CN111727061A - 修饰碳纳米材料、纳米簇、物质递送载体及药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种纳米簇,其是碳纳米材料经自组装而成的,所述碳纳米材料以下述式(I):‑Y1‑R(式中,Y1表示2价的连接基团,R表示有机基团)所示的官能团进行了修饰。
Description
技术领域
本发明涉及修饰碳纳米材料、纳米簇、物质递送载体及药物组合物。
在本说明书中,使用以下的缩写符号。
CND:carbon nano diamond(碳纳米金刚石)
SNP:super nano particle(超纳米粒子)
背景技术
碳纳米金刚石(以下,称为“CND”)除了具有金刚石固有的性质以外,还具有平均粒径小、比表面积大的表征,而且具有较为廉价、容易获取的优点。CND可以通过爆炸法、高温高压法等来制造(专利文献1)。CND具有毒性低、优异的生物相容性及稳定的荧光特性,因此已广泛研究了其在生物医学领域的应用。另外,专利文献2、3公开了经修饰的CND及其制造方法。
作为CND在生物医学领域中的应用的例子,非专利文献1中报道了下述内容:通过在CND上担载作为抗癌剂的顺铂而制作了顺铂-CND复合体;在pH为酸性范围的情况下,可以使顺铂从复合体游离出来;从复合体游离出的药剂保持了与游离的顺铂同等程度的细胞毒性。另外,非专利文献2中报道了通过利用疏水性相互作用使抗癌剂表阿霉素吸附于CND表面、并进一步利用脂质囊泡包裹该表阿霉素-CND复合体,会提高溶解性,并报道了对于癌细胞的药物蓄积作用及效能,所述脂质囊泡结合了对大肠癌的表皮生长因子受体(EpidermalGrowth Factor Receptor;EGFR)具有特异性的抗体(anti-EGFR-PEG)。
使药物担载于CND而成的现有的复合体基本上存在药物担载量少、形成复合体后的水中分散性显著降低的问题。
为了提高CND在水、极性有机溶剂中的溶解性、分散性及分散稳定性,已提出了利用高分子修饰CND的表面。例如,专利文献4中报道了通过用包含聚甘油链的特定基团修饰纳米金刚石的表面,从而大幅提高在水、极性有机溶剂中的溶解性、分散性及分散稳定性。然而,在现有技术中,基本上都是主要着眼于提高CND的分散性,而完全没有与利用了表面化学修饰后的CND的自组装能力相关的评价、与以担载药物为目的的纳米结构控制相关的研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2010-202458号公报
专利文献2:日本特开2017-186234号公报
专利文献3:日本特开2017-186235号公报
专利文献4:日本特开2010-248023号公报
非专利文献
非专利文献1:Bo Guan et al.,Small 2010,6,1514-1519
非专利文献2:Laura Moore et al.,Adv.Mater.2013,25,3532-3541
发明内容
发明要解决的课题
本发明的主要目的在于提供能够有效地担载医药品、香料等生理活性物质、且在生理环境下显示出优异的溶解性的材料。
解决课题的方法
本发明提供以下的修饰碳纳米材料、纳米簇、物质递送载体及药物组合物。
[1]一种纳米簇,其是碳纳米材料经自组装而成的,所述碳纳米材料以下述式(I)所示的官能团进行了修饰,
-Y1-R (I)
式(I)中,Y1表示2价的连接基团,R表示有机基团。
[2]根据[1]所述的纳米簇,其中,Y1所示的2价的连接基团为选自-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-及-NH-CO-NH-中的任意基团。
[3]根据[1]或[2]所述的纳米簇,其中,R所示的有机基团为氟有机基团、全氟有机基团、任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳烷基、或任选被取代的杂环基。
[4]根据[1]~[3]中任一项所述的纳米簇,其中,所述碳纳米材料具有选自OH、COOH及NH2中的至少1种表面基团,式(I)所示的官能团是经由所述表面基团被导入碳纳米材料的。
[5]根据[1]~[4]中任一项所述的纳米簇,其与有效成分进行了复合。
[6]根据[5]所述的纳米簇,其中,有效成分为生理活性物质、标记物质、香料、精油或有机色素。
[7]根据[1]~[6]中任一项所述的纳米簇,其中,碳纳米材料为碳纳米金刚石或碳纳米点。
[8]一种有效成分的递送载体,其包含[1]~[7]中任一项所述的纳米簇。
[9]一种碳纳米材料,其以下述式(I)所示的官能团进行了修饰,
-Y1-R (I)
式(I)中,Y1表示2价的连接基团,R表示氟有机基团或全氟有机基团。
[10]根据[9]所述的碳纳米材料,其中,Y1所示的2价的连接基团为选自-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-及-NH-CO-NH-中的任意基团。
[11]根据[9]或[10]所述的碳纳米材料,其中,碳纳米材料为碳纳米金刚石。
[12]一种药物组合物,其包含[1]所述的自组装而成的纳米簇,该纳米簇与药物进行了复合。
发明的效果
根据本发明,可以提供能够有效地担载生理活性物质、香料、有机色素等有效成分、且在生理环境下显示出优异的溶解性的表面化学修饰碳纳米材料簇、以及包含该纳米簇的药物组合物等复合材料。
附图说明
[图1]包封有抗癌剂喜树碱(CPT)的各种纳米材料的癌细胞消除效果。(a)包封有CPT的PEG化脂质体(CPT@DSPE-PEG);(b)CPT与CND-ori的复合体(CPT@CND-ori);(c)使CPT@CND-ori包封于由PEG化DSPE构成的脂质体而成的复合体(CPT@DSPE-PEG@CND-ori);(d)CPT与PFOA修饰CND的复合体(CPT@CND-SNP);(e)图1(a)~(d)的各种材料及对照对U2OS细胞的细胞存活率(viability)的试验结果。1.对照(仅溶剂)、2.PEG-CPT(CPT@DSPE-PEG)、3.CND-CPT(CPT@CND-ori)、4.CND-PEG-CPT(CPT@DSPE-PEG@CND-ori)、5.CND-PFOA-CPT(CPT@CND-SNP)。
[图2]表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的合成方法和表征。(a)表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的合成方法。(b)表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)水溶液的紫外-可见-近红外吸收光谱。(c)通过动态光散射得到的表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的粒径分析结果(平均粒径:90nm)。照片示出了CND浓度调整至0.32mg·mL-1的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液。(d)利用透射电子显微镜进行的表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的结构分析。
