CN102151250A

CN102151250A - 一种固体脂质纳米粒制备新方法

Info

Publication number: CN102151250A
Application number: CN2010101122027A
Authority: CN
Inventors: 王汀; 周亚球; 王宁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2010-02-11
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明是一种固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)(包括纳米结构脂质载体，nanostructured lipid carriers，NLC)制备新方法，它解决了固体脂质纳米粒(包括NLC)易于聚集、凝聚等不稳定难题。制备工艺过程包括如下步骤：a、将用于形成固体脂质纳米粒(包括NLC)的脂类物质、亲脂性物质(包括药物)溶于能够与水混溶的有机溶剂(如叔丁醇)形成油相(O)，或亲水性物质(包括药物)以表面活性剂增溶于能够与水混溶的有机溶剂O；b、将水溶性物质溶于水中形成水相(W)；c、将油相O按合适的体积比例注入搅拌条件下的水相W，得到固体纳米粒分散液；d、将得到的分散液冷冻干燥除去溶剂，得到冻干产物；e、将得到的冻干产物水化，即得到固体脂质纳米粒(包括NLC)。本工艺过程简单，容易实施。

Description

一种固体脂质纳米粒制备新方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，确切地说它是一种固体脂质纳米粒(包括NLC)药物载体制备新方法。

背景技术

固体脂质纳米粒(包括NLC)是由脂类分子层形成的纳米粒子。固体脂质纳米粒(包括NLC)根据其结构的不同可以分为固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)、纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)两类。前者由室温下呈固态脂质材料制备而成，后者则由前者在制备时加入了部分液态脂质成分得到。固体脂脂纳米粒由1990年开始发展用作药物载体，随后不久作为化妆品进入市场。固体脂质纳米粒(包括NLC)作为物质载体，尤其是药物载体，有着巨大的应用价值，目前人们对固体脂质纳米粒(包括NLC)正进行系统而广泛的研究。

经过了二十多年的探索，科研人员已经提出了许多很有价值的固体脂质纳米粒(包括NLC)制备方法。

(1)热融—分散法即将热的O/W微乳分散于冷水中，Marengo[1]等将Epikuron 200和热水加入到融化的硬脂酸中，制备温度(70±2)℃。将助乳化剂牛胆酸钠盐加入到上述热混合物中，在(70±2)℃下搅拌，形成热乳剂，用新研制的设备形成SLN。

(2)高压乳化法其原理是用高压推动液体通过狭缝，高速切变效应和空化作用使液体分散为亚微米级的液滴，此法是制备SLN的可靠技术，包括热乳匀法和冷乳匀法。热乳匀法是在高于脂质熔点温度以上制备SLN，载药熔融脂质和相同温度的水、乳化剂的初乳可以用高剪切混合设备制备，再在脂质熔点以上温度进行初乳的高压乳匀，其初级产品是纳米乳，类脂先呈液态，冷却后形成固态粒子，由于粒径小和乳化剂的存在，类脂的重结晶缓慢，产品以过冷熔化物形式可保存数月之久；冷乳匀法适用于对热不稳定的药物和熔点低的脂类，制备的SLN具有较大的粒径和较广的粒子分布，冷乳匀技术可以克服由于高温引起的敏感性药物降解，降低乳化过程中药物在水相中的分布，同时避免纳米乳结晶步骤复杂化所引起的几种中间相的形成。

(3)超声分散法将药物和类脂等溶于适宜的有机溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层脂质薄膜，加入含有乳化剂的水溶液，用带有探头的超声仪进行超声分散，即可得小而均匀的SLN。本法广谱而易于操作，但产品中常混有微米级的粒子，此外还需要考虑超声仪探头的金属污染。

(4)微乳法微乳是由脂质相、表面活性剂、助表面活性剂和水所组成的透明澄清的溶液，需在脂质熔点以上温度制备微乳。方法：将低熔点的脂肪酸、乳化剂和水一起混合，在65℃-70℃条件下搅拌形成微乳，然后在搅拌下将其稀释分散在2℃-3℃的冷水中，即可得到SLN的胶体溶液；稀释过程与微乳的组成密切相关，由于稀释所制备SLN的类脂含量较高压乳化法低，获得的SLN颗粒尺寸是由微乳胶粒沉淀而成而非机械搅拌所致。如以硬脂酸作为油相，磷脂作为表面活性剂，乙醇作为助表面活性剂，纯化水为水相，在磁力搅拌下将热乳剂分散在冰水中，获得SLN。

