CN102459064A - 纳米金刚石粒子络合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多种官能化的纳米金刚石粒子。具体而言，本发明提供了纳米金刚石粒子与治疗试剂的可溶性络合物，所述的治疗试剂例如为不可溶的治疗试剂、蒽环类和/或四环素类化合物、核酸、蛋白质等。

Description

纳米金刚石粒子络合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年5月28日提交的美国临时专利申请系列No.61/181,993的优先权，所述申请以引用方式全文并入本文。

关于联邦资助的研究或发展的陈述

在得自国家科学基金会(National Science Foundation)的Grant No.CMMI-0846323、CMMI-0856492和DMI-0327077(由University ofCalifornia-Berkeley转包的工作，转包合同号为SA5880-21593)以及得自国立卫生研究院(National Institutes of Health)的Grant No.U54 AI065359下，在政府支持下，形成本发明。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明提供了多种官能化的纳米金刚石粒子。在一些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的络合物。在一些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的可溶性络合物，其中所述的治疗试剂是不溶于水的或者水溶性较差的。在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米金刚石粒子以及蒽环类和/或四环素类化合物的络合物。在其他实施方案中，本发明提供了由聚乙烯亚胺表面官能化的纳米金刚石粒子和核酸分子构成的纳米金刚石-核酸络合物。在其他的实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子以及吸附在该纳米金刚石粒子上的蛋白质构成的碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物，其中所述的蛋白质被构造成在足够的碱性条件下会由所述的纳米金刚石粒子上解吸附。

背景技术

碳纳米管、纳米金刚石、纳米粒子嵌入式薄膜、天然和合成的聚合物、脂囊泡以及许多其他纳米级物质已经证明了纳米粒子作为有效的药品传递载体以及在机械、电学和MEMS应用中的用途[8，9，17-27]。在这些应用中，主要由于爆轰纳米金刚石具有小的分子承载能力[9，28]、官能化的表面[29]以及生物相容性[15，30-32]，而使得它们受到关注。这些性质创造了动力学界面，其中在ND与其他粒子或分子之间的相互作用可以通过ND表面特征来定义。通过具有亲水性羟基和羧基基团(由于特征性的表面电荷并允许在水中分散)的供应的ND给出所述相互作用的实例[8，28，29]。ND在生物医学应用以及它们所表现出的生物相容性中的未来前景表明了ND为有利的碳基生物材料。

发明概述

本发明提供了多种官能化的纳米金刚石粒子。在一些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的络合物。在某些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的络合物，其中所述的治疗试剂为水溶性的、不溶于水的或者水溶性较差的。在某些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的可溶性络合物，其中所述的治疗试剂为不溶于水的或者水溶性较差的。在一些实施方案中，纳米金刚石粒子表现为对一种或多种治疗试剂具有较高的结合能力。在其他实施方案中，本发明提供了由聚乙烯亚胺表面官能化的纳米金刚石粒子和核酸分子构成的纳米金刚石-核酸络合物。在其他实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和吸附在该纳米金刚石粒子上的蛋白质构成的碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物，其中所述的蛋白质被构造成在足够的碱性条件下会由所述的纳米金刚石粒子上解吸附。

在一些实施方案中，本发明提供了包含可溶性络合物的组合物，其中所述的可溶性络合物包含：a)包含一个或多个表面羧基基团的纳米金刚石粒子；以及b)治疗试剂，其中所述的治疗试剂本质上为不溶于水的或者是水溶性较差的(例如疏水性的)，其中所述的治疗试剂吸附在纳米金刚石粒子上从而形成可溶性的络合物，以及其中所述的可溶性络合物可溶于水中(例如可溶于生物流体中，例如在人体内)并且适用于对人类进行体内给药。在某些实施方案中，本发明提供了包含吸附在纳米金刚石粒子上的治疗试剂的组合物，其中所述的纳米金刚石粒子包含一个或多个表面羧基基团，其中所述的治疗试剂在未吸附在所述的纳米金刚石粒子上时是不溶于水的或者是水溶性较差的，并且其中所述的治疗试剂在吸附在所述的纳米金刚石粒子上时是水溶性的。

在一些实施方案中，本发明提供了包含络合物的组合物，其中所述的络合物包含：a)纳米金刚石粒子；以及b)治疗试剂。在一些实施方案中，治疗试剂包含四环素类治疗试剂。在一些实施方案中，治疗试剂包含蒽环类治疗试剂。在一些实施方案中，治疗试剂包含道诺霉素、表柔比星、去甲氧正定霉素、二甲胺四环素、四环素、土霉素中的一种或多种。在一些实施方案中，治疗试剂包含道诺霉素，亚德里亚霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，戊柔比星，米托蒽醌，四环素，氯四环素，土霉素，地美环素，强力霉素，赖甲四环素，甲氯环素，甲烯土霉素，二甲胺四环素和/或吡咯烷甲基四环素中的一种或多种。

在其他实施方案中，本发明提供了制备可溶性络合物的方法，其包括：在酸溶液存在下将纳米金刚石粒子与治疗试剂混合使得治疗试剂吸附在纳米金刚石粒子上，由此形成可溶性的络合物，其中所述的治疗试剂本质上是不溶于水的或者是水溶性较差的。在具体的实施方案中，酸溶液包含乙酸。

在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米金刚石-核酸络合物的组合物，其中所述的络合物包含：a)包含一个或多个表面聚乙烯亚胺分子的官能化的纳米金刚石粒子；以及b)核酸分子，其中所述的核酸分子和所述的官能化的纳米金刚石粒子形成纳米金刚石-核酸络合物。

在某些实施方案中，本发明提供了制备纳米金刚石-核酸络合物的方法，包括：a)将纳米金刚石粒子与聚乙烯亚胺分子混合，从而形成官能化的纳米金刚石粒子；以及b)将所述的官能化的纳米金刚石粒子与核酸混合，从而形成纳米金刚石-核酸络合物。

在具体的实施方案中，所述的官能化的纳米金刚石粒子与所述的核酸分子通过官能化的纳米金刚石粒子上的正电荷与核酸分子上的负电荷的吸引而形成纳米金刚石-核酸络合物。在其他实施方案中，核酸包含DNA、RNA、所关注的基因、microRNA、siRNA或质粒。在具体的实施方案中，纳米金刚石-核酸络合物中的核酸分子附着在纳米金刚石粒子上使得它们在引入到细胞中时被释放。在某些实施方案中，聚乙烯亚胺分子为低分子量的聚乙烯亚胺分子。

在一些实施方案中，本发明提供了包含碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物的组合物，其中所述的碱敏感性纳米金刚石络合物包含：a)包含一个或多个表面羧基或羟基基团的纳米金刚石粒子；以及b)蛋白质(例如人类胰岛素或其他治疗蛋白质)，其中所述的蛋白质吸附在纳米金刚石粒子上，从而形成碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物，以及其中蛋白质被构造成仅仅在足够的碱性条件下会由所述的纳米金刚石粒子上解吸附。在具体的实施方案中，碱性条件为pH为至少8.0...8.5...9.0...9.5...10.0...10.5...11.0...12.0...13.0...或14.0。

在其他实施方案中，本发明提供了处理受试对象的方法，包括：a)提供：i)包含处理位点的受试对象，其中所述的处理位点具有碱性pH；以及ii)包含碱敏感性纳米金刚石络合物的组合物，其中碱敏感性纳米金刚石络合物包含：A)包含一个或多个表面羧基或羟基基团的纳米金刚石粒子；以及B)蛋白质，其中所述的蛋白质吸附在纳米金刚石粒子上，从而形成碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物；以及b)在一定的条件下向受试对象给药(例如系统、局部、口服等)所述的组合物，使得：i)碱敏感性金刚石络合物达到处理位点，以及ii)使蛋白质相应于处理位点处的碱性pH而由碱敏感性金刚石络合物上解吸附。在具体的实施方案中，碱性条件为pH为至少8.0...8.5...9.0...9.5...10.0...10.5...11.0...12.0...13.0...或14.0。在其他实施方案中，处理位点为伤口并且所述的给药是局部的。在一些实施方案中，蛋白质包含胰岛素(例如人类胰岛素)。

附图说明

图1.ND增强了Purvalanol A和4-OHT分散于水中的能力。针对背景准备小瓶，并在以下条件下证明受到ND调节的浑浊度降低：A)1mg/mlND溶于5％DMSO的水溶液中；B)1mg/ml ND、0.1mg/ml Purvalanol A溶于5％DMSO的水溶液中；C)0.1mg/ml Purvalanol A溶于5％DMSO的水溶液中；D)1mg/mL ND溶于25％DMSO的水溶液中；E)1mg/mL ND、0.1mg/mL 4-OHT溶于25％DMSO的水溶液中；F)0.1mg/mL 4-OHT溶于25％DMSO的水溶液中。G)原始ND的TEM图像。H)可以在ND的表面上观察到4-OHT残基从而证明ND-药品的相互作用。比例尺表示10nm。

图2.ND的UV-Vis光谱分析：4-OHT和Dex-ND络合物沉降。A)离心后ND样品的UV-Vis分析表明UV-Vis吸光率减少，证明使用ND作为干扰4-OHT并将药品牵引至ND样品团中的试剂的能力。B)4-OHT与ND：4-OHT的UV/Vis吸光率之间的比较图证明ND与4-OHT之间的界面接合。随着与ND的物理吸附使得溶液中游离的4-OHT减少，所述的ND可以通过离心由水性溶液中除去。注意当ND缺乏时，未观察到4-OHT与水性上清液相分离的效果，如表示4-OHT分别在离心前和离心后的重叠的虚线和实线所示。C)此外，证明Dex-ND络合物形成，如在离心后捕获的Dex所示。

图3.ND-药品络合物的粒径和ζ电位的DLS分析。(图3A-3C)：所有药品在物理吸附ND时的平均粒径都减小。(图3D-3F)：所有样品的ζ电位在与ND络合时的正电性都变强。

图4.治疗生物功能性测试证明在通过与ND络合而使得药品的分散增强时，其活性得到保持。A)通过DNA片段测试证明Purvalanol A的活性得到保持，采用以下泳道名称：A)DNA标记物；B)阴性对照(未加入任何物质)；C)5％DMSO的水溶液；D)1mg/ml ND溶于5％DMSO的水溶液中；E)1mg/ml ND、0.1mg/ml Purvalanol A溶于5％DMSO的水溶液中；F)0.1mg/ml Purvalanol A溶于5％DMSO的水溶液中。泳道E证明了ND-Purvalanol A络合物的效力活性。B)进行MTT细胞活力测试以证明4-OHT在与ND形成络合物之后的治疗活性得到保持。测试以下条件：(-)：阴性对照；(+)：阳性对照，7.5ug/mL 4-OHT；ND：75ug/mL ND；ND：4-OHT：75ug/mL ND，7.5ug/mL 4-OHT。所有的条件都是在包含1.31mM乙酸培养基中。比较阳性对照与ND：4-OHT样品之间的细胞活力水平证明当与ND络合时，4-OHT的效力得到保持。显示出3个试验中的一个代表性试验。