[图3](a)表面化学修饰前的CND(CND-ori)(1)和表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)(2)的热重分析。(b)利用透射电子显微镜进行的表面化学修饰前的CND(CND-ori)的结构分析。(c)利用茚三酮检测(Kaiser test)进行的表面化学修饰前的CND和表面化学修饰CND复合纳米簇的氨基定量分析(n=3)。(d)表面化学修饰前的CND(CND-ori)和表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的ζ电位(n=3)。CND浓度:0.32mg·mL-1。(e)表面化学修饰前的CND(CND-ori)和表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的表面张力(n=3)。CND浓度:0.32mg·mL-1。
[图4]包封有荧光探针BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇的使用了荧光显微镜的细胞内分布分析。(a)包封有BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇的制造方法。(b)紫外-可见-近红外光谱。黑线(1):溶解有BODIPY的DMSO。灰色线(2):包封BODIPY之前的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液(CND-SNP)。绿线(3):包封有BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液(BODIPY@CND-SNP)。(c)将包封有BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液在4℃和37℃下温育2小时后的U2OS细胞的荧光显微镜图像。CND浓度:3.2μg·mL-1。(d)有无表面化学修饰CND复合纳米簇的情况下U2OS细胞中的LAMP1(溶酶体标志物)的蛋白质印迹法试验(Western blotting)。CND浓度:3.2μg·mL-1。使用了β-Tubulin(β微管蛋白)作为导入对照。(e)用包封有BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液(BODIPY@CND-SNP)在37℃下对HeLa细胞温育4小时时的荧光显微镜图像。红色:溶酶体,绿色:包封有BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇。
[图5]表面化学修饰CND复合纳米簇的细胞内分布行为。(a)包封荧光探针BODIPY前后的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液的荧光光谱分析。灰色线(1):BODIPY包封前。绿色线(2):BODIPY包封后。(b)向U2OS细胞导入表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP)前后的光学显微镜分析(明场图像)。CND浓度:3.2μg mL-1。温育时间:12小时。图5(b)的CND-SNP的右上方的箭头示出了导入至细胞内的表面化学修饰CND复合纳米簇。
[图6]封入了抗癌剂喜树碱(CPT)的表面化学修饰CND复合纳米簇在体外的癌细胞消除效果。(a)封入CPT前后的表面化学修饰CND复合纳米簇水溶液(灰色线(2):CPT封入前(CND-SNP)、红线(3):CPT封入后(CPT@CND-SNP))和溶解有CPT的DMSO(黑线(1))的紫外-可见-近红外吸收光谱。(b)CPT及封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT@CND-SNP)对U2OS细胞的细胞毒性评价。温育时间:24小时。(c)将对照、CPT、CND-SNP及封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT@CND-SNP)和U2OS细胞温育48小时时利用结晶紫进行的活细胞染色。(d)将对照、CPT、CND-SNP及封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT@CND-SNP)和U2OS细胞温育24小时时使用流式细胞术进行的细胞凋亡分析。(e)流式细胞术的定量分析结果。(f)利用蛋白质印迹法进行的U2OS细胞中的细胞凋亡相关生物标志物分析。使用了β-actin(β肌动蛋白)作为导入对照。CND浓度:3.2μg·mL-1、CPT浓度:10μg·mL-1。
[图7]封入了各种抗癌剂的表面化学修饰CND复合纳米簇在体外的癌细胞消除效果。(a)封入了各种抗癌剂(姜黄素(Curcumin)、卡莫氟(Carmofur)、顺铂(Cisplatin)、甲氨蝶呤(Methotrexate))的表面化学修饰CND复合纳米簇对U2OS细胞的细胞毒性评价。温育时间:24小时。(b)表面化学修饰CND复合纳米簇本身(CND-SNP)及PFOA对正常人成纤维细胞(TIG-3)的细胞毒性评价。(c)CPT、封入了CPT的PFOA、以及封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT@CND-SNP)对U2OS细胞的细胞毒性评价。温育时间:24小时。
[图8]封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇在体内的癌细胞消除效果。(a)腹腔内给药了CPT(2.78mg·kg-1)、封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT@CND-SNP,3.56mg·kg-1)、未封入CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP)、PBS缓冲液后的具有HT-29实体癌的裸鼠的经时变化。(b)各处理后的肿瘤体积比的经时变化。(c)各处理后的小鼠体重的经时变化。(d)终点时各处理后的肿瘤尺寸。
[图9]口服给药了表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP,3.56mg·kg-1)及PBS缓冲液后的小鼠的平均体重。
[图10]在羧基化CND(CND-COOH)及氨基化CND(CND-NH2)表面导入了不同长度的烷基链(C8:辛基、C12:十二烷基、C18:油基)时的CND复合纳米簇水溶液的照片和通过动态光散射得到的测定值。氨基化CND例如可以按照以下的文献来制造:A.Krueger,Chem.Eur.J.2008,14,1382-1390;Y.Liu,Chem.Mater.2004,16,3924-3930;A.Krueger,Langmuir 2008,24,4200-4204;Denisov S.A.,IOP Conf.Series:Materials Science andEngineering 16(2010)012005;A.Krueger,Advanced Functional Materials,22(5),890-906.