(5)溶剂乳化法将脂质材料溶于有机溶液中(如环己胺、氯仿、二氯甲烷等)，然后加入到含乳化剂的水相中，进行乳化，最后蒸去有机溶剂得到SLN的稳定分散系统，本法相对于高压乳化法的优点是可避免引入任何热应力，缺点是难以完全除尽有机溶剂的引入，当大规模生产时，也会遇到基于溶剂挥发技术聚合物纳米粒所出现的类似问题。

(6)乳剂/溶剂扩散法以丙酮或甲醇为“水相”，以水不溶有机溶剂为“油相”，分散成细微液滴，在蒸发溶剂后形成固体纳米粒。

而概括起来，目前固体脂质纳米粒(包括NLC)制备方法主要存在如下缺陷：

1.制剂的稳定性问题通过已有方法得到的固体脂质纳米粒(包括NLC)制剂通常为水溶液纳米粒分散体制剂，往往不够稳定，主要表现在如下三个方面：

(1)固体脂质纳米粒(包括NLC)属于热力学不稳定分散系。固体脂质纳米粒(包括NLC)混悬于水相时，常常会出现聚集、融合等现象，导致粒径变大，严重的还有可能出现聚集、分层。

(2)磷脂存在于水相时，通常容易出现水解、氧化等现象。由于磷脂水解后会形成溶血磷脂，一方面增加制剂的毒性，另一方面也容易使固体脂质纳米粒(包括NLC)解体，造成被包封药物的渗漏。

(3)固体脂质纳米粒(包括NLC)混悬在水相中，在储存过程中，药物可能会渗漏，导致药物包封率改变，从而影响制剂疗效。如果药物本身容易水解，制剂的稳定性问题更显突出。

2.包封率问题通过已有方法得到的固体脂质纳米粒(包括NLC)制剂，水溶性药物包封率往往较低。包封率低不但会造成原料浪费，还可能达不到有效剂量，不能够体现固体脂质纳米粒(包括NLC)制剂的优势。

3.固体脂质纳米粒(包括NLC)制剂灭菌问题由于磷脂本身的性质，一般不能够对最终的制剂加热灭菌，这样就要求整个生产过程必须采用无菌操作。这对某些固体脂质纳米粒(包括NLC)制备工艺来说可能无法实现。

4.固体脂质纳米粒(包括NLC)的粒径控制问题获得小粒径固体脂质纳米粒(包括NLC)(小于200nm)通常有利于静脉给药。这是因为：

(1)大粒径的固体脂质纳米粒(包括NLC)很容易被体内的单核巨噬系统所吞噬，从而被迅速清除。

(2)小粒径的固体脂质纳米粒(包括NLC)可以被动靶向肿瘤组织和缺血心肌。为了获得小粒径固体脂质纳米粒(包括NLC)，通常需要对已得到的固体脂质纳米粒(包括NLC)进行超声、研磨或挤出。这往往又会导致药物进一步渗漏，影响制剂质量。

为了能够解决上述问题，我们发明了固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法。

发明内容

为了克服上述固体脂质纳米粒(包括NLC)制备技术的不足，我们发明了一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法。通过此方法，可以解决目前固体脂质纳米粒(包括NLC)制剂所面临的一些难题。我们将该方法称为注入-冻干法(injection-lyophilization)。

该制备方法包括以下步骤：

将用于形成固体脂质纳米粒(包括NLC)的脂类物质、待包封的亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相(O)，将待包封的亲水性物质、冻干保护剂溶于水形成水相(W)，将油相(O)按合适体积比以微细流注入到快速搅拌下的水相(W)，得到固体脂质纳米粒(包括NLC)分散液；

b、将得到的固体脂质纳米粒(包括NLC)分散液冷冻干燥除去溶剂得到冻干产物；

c、将得到的冻干产物水化得到固体脂质纳米粒(包括NLC)。

步骤a中油相、水相可以分别通过微孔滤膜过滤除菌后进行注入混合；也可以油相注入水相混合，再通过微孔滤膜过滤除菌或控制粒径，之后进行冻干。

步骤a中有机溶剂指能够溶解脂质材料、能与水混溶且易挥发除去的有机溶剂，或其混合溶液，如异丙醇、乙醇、丙酮、甘油等；但优选与水凝固点接近的具有上述性质的有机溶剂，如叔丁醇。

步骤a中的注入(injection)指的是加入，尤其以微细流(microfluids)形式或交叉微细流(cross microfluids)形式注射加入；或在涡旋振荡、或超声等机械做功条件下进行的混合操作，等等。

