CN107303301B - 一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系，所述靶向给药体系包括纳米金刚石、表皮生长因子EGF和药物顺铂；所述靶向给药体系以纳米金刚石为载体，所述纳米金刚石与表皮生长因子EGF通过共价方式结合形成EGF‑纳米金刚石复合物，所述EGF‑纳米金刚石复合物通过非共价方式负载药物顺铂。本发明还提供了一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系的合成方法；该合成方法简单方便。以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系可以用于靶向杀伤肿瘤细胞。

Description

一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系及其合成 方法

技术领域

本发明涉及纳米材料靶向给药领域，尤其是涉及一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系。

背景技术

随着碳纳米材料应用研究的进步，碳纳米材料给药系统已成为纳米生物医药领域的一个重要研究方向。目前由于碳纳米材料能有效地被细胞摄取，并且碳纳米材料的表面可以与多种无机或有机分子以共价或非共价方式连接形成复合物，所以碳纳米材料能成为一种有效的药物输送载体，可以协助一些水溶性差的药物进入细胞，从而增强它们的药理活性。

由于碳纳米材料都具有尺寸极小、易于被细胞吸收、易于与化学/生物分子共价或非共价键结合的表面结构，所以它们已经被广泛地应用于构建药物输送体系领域。但是已有研究发现碳纳米管之类的碳纳米材料可诱导氧化应激，导致细胞凋亡或坏死，这限制了它们的进一步应用和推广。然而比较其他碳纳米材料(碳黑、多壁碳纳米管和单壁碳纳米管)和纳米金刚石对成神经细胞瘤细胞、巨噬细胞的毒性，发现纳米金刚石本身的细胞毒性最小。纳米金刚石作为一个具有更好生物相容性的碳纳米家族的新成员，可用来构建纳米金刚石药物载体。纳米金刚石很容易进入细胞，而且不会影响细胞的生物活性。DNA、蛋白质、抗原抗体等生物分子可以固定在纳米金刚石的表面，并保持其生物活性。因此纳米金刚石能够作为有效的转运载体，用于构建靶向给药体系。

顺铂是细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性，可抑制肿瘤细胞的DNA复制过程，有较强的广谱抗肿瘤作用。但由于其水溶性较差，且有很强的肾毒性和神经毒性，因此需要开发新的靶向给药体系，以降低顺铂毒性。在文献[Dhar S,Daniel WL,Giljohann DA,Mirkin CA,Lippard SJ:Polyvalent oligonucleotide gold nanoparticle conjugatesas delivery vehicles for platinum(IV)warheads.J Am Chem Soc 2009,131:14652-14653.]中，达尔等人将顺铂通过胺键共价连接到金纳米颗粒上杀伤肺癌细胞，但是共价结合方式影响顺铂的释放。文献[Guan B,Zou F,Zhi J.Nanodiamond as the pH-responsivevehicle for an anticancer drug.Small.2010Jul 19；6(14):1514-9.]中记载关波等人合成了单纯负载顺铂的纳米金刚石给药体系，这一载药体系可利用肿瘤细胞自身的渗透性，富集于肿瘤组织，杀伤肿瘤细胞，但它不能特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡。

由于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)在许多实体肿瘤中高表达或表达异常，所以它可以作为肿瘤治疗的主要靶点。本发明提供一种新的靶向给药体系将表皮生长因子(EGF)作为靶向分子，与肿瘤细胞表面的EGFR特异性结合，将药物靶向输送到肿瘤细胞。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系。该靶向给药体系可以用于靶向杀伤肿瘤细胞。

本发明的第二个目的是提供一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系的合成方法。

本发明的第三个目的是提供一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系在制备杀伤肿瘤细胞药物中的应用。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系。所述靶向给药体系包括纳米金刚石、表皮生长因子(EGF)和药物顺铂；所述靶向给药体系以纳米金刚石为载体，所述纳米金刚石与表皮生长因子(EGF)通过共价方式结合形成EGF-纳米刚石复合物，所述EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式负载药物顺铂。

所述EGF被用作靶向分子；所述药物顺铂被用作抗肿瘤药物。

本发明还提供一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系的合成方法，包括以下步骤：

1)纳米金刚石羧基化

纳米金刚石与混合酸发生羧基化反应，得羧基化的纳米金刚石；

2)共价结合EGF

在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下，羧基化的纳米金刚石和EGF共价结合形成稳定的EGF-纳米金刚石复合物；

3)非共价负载顺铂

所述EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式负载顺铂，即获得EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系。