具体实施方式
在本说明书中,碳纳米材料包含碳纳米金刚石、碳纳米点。
本发明的碳纳米材料以下述式(I)所示的官能团进行了修饰。
-Y1-R (I)
式中,Y1表示2价的连接基团。R表示有机基团。
有时将以该官能团修饰后的碳纳米材料记作“修饰碳纳米材料”。
本发明的碳纳米材料具有1个或2个以上的式(I)所示的官能团。式(I)所示的官能团为修饰碳纳米材料的0.0001~30质量%左右,优选为0.001~20质量%左右,优选为0.01~15质量%左右,优选为0.05~10质量%左右。
作为Y1所示的2价的连接基团,可以列举:-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-、-NH-CO-NH-。
作为R所示的有机基团,可以列举:氟有机基团、全氟有机基团、任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳烷基、任选被取代的杂环基。有机基团优选为氟有机基团或全氟有机基团。
作为R所示的氟有机基团或全氟有机基团,可以列举:任选被取代的氟烷基、任选被取代的氟环烷基、任选被取代的氟芳基、任选被取代的氟芳烷基、任选被取代的氟杂环基、任选被取代的全氟烷基、任选被取代的全氟环烷基、任选被取代的全氟芳基、任选被取代的全氟芳烷基、任选被取代的全氟杂环基。
作为任选被取代的(烷基、氟烷基、全氟烷基)、任选被取代的(环烷基、氟环烷基、全氟环烷基)、任选被取代的(芳基、氟芳基、全氟芳基)、任选被取代的(芳烷基、氟芳烷基、全氟芳烷基)、任选被取代的(杂环基、氟杂环基、全氟杂环基)的取代基,可以列举:卤原子、C1~C4烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、C1~C4烷基、C2~C4烯基、NO、NO2、NH2、CN、OH、SH、COOH、CONH2、NHCOCH3、单烷基氨基、二烷基氨基、单烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基等,具有取代基的各官能团的取代基的数量为1~5个,优选为1~3个,更优选为1~2个。作为优选的取代基,可以列举:氟原子、氯原子、芳氧基、芳烷氧基、C1~C4烷基、NH2、CN、OH、COOH、单烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基羰基。
任选被取代的烷基包含取代烷基和未取代烷基(以下,简称为“烷基”)。作为烷基,可以列举:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基等直链或具有分支的C1-C24烷基。
氟烷基包含烷基的一部分氢原子被氟原子取代而成的直链或具有分支的C1-C24氟烷基,全氟烷基包含烷基的全部氢原子被氟原子取代而成的直链或具有分支的C1-C24全氟烷基。
作为直链或具有分支的C1-C24氟烷基,可以举出CpHqFr(p表示1~24的整数,q表示1~2p的整数,r表示1~2p的整数,且q+r=2p+1),作为直链或具有分支的C1-C24全氟烷基,可以举出CsF2s+1(s表示1~24的整数)。
任选被取代的环烷基包含取代环烷基和未取代环烷基(以下,简称为“环烷基”)。作为环烷基,可以列举:环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基。
氟环烷基包含环烷基的一部分氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,单氟环戊基、二氟环戊基),全氟环烷基包含环烷基的全部氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,全氟环戊基、全氟环己基)。
任选被取代的芳基包含取代芳基和未取代芳基(以下,简称为“芳基”)。作为芳基,可以列举:苯基、萘基、芴基、蒽基、联苯基、四氢萘基、苯并二氢吡喃基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘基、茚满基及菲基。
氟芳基包含芳基的一部分氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,氟苯基、二氟苯基、三氟苯基),全氟芳基包含芳基的全部氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,全氟苯基、全氟联苯基、全氟萘基)。
任选被取代的芳烷基包含取代芳烷基和未取代芳烷基(以下,简称为“芳烷基”)。作为芳烷基,可以列举:苄基、萘基甲基、芴基甲基、蒽基甲基、联苯基甲基、四氢萘基甲基、苯并二氢吡喃基甲基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘基甲基、茚满基甲基及菲基甲基、苯乙基、萘基乙基、芴基乙基、蒽基乙基、联苯基乙基、四氢萘基乙基、苯并二氢吡喃基乙基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘基乙基、茚满基乙基及菲基乙基。
氟芳烷基包含芳烷基的一部分氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,单氟苄基、二氟苄基、三氟苄基、单氟苯乙基、二氟苯乙基、三氟苯乙基),全氟芳烷基包含芳烷基的全部氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,全氟苄基、全氟苯乙基)。
任选被取代的杂环基包含取代杂环基和未取代杂环基(以下,简称为“杂环基”)。作为杂环基,可以列举:呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、唑基、噻唑基、异唑基、异噻唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并[b]噻吩基及苯并咪唑基等。
氟杂环基包含杂环基的一部分氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,单氟呋喃基、单氟吡啶基、单氟吲哚基),全氟杂环基包含杂环基的全部氢原子被氟原子取代而成的基团(例如,全氟呋喃基、全氟噻吩基、全氟吡咯基、全氟吲哚基)。
“卤原子”是指氟、氯、溴、碘,优选为氟、氯、溴,更优选为氟或氯,特别优选为氟。
作为C1~C4烷氧基,可以列举:甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。
作为芳氧基,可以列举:苯氧基、萘氧基、芴氧基、蒽氧基、联苯氧基、四氢萘氧基、苯并二氢吡喃氧基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘氧基、茚满基氧基及菲氧基。