步骤a中用于形成固体脂质纳米粒(包括NLC)的脂类物质包括各种不溶于水、室温下呈固态的脂类物质或具有类脂性质的高分子聚合物。包括低分子醇脂类，如甘油脂类(如单硬脂酸甘油脂类、双硬脂酸甘油脂类、三硬脂酸甘油脂类)；高级脂肪醇脂类；高级脂肪酸类；高级脂肪醇类；胆固醇类(cholesterol)；具有类脂性质高分子聚合物；以及辅助成分，如磷脂类(phospholipid)，具有磷脂类似性质的其它两性物质(如司盘类等)；或各种脂类混合物(其中至少一种在室温下呈固态)。为了提高待包封物质的包封率、减小固体脂质纳米粒(包括NLC)粒径及增加稳定性，可加入适量的荷电脂类物质：在包封负电荷物质时，可加入荷正电的脂类物质，在包封正电荷物质时，可加入荷负电的脂类物质；为了提高固体脂质纳米粒(包括NLC)在体内外稳定性可以加入亲水性高分子修饰脂类，如聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸共聚物；为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂，如维生素E等。

步骤a中待包封的物质包括各种药物，如化学药物，天然药物，抗生素，核酸，DNA，各种疫苗，等等。

在步骤a水相(W)中可加入适当的冻干保护剂(cryoprotectant)，包括二糖(disaccharide)，如海藻糖(trehalose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麦芽糖(maltose)等；或单糖(monosaccharide)，如葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)，或其它寡聚糖(oligosaccharide)，如三糖(trisaccharide)、四糖(tetrose)、五糖等；或多元醇，如甘露醇(mannitol)、山梨醇、木糖醇、甘油等；或者亲水性高分子聚合物，如聚乙二醇(PEG)等具有冻干保护等作用的物质；或者为几种冻干保护剂的混合物；为了使冻干产品易于水化及改善冻干品外形或控制粒径，可以在油相中加入能够同时溶于有机溶剂及水的支撑剂(support agents)，如聚乙二醇类(polyethylene glycol，PEG，如PEG2000，PEG4000等溶于卤代烃，水)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP易溶解于水，醇，胺以及卤代烃中)。

步骤b中固体脂质纳米粒(包括NLC)分散液可以在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机中冻干；也可以直接在冻干机中冻干。

步骤c为水化冻干产物以形成固体脂质纳米粒(包括NLC)水分散体，可采用水或合适的缓冲液在适当的温度下完成；为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡等。

步骤c中水化冻干产物形成固体脂质纳米粒(包括NLC)其粒径大小受脂质、辅助成分(如磷脂等表面活性剂)、注射流、搅拌等因素影响，如相同条件下，采用荷电成分制备固体脂质纳米粒(包括NLC)粒径及分布较小；细微快速注射流粒径及分布较小；注入时采用快速搅拌水相可以减小粒径及分布。

从上述步骤中我们可以看出，我们发明的制备工艺具有如下优点：

1.该制备工艺适用于大规模生产。固体脂质纳米粒(包括NLC)工业化生产必须解决几个问题，例如：灭菌、除热源、生产工艺简单便于放大，保证固体脂质纳米粒(包括NLC)在储藏期内稳定等。我们发明的制备工艺可以解决上述问题：1)可以将a步骤得到油、水相过滤灭菌(经过200纳米孔径滤器)，其他步骤采用无菌操作，得到无菌制剂；2)工艺相对简单，只需冻干设备，其余均为常用设备，比较容易放大；3)为了保证固体脂质纳米粒(包括NLC)在储藏期内稳定，可以将冻干物在使用前水化形成固体脂质纳米粒(包括NLC)，实验表明得到的冻干物可以长期储存，使用时水化立即形成固体脂质纳米粒(包括NLC)。

2.本制备方法的显著特点是可以包封水溶性药物。如采用表面活性剂将水溶性药物以反胶束形式增溶于油相，按上述制备操作，可使水溶性药物包封于形成的固体脂质纳米粒(或NLC)内部，因此有较高包封率。

3.易于制备控释固体脂质纳米粒(包括NLC)。将能够与药物形成稳定晶型沉淀、复合体、或络合物等的物质与药物共同包封于固体脂质纳米粒(包括NLC)，可以有效控制药物释放速度。

4.本发明可以有效地控制固体脂质纳米粒(包括NLC)粒径。如前所述，通过调整冻干保护剂、支撑剂、脂类物质的比例以及搅拌、微细流注射过程等条件，可以有效地控制固体脂质纳米粒(包括NLC)的粒径。由于可以得到粒度均一的小粒径固体脂质纳米粒(包括NLC)，增加了本发明的应用价值。

