WO2019116936A1 - 修飾カーボンナノ材料、ナノクラスター、物質送達担体及び医薬組成物 - Google Patents

修飾カーボンナノ材料、ナノクラスター、物質送達担体及び医薬組成物 Download PDF

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WO2019116936A1
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cnd
nanocluster
substituted
carbon nanomaterial
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英次郎 都
躍 于
正浩 西川
明 劉
貴寛 鄭
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
株式会社ダイセル
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
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    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer

Definitions

  • the present invention relates to modified carbon nanomaterials, nanoclusters, substance delivery carriers and pharmaceutical compositions.
  • CND carbon nano diamond
  • SNP super nano particle
  • Carbon nanodiamonds (hereinafter referred to as "CND") have the characteristics of small average particle diameter and large specific surface area in addition to the intrinsic properties of diamond, and furthermore, they are relatively inexpensive and available. It has the advantage of being easy. CND can be manufactured by the explosion method, the high temperature high pressure method, etc. (patent document 1). Because of their low toxicity, excellent biocompatibility and stable fluorescence properties, CNDs have been extensively studied for applications in the biomedical field. Furthermore, Patent Documents 2 and 3 disclose a modified CND and a method for producing the same.
  • Non-Patent Document 1 has produced a cisplatin-CND complex by loading CND with a anticancer agent, CND, from the complex when the pH is in the acidic region It has been reported that it is possible to release cisplatin, and the drug released from the complex maintains the same degree of cytotoxicity as free cisplatin.
  • the anticancer drug epirubicin is adsorbed to the CND surface by hydrophobic interaction, and an antibody (anti-EGFR-) specific for the epidermal growth factor receptor (EGFR) of colon cancer is further used. Solubility is enhanced by wrapping the epirubicin-CND complex with lipid vesicles coupled with PEG), and reported on drug accumulation effect and efficacy on cancer cells.
  • the conventional complexes in which a drug is loaded on CND basically have a small amount of drug loading and have problems that the dispersibility in water significantly decreases after complex formation.
  • the main object of the present invention is to provide a material capable of effectively carrying a physiologically active substance such as a medicine, a flavor and the like and showing excellent solubility in a physiological environment.
  • the present invention provides the following modified carbon nanomaterials, nanoclusters, substance delivery carriers and pharmaceutical compositions.
  • the following formula (I) -Y 1 -R (I) (In the formula, Y 1 represents a divalent linking group. R represents an organic group.)
  • the divalent linking group represented by Y 1 is -NH-, -O-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-NH-, -NH-CO-, -NH
  • the organic group represented by R is a fluoroorganic group, a perfluoroorganic group, an alkyl group which may be substituted, a cycloalkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, a substituent
  • the carbon nanomaterial has at least one surface group selected from the group consisting of OH, COOH and NH 2 , and the functional group represented by the formula (I) is a carbon nanomaterial via the surface group
  • a delivery carrier of an active ingredient comprising the nanocluster according to any one of [1] to [7].
  • Y 1 represents a divalent linking group.
  • R represents a fluoro organic group or a perfluoro organic group.
  • the divalent linking group represented by Y 1 is -NH-, -O-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-NH-, -NH-CO-, -NH
  • the carbon nano described in [9] which is any one selected from the group consisting of -CO-O-, -O-CO-NH-, -O-CO-O-, and -NH-CO-NH- material.
  • a pharmaceutical composition comprising the self-assembled nanocluster according to [1
  • a surface chemically modified carbon nanomaterial cluster capable of effectively supporting an active ingredient such as a physiologically active substance, a fragrance, an organic pigment and the like and exhibiting excellent solubility in a physiological environment, and the nanocluster Composite materials such as pharmaceutical compositions can be provided.
  • FIG. 1 (a) Test results of cell viability to U2OS cells by various materials and controls of (d). 1. Control (solvent only), 2.
  • CND-SNP cluster Synthesis method and characterization of surface chemically modified CND composite nanoclusters (CND-SNP cluster).
  • CND concentration 3.2 ⁇ g mL ⁇ 1
  • CPT concentration 10 ⁇ g mL ⁇ 1 .
  • CPT Cytotoxicity evaluation of CPT, CPT-encapsulated PFOA, and CPT-encapsulated surface chemically modified CND composite nanocluster (CPT @ CND-SNP) for U2OS cells. Incubation time: 24 hours. In vivo cancer cell elimination effect of CPT-encapsulated surface chemically modified CND composite nanoclusters.
  • CPT (2.78 mg kg -1 ), CPT encapsulated surface chemically modified CND composite nanocluster (CPT @ CND-SNP, 3.56 mg kg -1 ), CPT encapsulated surface chemically modified CND composite nanocluster (CND-SNP), time course of nude mice with HT-29 solid carcinoma given intraperitoneal administration of PBS buffer.
  • CND-SNP Average body weight of mice orally administered surface chemically modified CND composite nanoclusters (CND-SNP, 3.56 mg kg ⁇ 1 ) and PBS buffer.
  • CND composite nanocluster aqueous solution when alkylated chains (C8: octyl, C12: dodecyl, C18: oleyl) of different lengths are introduced onto the surface of carboxylated CND (CND-COOH) and aminated CND (CND-NH 2 ) Photographs and measurements by dynamic light scattering.
  • Aminated CNDs can be prepared, for example, according to the following documents: A. Krueger, Chem. Eur. J. 2008, 14, 1382-1390; Y. Liu, Chem. Mater. 2004, 16, 3924-3930; Krueger, Langmuir 2008, 24, 4200-4204; Denisov SA, IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering 16 (2010) 012005; A. Krueger, Advanced Functional Materials, 22 (5), 890-906.
  • carbon nanomaterials include carbon nanodiamonds and carbon nanodots.
  • the carbon nanomaterial of the present invention is represented by the following formula (I) -Y 1 -R (I) (In the formula, Y 1 represents a divalent linking group. R represents an organic group.) It is modified by the functional group represented by The functional group-modified carbon nanomaterial may be described as "modified carbon nanomaterial”.
  • the carbon nanomaterial of the present invention has one or more functional groups represented by the formula (I).
  • the functional group represented by the formula (I) is about 0.0001 to 30% by mass, preferably about 0.001 to 20% by mass, preferably about 0.01 to 15% by mass, preferably about 0.05 to 10% by mass of the modified carbon nanomaterial It is.
  • Examples of the divalent linking group represented by Y 1 include -NH-, -O-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-NH-, -NH-CO-, -NH-CO Examples include -O-, -O-CO-NH-, -O-CO-O-, and -NH-CO-NH-.
  • the organic group represented by R includes a fluoroorganic group, a perfluoroorganic group, an alkyl group which may be substituted, a cycloalkyl group which may be substituted, an aryl group which may be substituted, and And an optionally substituted aralkyl group and an optionally substituted heterocyclic group.
  • the organic group is preferably a fluoroorganic group or a perfluoroorganic group.
  • Preferred substituents include fluorine atom, chlorine atom, aryloxy, aralkyloxy, C 1 -C 4 alkyl, NH 2 , CN, OH, COOH, monoalkylamino, dialkylamino and alkoxycarbonyl.
  • the alkyl group which may be substituted includes a substituted alkyl group and an unsubstituted alkyl group (hereinafter simply referred to as "alkyl group").
  • alkyl group methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl and pentadecyl
  • C 1 -C 24 alkyl groups having a straight or branched chain such as hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl, eicosyl, henicosyl, docosyl, tricosyl, tetracosyl
  • the fluoroalkyl group includes a straight or branched C 1 -C 24 fluoroalkyl group in which a part of hydrogen atoms of the alkyl group is substituted with a fluorine atom, and the perfluoroalkyl group includes all hydrogen atoms of the alkyl group And C 1 -C 24 perfluoroalkyl having a linear or branched chain substituted with a fluorine atom.
  • C 1 -C 24 perfluoroalkyl having linear or branched C s F 2s + 1 ( s is an integer of 1 to 24) are exemplified.
  • the cycloalkyl group which may be substituted includes a substituted cycloalkyl group and an unsubstituted cycloalkyl group (hereinafter, simply referred to as "cycloalkyl group").
  • the cycloalkyl group includes cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and cyclooctyl.
  • the fluorocycloalkyl group includes groups in which part of the hydrogen atoms of the cycloalkyl group is substituted with a fluorine atom (eg, monofluorocyclopentyl, difluorocyclopentyl), and the perfluorocycloalkyl group is all hydrogens of the cycloalkyl group Included are groups in which atoms have been substituted with fluorine atoms (eg, perfluorocyclopentyl, perfluorocyclohexyl).
  • the aryl group which may be substituted includes a substituted aryl group and an unsubstituted aryl group (hereinafter simply referred to as "aryl group").
  • the aryl group includes phenyl, naphthyl, fluorenyl, anthryl, biphenylyl, tetrahydronaphthyl, chromanyl, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenyl, indanyl and phenanthryl.