作为芳烷氧基,可以列举:苄基氧基、萘甲基氧基、芴甲基氧基、蒽甲基氧基、联苯甲基氧基、四氢萘甲基氧基、苯并二氢吡喃甲基氧基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘甲基氧基、茚满甲基氧基及菲甲基氧基、苯乙基氧基、萘乙基氧基、芴乙基氧基、蒽乙基氧基、联苯乙基氧基、四氢萘乙基氧基、苯并二氢吡喃乙基氧基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘乙基氧基、茚满乙基氧基及菲乙基氧基。
作为C1~C4烷基,可以列举:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基。
作为C2~C4烯基,可以列举:乙烯基、烯丙基、1-丁烯基。
作为单烷基氨基,可以列举:甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、异丙基氨基、正丁基氨基、异丁基氨基、叔丁基氨基、正戊基氨基、异戊基氨基、己基氨基。
作为二烷基氨基,可以列举:二甲基氨基、二乙基氨基、二正丙基氨基、二异丙基氨基、二正丁基氨基、二异丁基氨基、二叔丁基氨基、二正戊基氨基、二异戊基氨基、二己基氨基。
作为单烷基氨基羰基,可以列举:甲基氨基羰基、乙基氨基羰基、正丙基氨基羰基、异丙基氨基羰基、正丁基氨基羰基、异丁基氨基羰基、叔丁基氨基羰基、正戊基氨基羰基、异戊基氨基羰基、己基氨基羰基。
作为二烷基氨基羰基,可以列举:二甲基氨基羰基、二乙基氨基羰基、二正丙基氨基羰基、二异丙基氨基羰基、二正丁基氨基羰基、二异丁基氨基羰基、二叔丁基氨基羰基、二正戊基氨基羰基、二异戊基氨基羰基、二己基氨基羰基。
作为烷氧基羰基,可以列举:甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、丁氧基羰基、异丁氧基羰基、叔丁氧基羰基、戊氧基羰基、异戊氧基羰基及己氧基羰基。
作为芳氧基羰基,可以列举:苯氧基羰基、萘氧基羰基、芴氧基羰基、蒽氧基羰基、联苯氧基羰基、四氢萘氧基羰基、苯并二氢吡喃氧基羰基、2,3-二氢-1,4-二氧杂萘氧基羰基、茚满基氧基羰基及菲氧基羰基。
表面具有大量OH、COOH、NH2等基团的碳纳米材料(以下,有时记载为“CNM”)是公知的,可以使用这样的材料、按照以下的方案(1)~(10)得到本发明的用官能团进行了修饰的碳纳米材料。
方案
[化学式1]
[化学式2]
(式中,X表示Cl、Br或I。CNM表示碳纳米材料。n1表示1以上的整数。n2表示0以上的整数。R如上述的定义所述。)
上述方案(1)~(10)的反应可以按照常规方法来进行,相对于具有OH、NH2或COOH的表面基团的碳纳米材料1g使用1mg~过量的R-COX、R-NH2、R-OH、R-X中的任意化合物,并在0℃~溶剂沸腾温度下使反应进行1~24小时,由此可以得到目标的产物。作为溶剂,可以列举:氯仿、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷等卤代烃、甲苯等芳香族烃、四氢呋喃、乙醚、二异丙基醚等
本发明的纳米簇可以使经官能团修饰后的碳纳米材料悬浮于水或缓冲液等适当的水性介质中,并利用超声波照射使其自组装来制作。在超声波照射后,可以通过离心分离等纯化操作将未形成簇的未反应的官能团修饰碳纳米材料除去,从而分离出自组装纳米簇。
本发明的纳米簇可以通过悬浮于包含有效成分的适当溶剂中而与有效成分进行复合。有效成分存在于纳米簇的表面或内部。作为有效成分,可以列举:生理活性物质、标记物质、精油、香料、有机色素等。
作为标记物质,可以列举:荧光素、俄勒冈绿(Oregon Green)、曙红、赤藓红等荧光素类;四甲基罗丹明衍生物、德克萨斯红衍生物、罗丹明B碱性、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G等罗丹明类;香豆素类;丹酰型(二甲基氨基萘磺酸型)荧光色素;NBD型色素;芘;R-藻红蛋白、藻蓝蛋白(phlophycocyanin)、别藻蓝蛋白等藻胆蛋白;BODIPY衍生物;Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5等Cy(注册商标)色素;Alexa Fluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、680、700、750等Alexa(注册商标)Fluor等。这些标记物质可以单独使用1种,也可以组合使用2种以上。
作为精油,可以列举:甜橙、苦橙、苦橙叶(petitgrain)、柠檬、葡萄柚、酸橙、佛手柑、橘、橙花、薄荷、留兰香、薰衣草、洋甘菊、迷迭香、桉树、鼠尾草、罗勒、玫瑰、天竺葵、茉莉花、依兰、茴芹、茴香、八角茴香、丁香、肉桂、姜、肉豆蔻、小豆蔻、蛇麻草、日本雪松、柏树、香根草、广藿香(patchouli)、赖百当(labdanum)等,这些精油可以单独使用1种,也可以组合使用2种以上。
作为香料的成分,可以列举:l-薄荷醇、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、莰烯、柠檬烯等单萜烯、巴伦西亚橘烯、雪松烯、石竹烯、长叶烯等倍半萜烯、1,3,5-十一碳三烯、丁醇、戊醇、异戊醇、己醇、异戊烯醇、(Z)-3-己烯-1-醇、2,6-壬二烯醇、芳樟醇、香叶醇、香茅醇、四氢月桂烯醇、法呢醇、橙花叔醇、雪松醇、苯甲醇、苯乙醇、糠醇、乙醛、异戊醛、己醛、辛酸、壬醛、癸醛、(E)-2-己烯醛、2,4-辛二烯醛、香茅醛、柠檬醛、苯甲醛、肉桂醛、香草醛、乙基香草醛、糠醛、胡椒醛、2-庚酮、2-十一烷酮、1-辛烯-3-酮、乙偶姻、二乙酰、2,3-戊二酮、麦芽酚、乙基麦芽酚、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮、羟基酮、香芹酮、薄荷酮、诺卡酮等萜烯酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、β-大马酮、树莓酮酮、玫瑰醚(rose oxide)、芳樟醇氧化物、薄荷呋喃、茶螺烷、甲基胡椒酚、茴香烯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸芳樟酯、乙酸香叶酯、乙酸熏衣草酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸苄酯、水杨酸甲酯、γ-癸内酯、γ-十二内酯、δ-癸内酯、δ-十二内酯、7-癸烯-4-内酯、2-癸烯-5-内酯、丁酸、4-甲基-3-戊烯酸、辛酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、吲哚、粪臭素、吡啶、烷基取代吡嗪、邻氨基苯甲酸甲酯、甲硫醇、糠基硫醇、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、二糠基二硫醚、异硫氰酸烯丙酯等,这些香料可以单独使用1种,也可以组合使用2种以上。