图5.(A)氨基官能化的纳米金刚石与(B)低分子量聚乙烯亚胺(PEI800)修饰的纳米金刚石的示意图。

图6.纳米金刚石与官能化的E纳米金刚石在pDNA结合之前的粒径(A)和ζ电位(B)。将粒子以60ug/ml的浓度悬浮于去离子水中；纳米金刚石与官能化的纳米金刚石在pDNA结合之后的粒径(C)和ζ电位(D)，并且固定浓度为3ug pDNA/ml。使用Zetasizer Nano ZS(Malvern，Worcestershire，United Kingdom)在25℃下在173°散射角下进行粒径测量。通过累积分析测定平均水力直径。在水性介质中，根据粒子的电泳淌度进行ζ电位的测定，其是使用皱毛细细胞以自动模式进行的。数据表示为平均值±标准偏差(n＝2)。(E)ND-PEI800/DNA的TEM图像。比例尺为20nm。

图7.HeLa细胞中PEI800官能化的纳米金刚石介导的高效基因转染。在转染之前，将HeLa细胞以10⁵/孔的密度接种到24孔板中。将纳米粒子加入到所述的细胞中并在37℃下温育4h。在洗涤时，将细胞再温育44h。根据与3μg/孔的目标pLuc剂量的差异重量比来计算粒子的浓度。在转染后48h收获细胞并进行荧光素酶测试。数据表示为平均值±标准偏差(n＝2)。^*表示在细胞裂解物中转染效率低于10RLU/mg蛋白质的粒子。

图8.在重量比为5(A)和15(B)下，在ND-PEI800/pGFP调节的活性HeLa细胞中，GFP表达的明场和GFP共聚焦成像；在重量比为5(C)和15(D)下的未修饰的纳米金刚石/pGFP；在重量比为5(E)和15(F)下的PEI800/pGFP；以及裸露的pGFP(G)。在转染之前，在24h内将HeLa细胞以1.5x10⁵/孔的密度接种到24孔板中。将纳米粒子加入到所述的细胞中并在37℃下温育4h。在洗涤时，将细胞再温育44h。根据6μg/孔的目标pLuc剂量来计算粒子的浓度。通过PBS洗涤活性HeLa细胞，并在转染后48h在共聚焦显微镜(Leica Inverted Laser Scanning System，Argon Laser激发488nm)下观察活性。(比例尺：50um)

图9.示出了在水中胰岛素与ND吸附以及在NaOH存在下解吸附的理想示意图。在水中，胰岛素通过静电及其他的相互作用与ND表面以非共价的方式结合。碱性环境的变化改变了胰岛素表面电荷的特征，从而由ND的表面上释放。

图10.(a)裸露的ND、(b)在水性溶液中具有吸附的胰岛素的ND以及(c)在使用1mM NaOH进行处理从而调节至pH 10.5之后具有吸附的胰岛素的ND。与裸露的ND(a)相比，在ND(b)的表面上具有明显的层或涂层，其厚度为大约5-10nm。由于加入胰岛素为(a)和(b)的样品制备中的唯一差异，所以可见的层可以表明为吸附的胰岛素。在NaOH处理的ND上不存在所述的材料。在(a)中，比例尺为20nm，在(b，c)中比例尺为50nm。

图11.(a)FITC胰岛素、(b)裸露的ND以及(c)ND胰岛素络合物的红外光谱。箭头表示与裸露的ND光谱相比，在ND-胰岛素光谱上存在的胰岛素的特征光谱。图像(c)表明形成ND-胰岛素络合物，如光谱差异所示。所述的数据暗示胰岛素与ND为非共价吸附。

图12.与在pH7和Ph10.5下胰岛素与ND络合有关的ζ电位变化。与胰岛素以及ND-胰岛素络合物的负电动势相比，在两种pH值下，ND都具有微小的正ζ电位。在ND与ND-胰岛素络合物之间的ζ电位的明显差异表明ND与胰岛素之间的相互作用。

图13.胰岛素与ND吸附及解吸附的UV/vis定量。(a)FITC胰岛素与ND的吸附可通过初始及经离心的ND-胰岛素之间所获得的差异吸光率值所示，其在485nm下测量。(b)进行BCA蛋白质测试的牛胰岛素的吸光率，其在562nm下测量。(c)在1mM NaOH(其被调节至各种pH)中FITC胰岛素与ND的解吸附。在碱性条件下对样品进行离心，并测量所得的溶液。(d)使用BCA蛋白质测试的牛胰岛素与ND的解吸附。通过释放吸光光谱，在碱性环境下更多量的胰岛素解吸附，表明NaOH影响了胰岛素的电荷特征。

图14.使用NaOH(pH 10.5)和水处理的ND-胰岛素样品的5天胰岛素解吸附测试，表明在碱性pH环境下胰岛素被释放。测量释放胰岛素的累积重量百分率。在头2天内，NaOH样品显示出解吸附增多，然后为平稳量的释放，总的解吸附率为45.8±3.8％。然而，使用水处理的样品仅释放一部分胰岛素，总计达到2.2±1.2％。通过NaOH释放的大部分胰岛素发生在第1天，表明碱性溶液对完全吸附的ND的最大作用。

图15.在改变的培养基条件下，RAW 264.7噬菌细胞的MTT细胞活力测试。使细胞处于无血清下达到8小时，然后使用以下所示的培养基溶液进行24小时的恢复：(1)DMEM，(2)0.1μM胰岛素，(3)1μM胰岛素，(4)通过NaOH(pH 10.5)释放的大约0.1μM胰岛素，(5)由离心的ND-胰岛素在水中得到的溶液，(6)使用NaOH处理的ND-胰岛素(1μM胰岛素总量)，(7)具有结合的胰岛素的ND(ND-胰岛素，1μM胰岛素总量)以及(8)DMEM 10％FBS。使用NaOH处理的ND-胰岛素(6)的相对活力与浓度较高的胰岛素(3)的活力相似，表明对释放的胰岛素进行了有效的恢复。与通过水释放的胰岛素(5)相比，通过NaOH释放的胰岛素(4)显示出较高的相对活力，表明通过碱性溶液的解吸附更高。ANOVA统计分析得到P＜0.01，表示在各组之间具有显著差异。

图16.(a)3T3-L1脂肪前体细胞以及(b)分化的脂肪细胞，表明在两种类型的细胞之间形态学具有明显的差异。脂肪前体细胞成纤维细胞在补充具有胰岛素、地塞米松和IBMX的培养基时发生了分化，在诱导后的第10天形成完全的分化。在分化过程中形成脂囊泡，并且可以在(b)中见到(放大250倍)。

图17.在培养基条件下，用于Ins1和Csf3/G-csf的实时PCR基因表达。使3T3-L1脂肪细胞处于无血清下达到4小时，然后使用以下所示的培养基溶液进行2小时的恢复：(1)DMEM，(2)0.1μM胰岛素，(3)通过NaOH(pH 10.5)释放的大约0.1μM胰岛素，(4)由离心的ND-胰岛素在水中得到的溶液，(5)使用NaOH处理的ND-胰岛素(1μM胰岛素总量)以及(6)具有结合的胰岛素的ND(ND-胰岛素，1μM胰岛素总量)。对于通过NaOH释放的胰岛素(3)以及使用NaOH处理的ND-胰岛素(5)而言，两种基因的表达增多，表明通过碱性条件使得胰岛素得到有效的释放，同时保持了活性。相比之下，通过水释放的胰岛素(4)以及ND-胰岛素(6)对于两种基因而言表现为相对表达较低，暗示胰岛素被ND的表面捕获从而抑制了蛋白质的功能。代表了RT-PCR样品的基因表达图。ANOVA：P＜0.01。

图18.纳米金刚石-道诺霉素(ND-Daun)吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Daun络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图19.纳米金刚石-道诺霉素(ND-Daun)吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Daun(2)、ND-Daun(3)、以及ND-Daun+NaOH(4)溶液。

图20.分别在水中和PBS中DAUN由纳米金刚石缀合物上的解吸附。释放概况表明在几个小时内，药品的洗脱得到维持。在485nm下测量吸光率。

图21.纳米金刚石-表柔比星(ND-Epi)吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Epi络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图22.纳米金刚石-表柔比星(ND-Epi)吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Epi(2)、ND-Epi(3)、以及ND-Epi+NaOH(4)溶液。

图23.分别在水中和PBS中EPI由纳米金刚石缀合物上的解吸附。释放概况表明在几个小时内，药品的洗脱得到维持。在485nm下测量吸光率。

图24.纳米金刚石-去甲氧正定霉素(ND-IDA)吸附情况的光谱分析。在2小时离心之前(BS)，以及在经历2小时离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-IDA络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图25.ND-Ida吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Ida(2)、ND-Ida(3)、以及ND-Ida+NaOH(4)溶液。

图26.分别在水中和PBS中IDA由纳米金刚石缀合物上的解吸附。释放概况表明在几个小时内，药品的洗脱得到维持。在485nm下测量吸光率。

图27.ND-Daun-Dox-Epi-Ida吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Daun+Dox+Epi+Ida络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图28.ND-Daun-Dox-Epi-Ida吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Daun+Dox+Epi+Ida(2)、ND-Daun+Dox+Epi+Ida(3)、以及ND-Daun+Dox+Epi+Ida+NaOH(4)溶液。

图29.纳米金刚石-二甲胺四环素(ND-Mino)吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Mino络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图30.纳米金刚石-二甲胺四环素(ND-Mino)吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Mino(2)、ND-Mino(3)、以及ND-Mino+NaOH(4)溶液。

图31.二甲胺四环素由纳米金刚石缀合物上的解吸附。在水(上方)以及PBS(下方)中进行的释放概况表明在头几个小时的时间内释放得以维持。

图32.纳米金刚石-四环素(ND-Tetra)吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Tetra络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图33.纳米金刚石-四环素(ND-Tetra)吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Tetra(2)、ND-Tetra(3)、以及ND-Tetra+NaOH(4)溶液。

图34.四环素由纳米金刚石缀合物上的解吸附。在水(上方)以及PBS(下方)中进行的释放概况表明在头几个小时的时间内释放得以维持。

图35.纳米金刚石-强力霉素(ND-Doxy)吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Doxy络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图36.纳米金刚石-强力霉素(ND-Doxy)吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Doxy(2)、ND-Doxy(3)、以及ND-Doxy+NaOH(4)溶液。

图37.强力霉素由纳米金刚石缀合物上的解吸附。在水(上方)以及PBS(下方)中进行的释放概况表明在头几个小时的时间内释放得以维持。

图38.纳米金刚石-土霉素(ND-Oxy)吸附情况的光谱分析。在15分钟离心(14000rpm)之前(BS)，以及在经历15分钟离心从而使各种溶液中存在的任何ND或ND-Oxy络合物形成团之后(AS)，测量吸光率曲线。