5.该制备工艺可以充分保证某些敏感药物的活性。由于制备工艺在低温下完成，这样就避免了药物的水解甚至氧化；水溶性药物在反胶束中，可以避免有机溶媒使药物的变性失活；脂溶性药物在W/O型乳剂中虽存在于油相，但有机溶媒对于脂溶性药物一般无变性失活作用。

6.可以彻底除去残留溶媒也是本发明的一个优点。由于冻干机的真空度很低(可小于10pa)，所以得到的冻干产物中检查不出溶媒残留。

简而言之，本发明不同于传统的固体脂质纳米粒(包括NLC)制备工艺(如融化—乳化法，微乳法，传统注入法等)，其实质是通过冻干的手段去除的溶媒并得到冻干产物，再水化形成固体脂质纳米粒(包括NLC)，从而具备了上述显著优势。

具体实施方式

通过下列实施实例举例说明本发明的具体制备方法，但本发明的保护范围，不局限于此。

实施例1：

冻干保护剂蔗糖对冻干特性的影响：将以5％蔗糖水溶液为水相，3％硬脂酸甘油酯、1％大豆卵磷脂(SPC)溶于叔丁醇(t-butyl alcohol，TBA)为油相，在快速搅拌条件下(360rpm)，将1ml油相以微细流形式注入5ml水相，随后分装1ml/瓶，置入-80℃低温冰箱冷冻后，转入冻干机冻干，冻干品以1ml水水化，得到固体脂质纳米粒水分散体。发现冻干保护剂蔗糖加入明显改善冻干产物的形态，加快水化速率，并且得到的冻干产物可以长期储存。

实施例2：

脂质成分对固体脂质纳米粒粒径的影响：将以5％乳糖水溶液为水相，1％SPC或1％SPC/SPS(5∶1，w/w)+3％GMS溶于乙醇为油相，在快速搅拌条件下(600rpm)，将3ml油相以微细流形式注入5ml水相，分装1ml/瓶，置入充满液氮的液氮灌冷冻后，转入冻干机冻干，冻干品以1ml水水化，得到固体脂质纳米粒水分散体。用LS230(Beckmann公司)测定粒径。固体脂质纳米粒平均粒径分别为136nm，110nm。这说脂质成分对于固体脂质纳米粒粒径有一定的影响，荷电成分可减小粒径及分布。

实施例3：

用LS230(Beckmann公司)测定固体脂质纳米粒的平均粒径均小于200nm，用扫描电子显微镜观察实施例1和2中得到的固体脂质纳米粒，为纳米球体，大小与用粒度仪测定的结果相吻合。

实施例4：

5-FU固体脂质纳米粒(包括NLC)的制备：将含5-FU(5mg/ml)水溶液，含SPC(50mg/ml)TBA以1∶1体积比混合均匀，随后分装1ml/瓶，置入冻干机冻干。冻干品以2ml TBA溶解并加入单硬脂酸甘油酯(25mg/ml)，随后微细流形式注入快速搅拌(500rpm)的10ml 5％海藻糖水溶液，随后分装1ml/瓶，转入冻干机冻干，冻干品以1ml水水化，得到固体脂质纳米粒水分散体。用LS32(Beckmann公司)测定粒径，固体脂质纳米粒(包括NLC)的平均粒径为115nm(number mean diameter)，测得包封率为15.1％。

实施例5：

本实施例是将脂溶性药物桂利嗪cinnarizine制成固体脂质纳米粒。将以5％麦芽糖水溶液为水相，3％单硬脂酸甘油酯(GMS)、1％大豆卵磷脂(SPC)溶于甘油为油相，将0.3％cinnarizine溶于油相，在快速搅拌条件下(350rpm)，将3ml油相以微细流形式注入5ml水相，分装1ml/瓶，置入冻干机进行冻干。冻干品以1ml水水化，得到固体脂质纳米粒水分散体。用LS230(LS32version 3.19 software，Beckmann公司)测定平均粒径为108nm(numbermean diameter)。用柱分离法分离固体脂质纳米粒(包括NLC)和游离药物，测得包封率为100％。

实施例6：

本实施例是将脂溶性药物氟吡洛芬Flurbiprofen制成纳米结构脂质载体(NLC)。将以(2.5％葡萄糖+2.5％甘露醇)水溶液为水相，2.5％油酸甘油酯+0.5％中链(C8-C10)脂肪酸甘油酯+1％SPC溶于tBA为油相，将0.3％Flurbiprofen溶于油相，在快速搅拌条件下(400rpm)，将1ml油相以微细流形式注入5ml水相，随后分装1ml/瓶进行冻干，冻干品以1ml水水化，得到纳米结构脂质载体(NLC)水分散体。用LS230(LS32version 3.19 software，Beckmann公司)测定平均粒径为183nm(number mean diameter)。用柱分离法分离NLC和游离药物，测得包封率为82％。