步骤1)具体通过如下步骤实现：将纳米金刚石粉末加入到混合酸中，于60-80℃搅拌8-24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入碱，于80-100℃搅拌5-20min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，测定其pH值，然后用去离子水进行多次清洗，使其pH值呈中性，得羧基化的纳米金刚石。

步骤1)中，所述混合酸是硫酸和硝酸的混合物；所述硫酸和硝酸的体积比为1:1-5：1(例如为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1等)；所述混合酸将纳米金刚石进行羧基化。

步骤1)中，所述纳米金刚石是通过高温高压法合成的，所述纳米金刚石的粒径为100nm。

所述碱是用来中和多余的酸，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁等。

步骤2)具体通过如下步骤实现：将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声10-60min，得羧基化的纳米金刚石水溶液；向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入经过滤菌的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液和EGF水溶液，于30-50℃下摇晃0.5-2h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为12000rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得EGF-纳米金刚石复合物。

所述羧基化的纳米金刚石水溶液的浓度为1-5mg/mL(例如为：1、2、3、4或5mg/mL等)。

所述1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液的浓度为1-8mg/mL(例如为：1、2、5、7或8mg/mL等)；所述N-羟基琥珀酰亚胺水溶液的浓度为1-6mg/mL(例如为：1、2、3、4或6mg/mL等)。

所述EGF水溶液的浓度为1-5mg/mL(例如为：1、2、3、4或5mg/mL等)。

步骤3)具体通过如下步骤实现：将EGF-纳米金刚石复合物分散于水中，然后加入顺铂水溶液，于30-50℃摇晃0.5-2h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为12000rpm的条件下进行离心处理3min，然后去除上清液后，即获得EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系。

将所述EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系进行高压灭菌，于2-8℃保存。

所述顺铂水溶液的浓度为0.5-5mg/mL(例如为：1、2、3、4或5mg/mL等)。

在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液的存在下，EGF上的氨基和纳米金刚石上的羧基共价结合形成稳定的EGF-纳米金刚石复合物，然后EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式吸附吸附的方式负载顺铂。

EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式吸附顺铂，可以使药物顺铂集中作用肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。

此外，本发明还提供了一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系在制备杀伤肿瘤细胞药物中的应用。

另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系以纳米金刚石为载体，EGF为靶向分子，顺铂为抗肿瘤药物，EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系可以将药物集中作用肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。

2、本发明的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系通过EGF上的氨基和纳米金刚石上的羧基共价结合形成稳定的EGF-纳米金刚石复合物，然后EGF-纳米金刚石复合物通过非共价的方式吸附抗肿瘤药物顺铂。

3、本发明的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的合成方法简单方便，而且负载药物顺铂的量与细胞作用时可以被pH值变化所调控，具有一定的缓释作用，会降低所负载药物本身的副作用。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的流程图。

图2示出了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的粒径分布图。

图3a示出了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系对肝癌细胞的细胞毒性。

图3b示出了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系对肝癌细胞的靶向性。

图4示出了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系对子宫颈癌细胞的细胞毒性。

图5示出了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系对神经胶质瘤细胞的细胞毒性。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

1)纳米金刚石羧基化

将0.5g纳米金刚石粉末加入到硫酸和硝酸的混合酸(硫酸和硝酸的体积比为3：1)中，于70℃搅拌24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，用吸管吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入10mL浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液，于90℃搅拌10min，得第二混合物；将所述第二混合物静置，然后用吸管吸取上层清液并测定其pH值，将所述第二混合物进行多次清洗，使其pH值呈中性，得羧基化的纳米金刚石。

2)共价结合EGF

将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声20min，得浓度为1mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液；取100μL浓度为1mg/mL的羧基化的纳米金刚石水溶液，向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入经过滤菌的浓度为2mg/mL的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)水溶液、浓度为2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)水溶液和浓度为1mg/mL的EGF水溶液，于37℃下摇晃1h，得第三混合物；将所述第三混合物在离心转速为12000rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后得EGF-纳米金刚石复合物。

3)非共价负载顺铂

将所述EGF-纳米金刚石复合物分散于100μL水中，然后加入100μL的浓度为1mg/mL的顺铂水溶液，于37℃摇晃1h，得第四混合物，将所述第四混合物在离心转速为12000rpm的条件下进行离心处理3min，去除上清液后获得以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系，即EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系。

将EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系进行高压灭菌，然后分散于1000μL的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(DMEM)中，于4℃保存。

EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系中EGF结合率和顺铂负载率的测定方法，具体包括如下步骤：