图39.纳米金刚石-土霉素(ND-Oxy)吸附情况的比较。在15分钟离心(14000rpm)之前(A)以及之后(B)，ND(1)、Oxy(2)、ND-Oxy(3)、以及ND-Oxy+NaOH(4)溶液。

发明详述

本发明提供了多种官能化的纳米金刚石粒子。在某些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的可溶性络合物，其中所述的治疗试剂是不溶于水的或者是水溶性较差的。在一些实施方案中，本发明提供了包含纳米金刚石粒子以及蒽环类和/或四环素类化合物的络合物。在其他实施方案中，本发明提供了由聚乙烯亚胺表面官能化的纳米金刚石粒子和核酸分子构成的纳米金刚石-核酸络合物。在其他实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和与该纳米金刚石粒子吸附的蛋白质构成的碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物，其中所述的蛋白质被构造成在足够的碱性条件下会由所述的纳米金刚石粒子上解吸附。

I.纳米金刚石-药品络合物

在一些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和治疗试剂构成的络合物。在某些实施方案中，本发明提供了具有治疗试剂的纳米金刚石粒子的络合物，其中所述的治疗试剂是水溶性的、不溶于水的或者是水溶性较差的。在某些实施方案中，本发明提供了具有治疗试剂的纳米金刚石粒子的可溶性络合物，其中所述的治疗试剂是不溶于水的或者是水溶性较差的。在一些实施方案中，本发明提供了具有蒽环类和/或四环素类治疗试剂(例如蒽环类抗生素，四环素，道诺霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，二甲胺四环素，四环素，土霉素等)的纳米金刚石粒子的络合物。在一些实施方案中，纳米金刚石粒子对一种或多种治疗试剂表现出较高的结合能力。

广泛的不溶于水的化合物对一系列医学和生理学紊乱(包括癌症和炎症)表现出治疗相关性。但是，针对调节这些化合物在水中的分散的可升级、易到达以及生物相容性途径的持续研究限制了它们在医学中的普通应用。在本发明的研发过程中实施的试验证明与多个示例性治疗试剂发生的由水分散性纳米金刚石簇介导的相互作用的平台方法增加它们在水中的悬浮，并使得功能性得到保持，从而能够成为之前未实现的新颖的治疗范例。这些治疗试剂包括：Purvalanol A，其为用于治疗肝癌(肝脏的癌症)的高度有前途的化合物；4-羟基三苯氧胺(4-OHT)，用于治疗乳腺癌的新型药品；以及地塞米松，一种临床相关的抗炎症药品，其解决了由血癌和脑癌至风湿病和肾紊乱的并发症的整个范围的疾病。可以使用任何不溶于水或者水溶性较差的治疗试剂。示例性的不溶于水的试剂包括(例如)：别嘌呤醇，乙酰苯磺酰环己脲，苄硫噻嗪，氯丙嗪，甲氨二氮草，氟哌丁苯，吲哚美辛，劳拉西泮，甲氧沙林，甲基强的松，硝苯吡啶，去甲羟基安定，羟基保泰松，波尼松，脱氢皮质醇，乙嘧啶，苯茚满二酮，磺胺异恶唑，磺胺嘧啶，羟基安定，磺胺甲基嘧啶和/或三甲沙林。在本发明的实施方案中使用的不溶于水的、水溶性较差的或可溶于流体的治疗试剂包括中枢神经系统的药品、外周神经系统的药品、感觉器官的药品、心血管系统的药品、呼吸系统的药品、激素、泌尿生殖系统的药品、用于肛门疾病的药品、维生素、用于肝脏疾病的药品、抗痛风药品、酶、抗糖尿病的药品、免疫抑制剂、cytoactivators、抗肿瘤药品、放射性药品、抗过敏药品、抗生素、化疗试剂、生物学药品和体外诊断试剂。更具体而言，在本发明的ND-络合物中使用的不溶于水的、水溶性较差的和/或可溶于流体的治疗试剂包括甾体药品(例如地塞米松，脱氢皮质醇，倍他米松，丙酸倍氯米松，去炎松，氢化可的松，氟氢可的松，普拉雄酮，以及它们的盐和可溶于流体的衍生物)、β-肾上腺素拮抗剂(例如异丙喹喘宁，间羟异丙肾上腺素，盐酸异丙肾上腺素，吡布特罗，间羟叔丁肾上腺素，海索那林，氢溴酸非诺特罗，硫酸海索那林，硫酸间羟叔丁肾上腺素，硫酸沙丁胺醇，硫酸海索那林，富马酸福莫特罗，盐酸异丙肾上腺素，盐酸吡布特罗，盐酸异丙喹喘宁，盐酸马布特罗，叔丁氯喘通，以及它们的盐和可溶于流体的衍生物)、黄嘌呤衍生物(例如甘油茶碱，丙羟茶碱，氨茶碱，茶碱，以及它们的盐和可溶于流体的衍生物)、抗生素(例如羟乙磺酸喷他脒，头孢甲肟，卡那徽素，弗氏霉素，红霉素，交沙霉素，四环素，二甲胺四环素，氯霉素，链霉素，麦迪霉素，两性霉素B，依曲康唑，制霉菌素，以及它们的盐和可溶于流体的衍生物)、以及其他种类的治疗试剂(例如溴化异丙托品，盐酸甲基麻黄碱，盐酸三甲醌醇，盐酸克仑特罗，氧托溴铵，氟托溴铵，盐酸甲氧那明，盐酸氯丙那林，色甘酸钠等)。在一些实施方案中，络合物是以ND和上文所列试剂或本领域的技术人员所了解的其他试剂中的两种或多种的组合(例如2种治疗试剂，3种治疗试剂，4种治疗试剂，5种治疗试剂...10种治疗试剂...20种治疗试剂等)为基础的。考虑到纳米金刚石加工和官能化的可量测性，本发明的方法起到了易达到、作用广泛和重要的途径来将不溶于水的化合物转化为治疗相关的方案。

许多生物医学相关的化合物难以溶于水中，由此限制了它们的治疗潜力[1-5]。这些化合物在体外对诸如肝癌和乳腺癌之类的疾病显示出明显的治疗性质[1-2]。但是，由于这些治疗试剂主要溶解于通常被认为是不适用于注射的溶剂中，所以使这些药品能够对患者进行治疗的新途径的实现受到了阻碍。由于仍广泛地需要包装这些化合物以用于易到达的传递，所以对大量的聚合物和碳-基的纳米材料进行了探索[6-15]。例如，对嵌段共聚物-稳定的纳米乳液作为用于极性和非极性试剂的载体进行了探索[6]。此外，由流体-PEG壳和聚(乳酸-co-乙醇酸)(PLGA)疏水核心构成的流体-聚合物杂交纳米粒子已经研发用于释放水溶性较差的药品[7]。就用于分散水溶性较差的药品的碳-基策略而言，最近已经对聚乙二醇纳米氧化石墨烯用于传递芳香喜树碱(CPT)类似物进行了探索。

纳米金刚石(ND)代表了具有多种医学重要性的重要的新型的一类材料[16-36]。为了生产高度均匀的4-6nm的粒子直径，可以通过超声、离心和研磨方法对ND进行廉价的加工[22，26]。此外，酸处理以除去杂质可以同时得到羧基表面的官能化，这可以解决最后药品的界面接合。此外，表面接合的羧基基团能够稳定ND在水中的悬浮。因此，这些流线式的加工对制备用于医学的ND可升级材料提供了快速、廉价且高度有效的方法。之前对ND的研究证明了它们携带亚德里亚霉素的能力、在无需使用生物相容性或亲脂性试剂涂敷ND的条件下进行细胞内化、以及对鼠科巨噬细胞和人类结肠癌细胞系保持了药品的效力。此外，使用定量实时聚合酶链式反应(RT-PCR)质疑炎症细胞因子的广泛生物相容性测试已经表明它们的生物相容性质²⁶。在本发明的实施方案的研发过程中，已经表明ND簇另外能够与水溶性较差的药品络合从而增强它们在水中的分散性质。为了证明ND的平台能力，使用具有重要暗示(Purvalanol A，4-羟基三苯氧胺)或者已经证明相关性(地塞米松)的3种药品作为模型系统。

纳米金刚石提供了用于广泛的小分子、蛋白质、抗体和RNA/DNA疗法的易溶解的平台。本发明不限于所使用的治疗试剂。在本发明的实施方案的研发过程中进行的工作表明，纳米金刚石粉末的平台可以用于多种治疗化合物在水中的快速溶解，而由于这些化合物单独在水中时是不溶性的(例如目前可溶解于DMSO、乙醇、阻止人类使用的所有溶剂)，所以当前成为平移的挑战。在官能化/药品连接工艺过程中通过加入少量的酸(例如1％或更少)，我们已经证明了诸如4-羟基三苯氧胺(4-0HT，乳腺癌治疗试剂，可溶于乙醇中)、Purvalanol A(肝癌治疗试剂，可溶于DMSO中)和地塞米松(抗炎症试剂，可溶于乙醇/甲醇中)之类的化合物的连接。酸官能化工艺对细胞不具有毒性，如增殖测试所示，并且在几个小时内，pH每分钟都具有短暂的变化，随后快速恢复至正常水平。考虑到纳米金刚石生产、纯化和官能化的每个经济特征，所述工艺为高度可升级的工艺。此外，在某些实施方案中，这为一步工艺，并且可以在几分钟内完成，从而在最可升级的工艺中使得所述工艺可以用于溶解不溶于水的药品。考虑到具有改造性治疗潜力但是禁用的水不溶性的已经已知的且未发现的化合物，本发明通过生物相容性的、经济/可升级的以及极快速的加工速度而满足优化药品溶解的目标。

许多潜在可用的药物由于毒性而不能用于临床应用中。在一些实施方案中，本发明提供了由纳米金刚石粒子和毒性或潜在毒性的治疗试剂构成的络合物。在一些实施方案中，使治疗试剂与纳米金刚石粒子络合会减小药品的毒性并使得对于临床应用而言是安全的。

在一些实施方案中，本发明提供了纳米金刚石粒子与疫苗的络合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种疫苗向受试对象中的传递和持续释放。在一些实施方案中，疫苗由本发明的络合物的释放减小了疫苗传递的副作用，并增加了疫苗传递的效率。在一些实施方案中，在本发明中使用的疫苗包括但不限于：流感疫苗、霍乱疫苗、腺鼠疫疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肝炎A疫苗、狂犬病疫苗、黄热病疫苗、麻疹/腮腺炎/风疹疫苗、伤寒疫苗、破伤风疫苗、白喉疫苗、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)疫苗等。

在一些实施方案中，本发明提供了纳米金刚石粒子与一种或多种抗微生物试剂的络合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种抗微生物试剂向受试对象中的传递和持续释放。在一些实施方案中，抗微生物试剂由本发明的络合物的释放减小了副作用，并增加的抗微生物传递的效率。在一些实施方案中，在本发明中使用的抗微生物试剂包括但不限于抗生素、抗病毒试剂、抗真菌试剂和抗寄生物试剂。