作为天然色素,可以列举:胭脂树橙色素、胭脂虫红色素、红曲霉色素、β-胡萝卜素、木槿色素、硫化黄、可可色素、核黄素、叶绿素、焦糖、胭脂树橙、胭脂红、虫胶酸、巴西红木红、藏红花素、紫草素、紫苏素、芦丁等。
与有效成分复合化后的本发明的纳米簇,在对哺乳动物(人、小鼠、大鼠、仓鼠、马、牛、猪、山羊、绵羊、兔、犬、猫等)的生物体内或皮肤给药或适用时,会缓慢地释放出有效成分。因此,与有效成分复合化后的本发明的纳米簇作为医药品或药物组合物、化妆品、口腔用组合物是有用的。作为化妆品,可以列举:粉底、扑面粉、润肤乳、乳液、口红、化妆水、美容液、按摩霜、保湿霜、面膜、洗面奶、洗发水、护发素、养发剂、身体粉等。作为口腔用组合物,可以列举:漱口药、漱口水、牙膏、牙粉、口香糖、饴糖、软糖、汽水糖等。作为医药品的剂型,可以列举:片剂、胶囊剂、含片剂、丸剂、咀嚼片、注射剂、栓剂、糖浆剂、软膏剂、硬膏剂等。另外,本发明的纳米簇会缓慢地释放出有效成分,因此作为有效成分的递送载体是有用的。
生理活性物质包含药物、核酸、蛋白质。作为药物,可以列举:抗肿瘤剂、抗高血压剂、抗低血压剂、抗精神病剂、镇痛剂、抗抑郁剂、抗躁狂剂、抗焦虑剂、镇静剂、催眠剂、抗癫痫剂、阿片激动剂(opioid agonist)、哮喘治疗剂、麻醉剂、抗心律不齐剂、关节炎治疗剂、抗痉挛剂、ACE抑制剂、减充血剂、抗生素、抗心绞痛剂、利尿剂、抗帕金森氏病剂、支气管扩张剂、抗利尿剂、利尿剂、抗高血脂剂、免疫抑制剂、免疫调节剂、止吐剂、抗感染剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗病毒剂、抗糖尿病剂、抗过敏剂、解热剂、抗痛风剂、抗组胺剂、止痒剂、骨调节剂、心血管剂、降胆固醇剂、抗疟疾剂、止咳剂、祛痰剂、粘液溶解剂、鼻塞用药剂、多巴胺激动剂、消化道用药剂、肌肉松弛剂、神经肌肉阻滞剂、副交感神经激动剂、前列腺素、兴奋剂、食欲抑制剂、甲状腺剂或抗甲状腺剂、激素、抗偏头痛剂、抗肥胖剂、抗炎剂等。优选的药物为抗肿瘤剂。作为抗肿瘤剂,可以列举:激素治疗剂(例如,磷雌酚、己烯雌酚、氯烯雌醚(chlorotrianserine)、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、美帕曲星、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗雌激素(例如,枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸托瑞米芬等)、口服避孕药制剂、美雄烷、二氢睾内酯、氨鲁米特、LH-RH激动剂(例如,醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、乙炔雌二醇磺酸酯、芳香化酶抑制剂(例如,盐酸法倔唑、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏罗唑、福美司坦等)、抗雄激素(例如,氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制剂(例如,非那雄胺、爱普列特等)、肾上腺皮质激素类药剂(例如,地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙等)、雄激素合成抑制剂(例如,阿比特龙等)、类视黄醇及延缓类视黄醇代谢的药剂(例如,利阿唑等)等,其中,可以列举:LH-RH激动剂(例如,醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林等))、烷化剂(例如,氮芥、氮芥N-氧化物盐酸盐(nitrogen mustard N-oxide hydrochloride)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替哌、卡波醌、甲磺英丙舒凡、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、米尔法兰、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、曲他胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、溴丙哌嗪、依托格鲁、卡铂、顺铂、米帕、奈达铂、奥沙利铂、六甲密胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵(dibrospidiumhydrochloride)、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、替莫唑胺、曲奥舒凡、曲磷胺、净司他丁苯马聚合物、卡波醌、阿多来新、半胱胺亚硝脲(cystemustine)、比折来新)、代谢拮抗剂(例如,巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、依诺他滨、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytarabineocfosphate)、盐酸环胞苷、5-FU类药剂(例如,氟尿嘧啶、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨、乙嘧替氟等)、氨基喋呤、亚叶酸钙(calciumleucovorin)、硫鸟嘌呤(tabloid)、甘氨硫嘌呤(butocin)、甲酰四氢叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、噻唑羧胺核苷、氨莫司汀)、抗癌抗生素(例如,放线菌素D、放线菌素C、丝裂霉素C、色霉素A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表阿霉素、新制癌菌素、光辉霉素、肉瘤霉素(sarkomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星)、植物来源的抗癌剂(例如,依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊甙、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、喜树碱、盐酸伊立替康)、免疫治疗剂(BRM)(例如,溶链菌(picibanil)、云芝多糖(krestin)、裂裥多糖、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴毒素、BCG疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、云芝多糖(polysaccharide)K、丙考达唑)、抑制细胞生长因子及其受体的作用的药剂(例如,曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin)(商标);抗HER2抗体)、ZD1839(易瑞沙)、格列卫(GLEEVEC)等抗体药物)。作为成为抗肿瘤剂的对象的癌的种类,可以列举:结肠/直肠癌、肝癌、肾癌、头颈癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆囊/胆管癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、骨骼/软组织肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、脑瘤等,优选可以列举:结肠/直肠癌、胃癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胆道癌、肝癌。
