，以磷脂酰胆碱及磷脂酰丝氨酸（SPC/SPS = 10:1，mole ratio）为膜材，采用乳化-冻干法制备包封α-CD脂质体，离心去除游离α-CD，得到包封环糊精的空白脂质体（环糊精：脂质体膜材料=1：5，质量比）；随后加入黄芩素，药物/磷脂（1:20, w/w），40 °C孵育1h，完成主动载药；以电镜观察脂质体为球形纳米粒，DLS检测平均粒径为220纳米，PDI = 0.36，ζ = -30 mV，HLPC检测包封率分别为92%，95%，99%。（SPC, 豆磷脂酰胆碱；SPS, 豆磷脂酰丝氨酸；DLS，动态光散射; PDI, 多分散指数）。
实施例2
CRL法制备载两性药物脂质体
以100 mM PEG2000-hydroxypropyl-β-cyclodextrin（PEG-HP-β-CD）为水相，以磷脂及胆固醇（DPPC/CHO = 1:1，mole ratio）为膜材，采用逆向蒸发法法制备包封HP-β-CD脂质体，柱层析去除游离PEG-HP-β-CD，得到包封环糊精的空白脂质体（环糊精：脂质体膜材料=1：10，质量比）；随后加入Folate-PEG2000-DSPE（FPD）与拓扑替康（FPD/DPPC = 1:20, moleratio，drug/DPPC = 1:20, w/w），45 °C孵育1h，同时完成脂质体表面叶酸修饰及主动载药；以电镜观察脂质体为球形纳米粒，DLS检测平均粒径为300纳米，分布较均匀（PDI =0.23），ζ = -5mV，（高效液相）HLPC检测包封率分别为87%。荷瘤小鼠静脉注射脂质体阿霉素，与对照组比较（给予同剂量无叶酸修饰脂质体），4 h 后肿瘤部位药物分布显著增加，说明叶酸修饰脂质体具有肿瘤靶向作用。（CHO, 胆固醇; DPPC,dipalmitoylphosphatidylcholine）。
实施例3
CRL法制备载寡肽囊泡
以300 mM hydroxypropyl-β-cyclodextrin（HP-β-CD）及5%蔗糖为水相，以司盘80（SPAN80）及DOTAP（SPAN/DOTAP = 20:1，mole ratio）为膜材，采用薄膜分散-挤出法制备包封HP-β-CD荷正电囊泡，透析去除游离HP-β-CD，得到包封环糊精的空白脂质体（环糊精：脂质体膜材料=1：15，质量比）；随后加入谷胱甘肽（Glutathione/SPAN = 1:30, w/w），40 °C孵育0.5 h，完成主动载药；以电镜观察脂质体为球形纳米粒，DLS检测平均粒径为200纳米，分布均匀（PDI=0.23），ζ = 35mV，HLPC检测包封率分别为75%。进一步将载药囊泡冻干，冻干品4 °C 保存6月，水化后恢复囊泡，粒径、包封率无明显变化。
（DOTAP，N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl-sulfate)。
实施例4
冻干脂质体使用前以CRL载药
以100 mM PEG2000-hydroxypropyl-β-cyclodextrin（PEG-HP-β-CD）及5%蔗糖为水相，以磷脂及胆固醇（DPPC/CHO = 1:1，mole ratio）为膜材，采用逆向蒸发法法制备包封HP-β-CD脂质体，柱层析去除游离PEG-HP-β-CD，得到包封环糊精的空白脂质体（环糊精：脂质体膜材料=1：5，质量比）；随后冻干；冻干品4 °C 保存6月，水化后恢复脂质体，与拓扑替康（drug/DPPC = 1:20, w/w），45 °C孵育1h，完成主动载药；以电镜观察脂质体为球形纳米粒，DLS检测平均粒径为360纳米，分布较均匀（PDI = 0. 33），ζ = -3mV，HLPC检测包封率分别为83%。
本发明所述CRL载药法，是针对脂质体对于多数药物包封率较低及离子梯度法适用范围窄等不足所建立的脂质体主动载药新方法，能够将不同类型药物有效载入脂质体，是适用范围广、产品稳定性的脂质体技术平台。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以此限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种脂质体载药的方法，其特征在于操作步骤如下：
a、制备包封环糊精的空白脂质体，所述包封环糊精的空白脂质体是指没有包封待包封药物但包封有环糊精的脂质体，包封环糊精的量按质量比为环糊精：脂质体膜材料﹦1：0.1～10；
b、去除游离环糊精；
c、待包封药物与包封环糊精的空白脂质体共同孵育，即得到载药脂质体。
2.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤a中所述包封环糊精的空白脂质体的制备方法为薄膜分散法或乙醇注入法或逆向蒸发法或乳化法或去污剂透析法。
3.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤a中所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、聚乙二醇PEG化环糊精、糖基化环糊精。
4.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤a中所述空白脂质体的材料为不同磷脂、不同磷脂混合或磷脂与胆固醇混合为膜材制备的脂质体、司盘类制备的囊泡、GIMINI表面活性剂制备的囊泡、磷脂酰胆碱（PC）与胆固醇（cholesterol）制备的包封环糊精的中性脂质体、环境条件敏感材料制备的敏感脂质体。
5.根据权利要求4所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：所述PC与胆固醇（cholesterol）制备的包封环糊精的中性脂质体为不同荷电状态的单层中性脂质体。
6.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤a所述包封环糊精的空白脂质体的粒径为20-1000纳米。
7.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤b中所述去除游离环糊精的方法为离心法、柱层析法、透析法、超滤法。
8.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤c中所述待包封药物为非解离药物、化学药物和小分子肽。
9.根据权利要求1所述的一种脂质体载药的方法，其特征在于：步骤c中的孵育温度为高于脂质体脂质材料相变温度3°C以上，孵育时间小于2 h。
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