在一些实施方案中，本发明提供了纳米金刚石粒子与蒽环类和/或四环素类治疗试剂(例如蒽环类抗生素，四环素，道诺霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，二甲胺四环素，四环素，土霉素等)的络合物。在一些实施方案中，蒽环类和/或四环素类治疗试剂或其衍生物是不溶于水的或者是在水中的溶解性较差的。在一些实施方案中，蒽环类和/或四环素类治疗试剂或其衍生物是水溶性的。在一些实施方案中，ND-蒽环类络合物和/或ND-四环素类络合物在ND表面与治疗化合物之间表现出显著的结合能力。在本发明的实施方案的研发过程中进行的试验证明在具有治疗试剂(包括道诺霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，二甲胺四环素，四环素，土霉素)的ND络合物中ND表面与治疗化合物之间具有独特的结合。在一些实施方案中，ND与一种或多种任何合适的蒽环类和/或四环素类治疗试剂之间的络合物表现出较高的结合能力。在一些实施方案中，络合物是以ND以及蒽环类抗生素(例如道诺霉素，亚德里亚霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，戊柔比星，米托蒽醌等)和四环素(例如四环素，氯四环素，土霉素，地美环素，强力霉素，赖甲四环素，甲氯环素，甲烯土霉素，二甲胺四环素，吡咯烷甲基四环素)中的一种或任何组合为基础的。在本发明的实施方案的研发过程中进行的试验证明ND/蒽环类络合物和/或ND/四环素类络合物以极为紧密的方式结合，通常保持在水中分散。尽管本发明不限于任何特定的作用机制并且对这些作用机制的理解对本发明的实施而言不是必须的，但是应该理解的是在酸洗涤的ND的表面与治疗化合物之间的相反的电荷使得在NaOH或KOH处理之后具有较高的结合效力。在一些实施方案中，药品由ND/蒽环类络合物和/或ND/四环素类络合物中的释放以持续方式进行。在本发明的实施方案的研发过程中进行的试验已经证明对于抗药疾病的模型(例如癌症)而言，极为紧密的ND-药品结合可以使药品被运送至细胞中，并且由于ND保持了细胞内药品的存在所得抗性可以抵消。由此，防止了药品的排出/流出。在一些实施方案中，ND/蒽环类络合物和/或ND/四环素类络合物为抗多种药品的疾病提供了有效的治疗，所述的疾病例如癌症、肺结核、细菌感染等。在一些实施方案中，由于防止了药品由细胞中排出/流出，所以ND/蒽环类络合物和/或ND/四环素类络合物为抗多种药品的疾病(例如癌症、肺结核、细菌感染等)提供了有效的治疗。

总体而言，本发明适用于由癌症到炎症、再到再生医学等的特别广泛的治疗策略。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供了一种或多种疾病、迹象、状况和紊乱的治疗、症状减轻和/或抑制，其中所述的疾病、迹象、状况和紊乱包括但不限于：急性髓性白血病，抗药性白血病，乳腺癌，淋巴瘤，子宫内膜癌，肺癌，卵巢癌，疟疾，兽病应用，抗万古霉素肠球菌(VRE)，Parkinson(例如作为神经保护剂)，纤维肌痛，感染的动物咬伤(例如血败血性巴斯德氏菌(pasteurella multocida)，侵肺巴斯德菌(pasteurella pneumotropica)等)，类风湿性关节炎，反应性关节炎，慢性炎症性肺病(例如全细支气管炎，哮喘，囊性纤维化，支气管炎等)，结节病，抑制Marfan综合征患者的主动脉瘤，多发性硬化症，睑板腺功能异常，痤疮，阿米巴痢疾，炭疽，霍乱，淋病(例如在不能给予青霉素时)，Gougerot-Carteaud综合征，莱姆病，黑死病，牙周病，呼吸道感染(例如肺炎)，HIV(例如作为HAART的佐剂)，洛矶山斑点热，梅毒(例如在不能给予青霉素时)，泌尿道感染，直肠感染，子宫颈感染，上呼吸道感染(例如由化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流行性感冒嗜血杆菌(Hemophilus influenza)引起)，下呼吸道感染(例如由化脓链球菌，肺炎链球菌和肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)引起)，皮肤和软组织感染(例如由化脓链球菌，金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureaus))，由立克次氏体引起的感染(例如洛矶山斑点热，斑疹伤寒群感染，Q热，立克次氏体病)，饲鸟病的鹦鹉热(例如由鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)引起)，砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)引起的感染(例如非复杂性尿道感染，子宫颈感染或直肠感染；包涵体性结膜炎；沙眼；性病淋巴肉芽肿等)，腹股沟肉芽肿(例如肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)引起)，回归热(例如由包柔氏螺旋体菌引起)，巴尔通体病(例如由杆菌状巴顿体(Bartonella bacilli-formis)引起)，软下疳(例如由杜克嗜血杆菌(Hemophilus ducreyi)引起)，兔热病(例如由土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)引起)，斑块病(例如由鼠疫杆菌(Yersinia pestis)引起)，霍乱(例如由霍乱弧菌(Vibrio cholera)引起)，胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)感染，阿米巴性痢疾(例如由溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)引起)，泌尿道感染(例如由引起大肠杆菌、克雷白氏杆菌(Klebsiella)等引起)，由易感染的革兰氏阴性有机体引起的感染(例如E.coli，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，志贺氏菌，不动细菌，克雷白氏杆菌以及类杆菌)，严重的痤疮等。此外，在一些实施方案中，本发明的组合物和方法还与非生物学的工艺相关，其中所述的工艺需要不溶性试剂溶解于水，特别是在它们可以与惰性物质(例如纳米金刚石，其为极其稳定的)快速偶联并且可以通过简单的离心工艺容易地除去(如果需要)时更是如此。就生物学应用而言，已经显示纳米金刚石可以通过泌尿系统由体内除去，从而证明它们的生物顺应性。

II.纳米金刚石-核酸络合物

本发明提供了能够以保持的功能释放核酸的纳米金刚石-核酸络合物。在某些实施方案中，此类络合物起到了非病毒基因传递载体的作用。例如，在广泛的医学紊乱中可以使用此类ND-核酸络合物，其中所述的紊乱包括癌症、炎症、自身免疫疾病、伤口康复、疼痛、神经紊乱以及其他类型的紊乱。通过使用低分子量的聚乙烯亚胺(例如PEI800)对ND表面官能化，显示DNA质粒能够在引入细胞时被释放，但是在未经历官能化步骤的条件下，DNA能够与ND结合(通过物理吸附)，但是不被释放。例如，在治疗癌症、炎症、疼痛、伤疤/伤口康复、感染和糖尿病胰岛素传递、以及能够使用基因类型的疗法治疗的其他紊乱中，可以使用ND-核酸络合物。

III-碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物

本发明提供纳米金刚石-蛋白质络合物，该络合物可以例如使所述的蛋白质在碱性条件下解吸附。在本发明的实施方案的研发过程中进行的工作以纳米金刚石(ND)-胰岛素络合物来示例本发明，其中所述的络合物能够不依赖pH释放蛋白质(例如用于糖尿病治疗和伤口康复)。这是重要的，因为已经显示在皮肤烧伤之后，立即给予胰岛素会抑制感染(主要的并发症)。此外，已经显示在烧伤之后皮肤pH的水平可以达到碱性的水平(例如10-11)。在本发明的实施方案的研发过程中进行的工作已经显示此类络合物在所述的pH水平下可以选择性地释放胰岛素，同时未释放的胰岛素功能被捕获直到其被传递。在某些实施方案中，例如其中蛋白质为胰岛素的那些，ND-蛋白质络合物可以用于治疗伤口康复、感染和糖尿病胰岛素传递等。

仍非常需要药品传递的加强方法从而使治疗作用达到最大，同时减少相关的并发症。系统治疗提出了多个与普遍存在的药品暴露于肌体有关的问题，并且可以导致超过治疗益处的有害的副作用。有效地靶向并控制药品的传递以便限定药品-组织的相互作用是所需的结果。就这一点而言，位点特异性的药品传递对于由癌症至心血管疾病的治疗的大量疾病而言是高度有利的。在纳米医学中最近的进步(例如成像及诊断[1-3]，药品传递[4-10]以及基因诊断[11-13])已经证明了纳米粒子治疗试剂的益处，包括降低药品的浓度、靶向传递、减少并发症以及生物相容性[3，14-16]。

大量的研究显示了药品或治疗分子与ND的短暂连接或缀合的效力，其中所述的药品或治疗分子包括化疗试剂、有机分子和蛋白质[29，33，34]。最近的工作是关于ND的药品释放概况[8，9]，但是关于蛋白质-基药品的释放具有较少的科学调查。蛋白质-基药品的实例包括细胞因子、单克隆抗体、激素和凝血因子，对于靶向药品的传递而言，所有这些都具有较大的前景或者已经得到了证实。

药品传递中加强的特异性的目的在于在系统洗脱时通过局部浓缩治疗试剂并减小不利的副作用来改善多种方法。如以下实施例2所述，在水性溶液中，牛胰岛素与爆轰纳米金刚石通过物理吸附而非共价结合，并且证明了在氢氧化钠的碱性环境中依赖pH进行解吸附。通过FT-IR光谱和ζ电位测量来证明胰岛素与ND的吸附，同时使用TEM成像来使吸附和解吸附形象化，使用蛋白质检测测试来进行定量并通过MTT和RT-PCR来证明蛋白质的功能。ND与胰岛素以4∶1的比例结合显示分别在pH中性和碱性溶液中吸附情况为79.8±4.3％，解吸附情况为31.3±1.6％。此外，在NaOH(pH10.5)和中性溶液中的5天解吸附测试分别得到解吸附情况为45.8±3.8％和2.2±1.2％。MTT活力测试以及定量RT-PCR(基因Ins1和Csf3/G-csf的表达)显示结合的胰岛素保持无活性的，直到碱介导的解吸附。因此，本发明提供了使用具有经证实的可调释放以及保持的活性的治疗蛋白质-ND络合物在持续的药品释放、伤口治疗和成像中的用途。

实施例

列出以下实施例以便提供了本发明的某些示例性实施方案，并且无意于限定于这样的范围。

实施例1

可溶性纳米金刚石-药品络合物

本实施例描述了可溶性纳米金刚石-药品络合物的制备和测试。

ND-药品络合物的制备

制备单独的ND(20mg/ml)、ND：Purvalanol A(10∶1的比例，20mg/mlND，2mg/ml Purvalanol A)和Purvalanol A(2mg/ml)悬浮在DMSO形成的样品。将DMSO混合物在水中稀释20倍，从而创建具有ND与药品的多种混合物的5％DMSO溶液。

为了制备ND：4-OHT络合物，将1mg 4-OHT溶解于174mM乙酸的去离子水中。将ND(10mg/ml)超声处理4小时，加入到4-OHT样品中，并形成完全的涡流，从而产生ND：4-OHT缀合物溶液(5mg/mL ND，0.5mg/mL4-OHT)。制备唯一的溶剂(174mM乙酸)、唯一的ND(5mg/mL)、以及唯一的4-OHT(0.5mg/mL)溶液作为对照。