  • the fluoroaryl group includes a group in which part of the hydrogen atoms of the aryl group is substituted with a fluorine atom (for example, fluorophenyl, difluorophenyl, trifluorophenyl), and the perfluoroaryl group includes all hydrogen atoms of the aryl group Include groups substituted with a fluorine atom (eg, perfluorophenyl, perfluorobiphenyl, perfluoronaphthyl).
  • the aralkyl group which may be substituted includes a substituted aralkyl group and an unsubstituted aralkyl group (hereinafter simply referred to as "aralkyl group").
  • aralkyl group benzyl, naphthylmethyl, fluorenylmethyl, anthrylmethyl, biphenylylmethyl, tetrahydronaphthylmethyl, chromanylmethyl, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylmethyl, indanyl Methyl and phenanthrylmethyl, phenethyl, naphthylethyl, fluorenylethyl, anthrylethyl, biphenylylethyl, tetrahydronaphthylethyl, chromanylethyl, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylethyl, Examples include indanylethyl
  • the fluoroaralkyl group includes groups in which part of hydrogen atoms of the aralkyl group is substituted with a fluorine atom (eg, monofluorobenzyl, difluorobenzyl, trifluorobenzyl, monofluorophenethyl, difluorophenethyl, trifluorophenethyl)
  • the fluoroaralkyl group includes groups in which all hydrogen atoms of the aralkyl group are substituted with a fluorine atom (eg, perfluorobenzyl, perfluorophenethyl).
  • the optionally substituted heterocyclic group includes substituted heterocyclic groups and unsubstituted heterocyclic groups (hereinafter simply referred to as “heterocyclic groups”).
  • Heterocyclic groups include furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, oxazolyl, thiazolyl, isoxazolyl, isothiazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, indolyl, quinolyl, isoquinolyl, benzo [b] thienyl and benzimidazolyl and the like .
  • the fluoroheterocyclic group includes a group in which part of hydrogen atoms of the heterocyclic group is substituted with a fluorine atom (eg, monofluorofuryl, monofluoropyridyl, monofluoroindolyl), and the perfluoroheterocyclic group is a heteroaromatic group. Included are groups in which all hydrogen atoms of the ring group are replaced by fluorine atoms (eg, perfluorofuryl, perfluorothienyl, perfluoropyrrolyl, perfluoroindolyl).
  • halogen atom means fluorine, chlorine, bromine and iodine, but fluorine, chlorine and bromine are preferable, fluorine or chlorine is more preferable, and fluorine is particularly preferable.
  • C 1 -C 4 alkoxy examples include methoxy, ethoxy, n-propoxy, isopropoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy and tert-butoxy.
  • aryloxy As aryloxy, phenyloxy, naphthyloxy, fluorenyloxy, anthryloxy, biphenylyloxy, tetrahydronaphthyloxy, chromanyloxy, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenyloxy, indanyl And oxy and phenanthryloxy.
  • aralkyloxy benzyloxy, naphthylmethyloxy, fluorenylmethyloxy, anthrylmethyloxy, biphenylylmethyloxy, tetrahydronaphthylmethyloxy, chromanylmethyloxy, 2,3-dihydro-1,4-dioxanaphtha Renylmethyloxy, indanylmethyloxy and phenanthrylmethyloxy, phenethyloxy, naphthylethyloxy, fluorenylethyloxy, anthrylethyloxy, biphenylylethyloxy, tetrahydronaphthylethyloxy, chromanylethyloxy, 2 And 3-dihydro-1,4-dioxanaphthalenylethyloxy, indanylethyloxy and phenanthrethylethyloxy.
  • C 1 -C 4 alkyl methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, tert-butyl can be mentioned.
  • C 2 -C 4 alkenyl examples include vinyl, allyl and 1-butenyl.
  • monoalkylamino examples include methylamino, ethylamino, n-propylamino, isopropylamino, n-butylamino, isobutylamino, tert-butylamino, n-pentylamino, isopentylamino and hexylamino.
  • dialkylamino examples include dimethylamino, diethylamino, di-n-propylamino, diisopropylamino, di-n-butylamino, di-isobutylamino, di-tert-butylamino, di-n-pentylamino, di-isopentylamino and dihexylamino.
  • monoalkylaminocarbonyl methylaminocarbonyl, ethylaminocarbonyl, n-propylaminocarbonyl, isopropylaminocarbonyl, n-butylaminocarbonyl, isobutylaminocarbonyl, tert-butylaminocarbonyl, n-pentylaminocarbonyl, isopentylaminocarbonyl And hexylaminocarbonyl.
  • dialkylaminocarbonyl dimethylaminocarbonyl, diethylaminocarbonyl, di-n-propylaminocarbonyl, diisopropylaminocarbonyl, di-n-butylaminocarbonyl, di-isobutylaminocarbonyl, di-tert-butylaminocarbonyl, di-n-pentylaminocarbonyl, diiso And pentylaminocarbonyl and dihexylaminocarbonyl.
  • Alkoxycarbonyl includes methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, butoxycarbonyl, isobutoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, isopentyloxycarbonyl and hexyloxycarbonyl.
  • aryloxycarbonyl phenyloxycarbonyl, naphthyloxycarbonyl, fluorenyloxycarbonyl, anthryloxycarbonyl, biphenylyloxycarbonyl, tetrahydronaphthyloxycarbonyl, chromanyloxycarbonyl, 2,3-dihydro-1,4-geo And xanaphthalenyloxycarbonyl, indanyloxycarbonyl and phenanthryloxy carbonyl.
  • Carbon nanomaterials (hereinafter sometimes referred to as “CNM”) having a large number of groups such as OH, COOH, NH 2 and the like on the surface are known, and such materials are used for the following scheme (1) According to 10), the functional group-modified carbon nanomaterial of the present invention can be obtained.
  • CCM Carbon nanomaterials
  • solvent examples include halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride and 1,2-dichloroethane, aromatic hydrocarbons such as toluene, tetrahydrofuran, diethyl ether, diisopropyl ether and the like.
  • halogenated hydrocarbons such as chloroform, methylene chloride and 1,2-dichloroethane
  • aromatic hydrocarbons such as toluene, tetrahydrofuran, diethyl ether, diisopropyl ether and the like.
  • the nanoclusters of the present invention can be prepared by suspending a functional group-modified carbon nanomaterial in a suitable aqueous medium such as water or buffer and self-organizing by ultrasonic irradiation. After ultrasonication, unreacted functional group-modified carbon nanomaterials which do not form clusters can be removed by a purification operation such as centrifugation to separate self-assembled nanoclusters.
  • the nanoclusters of the present invention can be complexed with the active ingredient by suspending in an appropriate solvent containing the active ingredient.
  • the active ingredient is present on the surface or inside of the nanoclusters.
  • the active ingredient include physiologically active substances, labeling substances, essential oils, perfumes, organic dyes and the like.
  • Labeling substances include fluoresceins such as fluorescein, oregon green, eosin, erythrosine, etc .; tetramethyl rhodamine derivatives, Texas red derivatives, rhodamine B base, rhisamine rhodamine B, rhodamines such as rhodamine 6G; coumarins; Aminonaphthalenesulfonic acid type) fluorescent dyes; NBD type dyes; pyrene; phycobiliproteins such as R-phycoerythrin, phlophycocyanin, allophycocyanin; BODIPY derivatives; Cy such as Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 Alexa Fluor® such as Alexa Fluor 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 633, 647, 680, 700, 750 etc. It is. These may be used alone or in combination of two or more.
  • sweet orange, bitter orange, petit gren, lemon, grapefruit, lime, bergamot, mandarin, neroli, peppermint, spearmint, lavender, chamomile, rosemary, eucalyptus, sage, basil, rose, geranium, jasmine, ylang ylang, Anise, fennel, star anise, clove, cinnamon, ginger, nutmeg, cardamom, hop, cedar, cypress, vetiver, patchouli, rubdaneum, etc. may be used, and one or more of these may be used.
  • flavoring agents include monoterpenes such as l-menthol, ⁇ -pinene, ⁇ -pinene, myrcene, camphene and limonene, sesquiterpenes such as valencene, cedrene, caryophyllene and longifolene, 1,3,5-undecatriene, Butanol, pentanol, isoamyl alcohol, hexanol, prenol, (Z) -3-hexen-1-ol, 2,6-nonadienol, linalool, geraniol, citronellol, tetrahydromyrusenol, farnesol, nerolidol, cedrol, benzyl alcohol , Phenylethyl alcohol, furfuryl alcohol, acetaldehyde, isovaleraldehyde, hexanal, octanal, nonanal, decanal, (E)
  • annatto pigment As a natural pigment, annatto pigment, cochineal pigment, erythema pigment, ⁇ -carotene, hibiscus pigment, sulfil yellow, cocoa pigment, riboflavin, chlorophyll, caramel, annat, carmine, ruckaic acid, brazilin, crocin, shikonin, shisonin, Rutin etc. are mentioned.