作为核酸,没有特别限制,可以是DNA、RNA、DNA和RNA的嵌合核酸、DNA/RNA的杂合体等中的任意核酸。另外,核酸可以使用1~3链中的任意核酸,优选为单链或双链。核酸可以是作为嘌呤碱或嘧啶碱的N-糖苷的其它类型核苷酸、或者具有非核苷酸骨架的其它低聚物(例如,市售的肽核酸(PNA)等)或含有特殊键的其它低聚物(其中,该低聚物含有核苷酸,所述核苷酸具有允许存在可在DNA、RNA中观察到的碱基对、碱基附着的配置)等。进一步,可以是被附加了公知的修饰的核酸,例如具有该领域已知的标记的核酸、加帽的核酸、甲基化的核酸、用类似物取代1个以上天然核苷酸而得到的核酸、进行了分子内核苷酸修饰的核酸、例如具有不带电荷的键(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)的核酸、具有带电荷的键或含硫键(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核酸、例如蛋白质(核酸酶、核酸酶抑制剂、毒素、抗体、信号肽等)、糖(例如,单糖等)等具有侧链基团的核酸、具有插层化合物(例如,吖啶、补骨脂素等)的核酸、含有螯合物(例如,金属、具有放射活性的金属、硼、氧化性的金属等)的核酸、含有烷化剂的核酸、具有经修饰的键的核酸(例如,α异头型的核酸等)。作为优选的核酸,可以举出siRNA等RNA。
siRNA是指由与靶基因的mRNA、或初始转录产物的核苷酸序列或其部分序列(优选为编码区域内)(初始转录产物的情况下包含内含子部分)同源的核苷酸序列和其互补链形成的双链寡RNA。siRNA中包含的与靶核苷酸序列同源的部分的长度通常约为18个碱基以上、例如为约20个碱基左右(代表性地为约21~23个碱基长度)的长度,只要可以引起RNA干扰则没有特别限定。另外,siRNA的全长也通常约为18个碱基以上、例如为约20个碱基左右(代表性地为约21~23个碱基长度)的长度,只要可以引起RNA干扰则没有特别限定。
关于靶核苷酸序列与siRNA中包含的与其同源的序列的关系,可以100%一致,也可以有碱基的突变(可以是至少70%、优选80%、更优选90%、最优选95%以上的同一性的范围内)。
siRNA可以在5’或3’末端具有由5个碱基以下、优选由2个碱基构成的、未形成碱基对的添加的碱基。该添加的碱基可以是DNA也可以是RNA,在使用DNA时,可以提高siRNA的稳定性。作为这样的添加的碱基的序列,可以列举例如:ug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等序列,但并不限定于此。
siRNA可以是相对于任意的靶基因的siRNA。siRNA优选为其表达增加以与对象疾病的发病和/或恶化相关的基因作为标靶的siRNA,更具体而言,可以举出相对于该基因的反义核酸以进行到了临床阶段或临床前阶段的基因、新发现的基因作为标靶的siRNA等。
siRNA可以仅使用1种,也可以组合使用2种以上。
作为蛋白质,可以列举:酶、受体、抗体、抗原、干扰素、白细胞介素等细胞因子等。
本发明的纳米簇的平均粒径为1~1000nm左右,优选为3~800nm左右,更优选为5~500nm左右,进一步优选为10~300nm左右,特别为30~250nm左右。
作为纳米簇的ζ电位,优选为5~30mV左右,更优选为10~25mV左右。
在本发明的纳米簇与有效成分进行了复合的情况下,相对于纳米簇100质量份,包含5~50质量份左右、优选包含10~20质量份左右的有效成分。
实施例
以下,基于实施例对本发明更详细地进行说明,但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
<实验方法>
表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的合成
表面化学修饰CND复合纳米簇通过以下的方法合成(图2(a))。
利用浴(bath)式超声波装置(USD-2R;输出功率80W;振荡频率40kHz;AS ONE)对表面具有氨基的CND-ori水溶液(1mL)(CND浓度:3.2mg/mL,Daicel,Tokyo,Japan)、全氟辛酸(perfluorooctanoic acid)(PFOA)(10mg)(Sigm a-Aldrich,St.Louis,MO,USA)、以及水溶性碳二亚胺(water soluble carbod iimide)(10mg)(WSC)(Wako,Osaka,Japan)照射5分钟的超声波,使其溶解于2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(9mL)(pH6.0,100mM)。在室温下剧烈搅拌5分钟后,通过离心分离用Milli-Q水对混合物进行3次清洗,除去未反应化合物。利用脉冲型超声波装置(VCX-600;Sonics,Danbury,CT,USA)对通过离心分离而生成的粒料照射10分钟超声波,由此使其分散于蒸馏水(10mL)中。实施离心分离(VCX-600;Sonics,Danbury,CT,USA)(1,000rpm、10分钟、20℃),除去因脉冲型超声波装置而形成的杂质,将分散有表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的上清溶液用于随后的实验。
封入了BODIPY及CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(BODIPY@CND-SNP及CPT@CND-SNP)的制备方法如下所述。向上述的用PFOA进行了化学修饰的CND粒料(CND-SNP簇)加入蒸馏水(10mL)、BODIPY(1mg)(Sigma-Aldrich)或喜树碱(CPT)(10mg)(Wako),使用浴式超声波装置照射了10分钟超声波。制备成的混合物在4℃下保存,用于各生物学实验。将封入了CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT@CND-SNP)示于图1(d),将封入了BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇(BODIPY@CND-SNP)的制造工序示于图4(a)。