药品吸附/解吸附的UV-Vis光谱特征

在扫描前，对于4-OHT和ND，所有的样品都分别稀释为浓度50μg/mL和500μg/mL。在25℃下，所有的样品都在14000rpm下离心2小时，其中随后收集上清液以用于200nm至600nm的光谱扫描。通过ND-络合物沉降试验测定药品承载浓度，其中所述的试验由初始吸光率读数、然后在25℃下在14000rpm下离心2小时、接着进行最终的吸光率读数。然后，通过测量初始读数与最终读数之间的差异来计算承载药品的浓度。

透射式电子显微镜

通过对ND：4-OHT溶液进行超声处理，然后将液滴吸到碳TEM网格(Ted Pella)上来进行TEM。在干燥2小时后，使用JEOL 2100F Field EmissionGun TEM来进行高压200kV成像。此外，通过相同的方案对原始的ND样品成像。

粒径以及ζ电位的测量

使用Zetasizer Nano(Malvern Instruments)测量络合物的粒径和ζ电位。如上文所述，在25％水性DMSO中制备ND：4-OHT和Dex-ND络合物。如上文所述，在5％水性DMSO中以相同方式制备ND：Purvalanol A络合物。在所有的络合物中ND和治疗试剂的最终浓度分别为1mg/mL和0.1mg/mL。在25℃下在90°散射角下进行所有的尺寸测量。通过11个测量的累积分析得到平均水力直径。在25℃下使用毛细孔进行ζ电位的测量，并且通过15个测量的累积分析得到平均电动势。

DNA片段的测试

将在5％DMSO水溶液中1∶10的稀释液、在5％DMSO水溶液中的ND(1mg/ml)、在5％DMSO水溶液中的ND：Purvalanol A(10∶1比例，1mg/mlND，0.1mg/ml Purvalanol A)以及5％DMSO水溶液中的Purvalanol A(0.1mg/ml)加入到HepG2组织培养细胞中并生长24小时。在500500μL裂解缓冲剂(10mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM EDTA，1％Triton X-100)中裂解培养细胞。分别经过Rnase A和蛋白质酶K处理之后，在37℃下温育30分钟。在苯酚氯仿萃取后，在异丙醇中分离得到核DNA，并在-80℃下储存过夜。然后，在70％乙醇洗涤后，将样品再次悬浮于DEPC水中，并使用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，最后使用菲啶溴红染色。

MTT细胞活力测试

在96孔板中，在包含75ug/mL ND或ND：4-OHT络合物(75ug/mL ND，7.5ug/mL 4-OHT)的pH7.1 MEM/EBSS培养基中接种MCF-7细胞，直到达到50％汇合。使用7.5ug/mL 4-OHT作为阳性对照。所有样品说明和4-OHTND络合物溶液相关的1.31mM乙酸。在CO₂下将培养物在37℃下保持44小时，然后根据制造商的方案(Sigma-Aldrich)进行MTT-基细胞活力的测试。使用Safire多孔平板读取器(Tecan)和Magellan软件(Tecan)，在570nm下测定吸光率。所有的样品都进行3个重复试验。

结果

如之前所述，合成、纯化和加工ND[22，26]。傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量证明在所述的表面上具有羧基基团，该基团是在为了出去污染物的纯化工艺过程中经过酸处理后沉积的[26]。最初假定，使用羧基基团会有助于ND与药品分子通过物理吸附和静电相互作用而形成界面接合的能力，使得所述的药品能够在外部刺激下最终被释放。在本实施例中，除了功能性测试以外，通过大量的药品-ND成像和表征试验、以及药品-ND界面接合的UV-Vis分析来证明上述假说。

由于Purvalanol A作为肝癌的化疗试剂的巨大潜力，其为与ND络合的理想药品。Purvalanol A可溶于DMSO中，并且为能够中断细胞周期进程的细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂。已经显示，myc(在癌症中通常为构成性表达的原癌基因)的过表达会促进细胞系的死亡。由于myc在细胞增殖中的作用，其过表达或突变通常导致癌症。选择4-羟基三苯氧胺(4-OHT)，一种不溶于水的乳腺癌治疗试剂，作为另一个模型药品系统，这是由于已经得到证明的其对抗雌激素相关癌症的效力。最后，选择地塞米松(Dex)作为额外的药品模型是由于在其适合的其他生理学条件下，地塞米松作为甾体抗炎药品的广泛临床相关性。已经证明所有的ND-药品络合物会快速地分散于水中，表明ND平台作为可升级的不溶于水的治疗化合物传递试剂的潜在适用性。

为了检测在引入ND条件溶解性的改变，比较单独悬浮于DMSO中的ND(20mg/ml)、ND：Purvalanol A(10∶1比例，20mg/ml ND，2mg/mlPurvalanol A)、以及Purvalanol A(2mg/ml)样品。将DMSO混合物在水中稀释20倍，从而创建具有ND与药品的多种混合物的5％DMSO溶液(图1A-1C)。在水中稀释后，Purvalanol A由溶液中沉淀，从而产生浑浊的流体(图1C)。ND的存在会显著地降低Purvalanol A水性溶液的浑浊度，推测是通过使药品高效地吸附在ND的表面上，这暗示了溶液中游离Purvalanol A减少。在本研究中，已经针对多种类型的药品(例如亚德里亚霉素，4-羟基三苯氧胺，地塞米松等)证明了ND与治疗试剂之间的表面界面。尽管不必理解或实施本发明，并且尽管未限定本发明，但是假定物理吸附为Purvalanol A与ND之间的主要相互作用。之前已经证明，通过加入或除去盐来调节这种相互作用而使得小分子被释放的潜力²⁶。由于Purvalanol A-ND界面的可逆性，对于将药品初始分散于水中以及促进其随后的释放而言，所述的络合物起到了有利的平台的作用。

考虑到4-羟基三苯氧胺(4-OHT)作为用于雌激素受体阳性乳腺癌的三苯乙烯(TPE)治疗策略是重要的，选择4-羟基三苯氧胺(4-OHT)作为ND-药品络合的第二治疗试剂。4-OHT可溶于乙醇中，并且甚至通过系统给药和治疗对乳腺的局部活性来对其进行描述，其中所述的给药和治疗对于其他药品而言通常可能导致非特异的作用。已经显示，给药4-OHT可通过防止新的原发肿瘤被引入到乳腺中来降低局部复发的风险[37-40]。

ND介导的4-OHT在水性溶解性的加强可通过观察小瓶的可见度来定性检测和证实，其中所述的小瓶装有与使用[37-40]进行的界面测试相似的溶于25％DMSO中的ND、4-OHT和ND：4-OHT样品(图1D-1F)。此外，为了视觉证明ND：4-OHT的界面接合，比较具有和不具有结合的4-OHT的ND的透射式电子显微镜(TEM)图像(图1G-1H)。清楚地观察到在将药品加入到ND溶液中时存在不定形的4-OHT残余物(图1H)。

通过与UV-Vis分光光度计分析偶联的ND沉降测试来进一步定量证明的ND：4-OHT界面接合(图2)。未络合的ND的波长扫描表明大量的ND在离心是形成团状，留下较少的ND剩余部分在上清液中(图2A)。相反，使用未络合的4-OHT在离心前和离心后进行相似的对照测试。UV-Vis吸光率的不明显的变化证明在缺乏ND条件下，尽管进行了离心，但是相同量的游离4-OHT残留在上清液中(图2B)。这种读数起到了对照的作用，从而标记了在未络合的4-OHT分散液中由于离心所发升的变化。因此，在逻辑上符合ND：4-OHT络合物在离心时会形成团状，并且未络合的4-OHT会残留在上清液中，从而使得上清液中的4-OHT减少。在与ND和4-OHT对照相同的条件和浓度下，针对ND：4-OHT溶液在离心前和离心后通过测量UV-Vis吸收情况来测试所述的缀合方案(图2B)。该试验表明在未离心和离心的ND：4-OHT样品之间的吸光率发生了经标记的变化，这暗示大量的4-OHT可能通过ND：4-OHT物理吸附和形成簇而沉降下来与ND缀合。这些数据证明这种观察，即，与单独的4-OHT相比，ND增加了4-OHT在25％DMSO中的溶解性。使用FITC-标记的Dex-ND络合物，在沉降测试中观察到相同的成簇作用(图2C)。

尽管本发明不限于任何特定的机制并且对该机制的理解对本发明的实施而言不是必须的，但是与Purvalanol A和ND之间的相互作用相似，实际上4-OHT和ND之间的相互作用也被认为主要是因为的物理吸附和/或静电。由4-OHT的结构得到的潜在偶极使得存在的表面羧基有助于两种成分之间的界面接合，以便保持捕获的ND：4-OHT。

为了测定ND与各种治疗试剂之间的静电相互作用的物理效果，通过动态光散射(DLS)来检测所述络合的粒径和ζ电位(图3)。3种药品缺乏溶解性最终是由于使用具有DMSO的水进行滴定时粒子聚集的结果。在5％DMSO中，ND的平均直径为46.96nm，而Purvalanol A、4-OHT和Dex分别聚集成340μm、485.1nm和1.245μm粒子。在与ND络合时，PurvalanolA、4-OHT和Dex的平均粒径分别减小至556nm、278.9nm和77.55nm。对于所有药品而言，粒径的减小是药品分子与ND粒子的表面形成物理吸附的证据。这些数据证明药品分子与ND结合的能力并且结果使得粒径显著减小，在一些情况下，减小几个数量级。此外，各个药品的ζ电位显示出在与ND结合时，正电性更强(图3D-3F)。ζ电位的增加有助于ND-药品络合物在水中的溶解性增加，这是由于与中性分子相比，在带电络合物的周围形成水合壳的亲和性更大。

此外，当粒子较小并且具有微小的正电性时，细胞的内化增强，如此可见，已经得到证明的药品溶解性的增大还可以具有与治疗效力增加有关的潜在的临床益处[41-42]。两种性质都有利于穿过带负电荷的质膜的内化，并且可以有利于通过内吞作用和胞饮作用吸收药品。

为了在通过ND络合而使得在水中的分散增强之后评估药品的功能性，进行DNA阶梯测试以证明Purvalanol A诱导的DNA片段(图4A)。在ND：Purvalanol A和Purvalanol A这两种样品中，片段均是明显的，证明Purvalanol在经历被ND捕获以及被ND释放之后的生物学活性得到保持。因此，所述的测试不仅证明了ND使水溶性较差的药品在水性溶液中分散的能力，而且还使得Purvalanol A的治疗活性得到保持。

此外，通过MTT细胞活力测试评价ND：4-OHT络合物的化疗作用(图4B)。图4B示出了在具有ND和不具有ND的MCF-7培养物之间细胞活力不具有显著的差异，这进一步证明了所报告的ND的生物相容性。此外，比较ND：4-OHT络合物与4-OHT阳性对照之间的细胞活力证明，与单独的药品相比，ND：4-OHT络合物具有同等级别的化疗效力。与隐形对照及ND簇相比，暴露于ND：4-OHT络合物使得细胞活力降低7倍。最重要的是，这些观察共同证明了ND通过形成水溶性的ND：4-OHT络合物而增加4-OHT在水中分散的能力，通常保持了药品的功能性。