  • the nanoclusters of the present invention complexed with the active ingredient can be administered or applied in vivo or on the skin of a mammal (human, mouse, rat, hamster, horse, cow, pig, pig, goat, sheep, rabbit, dog, cat, etc.) When released, the active ingredient is released gradually. Therefore, the nanoclusters of the present invention complexed with an active ingredient are useful as pharmaceuticals or pharmaceutical compositions, cosmetics, oral compositions.
  • Cosmetics include foundation, face powder, lotion, milk, lipstick, lotion, beauty fluid, massage cream, moisturizing cream, pack, face wash, shampoo, rinse, hair restorer, body powder and the like.
  • Oral compositions include mouthwashes, mouthrinses, toothpastes, tooth powders, chewing gum, chewing, gummy, rhamne and the like.
  • Examples of pharmaceutical dosage forms include tablets, capsules, troches, pills, chewable tablets, injections, suppositories, syrups, ointments, plasters and the like.
  • the nanoclusters of the present invention gradually release the active ingredient, they are useful as delivery carriers for the active ingredient.
  • Physiologically active substances include drugs, nucleic acids and proteins.
  • Preferred medicaments are antineoplastic agents.
  • hormonal therapeutic agents eg, phosphestrol, diethylstilbestrol, chlorotrianiserin, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, chlormadinone acetate, cyproterone acetate, danazol, allylestrenol, gestrinone , Mepaltricin, raloxifene, olmelokifene, levormeloxifene, anti-estrogen (eg, tamoxifen citrate, toremifene citrate etc.), pill formulation, mepithiostan, testolactone, aminoglutethimide, LH-RH agonist (eg, goserelin acetate) , Buserelin, leuprorelin etc.), droloxifene, epithiostanol, ethynyl estradiol sulfonate, aroma
  • the types of cancer targeted by the antitumor agent include colorectal cancer, liver cancer, liver cancer, kidney cancer, head and neck cancer, esophagus cancer, gastric cancer, biliary cancer, bile duct and cholangiocarcinoma, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer Cervical cancer, endometrial cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular tumor, bone and soft tissue sarcoma, leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma, skin cancer, brain tumor and the like, preferably colorectal cancer, gastric cancer Head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, biliary cancer, liver cancer.
  • the nucleic acid is not particularly limited, and may be any of DNA, RNA, chimeric nucleic acid of DNA and RNA, hybrid of DNA / RNA, and the like.
  • the nucleic acid may be any one of 1 to 3 strands, preferably 1 or 2 strands.
  • the nucleic acid is another type of nucleotide that is an N-glycoside of a purine or pyrimidine base, or another oligomer having a non-nucleotide backbone (e.g., a commercially available peptide nucleic acid (PNA) etc.) or other oligomer containing special linkages (However, the oligomer may contain a nucleotide having an arrangement that permits base pairing or attachment of a base as found in DNA or RNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • Intramolecular nucleotide-modified ones for example, those having non-charged bonds (eg, methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioate, phosphoro)
  • Those having a dithioate such as those having a side chain group such as a protein (nuclease, nuclease inhibitor, toxin, antibody, signal peptide, etc.) or a sugar (eg, monosaccharide etc.), an intercalating compound With (eg, acridine, psoralen, etc.), chelating Containing a metal (eg, metal, radioactive metal, boron, oxidizing metal, etc.), containing an alkyl
  • a metal eg, metal, radioactive metal, boron, oxidizing metal, etc.
  • siRNA means a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of a target gene mRNA or an initial transcript or a partial sequence thereof (preferably in a coding region) (including an intron portion in the case of an initial transcript) and a complementary strand thereof It is a single stranded oligo RNA.
  • the length of a portion homologous to the target nucleotide sequence contained in the siRNA is usually about 18 bases or more, for example, about 20 bases (typically about 21 to 23 bases in length), but RNA interference There is no particular limitation as long as it can cause the Also, the total length of the siRNA is usually about 18 bases or more, for example, about 20 bases (typically about 21 to 23 bases) in length, but is not particularly limited as long as it can cause RNA interference. .
  • the relationship between the target nucleotide sequence and the homologous sequence contained in the siRNA may be 100% identical or there may be base mutation (at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, most preferably in the range of 95% or more identity).
  • the siRNA may have an additional base that does not form a base pair, consisting of 5 bases or less, preferably 2 bases, at the 5 'or 3' end.
  • the additional base may be DNA or RNA, but using DNA can improve the stability of the siRNA. Examples of sequences of such additional bases include ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', ttttt-3. Sequences such as ', uuuuuu-3', etc. may be mentioned, but not limited thereto.
  • the siRNA may be directed to any target gene.
  • the siRNA preferably targets a gene whose upregulation is associated with the onset and / or exacerbation of a target disease, and more specifically, an antisense nucleic acid against the gene is used at a clinical or preclinical stage. These include those targeting advanced genes and newly known genes.
  • the siRNA may be used alone or in combination of two or more.
  • Proteins include enzymes, receptors, antibodies, antigens, interferons, cytokines such as interleukins, and the like.
  • the average particle diameter of the nanoclusters of the present invention is about 1 to 1000 nm, preferably about 3 to 800 nm, more preferably about 5 to 500 nm, still more preferably about 10 to 300 nm, and particularly about 30 to 250 nm.
  • the zeta potential of the nanocluster is preferably about 5 to 30 mV, more preferably about 10 to 25 mV.
  • the active ingredient is contained in an amount of about 5 to 50 parts by mass, preferably about 10 to 20 parts by mass, with respect to 100 parts by mass of the nanocluster.
  • Example 1 Synthesis of surface chemically modified CND composite nanocluster (CND-SNP cluster)
  • the surface chemically modified CND composite nanocluster was synthesized by the following method (FIG. 2 (a)).
  • CND-ori aqueous solution having an amino group on the surface (1 mL) (CND concentration: 3.2 mg / mL, Daicel, Tokyo, Japan), perfluorooctanoic acid (PFOA) (10 mg) (Sigma-Aldrich, St.
  • the pellet produced by centrifugation was dispersed in distilled water (10 mL) by irradiating ultrasound for 10 minutes with a pulse type ultrasonic device (VCX-600; Sonics, Danbury, Conn., USA). Centrifugation (VCX-600; Sonics, Danbury, Conn., USA) (1,000 rpm, 10 minutes, 20 ° C.) to remove impurities formed by a pulsed ultrasound device, and surface chemically modified CND composite nanoclusters (CND) The supernatant solution in which the -SNP cluster) was dispersed was used for the subsequent experiments.
  • a pulse type ultrasonic device VCX-600; Sonics, Danbury, Conn., USA
  • Centrifugation VCX-600; Sonics, Danbury, Conn., USA
  • CND surface chemically modified CND composite nanoclusters
  • the method for preparing surface chemically modified CND composite nanoclusters (BODIPY @ CND-SNP and CPT @ CND-SNP) encapsulating BODIPY and CPT is as follows. Distilled water (10 mL), BODIPY (1 mg) (Sigma-Aldrich) or camptothecin (CPT) (10 mg) (Wako) is added to the CND pellet (CND-SNP cluster) chemically modified with PFOA described above, and bath type Ultrasonication was performed for 10 minutes using an ultrasonic device. The prepared mixture was stored at 4 ° C. and used for each biological experiment.
  • the surface chemically modified CND composite nanocluster (CPT @ CND-SNP) encapsulating CPT is shown in FIG. 1 (d), and the manufacturing process of the surface chemically modified CND composite nanocluster (BODIPY @ CND-SNP) encapsulating BODIPY is illustrated. It is shown in 4 (a).
  • CND-ori high resolution transmission electron microscopy
  • EM-002B Topcon, Tokyo, Japan
  • 120 kV transmission electron microscopy
  • the hydrodynamic diameter of the surface chemically modified CND composite nanocluster was investigated using dynamic light scattering (DLS) (Photal FPAR-1000; Otsuka Electronics, Osaka, Japan) (FIG. 2 (c)).
  • DLS dynamic light scattering
  • Optical properties and concentrations of various samples were determined using an ultraviolet-visible-near-infrared spectrometer (V-730 BIO; Jasco, Tokyo, Japan) (Fig. 2 (b), Fig. 4 (b), Fig. 5 (a).
  • Surface chemically modified CND composite nanoclusters (CND-SNP cluster) and unmodified CND powder (CND-ori) (2 mg each) were oxygenated by thermogravimetry (TGA Q 500; TA Instrument, New Castle, DE, USA) The combustion was performed under a gas atmosphere (10 ° C. min ⁇ 1 ), and the amount of surface chemically modified PFOA was analyzed (FIG. 3 (a)).
  • the quantification of the surface chemically modified CND composite nanocluster as well as the amino group of unmodified CND was investigated using the Kaiser test kit (60017-1 EA, Sigma-Aldrich) as follows.
  • Surface chemically modified CND composite nanoclusters or unmodified CND powder (0.64 mg) were added to distilled water (200 ⁇ L).