1)EGF结合率的测定

收集EGF-纳米金刚石复合物合成过程中经过离心处理的上清液，采用2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)试剂法对上清液中的EGF进行检测。EGF结合率(μg/100μg)＝(反应前EGF的量-上清液中EGF的量)/反应所用的纳米金刚石的量。

2)顺铂负载率的测定

用王水将以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系溶解，然后用去离子水进行适当的稀释，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)对负载的顺铂的量进行检测。顺铂负载率(μg/100μg)＝顺铂的量/反应所用的纳米金刚石的量。

用Zetasizer 3000HS(Malvern Instruments,Malvern,England)仪检测EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的粒径分布(见图2)和zeta电位(见表1)。图2横坐标标尺是非线性的(横坐标为log10)。

表1EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的zeta电位以及其给药体系中EGF结合率、顺铂的负载率

名称	Zeta电位(mV)	顺铂负载率(μg/100μg)	EGF结合率(μg/100μg)
				EGF-纳米金刚石-顺铂	-15.9±2.3	1.0±0.4	23.6±3.2

应用例1肝癌细胞的细胞毒性检测

实验组1：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、实施例1合成的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、与给药体系顺铂量一致的含顺铂(浓度为0.6μg/mL)的无血清培养基培养4h；分别吸去含纳米金刚石的培养基、含EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基和含顺铂的培养基，然后用PBS溶液分别将培养好的三组细胞冲洗3遍，再将每组冲洗后的细胞分别用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用细胞计数试剂盒-8(CCK8试剂盒)分别检测三组细胞的毒性。

实验组2：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为两组，然后分别用含EGFR抗体(浓度为5ug/mL)的无血清培养基、单一的无血清培养基培养2h；然后分别吸去含EGFR抗体的培养基和单一的培养基，用PBS溶液分别将培养好的两组细胞冲洗3遍，再将冲洗后的两组细胞分别用实施例1合成的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的培养基培养4h；然后吸去EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基并用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒分别检测两组细胞的毒性。

对照组：选用肝癌细胞(HepG2细胞)为肿瘤细胞，将HepG2细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍；将冲洗后的细胞用无血清的DMEM培养基培养4h，然后吸去无血清的DMEM培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒检测细胞的毒性。

结合图3a比较实验组1和对照组，在培养基中加入纳米金刚石，细胞存活率为98.86±8.81％，表明纳米金刚石本身在给药浓度下对HepG2细胞没有毒性；在培养基中加入EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞的存活率为55.82±13.10％，表明EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系在给药浓度下可以有效地杀死HepG2细胞；在培养基中加入与给药体系顺铂量一致的顺铂，细胞的存活率为100.24±2.01％，表明与给药体系顺铂量一致的顺铂在给药浓度下对HepG2细胞没有毒性，进一步验证EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系可以将药物顺铂集中作用于肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。

结合图3b比较实验组2和对照组，在培养基中加入EGFR抗体后再加入EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞存活率为101.93±4.60％，表明EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系在HepG2细胞表面的EGFR封闭后丧失靶向杀伤肿瘤细胞的能力。进一步证明了EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系靶向杀死HepG2细胞的特异性。

应用例2子宫颈癌细胞的细胞毒性检测

实验组1：选用子宫颈细胞(HeLa细胞)为肿瘤细胞，将HeLa细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、实施例1合成的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、与给药体系顺铂量一致的含顺铂(浓度为0.6μg/mL)的无血清培养基培养4h；分别吸去含纳米金刚石的培养基、含EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基和含顺铂的培养基，然后用PBS溶液分别将培养好的三组细胞冲洗3遍，再将每组冲洗后的细胞分别用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒分别检测三组细胞的毒性。

对照组：选用子宫颈癌细胞(HeLa细胞)为肿瘤细胞，将HeLa细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍；将冲洗后的细胞用无血清的DMEM培养基培养4h，然后吸去培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒检测细胞的毒性。

结合图4比较实验组1和对照组，在培养基中加入纳米金刚石，细胞存活率为99.01±7.83％，表明纳米金刚石在给药浓度下对HeLa细胞没有毒性；在培养基中加入EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞的存活率为51.98±9.12％，表明EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系在给药浓度下可以有效地杀死子HeLa细胞；在培养基中加入与给药体系顺铂量一致的顺铂，细胞的存活率为99.80±7.78％，表明给药体系顺铂量一致的顺铂在给药浓度下对HeLa细胞没有毒性，进一步验证EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系可以将药物集中作用肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。