Claims

1.固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：

a、质纳米粒(包括NLC)的脂类物质和待包封的亲脂性物质溶于有机溶剂形成油相(O)，将亲水性物质溶于水形成水相(W)，将油相按合适体积比注射入搅拌下的水相(W)得到固体脂质纳米粒(包括NLC)分散液；

b、到的固体脂质纳米粒(包括NLC)分散液冷冻干燥除去溶媒得到冻干产物；

c、到的冻干产物水化得到固体脂质纳米粒(包括NLC)。

2.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：步骤a中油相、水相可以分别通过微孔滤膜过滤除菌后进行注入混合；也可以油相注入水相混合，再通过微孔滤膜过滤除菌或控制粒径，之后进行冻干。

3.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：步骤a中有机溶剂指能够溶解脂质材料、能与水混溶且易挥发除去的有机溶剂，或其混合溶液，如异丙醇、乙醇、丙酮、甘油等；但优选与水凝固点接近的具有上述性质的有机溶剂，如叔丁醇。

4.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：步骤a中的注入(injection)指的是加入，尤其以微细流(microfluids)形式或交叉微细流(cross microfluids)形式注射加入，或在涡旋振荡、或超声等机械做功条件下进行的混合操作，等等。

5.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：步骤a中用于形成固体脂质纳米粒(包括NLC)的脂类物质包括各种不溶于水、室温下呈固态的脂类物质或具有类脂性质的高分子聚合物。包括低分子醇脂类，如甘油脂类(如硬脂酸甘油脂类、油酸甘油脂类等等)；高级脂肪醇脂类；高级脂肪酸类；高级脂肪醇类；胆固醇类(cholesterol)；具有类脂性质高分子聚合物；以及辅助成分，如磷脂类(phospholipid)，具有磷脂类似性质的其它两性物质(如司盘类等)；或各种脂类混合物(其中至少一种在室温下呈固态)。为了提高待包封物质的包封率、减小固体脂质纳米粒(包括NLC)粒径及增加稳定性，可加入适量的荷电脂类物质：在包封负电荷物质时，可加入荷正电的脂类物质，在包封正电荷物质时，可加入荷负电的脂类物质；为了提高固体脂质纳米粒(包括NLC)在体内外稳定性可以加入亲水性高分子修饰脂类，如聚乙二醇磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；聚乙二醇-聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物；为了提高磷脂的抗氧化能力，可加入脂溶性抗氧化剂，如维生素E等。

6.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：步骤a中待包封的物质包括各种药物，如化学药物，天然药物，抗生素，核酸，DNA，各种疫苗，等等。

7.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：在步骤a水相(W)中可加入适当的冻干保护剂(cryoprotectant)，包括二糖(disaccharide)，如海藻糖(trehalose)、蔗糖(sucrose)、乳糖(lactose)、麦芽糖(mal tose)等；或单糖(monosaccharide)，如葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)，或其它寡聚糖(oligosaccharide)，如三糖(trisaccharide)、四糖(tetrose)、五糖等；或多元醇，如甘露醇(mannitol)、山梨醇、木糖醇、甘油等；或者亲水性高分子聚合物，如聚乙二醇(PEG)等具有冻干保护等作用的物质；或者为几种冻干保护剂的混合物；为了使冻干产品易于水化及改善冻干品外形或控制粒径，可以在油相中加入能够同时溶于有机溶剂及水的支撑剂(support agents)，如聚乙二醇类(polyethylene glycol，PEG，如PEG2000，PEG4000等溶于卤代烃，水)、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP易溶解于水，醇，胺以及卤代烃中)。

8.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其特征在于：步骤b中固体脂质纳米粒(包括NLC)分散液可以在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机中冻干；也可以直接在冻干机中冻干。

9.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其待征在于：步骤c为水化冻干产物以形成固体脂质纳米粒(包括NLC)水分散体，可采用水或合适的缓冲液在适当的温度下完成；为加速水化，也可在机械力的作用下完成，如可以进行搅拌或振荡等。

10.根据权利要求1所述的一种固体脂质纳米粒(包括NLC)制备新方法，其待征在于：步骤水化冻干产物形成固体脂质纳米粒(包括NLC)其粒径大小受脂质、辅助成分(如磷脂等表面活性剂)、注射流、搅拌等因素影响，如相同条件下，采用荷电成分制备固体脂质纳米粒(包括NLC)粒径及分布较小；细微快速注射流粒径及分布较小；注入时采用快速搅拌水相可以减小粒径及分布。