本实施例证明ND在增强水溶性较差的治疗试剂的水分散性中的应用。由于Purvalanol A和4-OHT/地塞米松可分别特征性地溶解于DMSO和乙醇中，所以选择它们作为模型药品。此外，由于Purvalanol A作为广泛相关的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂/化疗试剂、以及4-OHT作为有效力的乳腺癌药品的功能性，它们在水中的溶解性增强会促进它们持续地转移到临床领域中。ND代表了一类具有医学重要性的纳米材料，这些材料能够与疏水性药品快速且高产量地形成络合物，从而使它们能够悬浮于水中并且用于临床相关的应用中。因此，ND起到了能够促进这些药品容易地传递并保持生物相容性的可升级平台的作用。

实施例2

碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物

本实施例描述了纳米金刚石-蛋白质络合物的制备和测试。

细胞培养

在5％CO₂中，在37℃下，将鼠科细胞系RAW 264.7巨噬细胞和3T3-L1成纤维细胞(ATCC Manassas，VA)保持在分别包含10％FBS(ATCC)和10％CBS(ATCC)的1％青霉素/链霉素(Cambrex，EastRutherford，NJ)的DMEM(Cellgro，Herndon，VA)中。将3T3-L1成纤维细胞在补充有10％CBS的DMEM中培养直到达到90％汇合，根据之前公开的方案，此后脂肪细胞开始分化[35，36]。使用DMEM、10％FBS、0.86μM胰岛素、0.25μM地塞米松和0.5mM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)(SigmaAldrich St.Louis，MO)替代培养基，持续4天，并在第2天更新培养基。在第4天，用DMEM、10％FBS和0.86μM胰岛素替代培养基，并在第6天再次用DMEM和10％FBS替代培养基，并且再持续4天。在第10天细胞完全分化，并随后在DMEM、10％FBS和1％青霉素/链霉素中培养。

ND-胰岛素络合物的形成

在超声条件(100W，VWR 150D Sonicator)下，将纳米金刚石(NanoCarbon Research Institute Co.，Ltd.，Nagano，Japan)在水中分散4小时，以便进一步分散ND聚集体。然后，将水性胰岛素以变换的比例加入到ND溶液中，并充分混合，以便促进胰岛素通过物理吸附与ND结合。

蛋白质的表征

将FITC-标记的胰岛素(Sigma-Aldrich)溶解于1mM原液溶液中。使用Beckman Coulter DU730 UV/vis分光光度计(Fullerton，CA)在大约494nm的峰值(峰值随溶剂变化)吸光率下测量样品。溶解于乙酸(pH 3)中并使用1mM NaOH中和的牛胰岛素(Sigma-Aldrich)用于补充得自FITC胰岛素的结果。使用Micro BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific，Rockford，IL)，在562nm下测量吸光率来进行蛋白质的检测。

FT-IR及TEM表征

制备比例为4∶1的ND及胰岛素，在14000rpm下离心2小时，并除去上清液。将ND-胰岛素团用水漂洗，并在真空下干燥。此外，通过对各个溶液脱水来制备各个ND和胰岛素样品。此外，通过加入1mM NaOH调节ND-胰岛素至pH10.5，在14000下离心2小时并分离ND团来制备用于TEM成像的经NaOH处理的ND胰岛素样品。使用Thermo Nicolet Nexus 870FT-IR分光光度计和Hitachi H-8100 TEM(Pleasanton，CA)在室温下表征样品。

DLS分析

使用Zetasizer Nano(Malvern Instruments，Worcestershire，UnitedKingdom)测量样品的水力直径和ζ电位。如之前所述制备ND和胰岛素。简言之，将粒子以浓度为50mg/mL悬浮于具有相应pH的缓冲剂中。在25℃及173°散射角下进行粒径的测量。通过累积分析确定平均水力直径。根据微粒子在水性介质中的电泳淌度来进行ζ电位的测定，该测定是使用折叠毛细孔(folded capillary cell)以自动模式进行的。

胰岛素的吸附和解吸附

在离心前和离心后，通过蛋白质检测测试来测定胰岛素对ND的吸附。将胰岛素加入到ND悬浮液中，在14000rpm下离心2小时，并萃取及定量所得的溶液。通过加入1mM NaOH的碱性溶液将悬浮液中的ND-胰岛素样品调节至变化的pH来测定胰岛素的解吸附。与吸附测试相似，测定结合比例。

此外，进行5天的解吸附测试，以测定累积的胰岛素的释放。通过将ND与胰岛素(4∶1比例)结合，在14000rpm下离心2小时，并萃取所得的溶液以便除去任何未吸附的胰岛素来制备样品。随后，将调节至pH 10.5的1mM NaOH溶液加入到所述的样品中，充分混合，并在24小时后离心，然后使用BCA测试来测定蛋白质的浓度。除了碱介导的释放以外，加入水从而使一组样品分离。在针对各个条件进行各个测量之后，使用NaOH或水补充样品，并在5天内每24小时重复所述的工艺。

MTT细胞活力测试

将RAW 264.7鼠科巨噬细胞接种于96孔板中，在无血清下持续8小时，然后温育24小时。饥饿后培养基由以下条件构成：DMEM，0.1μM胰岛素，1μM胰岛素，DMEM 10％FBS，在pH10.5下通过NaOH由ND-胰岛素络合物上释放的大约0.1μM胰岛素(胰岛素存在于培养基中)，由离心的ND-胰岛素在水中得到的溶液，在pH10.5下使用NaOH处理的ND-胰岛素(1μM胰岛素总量，ND-胰岛素络合物，存在于培养基中)，以及ND-胰岛素(1μM胰岛素总量，ND-胰岛素络合物，存在于培养基中)。通过在NaOH中对具有吸附的胰岛素的ND样品进行离心，并萃取所得的溶液来制备由ND释放的胰岛素，其中所述的溶液可以使用培养基来重新构建成0.1μM胰岛素。按照相同的方式，使用水作为用于相关解吸附分析的中性溶液。加入相应于10％总体积的3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)溶液(Sigma-Aldrich)，然后温育3小时。在甲臜结晶形成后，除去培养基和MTT溶剂，并将在无水异丙醇(Sigma-Aldrich)中的0.1N HCl加入到样品中从而溶解MTT燃料。在570nm下测量样品的吸光率，在690nm波长下作为背景。

定量RT-PCR

如之前所述实施RT-PCR过程[35]。将3T3-L1脂肪细胞接种于6孔板中，无血清持续4小时，然后恢复到DMEM、0.1μM胰岛素、通过NaOH由ND-胰岛素上释放的大约0.1μM胰岛素(pH 10.5)、在pH中性水中由离心的ND-胰岛素得到的溶液、使用NaOH处理的ND-胰岛素(1μM胰岛素总量)、以及具有结合的胰岛素的ND(ND-胰岛素，1μM胰岛素总量)的培养基溶液中。按照与用于进行MTT测试的那些培养基相同的方式，制备包含DMEM、胰岛素、ND和NaOH的培养基溶液。通过使用TRIzol试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)裂解细胞来完成RNA的分离，并加入到氯仿中，通过离心得到基因材料。使用iScript Select cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad，Hercules，CA)进行cDNA的合成。通过MyiQ Single ColorReal-Time PCR机器(Bio-Rad，Hercules，CA)，使用SYBER Green检测试剂(Quanta Biosciences，Gaithersburg，MD)对Ins 1和Csf3/G-csf基因(IntegratedDNA Technologies，Coralville，IA)的PCR表达进行定量。Rpl32基因(Integrated DNA Technologies)起到了对多个样品中的cDNA进行归一化的看家基因的作用。给出基因的引物序列：

Ins1，5’-AGGTGGCCCGGCAGAAG-3’(SEQ ID NO：1)和

5’-GCCTTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCT-3’(SEQ ID NO：2)；

Csf3/G-csf，5’-CCAGAGGCGCATGAAGCTAAT-3’(SEQ ID NO：3)和

5’-CGGCCTCTCGTCCTGACCAT-3’(SEQ ID NO：4)；

Rpl32，5’-AACCGAAAAGCCATTGTAGAAA-3’(SEQ ID NO：5)和

5’-CCTGGCGTTGGGATTGG-3’(SEQ ID NO：6)。

FT-IR和TEM

尽管本发明不限于任何特定的机制并且对该机制的理解对本发明的实施而言不是必须的，图9中的图示分别为在中性和碱性溶液中胰岛素吸附和解吸附的建议机制的代表。图10中的透射式电子显微镜(TEM)图像示出了裸露的ND(a)、具有吸附的胰岛素的ND(b)、以及在使用NaOH处理后的ND-胰岛素络合物(c)。在(b)中，具有涂敷ND的明显的材料层，该层的厚度为大约5-10nm。NaOH处理的ND-胰岛素样品(c)定量地显示出在ND上材料层减少，表明ND-胰岛素的NaOH处理除去了ND表面上存在的材料。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)光谱(图11)表明在ND上存在胰岛素。示出了胰岛素(1)、裸露的ND(2)、以及ND-胰岛素(3)的样品，以及在ND-胰岛素上的光谱峰值，从而表明与胰岛素相似的特征峰值。

DLS分析

通过动力学光散射(DLS)分析表征ND和胰岛素之间的相互作用，从而表明表1中概括的纳米粒子簇的水力直径和多分散指数、以及图12中所示的ζ电位。在pH7和10.5下，ND簇的平均尺寸保持相似，而胰岛素显示在pH10.5下平均尺寸更大。ND-胰岛素络合物证明平均尺寸与裸露的ND相当，而多分散指数减小。在pH7和10.5下，ND表现出微小的正电性ζ电位，而胰岛素和ND-胰岛素得到负值。在pH10.5下胰岛素和ND-胰岛素的ζ电位基本上比在pH7下的相似样品的负电性更高。

吸附

图9示出了在中性溶液中胰岛素是如何通过物理吸附与ND结合的假设性示意图。将浓度变化的FITC胰岛素样品与100μg/mL ND充分混合，以便促进吸附。由于胰岛素与ND吸附，所以ND-胰岛素的吸光光谱(图13-a)与水性胰岛素的吸光光谱不同。但是，ND-胰岛素络合物保持了定量胰岛素存在所必需的光谱特征。除了任何吸附的材料以外，ND的分子量允许通过离心分离各种成分。剩余溶液的分离和分析产生了与ND的承载能力和所得释放有关的支持数据。图13-a示出了在ND与胰岛素的比例为5∶1下FITC胰岛素的蛋白质吸附，从而表明在水中89.8±8.5％的结合。在离心之前和之后测量ND-胰岛素和胰岛素样品，从而得到与经过离心的胰岛素样品相比胰岛素浓度较低的ND-胰岛素。