应用例3神经胶质瘤细胞的细胞毒性检测

实验组1：选用神经胶质瘤细胞(C6细胞)为肿瘤细胞，将C6细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)将培养好的细胞冲洗3遍，将冲洗后的细胞分为三组，然后分别用实施例1中纳米金刚石(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、实施例1合成的EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系(浓度为0.1mg/mL)的无血清培养基、与给药体系顺铂量一致的含顺铂(浓度为0.6μg/mL)的无血清培养基培养4h；分别吸去含纳米金刚石的培养基、含EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系的培养基和含顺铂的培养基，然后用PBS溶液分别将培养好的三组细胞冲洗3遍，再将每组冲洗后的细胞分别用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒分别检测三组细胞的毒性。

对照组：选用神经胶质瘤细胞(C6细胞)为肿瘤细胞，将C6细胞接种于96孔板，每孔细胞的个数为3×10³个，以DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养24h，细胞增殖到50-60％汇合度；然后吸去培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍；将冲洗后的细胞用无血清的DMEM培养基培养4h，然后吸去含培养基，用PBS溶液将培养好的细胞冲洗3遍，再将冲洗后的细胞用DMEM+10％胎牛血清+青链霉素的培养基培养48h，然后用CCK8试剂盒检测细胞的毒性。

结合图5比较实验组1和对照组，在培养基中加入纳米金刚石，细胞存活率为95.22±7.11％，表明纳米金刚石在给药浓度下对C6细胞没有毒性；在培养基中加入EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系，细胞的存活率为30.60±3.42％，表明EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系在给药浓度下可以有效地杀死C6细胞；在培养基中加入给药体系顺铂量一致的顺铂，细胞的存活率为99.45±2.00％，表明给药体系顺铂量一致的顺铂在给药浓度下对C6细胞没有毒性，进一步验证EGF-纳米金刚石-顺铂给药体系可以将药物集中作用肿瘤细胞，提高顺铂对肿瘤细胞的杀伤能力。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系，其特征在于：所述靶向给药体系包括纳米金刚石、表皮生长因子EGF和药物顺铂；所述靶向给药体系以纳米金刚石为载体，所述纳米金刚石与表皮生长因子EGF通过共价方式结合形成EGF-纳米刚石复合物，所述EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式负载药物顺铂。

2.一种如权利要求1所述以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)纳米金刚石羧基化

纳米金刚石与混合酸发生羧基化反应，得羧基化的纳米金刚石；

2)共价结合EGF

在1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下，羧基化的纳米金刚石和表皮生长因子EGF共价结合形成稳定的EGF-纳米金刚石复合物；

3)非共价负载顺铂

所述EGF-纳米金刚石复合物通过非共价方式负载顺铂，即获得EGF-纳米金刚石-顺铂的靶向给药体系。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤1)具体通过如下步骤实现：将纳米金刚石粉末加入到混合酸中，于60-80℃搅拌8-24h，得第一混合物；将所述第一混合物冷却至室温，吸出所述第一混合物中的多余酸，向所述第一混合物中加入碱，于80-100℃搅拌5-20min，得第二混合物；使第二混合物的pH值呈中性，得羧基化的纳米金刚石。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤2)具体通过如下步骤实现：将所述羧基化的纳米金刚石分散到水中并进行超声处理，得羧基化的纳米金刚石水溶液；向所述羧基化的纳米金刚石水溶液中加入经过滤菌的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液、N-羟基琥珀酰亚胺水溶液和表皮生长因子的水溶液，于30-50℃下摇晃0.5-2h，得第三混合物；将所述第三混合物进行离心处理，然后去除上清液得EGF-纳米金刚石复合物。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤3)具体通过如下步骤实现：将EGF-纳米金刚石复合物分散于水中，然后加入顺铂水溶液，于30-50℃摇晃0.5-2h，得第四混合物，将所述第四混合物进行离心处理，然后去除上清液，即获得EGF-纳米金刚石-顺铂的靶向给药体系。

6.根据权利要求2或3所述的合成方法，其特征在于，步骤1)中，所述混合酸是硫酸和硝酸的混合物；所述硫酸和硝酸的体积比为1:1-5：1。

7.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，步骤2)中，所述羧基化的纳米金刚石水溶液的浓度为1-5mg/mL。

8.根据权利要求5所述的合成方法，其特征在于，步骤3)中，所述顺铂水溶液的浓度为0.5-5mg/mL。

9.根据权利要求2或5所述的合成方法，其特征在于，步骤3)中，将所述EGF-纳米金刚石-顺铂的靶向给药体系进行高压灭菌，于2-8℃保存。

10.一种如权利要求1所述以纳米金刚石为载体负载顺铂的靶向给药体系在制备杀伤肿瘤细胞药物中的应用。

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