表面化学修饰CND复合纳米簇的合成的表征
使用高分辨率透射电子显微镜(TEM)(EM-002B;Topcon,Tokyo,Japan)(120kV)分析了表面化学修饰前的CND(CND-ori)和表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)的纳米结构(图2(d)、图3(b))。使用动态光散射装置(DLS)(Photal FPAR-1000;OtsukaElectronics,Osaka,Japan)考察了表面化学修饰CND复合纳米簇的流体力学粒径(图2(c))。使用紫外-可见-近红外光谱仪(V-730BIO;Jasco,Tokyo,Japan)确定了各种样品的光学特性、浓度(图2(b)、图4(b)、图5(a))。利用热重测定装置(TGA Q 500;TA Instrument,New Castle,DE,USA)使表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP簇)及未修饰CND粉末(CND-ori)(各2mg)在氧气氛围中(10℃·min-1)燃烧,分析了表面化学修饰的PFOA量(图3(a))。利用荧光光谱仪(FP-6500;Jasco)对封入BODIPY前后的表面化学修饰CND复合纳米簇的荧光特性进行了观察(图4(b)、图5(a))。
使用茚三酮(Kaiser)检测试剂盒(60017-1EA,Sigma-Aldrich)按照下述要点考察了表面化学修饰CND复合纳米簇及未修饰CND的氨基的定量。将表面化学修饰CND复合纳米簇或未修饰CND粉末(0.64mg)加入蒸馏水(200μL)。接着,向该水溶液加入溶液1(200μL)(乙醇中溶有80%的苯酚)和溶液2(200μL)(水/吡啶中溶有KCN),利用浴型超声波装置处理至来自于CND的粉末良好地分散。利用加热块(EB-603;AS ONE)在120℃下加热10分钟后,加入溶液3(200μL)(乙醇中溶有6%的茚三酮),进一步加热10分钟。将得到的溶液在室温下冷却30分钟,加入60%的乙醇进行稀释,使得总量为3mL。在离心分离后(15,000rpm、5分钟),对上清溶液的紫外-可见光光谱进行了分析。通过下式由570nm的吸光度计算CND表面上的游离氨基(图3(c))。
[数学式1]
需要说明的是,稀释量为3mL,消光系数(extinction coefficient)为15000m-1·cm-1。空白的样品使用蒸馏水按照同样的方法准确地进行了制备。结果是将未修饰CND的氨基量设为100%而计算的。
表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP)的ζ电位使用来自于Kyowa InterfaceScience Co.,Ltd.(Saitama,Japan)的ζ电位测定系统(ZEECOM ZC-3000;Microtec Co.,Ltd.,Chiba,Japan)进行了测定(图3(d))。
表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP)的表面张力由Mitsui ChemicalAnalysis&Consulting Service,Inc.(Tokyo,Japan)使用全自动表面张力计(CBVP-Z;Kyowa Interface Science Co.,Ltd.)进行了测定(图3(e))。
细胞培养和细胞毒性评价
人结肠腺癌(HT-29)、人骨肉瘤细胞(U2OS)、人宫颈癌(HeLa)、正常人成纤维细胞(TIG3)从JCRB Cell Bank或DS Pharma Biomedical(Tokyo,Japan)购入,使用加入了胎牛血清(10%)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、庆大霉素、青霉素-链霉素(100IU·mL-1)、Hank’s平衡盐溶液(Life Technologies,MD,USA)的DMEM培养基(Gibco BRL,GrandIsland,NY,USA)在37℃、5%二氧化碳的环境中进行了培养。使用相差显微镜(NikonEclipse TE300,Japan)记录了细胞的形态观察(图5(b))。细胞毒性评价使用结晶紫染色(Wako)和细胞计数试剂盒-8(CCK-8;Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)进行。在CCK-8试验中,将细胞接种(7000细胞·孔-1)在96孔板上,温育过夜以便进行粘附。在温育后,将细胞暴露于药物、各种纳米材料。用新鲜的培养基清洗后,按照CCK-8试验试剂盒的操作说明书,将细胞和CCK-8溶液一起温育,利用酶标仪(infinite M200 PRO;TECAN,Switzerland)分析了450nm的吸光度。在结晶紫试验中,将细胞接种(1.5×105细胞·孔-1)在12孔板上,然后温育过夜。用冷却的PBS缓冲液清洗细胞后,用预先冷却的甲醇/丙酮(v/v,1∶1)混合液固定10分钟。用0.1%的结晶紫溶液将固定后的细胞染色过夜。与细胞毒性评价相关的全部实验至少实施了3次以上(图1(e)、图6(b)、图6(c)、图7(a)-图7(c))。
荧光显微镜实时成像
将细胞接种于成像用玻璃底培养皿,温育过夜以便进行粘附。接种,向该细胞添加封入了BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇,在37℃或4℃下温育2小时。温育后,用Hoechst 33342(1μg·mL-1,Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)将细胞核染色10分钟。在3分钟后,用PBS缓冲液清洗,加入无酚红的RPMI 1640培养基(Thermo Scientific),实施了细胞的实时成像。为了考察封入了BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇的细胞内分布,使用LysoTracker Red(Thermo Scientific)、基于手册并按照以下要点进行了同时染色。首先,将用封入了BODIPY的表面化学修饰CND复合纳米簇将细胞处理4小时,然后与LysoTracker试剂(100nM)在37℃下温育2小时。用新鲜的PBS缓冲液将细胞清洗3次后,与Hoechst 33342(1μg·mL-1)一起温育10分钟。使用搭载有镜单元(IX3-FGFPXL,Olympus)和EM-CCD相机(DP80;Olympus)的荧光显微镜(IX73;Olympus)在无酚红的培养基中观察了染色后的细胞(图4(c)、图4(e))。