  • solution 1 (200 ⁇ L) (Phenol, 80% in ethanol) and solution 2 (200 ⁇ L) (KCN in H 2 O / pyridine) to the aqueous solution, and use a bath type until the powder derived from CND disperses well. It was hung on an ultrasonic device. After heating at 120 ° C.
  • the dilution amount is 3 mL, and the extinction coefficient (extinction coefficient) is 15000 m -1 cm -1 .
  • Blank samples were prepared exactly by the same method using distilled water. The results were calculated assuming that the amount of amino group of unmodified CND was 100%.
  • the zeta potential of the surface chemically modified CND composite nanocluster can be determined by the Kyota Interface Science Co., Ltd. (Saitama, Japan) using a zeta potential measurement system (ZEECOM ZC-3000; Microtec Co., Ltd., Chiba, It measured using Japan) (FIG. 3 (d)).
  • CND-SNP surface chemically modified CND composite nanocluster
  • HT-29 Human colon adenocarcinoma
  • U2OS human osteosarcoma cells
  • HeLa human cervical cancer
  • TAG3 human normal fibroblasts
  • JCRB Cell Bank or DS Pharma Biomedical ( Purchased from bovine, bovine serum (10%), L-glutamine (2 mM), sodium pyruvate (1 mM), genamycin, penicillin-streptomycin (100 IU mL -1 ), Hank's balanced salt solution (Life)
  • the cells were cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide environment using DMEM medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) containing Technologies, MD, USA).
  • Fluorescent Microscope Live Imaging Cells were seeded on glass bottom dishes for imaging and incubated overnight for attachment. Then, surface chemically modified CND composite nanoclusters in which BODIPY was encapsulated were added to the cells, and incubated at 37 ° C. or 4 ° C. for 2 hours. After incubation, cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (1 ⁇ g mL ⁇ 1 , Thermo Scientific, Waltham, Mass., USA) for 10 minutes. Three minutes after that, the cells were washed with PBS buffer, phenol red free RPMI 1640 medium (Thermo Scientific) was added, and live imaging of cells was performed.
  • the stained cells were observed in a phenol red free medium using a fluorescence microscope (IX 73; Olympus) equipped with a mirror unit (IX3-FGFPXL, Olympus) and an EM-CCD camera (DP80; Olympus) (FIG. 4 (c ), Fig. 4 (e)).
  • a fluorescence microscope IX 73; Olympus
  • a mirror unit IX3-FGFPXL, Olympus
  • DP80 Olympus
  • anti-Bcl-xL 2762; Cell Signaling, MA, USA
  • anti-Bcl-2 2876; Cell Signaling
  • anti-caspase-8 0.6-775; Millipore, Billerica, MA, USA
  • anti-caspase -3 H-277; Santa Cruz, CA, USA
  • anti-PARP-1 H-250; Santa Cruz
  • mouse anti- ⁇ -Tubulin T5293; Sigma-Aldrich
  • anti-p53 DO-1) Santa Cruz
  • anti- ⁇ -actin AC-15; Abcam
  • Flow cytometry was performed by double staining with Annexin-V and 7-AAD, which can detect apoptosis.
  • Cells were seeded on a 6-well plate to a density of 3 ⁇ 10 5 cells well ⁇ 1 and then incubated overnight for adhesion. After 24 hours, cells were harvested and analyzed by the Guava PCA flow cytometer (Millipore) using a cocktail solution containing Guava Nexin Reagent (Millipore), Annexin V-PE and 7-AAD according to the apoptosis assay according to the manual.
  • the percentage of apoptotic cells was calculated by FlowJo software (Version 7.6, FlowJo LLC, Oregon, USA) (FIG. 6 (d), FIG. 6 (e)).
  • CND-SNPs surface chemically modified CND composite nanoclusters
  • ⁇ in the data indicates the standard deviation
  • n indicates the number of samples used.
  • Student's t-test was used. *, ** and *** indicate p values of ⁇ 0.05, ⁇ 0.005 and ⁇ 0.001, respectively.

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Abstract

本発明は、下記式（Ｉ）　－Ｙ1－Ｒ　（Ｉ） （式中、Ｙ1は２価の連結基を示す。Ｒは有機基を示す。） で表される官能基で修飾されたカーボンナノ材料が自己組織化したナノクラスターを提供するものである。

Description

修飾カーボンナノ材料、ナノクラスター、物質送達担体及び医薬組成物
　本発明は、修飾カーボンナノ材料、ナノクラスター、物質送達担体及び医薬組成物に関する。
　本明細書において、以下の略号を用いる：
CND：carbon nano diamond
SNP：super nano particle
　カーボンナノダイヤモンド(以下、「CND」と称する)は、ダイヤモンド固有の性質に加え、平均粒径が小さく、比表面積が大きいという特徴を有しており、更には、比較的安価であり、入手が容易という利点がある。CNDは、爆発法や高温高圧法などによって製造することができる(特許文献１)。CNDは毒性の低さ、優れた生体適合性及び安定した蛍光特性を有することから、生物医療分野での応用が幅広く研究されている。さらに、特許文献２、３は、修飾されたCND及びその製造方法について開示する。
　CNDの生物医療分野での応用の例として、非特許文献1では、CNDに抗癌剤であるシスプラチンを担持させることによりシスプラチン-CND複合体を作製したこと、pHが酸性領域にある場合に複合体からシスプラチンを遊離させることが可能であること、複合体から遊離した薬剤は遊離のシスプラチンと同程度の細胞毒性を保持していることが報告されている。また、非特許文献2では、CND表面に抗癌剤エピルビシンを疎水性相互作用により吸着させ、さらに大腸癌の上皮成長因子受容体（Epidermal Growth Factor Receptor; EGFR）に特異性のある抗体（anti-EGFR-PEG）を結合させた脂質ベシクルで当該エピルビシン-CND複合体を包み込むことで溶解性を高め、癌細胞に対する薬物集積作用ならびに効能について報告している。
　CNDに薬物を担持させた従来の複合体は、基本的に薬物担持量が少ないことや複合体形成後に水中分散性が著しく低下する問題点がある。
　CNDの水や極性有機溶媒への溶解性、分散性及び分散安定性を向上させるために、CNDの表面を高分子により修飾することが提案されている。例えば、特許文献４では、ナノダイヤモンドの表面を、ポリグリセリン鎖を含む特定の基で修飾することにより、水や極性有機溶媒への溶解性、分散性及び分散安定性が大幅に向上することが報告されている。しかしながら、従来技術では、基本的にCNDの分散性を高めることに主眼が置かれており、表面化学修飾後のCNDを利用した自己組織化能に関する評価や薬物担持を目的とするナノ構造制御に関する研究は皆無である。
特開2010-202458号公報 特開2017-186234号公報 特開2017-186235号公報 特開2010-248023号公報
Bo Guan et al., Small 2010, 6, 1514-1519 Laura Moore et al., Adv. Mater. 2013, 25, 3532-3541
　本発明は、医薬品、香料などの生理活性物質を効果的に担持可能で、且つ生理的環境下で優れた溶解性を示す材料を提供することを主な目的とする。
　本発明は、以下の修飾カーボンナノ材料、ナノクラスター、物質送達担体及び医薬組成物を提供するものである。
〔１〕　下記式（Ｉ）
　　－Ｙ1－Ｒ　　　（Ｉ）
（式中、Ｙ1は２価の連結基を示す。Ｒは有機基を示す。）
で表される官能基で修飾されたカーボンナノ材料が自己組織化したナノクラスター。
〔２〕　Ｙ1で表される２価の連結基が、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、及び、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれるいずれかである、〔１〕に記載のナノクラスター。