使用进行BCA蛋白质测试的标准牛胰岛素进行相似的测试。25μg/mL胰岛素与100μg/mL ND(ND与胰岛素的比例为4∶1)证明79.8±4.3％结合，其中考虑到对胰岛素进行离心的沉降作用。图13-b示出了在离心之前和之后ND-胰岛素样品的吸光光谱，在562nm下具有峰值吸光率。经离心的样品的吸光率明显低于初始样品的吸光率。

通过计算初始与经离心的样品之间的吸光率的差异，并减去初始与经离心的胰岛素对照之间的差异来测定蛋白质的结合比例。由于当对胰岛素进行离心时形成轻微的梯度，所以必须考虑胰岛素对照。

解吸附

按照与吸附测试相同的方式进行解吸附测试。将FITC-标记的胰岛素和标准的胰岛素的水性溶液分别以5∶1和4∶1的比例加入到ND悬浮液中。测量初始及经离心的样品，并计算解吸附的胰岛素的量。比较在pH值为8.90，9.35，10.35和11.53下释放的FITC胰岛素，在最高的碱性pH下证明解吸附最大(图13-c)。在pH10.7下的分离测试显示ND-胰岛素络合物取得53.3±1.2％的解吸附。此外，在pH7.1、9.3和10.6下标准的胰岛素释放显示在pH10.6下的洗脱最大(图13-d)。这种解吸附概况显示，胰岛素的释放表明与溶液的pH成比例。在NaOH存在下，在pH10.5下，使用比例为4∶1的ND和胰岛素进行的分离测试得到胰岛素的释放为31.3±1.6％。

图14示出了在NaOH(pH 10.5)和水中，在5天内由ND释放的胰岛素。通过总体的吸附胰岛素的重量百分率来定量累积洗脱的胰岛素。与水样品中胰岛素的0.2±0.1wt％释放量相比，在碱性条件(pH 10.5)下在第1天释放的胰岛素的量为32.7±1.9wt％，表明在两种样品之间的释放具有相当大的差异。到第3天，两种样品都趋向平稳，并且胰岛素的释放显著减少，而到第5天，通过NaOH和水洗脱的胰岛素的总量分别为45.8±3.8wt％和2.2±1.2wt％。这些值表明由包含NaOH的样品释放的胰岛素的量为包含水的样品的20倍。

MTT细胞活力测试

在不同的胰岛素和ND条件下进行细胞活力测试(图15)：DMEM(1)，0.1μM胰岛素(2)，1μM胰岛素(3)，通过NaOH(pH 10.5)由ND-胰岛素络合物释放的大约0.1μM胰岛素(4)，在水中由离心的ND-胰岛素得到的溶液(5)，使用NaOH处理的ND-胰岛素(1μM胰岛素总量)(6)，具有结合的胰岛素的ND(ND-胰岛素，1μM胰岛素总量)(7)，以及DMEM 10％FBS(8)。注意如果胰岛素完全由ND表面上解离，则在培养基中，对于两种包含ND的样品而言，吸附到ND上的胰岛素的量等于1μM。在0.1μM(2)至1μM(3)胰岛素下形成显著较高的相对活力，在较高的胰岛素浓度下会干扰增加的活力。通过NaOH由ND-胰岛素释放的胰岛素的相对活力(4)与0.1μM至1μM胰岛素之间的相对活力相当。尽管之前的解吸附结果表明在所得的溶液中胰岛素的水平较低，但是通过水解吸附的胰岛素(5)显示出与0.1μM胰岛素相似的相对活力。使用NaOH处理的ND-胰岛素(6)证明相对活力得到改善，其高于1μM胰岛素但是低于10％FBS培养基。ND-胰岛素(7)得到与通过水释放的DMEM和胰岛素相比较低的相对细胞活力。对于使用NaOH处理的ND-胰岛素和ND-胰岛素条件而言，在恢复过程中ND存在于培养基中，从而得到与缺乏ND的样品相似的与ND的细胞相互作用。规则培养基(10％FBS，在DMEM中(8))反应了最高的相对活力。进行方差分析(ANOVA)统计测试，得到P＜0.01，表明各样品组之间的显著差异。

定量RT-PCR

根据在＞90％的细胞中观察到的形态学变化和脂囊泡形成，在诱导后10天，脂肪前体细胞分化产生脂肪细胞(图16)。脂肪前体细胞(a)因清楚可见的脂囊泡而与脂肪细胞(b)不同。通过对胰岛素1(Ins1)和粒细胞集落刺激因子(Csf3/G-csf)的基因进行RT-PCR来对脂肪细胞上释放的胰岛素的作用进行定量，并针对看家基因核糖体蛋白质L32(Rpl32)进行归一化。示出了相对于变化的培养基溶液的Ins1的相对表达(图17-a)。与DMEM(1)相比，由NaOH释放的胰岛素(3)以及使用NaOH处理的ND-胰岛素(5)显示出最高的相对表达，从而表明这些条件对Ins1具有最大的影响。由水释放的胰岛素(4)以及ND-胰岛素(6)得到与仅为胰岛素条件(2)相比中等程度的表达水平，从而显示Ins1的表达最低。Csf3/G-csf的相对表达示于图17-b中，并且显示出与Ins1相似的趋势，其在于由NaOH释放的胰岛素(3)以及使用NaOH处理的ND-胰岛素(5)都证明了较高的表达水平，而由水释放的胰岛素(4)以及具有结合的胰岛素的ND(6)明显较低。但是，与Ins1相比，0.1μM胰岛素对Csf3/G-csf的作用相对较高。ANOVA统计测试得到P＜0.01，表明各样本组之间的显著差异。

物理吸附

在ND合成过程中的条件得到了羟基和羧基基团高度官能化的亲水性碳表面，这可以在水性溶液中得到特征性的表面电荷[8，28，29]。这种官能团提供了通过多肽的阴离子端基基团(-COO^-)和质子化的氨基基团(-NH₃ ⁺)之间的静电吸引而用于蛋白质的物理吸附的有利条件。处理电荷-电荷之间的相互作用，在-NH₃ ⁺与-COO^-或者其他含CO表面基团之间可以形成氢键，并且H键结合能为10-30kcal/摩尔[33，34，37]。胰岛素分子的外部上的带电氨基酸残基有助于其亲水性并且可以被ND的表面所吸引。尽管胰岛素的等电点为大约5.6[38]，表明在中性pH下的微小的负电净电荷、静电相互作用以及ND官能团与氨基生物分子之间的H键可以导致吸引的相互作用。图9假设性地示出了在中性环境下胰岛素与ND的吸附的概念。

TEM图像示出了与裸露的ND(a)相比，在浸渍于水性胰岛素中之后的ND，其具有涂敷ND表面上的可见材料层。由于加入胰岛素(b)为唯一的区别因素，所以优先地将材料层(厚度为5-10nm)作为吸附的胰岛素。图10所示的ND簇扩大了极高的表面积，从而可以使大量的胰岛素吸附在ND的官能团上。事实上，之前ND的表征证明了明显的表面积为450m²/g[9]。TEM成像提供了对蛋白质结合的视觉识别，并且可以通过FT-IR光谱对吸附进行定量。通过对胰岛素、裸露的ND以及具有结合的胰岛素的ND进行FT-IR表征来证实胰岛素与ND的吸附(图11)。在具有结合的胰岛素(c)的ND光谱中，清楚可见胰岛素(a)的特征光谱，其为可定量的结果，该结果不能在不具有吸附的胰岛素(b)的ND中获得。TEM和FT-IR提供了胰岛素吸附在ND的表面上的其他证明。

ND-胰岛素络合物的其他证明通过UV/vis分析给出。吸附测试表明在最佳的结合能力(在所得的溶液中缺乏过量的胰岛素)下ND与FITC胰岛素的比例为5∶1，表明89.8±8.5％的吸附。离心ND-胰岛素样品缺乏可测量的吸光率(图13-a)表示相当多的FITC胰岛素与ND吸附。在485nm下，在初始ND-胰岛素样品与离心ND-胰岛素样品之间的吸光率差异是由于ND的分子量以及离心过程中具有结合的胰岛素的ND的沉淀，从而在溶液中留下微量的残余胰岛素。初始胰岛素与离心胰岛素对照样品之间的微小差异可用于对吸附值归一化，这是由于与水性溶液相比，胰岛素的分子量可以分离多种成分。图5-a表明与胰岛素的吸光光谱相比时改变的ND-胰岛素的吸光光谱，其中胰岛素和ND-胰岛素的吸光峰值由485nm移位至505nm。这种峰值的移位可能是由于在FITC-标记的胰岛素吸附在ND上时FITC分子光学性质的改变，从而表明在蛋白质吸附中通常可见的蛋白质结构的可能的构象变化[39]。

由标准的胰岛素吸附测试得到相似的结果，其中ND与胰岛素的最佳结合比例为4∶1。考虑到与FITC-标记的胰岛素相比的胰岛素的分子量，预计对标准的牛胰岛素的吸附比例较高。图13-b描绘了BCA蛋白质测试的吸光率，其表明了初始以及离心ND-胰岛素样品(其与基本为79.8±4.3％的胰岛素吸附有关)的对比峰。

与FITC-标记的胰岛素以及标准胰岛素有关的胰岛素吸附测试与证明了蛋白质-ND的结合[34]的多个研究一致，并且表现出独特的吸附能力，其中大约80％的胰岛素在最佳的ND-胰岛素比例下与ND表面结合。如通过吸附测试证明的ND的蛋白质承载能力暗示相对高效的药品-承载工艺，其中大部分可利用的蛋白质吸附到ND的表面上。对于药品传递的制备方法而言，通过消除可以影响药品或底物的性质的络合物缀合方案而使得水性溶液中的物理吸附的简单方法是理想的。

此外，通过动力学光散射对ND与胰岛素之间的物理相互作用进行表征(表1)。

表1

表1示出了在pH7和10.5下纳米粒子簇的水力直径以及相关的多分散体指数(PDI)的DLS分析。在两种pH条件下，ND表现出相似的尺寸和PDI，同时在pH10.5下胰岛素往往形成较大的粒子并且PDI增大。在形成ND-胰岛素络合物时，PDI减小，表明ND调节了簇的相对均衡的分布尺寸。

在pH 7和10.5下，ND形成相似水力直径和分布的簇，同时胰岛素在碱性溶液中聚集成较大的尺寸。在与ND络合时，不仅多分散指数减小，而且簇的ζ电位也被改变成负值(图12)。与胰岛素相比，在形成ND-胰岛素络合物中所见的PDI的减小表明ND介导的更均匀纳米材料-蛋白质络合物的发展。ND在碱性溶液中开始保持微小正性的ζ电位，同时胰岛素本质上具有负性的ζ电位，该电动势在碱性溶液中进一步降低。该ζ电位在引入ND时得到保持，暗示胰岛素附着在ND的表面上。由于在pH 10.5下簇的ζ电位处于狭窄有限的值范围内，所以进一步证明了所述的结果。裸露的ND与ND-胰岛素之间ζ电位的清楚的差异表明ND与胰岛素之间的相互作用。

pH介导的解吸附

在碱性氢氧化钠溶液中观察到胰岛素由ND-胰岛素络合物上释放，并且这种释放可以通过受到pH调控影响的电荷特征的变化来解释。在等电点以上的pH下，在水性环境中，由于官能端基基团的电荷发生了改变，胰岛素可以携带负性的净表面电荷。随后，随着碱性的增加，负电荷可以变得更强，并且影响与其他物质的电荷相互作用。因此，pH对解吸附的影响更直接。胰岛素分子通过静电相互作用与ND表面上的带电官能团结合，并且随着水性环境由中性变为碱性，氢键开始表现出改变的电荷特征，并由此通过静电排斥由ND上释放。