蛋白质印迹法
使用添加了蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)的RIPA缓冲液(Thermo Scientific)采集细胞。利用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒(ThermoScientific)确定了各种蛋白质浓度。按照已报道的文献(非专利文献:Yu et al.CellDeatHand Disease(2017)8,e2755;doi:10.1038/cddis.2017.33),使用以下各种抗体实施了蛋白质印迹法试验(图4(d)、图6(f)):兔抗LAMP1(ab24170;Abcam,Cambridge,MA,USA)、抗Bcl-xL(2762;Cell Signaling,MA,USA)、抗Bcl-2(2876;Cell Signaling)、抗caspase-8(06-775;Millipore,Billerica,MA,USA)、抗caspase-3(H-277;Santa Cruz,CA,USA)、抗PARP-1(H-250;Santa Cruz)、小鼠抗β微管蛋白(T5293;Sigma-Aldrich)、抗p53(DO-1;Santa Cruz)、抗β肌动蛋白(AC-15;Abcam)。
流式细胞术
流式细胞术通过基于可检测细胞凋亡的Annexin-V和7-AAD的双重染色而实施。将细胞接种在6孔板上、并使其为3×105细胞·孔-1的密度,然后温育过夜以便进行粘附。24小时后,采集细胞,按照手册进行细胞凋亡检测,使用包含Guava Nexin Reagent(Millipore)、Annexin V-PE及7-AAD的混合溶液利用Guava PCA flow cytometer(Millipore)进行了分析。通过FlowJo软件(Version 7.6,FlowJo LLC,Oregon,USA)计算出凋亡细胞的比例(图6(d)、图6(e))。
体内抗癌实验和毒性评价
从Japan SLC,InC(Shizuoka,Japan)购入5周龄的雌性裸鼠(n=5;平均体重=18g;C57BL/6NCrSlc),使其在无特定病原(specific pathogen-free,SPF)的环境中适应一周。全部动物实验得到了产业技术总合研究所及Japan SLC,Inc的动物实验委员会的批准后实施。对小鼠腹部皮下给药包含HT-29细胞分散液(1×106细胞)(100μL)和培养基/基质胶(Corning,NY,USA)的混合溶液(v/v,1∶1),制备了癌模型小鼠。8天后,对形成了实体癌的小鼠的腹腔内分别给药表面化学修饰CND复合纳米簇(3.56mg·kg-1)、CPT(2.78mg·kg-1)、包封有CPT的表面化学修饰CND复合纳米簇(CPT,2.78mg·kg-1;CND-SNP,3.56mg·kg-1)、PBS缓冲液各200μL。每两天测量一次小鼠的行为、性状、实体癌尺寸、小鼠体重的变化(图8(a)-(d))。需要说明的是,实体癌的尺寸通过下式计算。
V=L×W2/2
式中,V表示实体癌体积,L表示实体癌的长度,W表示实体癌的宽度。
另一方面,通过以下方式进行了表面化学修饰CND复合纳米簇(CND-SNP)的体内毒性评价。对5周龄的雌性裸鼠(n=5;平均体重=18g、C57BL/6NCrSlc)口服给药表面化学修饰CND复合纳米簇(3.56mg·kg-1)或PBS缓冲液,在28天内以每两天一次的频率仔细考察了小鼠体重(图9)和行为/性状。对11周龄的雌性小鼠(n=6;平均体重=21g、BALB/cAJcl)的尾静脉分别给药各200μL的表面化学修饰CND复合纳米簇(3.56mg·kg-1)或PBS缓冲液,28天后由腹部主动脉采集血液,进行了小鼠血液检查。全血细胞计数(complete blood cellcount:CBC)及生化检查利用Japan SLC,Inc.和OrientalYeast Co.,Ltd.(Tokyo,Japan)进行了分析。
[表1]
数据的统计分析
数据中的±表示标准偏差,n表示使用的样品数。数据的统计分析使用了Student氏t检验(Student’s t-test)。*、**、***分别表示<0.05、<0.005、<0.001的p值。
Claims (12)
1.一种纳米簇,其是碳纳米材料经自组装而成的,所述碳纳米材料以下述式(I)所示的官能团进行了修饰,
-Y1-R (I)
式(I)中,Y1表示2价的连接基团,R表示有机基团。
2.根据权利要求1所述的纳米簇,其中,Y1所示的2价的连接基团为选自-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-及-NH-CO-NH-中的任意基团。
3.根据权利要求1或2所述的纳米簇,其中,R所示的有机基团为氟有机基团、全氟有机基团、任选被取代的烷基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的芳烷基、或任选被取代的杂环基。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的纳米簇,其中,所述碳纳米材料具有选自OH、COOH及NH2中的至少1种表面基团,式(I)所示的官能团经由所述表面基团被导入碳纳米材料。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的纳米簇,其与有效成分进行了复合。
6.根据权利要求5所述的纳米簇,其中,有效成分为生理活性物质、标记物质、香料、精油或有机色素。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的纳米簇,其中,碳纳米材料为碳纳米金刚石或碳纳米点。
8.一种有效成分的递送载体,其包含权利要求1~7中任一项所述的纳米簇。
9.一种碳纳米材料,其以下述式(I)所示的官能团进行了修饰,
-Y1-R (I)
式(I)中,Y1表示2价的连接基团,R表示氟有机基团或全氟有机基团。
10.根据权利要求9所述的碳纳米材料,其中,Y1所示的2价的连接基团为选自-NH-、-O-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NH-、-NH-CO-、-NH-CO-O-、-O-CO-NH-、-O-CO-O-及-NH-CO-NH-中的任意基团。
11.根据权利要求9或10所述的碳纳米材料,其中,碳纳米材料为碳纳米金刚石。
12.一种药物组合物,其包含权利要求1所述的自组装而成的纳米簇,该纳米簇与药物进行了复合。
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