〔３〕　Ｒで表される有機基が、フルオロ有機基、パーフルオロ有機基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は置換されていてもよい複素環基である、〔１〕又は〔２〕に記載のナノクラスター。
〔４〕　前記カーボンナノ材料がＯＨ、ＣＯＯＨ及びＮＨ2からなる群から選ばれる少なくとも１種の表面基を有し、式（Ｉ）で表される官能基は前記表面基を介してカーボンナノ材料に導入されている、〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のナノクラスター。
〔５〕　有効成分と複合化した、〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のナノクラスター。
〔６〕　有効成分が生理活性物質、標識物質、香料、精油又は有機色素である、〔５〕に記載のナノクラスター。
〔７〕　カーボンナノ材料がカーボンナノダイヤモンド又はカーボンナノドットである、〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載のナノクラスター。
〔８〕　〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載のナノクラスターを含む、有効成分の送達担体。
〔９〕　下記式（Ｉ）
　　－Ｙ1－Ｒ　　　（Ｉ）
（式中、Ｙ1は２価の連結基を示す。Ｒはフルオロ有機基又はパーフルオロ有機基を示す。）
で表される官能基で修飾されたカーボンナノ材料。
〔１０〕　Ｙ1で表される２価の連結基が、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、及び、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれるいずれかである、〔９〕に記載のカーボンナノ材料。
〔１１〕　カーボンナノ材料がカーボンナノダイヤモンドである、〔９〕又は〔１０〕に記載のカーボンナノ材料。
〔１２〕　医薬と複合化した〔１〕に記載の自己組織化したナノクラスターを含む医薬組成物。
　本発明によれば、生理活性物質、香料、有機色素などの有効成分を効果的に担持可能で、且つ生理的環境下で優れた溶解性を示す表面化学修飾カーボンナノ材料クラスターならびに該ナノクラスターを含む医薬組成物などの複合材料を提供することができる。
抗癌剤カンプトテシン（CPT）を内包した各種ナノ材料における癌細胞排除効果。(a) CPTを内包したPEG化リポソーム（CPT@DSPE-PEG）；(b) CPTとCND-oriの複合体（CPT@CND-ori）；(c) CPT@CND-oriがPEG化DSPEから構成されるリポソームに内包された複合体（CPT@DSPE-PEG@CND-ori）；(d) CPTとPFOA修飾CNDの複合体（CPT@CND-SNP）；(e) 図１(a)～(d)の各種材料とコントロールによるU2OS細胞に対する細胞生存度の試験結果。1.Control(溶媒のみ)、2.PEG-CPT（CPT@DSPE-PEG）、　3.CND-CPT（CPT@CND-ori）、　4.CND-PEG-CPT（CPT@DSPE-PEG@CND-ori）、　5. CND-PFOA-CPT（CPT@CND-SNP）。 表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）の合成方法とキャラクタリゼーション。 (a) 表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）の合成方法。 (b) 表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）水溶液の紫外-可視-近赤外吸収スペクトル。 (c) 動的光散乱による表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）の粒子径解析結果（平均粒子径：90 nm）。写真は、CND濃度を0.32 mg mL-1に調整した表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液を示している。 (d) 透過型電子顕微鏡による表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）の構造解析。 (a) 表面化学修飾前のCND(CND-ori)(1)と表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）(2)の熱重量分析。 (b) 透過型電子顕微鏡による表面化学修飾前のCND(CND-ori)の構造解析。 (c) カイザーテストによる表面化学修飾前のCNDと表面化学修飾CND複合ナノクラスターのアミノ基定量分析（n =3 ）。(d) 表面化学修飾前のCND(CND-ori)と表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）のゼータ電位（n = 3）。CND濃度： 0.32 mg mL-1。(e) 表面化学修飾前のCND(CND-ori)と表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）の表面張力（n = 3）。CND濃度： 0.32 mg mL-1。 蛍光プローブBODIPYを内包した表面化学修飾CND複合ナノクラスターの蛍光顕微鏡を用いた細胞内分布解析。(a) BODIPYを内包した表面化学修飾CND複合ナノクラスターの製造方法。　(b) 紫外-可視-近赤外スペクトル。黒線(1)： BODIPYを溶解したDMSO。灰色線(2)：BODIPYを内包する前の表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液（CND-SNP）。緑線(3)：BODIPYを内包させた表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液（BODIPY@CND-SNP）。 (c) BODIPYを内包させた表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液を2時間、4℃と37℃でインキュベートしたU2OS細胞の蛍光顕微鏡像。CND濃度： 3.2 μg mL-1。(d) 表面化学修飾CND複合ナノクラスターの有無におけるU2OS細胞中のLAMP1（リソソームマーカー）のウエスタンブロッティング。CND濃度： 3.2 μg mL-1。β-Tubulinは導入コントロールとして使用した。(e) HeLa細胞にBODIPYを内包させた表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液（BODIPY@CND-SNP）を4時間、37℃でインキュベートした時の蛍光顕微鏡像。赤色：リソソーム、緑色： BODIPYを内包させた表面化学修飾CND複合ナノクラスター。 表面化学修飾CND複合ナノクラスターの細胞内分布挙動。(a) 蛍光プローブBODIPYの内包前後の表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液の蛍光スペクトル解析。灰色線(1)：BODIPY内包前。緑色線(2)：BODIPY内包後。(b) U2OS細胞への表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP）導入前後の光学顕微鏡解析（明視野像）。CND濃度： 3.2 μg mL-1。インキュベート時間：12時間。図５(b)のCND-SNPの右上の矢印は、細胞内に導入された表面化学修飾CND複合ナノクラスターを示している。 抗癌剤カンプトテシン（CPT）を封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターのin vitroにおける癌細胞排除効果。(a) CPTを封入前後の表面化学修飾CND複合ナノクラスター水溶液（灰色線(2)：CPT封入前（CND-SNP）、赤線(3)：CPT封入後（CPT@CND-SNP））とCPTを溶解したDMSO（黒線(1)）の紫外-可視-近赤外吸収スペクトル。(b) CPTならびにCPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CPT@CND-SNP）のU2OS細胞に対する細胞毒性評価。インキュベート時間：24時間。(c)Control、CPT、CND-SNPならびにCPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CPT@CND-SNP）とU2OS細胞を48時間インキュベートした時のクリスタルバイオレットによる生細胞染色。(d) Control、CPT、CND-SNPならびにCPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CPT@CND-SNP）とU2OS細胞を24時間インキュベートした時のフローサイトメトリーを用いたアポトーシス解析。(e) フローサイトメトリーの定量解析結果。(f) ウエスタンブロッティングによるU2OS細胞中のアポトーシス関連バイオマーカー解析。β-actinは導入コントロールとして使用した。CND濃度： 3.2 μg mL-1、CPT濃度：10 μg mL-1。 各種抗癌剤を封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターのin vitroにおける癌細胞排除効果。(a) 各種抗癌剤（Curcumin, Carmofur, Cisplatin, Methotrexate）を封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターのU2OS細胞に対する細胞毒性評価。インキュベート時間：24時間。(b) 表面化学修飾CND複合ナノクラスターそのもの（CND-SNP）、ならびにPFOAのヒト正常線維芽細胞（TIG-3）に対する細胞毒性評価。(c) CPT、CPTを封入したPFOA、ならびにCPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CPT@CND-SNP）のU2OS細胞に対する細胞毒性評価。インキュベート時間：24時間。 CPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターのin vivoにおける癌細胞排除効果。 (a) CPT（2.78 mg kg-1）、CPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CPT@CND-SNP, 3.56 mg kg-1）、CPTを封入していない表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CND-SNP)、PBS緩衝液を腹腔内投与したHT-29固形癌を有するヌードマウスの経時変化。 (b) 各処理後の腫瘍体積比の経時変化。(c) 各処理後のマウス体重の経時変化。(d) エンドポイントにおける各処理後の腫瘍サイズ。 表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP, 3.56 mg kg-1）ならびにPBS緩衝液を経口投与したマウスの平均体重。 カルボキシル化CND（CND-COOH）ならびにアミノ化CND（CND-NH2）表面に異なる長さのアルキル鎖(C8:octyl, C12:dodecyl, C18:oleyl)を導入した際のCND複合ナノクラスター水溶液の写真と動的光散乱による測定値。アミノ化CNDは、例えば以下の文献に従い製造可能である：A. Krueger, Chem. Eur. J. 2008, 14, 1382-1390；　Y. Liu, Chem. Mater. 2004, 16, 3924-3930；　A. Krueger, Langmuir 2008, 24, 4200-4204；　Denisov S.A., IOP Conf. Series: Materials Science and Engineering 16 (2010) 012005；　A. Krueger, Advanced Functional Materials, 22(5), 890-906.