解吸附的胰岛素的量似乎与溶液的pH成比例，表现为在碱性溶液中，胰岛素的释放增多(图13c-d)。FITC-标记的胰岛素解吸附的吸光光谱表示随着pH由8.90变为11.53而使得解吸附增多(图13-c)，并且相似的图形在图13-d中表示，其中使用了标准的胰岛素。这些结果与之前体积的pH依赖的解吸附前体相符。在NaOH中标准的胰岛素的解吸附为31.3±1.6％证明胰岛素能够被吸附，并且随后由ND的表面被释放到水性培养基中。

许多实际应用需要药品在一段时间内释放，并且为了定量胰岛素的时间-释放，使用具有结合的胰岛素的ND在NaOH和水中进行5天解吸附测试。图14中两种释放曲线之间不成比例示例了碱性和中性溶液中解吸附能力的差异。与在水中的5天解吸附仅为2.2±1.2％相比，碱性介导的5天解吸附达到45.8±3.8％。在测试的第1天，发生了大量的解吸附，表明胰岛素由ND上的突发释放。但是，第2天产生了中等程度的胰岛素的释放。时间依赖的胰岛素的释放能够使ND-胰岛素络合物在暴露于碱性环境下时缓慢地释放胰岛素。

蛋白质功能的保留

上述部分中讨论的结果建立了用于pH介导的胰岛素解吸附的基础，然而该系统的试剂应用依赖于在由ND表面上释放时所保留的药品的功能。由MTT活力测试和RT-PCR得到的数据表明在解吸附之后，胰岛素的功能确实得到保持，如细胞活力和基因表述所示。此外，尽管存在ND-胰岛素络合物，但是ND表面所捕获的胰岛素对细胞途径而言似乎保持无活性的。

细胞活力数据(图15)表明，在细胞恢复中，经历NaOH的ND以及使用NaOH处理的ND-胰岛素络合物释放的胰岛素增多，其中在培养基溶液中所述的ND-胰岛素络合物由ND和解吸附的胰岛素构成。与DMEM基线相比，在这两种培养基条件下细胞的活力水平增加表明在饥饿期之后，释放的胰岛素活化了细胞恢复途径。此外，使用NaON处理的ND-胰岛素的活力表明细胞的恢复是在释放的胰岛素以及随后经NaOH处理的ND存在下发生的，其中所述的经NaOH处理的ND可以或者不可以得到裸露的ND表面。之前对RAW 264.7巨噬细胞[40]进行的血清饥饿和胰岛素恢复的研究与所获得的显示胰岛素介导的恢复的MTT数据一致。

相比之下，由水和ND-胰岛素释放的胰岛素产生了较低的活力水平，暗示在中性环境下具有较少或不具有胰岛素的释放。ND-胰岛素络合物似乎会防止吸附的胰岛素影响细胞途径，即使是ND表面上暴露的胰岛素。通常，已知蛋白质在吸附到表面上时[39]，会发生构象变化，从而导致物理性质改变，并且在ND表面上胰岛素结构的变化会抑制细胞途径的活化。胰岛素由可溶环境中有效地分离直到通过碱度进行调节对于本系统的靶向胰岛素传递而言是重要的。

RT-PCR的基因表达与MTT活力测试结果密切相关。图17示出了基因Ins1和Csf3/G-csf的相对表达，该基因受到脂肪细胞的胰岛素刺激的正调节[35]。对于各基因而言，包含由NaOH释放的胰岛素以及包含使用NaOH处理的ND-胰岛素的样品的表达水平增多，证明了胰岛素由ND表面上解吸附之后的效力。活性胰岛素的缺乏不会增加表达水平，如DMEM基线所示。与MTT结果相似，对于各基因而言，由水以及ND-胰岛素释放的胰岛素显示出表达水平降低，表明对应答不足或者胰岛素浓度降低从而不能活化细胞途径。这说明对于由ND解吸附的胰岛素而言，蛋白质的活性得到保持，如通过因胰岛素的刺激所导致的基因表达来确定。此外，尽管吸附的胰岛素与ND的表面结合，但是其不能增加细胞活力或基因的表达。按照这种方式，ND-胰岛素络合物提供了在碱性环境中用于靶向胰岛素(或其他蛋白质)传递的独特方法，通常在中性溶液中保持稳定。

此外，这些发现表明胰岛素的吸附以及由ND上洗脱是pH依赖性的，该观察可以扩大用于治疗目的。尽管本发明不限于任何特定的机制并且对该机制的理解对于本发明的事实而言不是必须的，但是显示在碱性环境下可能通过蛋白质表面电荷的变化作用，从而降低了ND与胰岛素吸引的倾向而使得胰岛素的解吸附增多。探索这种pH介导的解吸附机制可以提供用于增强的药品传递方法的独特益处。胰岛素通过生长激素的作用来加速伤口的康复是公知的[41-45]。此外，之前的研究证实伤口组织的碱度由于细菌集落而增加，有时高达pH10.5[46，47]。考虑这两种观察，ND-胰岛素络合物可以用作用于治疗伤口康复的有用的治疗药品传递系统。给药具有吸附的胰岛素的ND能够缩短康复过程，并通过在碱性伤口区域释放胰岛素来降低感染的发生率。由于在损伤位点处发生了胰岛素的释放，所以限定了胰岛素的系统活性。因此，本发明提供了定向于损伤伤口的靶向胰岛素释放机制作为使用ND作为胰岛素载体的再生治疗。

在本发明的实施方案的研发过程中进行的试验证明胰岛素通过简单的物理吸附与ND发生有效的非共价吸附，并且研究到蛋白质的解吸附是pH依赖的。ND-胰岛素络合物暴露于碱性环境会调整ND与胰岛素之间的相互作用，从而使得蛋白质被释放。成像方法和吸附/解吸附测试表明胰岛素与ND发生有效的结合，并且在碱性条件下大量胰岛素被释放。MTT和RT-PCR分析表明在解吸附后功能得到保持，同时吸附的胰岛素大多保持无活性的。

实施例3

纳米金刚石-药品结合测试

在本发明的实施方案的研发过程中进行了纳米金刚石-药品结合测试，以便证明广泛的蒽环类和四环素类化合物之间的有效力的相互作用。使用UV-vis分光光度计以及离心测试分析诸如道诺霉素、去甲氧正定霉素之类的治疗试剂的结合效率(参见图18-39)。在所有情况下，纳米金刚石-药品的相互作用能够广泛地使治疗试剂形成团(参见图19，22，25，28，30，33，36和39)，表明了有效地吸附，其通过分光光度计分析进一步证实(参见图17-18，20-21，23-24，26-27，29，参见图17-18，20-21，23-24，26-27，29，1-32，34-35和37-38)。

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部分I(可溶性纳米金刚石-药品络合物)以及实施例1的参考文献

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本申请提及的所有公开和专利都以引用方式并入本文。在不脱离本发明的范围和实质的条件下，本发明的所述的方法和组合物的各种修改和改变对于本领域的技术人员而言是显而易见的。尽管参照特定的优选实施方案描述本发明，但是应该理解的是所要求的本发明不应该不适当地限于这些特定的实施方案。事实上，对于相关领域中的技术人员显而易见的、用于实施本发明的所述方式的多种修改都在所附权利要求书的范围内。

Claims (13)

1.一种包含可溶性络合物的组合物，其中所述的可溶性络合物包含：

a)包含一个或多个表面羧基基团的纳米金刚石粒子；以及

b)治疗试剂，其中所述的治疗试剂本质上是不溶于水的或者是水溶性较差的，其中所述的治疗试剂吸附在所述的纳米金刚石粒子上，从而形成所述的可溶性络合物，其中所述的可溶性络合物可溶于水。

2.一种制备可溶性络合物的方法，包括：将纳米金刚石粒子与治疗试剂在酸溶液存在下混合，使得所述的治疗试剂吸附在所述的纳米金刚石粒子上，由此形成可溶性络合物，其中所述的治疗试剂本质上是不溶于水的或者是水溶性较差的。

3.权利要求2所述的方法，其中所述的酸溶液包含乙酸。

4.一种包含纳米金刚石-核酸络合物的组合物，其中所述的络合物包含：

a)包含一个或多个表面聚乙烯亚胺分子的纳米金刚石粒子；以及

b)核酸分子，其中所述的核酸分子和所述的纳米金刚石粒子形成纳米金刚石粒子-核酸络合物。

5.权利要求4所述的组合物，其中所述的纳米金刚石粒子和所述的核酸分子通过所述纳米金刚石粒子上的正电荷与所述的核酸分子上的负电荷之间的吸引形成所述的纳米金刚石-核酸络合物。

6.权利要求4所述的组合物，其中在所述的纳米金刚石-核酸络合物中所述的核酸分子附着在所述的纳米金刚石粒子上，使得它们在引入细胞时被释放。

7.权利要求4所述的组合物，其中所述的聚乙烯亚胺分子为低分子量的聚乙烯亚胺分子。

8.一种包含碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物的组合物，其中所述的碱敏感性纳米金刚石络合物包含：

a)包含一个或多个表面羧基或羟基基团的纳米金刚石粒子；以及

b)蛋白质，其中所述的蛋白质被吸附到所述的纳米金刚石粒子上，从而形成所述的碱敏感性纳米金刚石-蛋白质络合物，其中所述的蛋白质被构造成仅在足够的碱性条件下由所述的纳米金刚石粒子上解吸附。

9.权利要求8所述的组合物，其中所述的碱性条件为pH至少为9.0。

10.权利要求8所述的组合物，其中所述的碱性条件为pH至少为10.0。

11.一种包含可溶性络合物的组合物，其中所述的可溶性络合物包含：

a)纳米金刚石粒子；以及

b)治疗试剂，其中所述的治疗试剂包括蒽环类化合物或四环素类化合物。

12.权利要求11所述的组合物，其中所述的蒽环类化合物或四环素类化合物选自：道诺霉素，亚德里亚霉素，表柔比星，去甲氧正定霉素，戊柔比星，米托蒽醌，四环素，氯四环素，土霉素，地美环素，强力霉素，赖甲四环素，甲氯环素，甲烯土霉素，二甲胺四环素以及吡咯烷甲基四环素。

13.权利要求11所述的组合物，其中所述的可溶性络合物中的所述的蒽环类化合物或四环素类化合物在引入细胞时被释放。

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