　本明細書において、カーボンナノ材料はカーボンナノダイヤモンド、カーボンナノドットを包含する。
本発明のカーボンナノ材料は、下記式（Ｉ）
　　－Ｙ1－Ｒ　　　（Ｉ）
（式中、Ｙ1は２価の連結基を示す。Ｒは有機基を示す。）
で表される官能基で修飾されている。この官能基で修飾されたカーボンナノ材料を「修飾カーボンナノ材料」と記載することがある。
　本発明のカーボンナノ材料は、式（Ｉ）で表される官能基を１個又は２個以上有している。式（Ｉ）で表される官能基は、修飾カーボンナノ材料の0.0001～30質量％程度、好ましくは0.001～20質量％程度、好ましくは0.01～15質量％程度、好ましくは0.05～10質量％程度である。
　Ｙ1で表される２価の連結基としては、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－が挙げられる。
　Ｒで表される有機基としては、フルオロ有機基、パーフルオロ有機基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基、置換されていてもよい複素環基が挙げられる。有機基は、フルオロ有機基又はパーフルオロ有機基が好ましい。
　Ｒで表されるフルオロ有機基又はパーフルオロ有機基としては、置換されていてもよいフルオロアルキル基、置換されていてもよいフルオロシクロアルキル基、置換されていてもよいフルオロアリール基、置換されていてもよいフルオロアラルキル基、置換されていてもよいフルオロ複素環基、置換されていてもよいパーフルオロアルキル基、置換されていてもよいパーフルオロシクロアルキル基、置換されていてもよいパーフルオロアリール基、置換されていてもよいパーフルオロアラルキル基、置換されていてもよいパーフルオロ複素環基が挙げられる。
　置換されていてもよい（アルキル基、フルオロアルキル基、パーフルオロアルキル基）、置換されていてもよい（シクロアルキル基、フルオロシクロアルキル基、パーフルオロシクロアルキル基）、置換されていてもよい（アリール基、フルオロアリール基、パーフルオロアリール基）、置換されていてもよい（アラルキル基、フルオロアラルキル基、パーフルオロアラルキル基）、置換されていてもよい（複素環基、フルオロ複素環基、パーフルオロ複素環基）の置換基としては、ハロゲン原子、Ｃ1～Ｃ4アルコキシ、アリールオキシ、アラルキルオキシ、Ｃ1～Ｃ4アルキル、Ｃ2～Ｃ4アルケニル、ＮＯ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＣＮ、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、ＮＨＣＯＣＨ3、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルなどが挙げられ、置換基を有する各官能基の置換基の数は、１～５個、好ましくは１～３個、より好ましくは１～２個である。好ましい置換基としては、フッ素原子、塩素原子、アリールオキシ、アラルキルオキシ、Ｃ1～Ｃ4アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、ＯＨ、ＣＯＯＨ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシカルボニルが挙げられる。
　置換されていてもよいアルキル基は、置換アルキル基と非置換アルキル基（以下、単に「アルキル基」という）を包含する。アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、tert－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、アイコシル、ヘンアイコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシルなどの直鎖又は分岐を有するＣ1－Ｃ24アルキル基が挙げられる。
　フルオロアルキル基は、アルキル基の水素原子の一部がフッ素原子で置換された直鎖又は分岐を有するＣ1－Ｃ24フルオロアルキルを包含し、パーフルオロアルキル基は、アルキル基の全ての水素原子がフッ素原子で置換された直鎖又は分岐を有するＣ1－Ｃ24パーフルオロアルキルを包含する。
　直鎖又は分岐を有するＣ1－Ｃ24フルオロアルキルとしては、ＣpＨqＦr（ｐは１～２４の整数、ｑは１～２ｐの整数、ｒは１～２ｐの整数を示し、ｑ＋ｒ＝２ｐ＋１である。）が挙げられ、直鎖又は分岐を有するＣ1－Ｃ24パーフルオロアルキルとしては、ＣsＦ2s+1（ｓは１～２４の整数を示す）が挙げられる。
　置換されていてもよいシクロアルキル基は、置換シクロアルキル基と非置換シクロアルキル基（以下、単に「シクロアルキル基」という）を包含する。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルが挙げられる。
　フルオロシクロアルキル基は、シクロアルキル基の水素原子の一部がフッ素原子で置換された基（例えばモノフルオロシクロペンチル、ジフルオロシクロペンチル）を包含し、パーフルオロシクロアルキル基は、シクロアルキル基の全ての水素原子がフッ素原子で置換された基（例えばパーフルオロシクロペンチル、パーフルオロシクロヘキシル）を包含する。
　置換されていてもよいアリール基は、置換アリール基と非置換アリール基（以下、単に「アリール基」という）を包含する。アリール基としては、フェニル、ナフチル、フルオレニル、アントリル、ビフェニリル、テトラヒドロナフチル、クロマニル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニル、インダニル及びフェナントリルが挙げられる。
　フルオロアリール基は、アリール基の水素原子の一部がフッ素原子で置換された基（例えばフルオロフェニル、ジフルオロフェニル、トリフルオロフェニル）を包含し、パーフルオロアリール基は、アリール基の全ての水素原子がフッ素原子で置換された基（例えばパーフルオロフェニル、パーフルオロビフェニル、パーフルオロナフチル）を包含する。
　置換されていてもよいアラルキル基は、置換アラルキル基と非置換アラルキル基（以下、単に「アラルキル基」という）を包含する。アラルキル基としては、ベンジル、ナフチルメチル、フルオレニルメチル、アントリルメチル、ビフェニリルメチル、テトラヒドロナフチルメチル、クロマニルメチル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチル、インダニルメチル及びフェナントリルメチル、フェネチル、ナフチルエチル、フルオレニルエチル、アントリルエチル、ビフェニリルエチル、テトラヒドロナフチルエチル、クロマニルエチル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルエチル、インダニルエチル及びフェナントリルエチルが挙げられる。
　フルオロアラルキル基は、アラルキル基の水素原子の一部がフッ素原子で置換された基（例えばモノフルオロベンジル、ジフルオロベンジル、トリフルオロベンジル、モノフルオロフェネチル、ジフルオロフェネチル、トリフルオロフェネチル）を包含し、パーフルオロアラルキル基は、アラルキル基の全ての水素原子がフッ素原子で置換された基（例えばパーフルオロベンジル、パーフルオロフェネチル）を包含する。
　置換されていてもよい複素環基は、置換複素環基と非置換複素環基（以下、単に「複素環基」という）を包含する。複素環基としては、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、キノリル、イソキノリル、ベンゾ［ｂ］チエニル及びベンズイミダゾリルなどが挙げられる。
　フルオロ複素環基は、複素環基の水素原子の一部がフッ素原子で置換された基（例えばモノフルオロフリル、モノフルオロピリジル、モノフルオロインドリル）を包含し、パーフルオロ複素環基は、複素環基の全ての水素原子がフッ素原子で置換された基（例えばパーフルオロフリル、パーフルオロチエニル、パーフルオロピロリル、パーフルオロインドリル）を包含する。
　「ハロゲン原子」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を意味するが、フッ素、塩素、臭素が好ましく、フッ素又は塩素がさらに好ましく、フッ素が特に好ましい。
　Ｃ1～Ｃ4アルコキシとして、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられる。
　アリールオキシとして、フェニルオキシ、ナフチルオキシ、フルオレニルオキシ、アントリルオキシ、ビフェニリルオキシ、テトラヒドロナフチルオキシ、クロマニルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシ、インダニルオキシ及びフェナントリルオキシが挙げられる。
　アラルキルオキシとして、ベンジルオキシ、ナフチルメチルオキシ、フルオレニルメチルオキシ、アントリルメチルオキシ、ビフェニリルメチルオキシ、テトラヒドロナフチルメチルオキシ、クロマニルメチルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルメチルオキシ、インダニルメチルオキシ及びフェナントリルメチルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルエチルオキシ、フルオレニルエチルオキシ、アントリルエチルオキシ、ビフェニリルエチルオキシ、テトラヒドロナフチルエチルオキシ、クロマニルエチルオキシ、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルエチルオキシ、インダニルエチルオキシ及びフェナントリルエチルオキシが挙げられる。
　Ｃ1～Ｃ4アルキルとして、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、tert－ブチルが挙げられる。
　Ｃ2～Ｃ4アルケニルとして、ビニル、アリル、１-ブテニルが挙げられる。
　モノアルキルアミノとして、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、イソブチルアミノ、tert－ブチルアミノ、ｎ－ペンチルアミノ、イソペンチルアミノ、ヘキシルアミノが挙げられる。
　ジアルキルアミノとして、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ－プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ－ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジtert－ブチルアミノ、ジｎ－ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジヘキシルアミノが挙げられる。
　モノアルキルアミノカルボニルとして、メチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ｎ－プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、ｎ－ブチルアミノカルボニル、イソブチルアミノカルボニル、tert－ブチルアミノカルボニル、ｎ－ペンチルアミノカルボニル、イソペンチルアミノカルボニル、ヘキシルアミノカルボニルが挙げられる。
　ジアルキルアミノカルボニルとして、ジメチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、ジｎ－プロピルアミノカルボニル、ジイソプロピルアミノカルボニル、ジｎ－ブチルアミノカルボニル、ジイソブチルアミノカルボニル、ジtert－ブチルアミノカルボニル、ジｎ－ペンチルアミノカルボニル、ジイソペンチルアミノカルボニル、ジヘキシルアミノカルボニルが挙げられる。
　アルコキシカルボニルとして、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、tert－ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、イソペンチルオキシカルボニル及びヘキシルオキシカルボニルが挙げられる。
　アリールオキシカルボニルとして、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル、フルオレニルオキシカルボニル、アントリルオキシカルボニル、ビフェニリルオキシカルボニル、テトラヒドロナフチルオキシカルボニル、クロマニルオキシカルボニル、２，３－ジヒドロ－１，４－ジオキサナフタレニルオキシカルボニル、インダニルオキシカルボニル及びフェナントリルオキシカルボニルが挙げられる。
　表面にＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ2などの基を多数有するカーボンナノ材料（以下、「ＣＮＭ」と記載することがある）は公知であり、このような材料を用いて以下のスキーム（１）～（１０）に従い、本発明の官能基で修飾されたカーボンナノ材料を得ることができる。
スキーム
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
（式中、ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩを示す。ＣＮＭはカーボンナノ材料を示す。ｎ１は１以上の整数を示す。ｎ２は０以上の整数を示す。Ｒは前記に定義されるとおりである。）
　上記スキーム（１）～（１０）の反応は常法に従い行うことができ、ＯＨ、ＮＨ2又はＣＯＯＨの表面基を有するカーボンナノ材料１ｇに対し、Ｒ－ＣＯＸ、Ｒ－ＮＨ2、Ｒ－ＯＨ、Ｒ－Ｘのいずれかの化合物を１ｍｇ～過剰量使用し、０℃から溶媒の沸騰する温度において１～２４時間反応させることで目的とする生成物を得ることができる。溶媒としては、クロロホルム、塩化メチレン、１，２－ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素、トルエンなどの芳香族炭化水素、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどが挙げられる。
　本発明のナノクラスターは、官能基で修飾されたカーボンナノ材料を水又は緩衝液などの適当な水性媒体に懸濁させ、超音波照射により自己組織化させて作製することができる。超音波照射後、クラスターを形成していない未反応の官能基修飾カーボンナノ材料を遠心分離などの精製操作により除去し、自己組織化ナノクラスターを分離することができる。
　本発明のナノクラスターは、有効成分を含む適当な溶媒に懸濁させることにより、有効成分と複合化させることができる。有効成分はナノクラスターの表面又は内部に存在する。有効成分としては、生理活性物質、標識物質、精油、香料、有機色素などが挙げられる。
　標識物質としては、フルオレセイン、オレゴングリーン、エオシン、エリスロシン等のフルオレセイン類；テトラメチルローダミン誘導体、テキサスレッド誘導体、ローダミンＢ  ｂａｓｅ、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ等のローダミン類；クマリン類；ダンシル型（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸型）蛍光色素；ＮＢＤ型色素；ピレン；Ｒ－フィコエリスリン、フロフィコシアニン、アロフィコシアニン等のフィコビリプロテイン；ＢＯＤＩＰＹ誘導体；Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５等のＣｙ（登録商標）色素；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６８０、７００、７５０等のアレキサ（登録商標）フローラなど挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　精油としては、スイートオレンジ、ビターオレンジ、プチグレン、レモン、グレープフルーツ、ライム、ベルガモット、マンダリン、ネロリ、ペパーミント、スペアミント、ラベンダー、カモミール、ローズマリー、ユーカリ、セージ、バジル、ローズ、ゼラニウム、ジャスミン、イランイラン、アニス、フェンネル、スターアニス、クローブ、シナモン、ジンジャー、ナツメグ、カルダモン、ホップ、スギ、ヒノキ、ベチバー、パチョリ、ラブダナムなどが挙げられ、これらの１種又は２種以上を使用することができる。
　香料の成分としては、ｌ－メントール、α－ピネン、β－ピネン、ミルセン、カンフェン、リモネンなどのモノテルペン、バレンセン、セドレン、カリオフィレン、ロンギフォレンなどのセスキテルペン、１，３，５－ウンデカトリエン、ブタノール、ペンタノール、イソアミルアルコール、ヘキサノール、プレノール、（Ｚ）－３－ヘキセン－１－オール、２，６－ノナジエノール、リナロール、ゲラニオール、シトロネロール、テトラヒドロミルセノール、ファルネソール、ネロリドール、セドロール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、フルフリルアルコール、アセトアルデヒド、イソバレルアルデヒド、ヘキサナール、オクタナール、ノナナール、デカナール、（Ｅ）－２－ヘキセナール、２，４－オクタジエナール、シトロネラール、シトラール、ベンズアルデヒド、シンナミルアルデヒド、バニリン、エチルバニリン、フルフラール、ヘリオトロピン、２－ヘプタノン、２－ウンデカノン、１－オクテン－３－オン、アセトイン、ジアセチル、２，３－ペンタンジオン、マルトール、エチルマルトール、２，５－ジメチル－４－ヒドロキシ－３（２Ｈ）－フラノン、ヒドロキシケトン、カルボン、メントン、ヌートカトンなどのテルペンケトン、α－イオノン、β－イオノン、β－ダマセノン、ラズベリーケトン、ローズオキシド、リナロールオキシド、メントフラン、テアスピラン、メチルチャビコール、アネトール、酢酸エチル、酢酸イソアミル、酢酸リナリル、酢酸ゲラニル、酢酸ラバンジュリル、酪酸エチル、カプロン酸エチル、酢酸ベンジル、サリチル酸メチル、γ－デカラクトン、γ－ドデカラクトン、δ－デカラクトン、δ－ドデカラクトン、７－デセン－４－オリド、２－デセン－５－オリド、酪酸、４－メチル－３－ペンテン酸、オクタン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、インドール、スカトール、ピリジン、アルキル置換ピラジン、アントラニル酸メチル、メタンチオール、フルフリルメルカプタン、ジメチルスルフィド、ジメチルジスルフィド、ジフルフリルジスルフィド、アリルイソチオシアネートなどが挙げられ、これらの２種以上を組み合わせて使用することができる。
　天然色素としては、アナトー色素、コチニール色素、紅麹色素、β-カロチン、ハイビスカス色素、サーフルイエロー、カカオ色素、リボフラビン、クロロフィル、カラメル、アンナット、カルミン、ラッカイン酸、ブラジリン、クロシン、シコニン、シソニン、ルチンなどが挙げられる。
　有効成分と複合化した本発明のナノクラスターは、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、イヌ、ネコなど）の生体内または皮膚に投与もしくは適用した場合に、有効成分を徐々に放出する。したがって、有効成分と複合化した本発明のナノクラスターは、医薬品もしくは医薬組成物、化粧品、口腔用組成物として有用である。化粧品としては、ファンデーション、フェイスパウダー、ローション、乳液、口紅、化粧水、美容液、マッサージクリーム、保湿クリーム、パック、洗顔料、シャンプー、リンス、育毛剤、ボディパウダーなどが挙げられる。口腔用組成物としては、マウスウォッシュ、マウスリンス、練歯磨き、歯磨き粉、チューインガム、飴、グミ、ラムネなどが挙げられる。医薬品の剤形としては、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、丸剤、チュアブル錠、注射剤、坐剤、シロップ剤、軟膏剤、硬膏剤などが挙げられる。また、本発明のナノクラスターは、有効成分を徐々に放出するので、有効成分の送達担体として有用である。
　生理活性物質は、医薬、核酸、タンパク質を含む。医薬としては、抗腫瘍剤、抗高血圧剤、抗低血圧剤、抗精神病剤、鎮痛剤、抗鬱剤、抗躁剤、抗不安剤、鎮静剤、催眠剤、抗癲癇剤、オピオイドアゴニスト、喘息治療剤、麻酔剤、抗不整脈剤、関節炎治療剤、鎮痙剤、ＡＣＥインヒビター、鬱血除去剤、抗生物質、抗狭心症剤、利尿剤、抗パーキンソン病剤、気管支拡張剤、抗利尿剤、利尿剤、抗高脂血症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、制吐剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、抗アレルギー剤、解熱剤、抗痛風剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、骨調節剤、心血管剤、コレステロール低下剤、抗マラリア剤、鎮咳剤、去痰剤、粘液溶解剤、鼻詰り用薬剤、ドパミン作動剤、消化管用薬剤、筋弛緩剤、神経筋遮断剤、副交感神経作動剤、プロスタグランジン、興奮薬、食欲抑制剤、甲状腺剤又は抗甲状腺剤、ホルモン、抗偏頭痛剤、抗肥満剤、抗炎症剤などが挙げられる。好ましい医薬は抗腫瘍剤である。抗腫瘍剤としては、ホルモン療法剤（例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、アリルエストレノール、ゲストリノン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェンなど）、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ－ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンなど）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミドなど）、５α－レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、エプリステリドなど）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンなど）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロンなど）、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例、リアロゾールなど）などが挙げられ、なかでもＬＨ－ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど））、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード－Ｎ－オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、カルボコン、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン）、代謝拮抗剤（例えば、メルカプトプリン、６－メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５－ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフールなど）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン）、抗癌性抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン）、植物由来抗癌剤（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビン、カンプトテシン、塩酸イリノテカン）、免疫療法剤（ＢＲＭ）（例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾール）、細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤（例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標）；抗ＨＥＲ２抗体）、ＺＤ１８３９（イレッサ）、グリーベック（ＧＬＥＥＶＥＣ）などの抗体医薬）が挙げられる。抗腫瘍剤の対象となる癌の種類としては、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられ、好ましくは結腸・直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肝臓癌が挙げられる。
  核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等いかなるものであってもよい。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）または特殊な結合を含有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチドなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。好ましい核酸としては、siRNAなどのRNAが挙げられる。
  ｓｉＲＮＡとは、標的遺伝子のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のヌクレオチド配列又はその部分配列（好ましくはコード領域内）（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なヌクレオチド配列とその相補鎖からなる二本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相同な部分の長さは、通常、約１８塩基以上、例えば約２０塩基前後（代表的には約２１～２３塩基長）の長さであるが、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。また、ｓｉＲＮＡの全長も、通常、約１８塩基以上、例えば約２０塩基前後（代表的には約２１～２３塩基長）の長さであるが、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。
  標的ヌクレオチド配列と、ｓｉＲＮＡに含まれるそれに相同な配列との関係については、１００％一致していてもよいし、塩基の変異があってもよい（少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）。
  ｓｉＲＮＡは、５’又は３’末端に５塩基以下、好ましくは２塩基からなる、塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等の配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
  ｓｉＲＮＡは任意の標的遺伝子に対するものであってよい。ｓｉＲＮＡは、その発現亢進が対象疾患の発症および／または増悪に関与する遺伝子を標的とするものであることが好ましく、より具体的には、その遺伝子に対するアンチセンス核酸が、臨床もしくは前臨床段階に進んでいる遺伝子や新たに知られた遺伝子を標的とするもの等が挙げられる。
  ｓｉＲＮＡは、１種のみで使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
  タンパク質としては、酵素、受容体、抗体、抗原、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカインなどが挙げられる。
　本発明のナノクラスターの平均粒径は、１～１０００ｎｍ程度、好ましくは３～８００ｎｍ程度、より好ましくは５～５００ｎｍ程度、さらに好ましくは１０～３００ｎｍ程度、特に３０～２５０ｎｍ程度である。
　ナノクラスターのゼータ電位としては、好ましくは５～３０ｍＶ程度、より好ましくは１０～２５ｍＶ程度である。
　本発明のナノクラスターが有効成分と複合化している場合、ナノクラスター１００質量部に対し、有効成分を５～５０質量部程度、好ましくは１０～２０質量部程度含む。
　以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことは言うまでもない。
実施例１
＜実験方法＞
表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CND-SNP cluster)の合成
　表面化学修飾CND複合ナノクラスターは以下の方法により合成した(図2(a))。
　表面にアミノ基を有するCND-ori水溶液（1 mL）（CND濃度：3.2 mg/mL, Daicel, Tokyo, Japan）、パーフルオロオクタン酸（perfluorooctanoic acid）（PFOA）（10 mg）（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）、及び、水溶性カルボジイミド(water soluble carbodiimide)（10 mg）（WSC）（Wako, Osaka, Japan）を、バス(bath)型超音波装置（USD-2R; power output, 80 W; oscillation frequency, 40 kHz; AS ONE）により超音波を5分間照射することにより、2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid（MES）緩衝液（9 mL）（pH 6.0, 100 mM）に溶解させた。室温で5分間激しく攪拌後、混合物を遠心分離によりMilli-Q水で3回洗浄し、未反応化合物を除去した。遠心分離によって生成したペレットをパルス型超音波装置（VCX-600; Sonics, Danbury, CT, USA）により超音波を10分間照射することで蒸留水（10 mL）に分散させた。遠心分離（VCX-600; Sonics, Danbury, CT, USA）（1,000 rpm、10分、20℃）を掛け、パルス型超音波装置によって形成した不純物を除去し、表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CND-SNP cluster)が分散している上澄み溶液を以後の実験に用いた。
　BODIPY並びにCPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター(BODIPY@CND-SNP並びにCPT@CND-SNP)の調製方法は以下の通りである。上述したPFOA を化学修飾したCNDペレット(CND-SNP cluster)に蒸留水（10 mL）、BODIPY（1 mg）（Sigma-Aldrich）あるいはcamptothecin（CPT）（10 mg）（Wako）を加え、バス型超音波装置を用いて10分間超音波照射した。調製した混合物は4℃で保存し、各生物学的実験に使用した。CPTを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CPT@CND-SNP)を図1(d)に示し、BODIPYを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスター(BODIPY@CND-SNP)の製造工程を図4(a)に示す。
表面化学修飾CND複合ナノクラスターの合成のキャラクタリゼーション
表面化学修飾前のCND(CND-ori)と表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）のナノ構造は、高分解能透過型電子顕微鏡（TEM）（EM-002B; Topcon, Tokyo, Japan）（120 kV）を用いて解析した（図2(d)、図3(b)）。表面化学修飾CND複合ナノクラスターの流体力学的径は動的光散乱（DLS）（Photal FPAR-1000; Otsuka Electronics, Osaka, Japan）を用いて調査した(図2(c))。各種サンプルの光学特性や濃度は、紫外-可視-近赤外スペクトルメータ（V-730 BIO; Jasco, Tokyo, Japan）を用いて決定した（図2(b)、図4(b)、図5(a)）。表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CND-SNP cluster）ならびに未修飾CND粉末（CND-ori）（各2 mg）を熱重量測定装置（TGA Q 500; TA Instrument, New Castle, DE, USA）によって酸素ガス雰囲気下（10℃ min-1）で燃焼させ、表面化学修飾されたPFOA量を解析した(図3(a))。BODIPYの封入前後における表面化学修飾CND複合ナノクラスターの蛍光特性を蛍光スペクトルメータ（FP-6500; Jasco）により観察した（図4(b)、図5(a)）。
　表面化学修飾CND複合ナノクラスターならびに未修飾CNDのアミノ基の定量はカイザーテストキット（60017-1EA, Sigma-Aldrich）を用いて下記の要領で調査した。表面化学修飾CND複合ナノクラスターあるいは未修飾CND粉末（0.64 mg）を蒸留水（200 μL）に添加した。次いで、当該水溶液に溶液1（200 μL）（Phenol, 80% in ethanol）と溶液2（200 μL）（KCN in H2O/ pyridine）を加え、CNDに由来する粉末が良く分散するまでバス型超音波装置に掛けた。加熱ブロック（EB-603; AS ONE）により120℃、10分間加熱後、溶液3（200 μL）（Ninhydrin, 6% in ethanol）を加え、さらに10分間加熱した。得られた溶液を室温で30分間冷却し、60% ethanolを加え、全量が3 mLになるように希釈した。遠心分離後（15,000 rpm、5分間）、上澄み溶液の紫外-可視スペクトルを解析した。570 nmの吸光度をCND表面上の遊離のアミノ基として下式により算出した(図3(c))。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
なお、希釈量は3 mL、励起係数（extinction coefficient）は15000 m-1 cm-1である。ブランクのサンプルは蒸留水を用いて同様の方法により正確に調製した。結果は、未修飾CNDのアミノ基量を100%として算出した。
　表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CND-SNP)のゼータ電位は、Kyowa Interface Science Co., Ltd.（Saitama, Japan）によりゼータ電位測定システム（ZEECOM ZC-3000; Microtec Co., Ltd., Chiba, Japan）を用いて測定した(図3(d))。
　表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CND-SNP)の界面張力は、Mitsui Chemical Analysis & Consulting Service, Inc.（Tokyo, Japan）により全自動表面張力計（CBVP-Z; Kyowa Interface Science Co., Ltd.）を用いて測定した(図3(e))。
細胞培養と細胞毒性評価
ヒト結腸腺癌（HT-29）、ヒト骨肉腫細胞（U2OS）、ヒト子宮頸癌（HeLa）、ヒト正常線維芽細胞（TIG3）は、JCRB Cell BankあるいはDS Pharma Biomedical (Tokyo, Japan)より購入し、fetal bovine serum（10%）、L-glutamine（2 mM）、sodium pyruvate（1 mM）、gentamycin、penicillin-streptomycin（100 IU mL-1）、Hank's balanced salt solution (Life Technologies, MD, USA)が入ったDMEM培地（Gibco BRL, Grand Island, NY, USA）を用いて37℃、5%二酸化炭素環境下で培養した。細胞の形態観察は位相差顕微鏡（Nikon Eclipse TE300, Japan）を用いて記録した(図5(b))。細胞毒性評価は、クリスタルバイオレット染色（Wako）とcell counting kit-8（CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan）を用いて行った。CCK-8 assayでは、細胞を96-wellプレート上に播種（7000 cells well-1）し、接着のために一晩インキュベートした。インキュベート後、細胞を薬物や各種ナノ材料に曝露した。新鮮な培地で洗浄後、CCK-8 assayキットの取扱説明書に従い、細胞はCCK-8溶液とインキュベートし、450 nmの吸光度をマイクロプレートリーダ（infinite M200 PRO; TECAN, Switzerland）により解析した。クリスタルバイオレットアッセイでは、細胞を12-wellプレート上に播種（1.5×105 cells well-1）後、一晩インキュベートした。細胞を冷却したPBS緩衝液で洗浄後、予備冷却しておいたmethanol/acetone（v/v, 1:1）混合液で10分間固定化した。固定化した細胞は0.1% crystal violet溶液で一晩染色した。細胞毒性評価に関わる全ての実験は少なくとも3回以上実施した（図1(e)、図6(b)、図6(c)、図7(a)-図7(c)）。
蛍光顕微鏡ライブイメージング
細胞はイメージング用ガラスボトムディッシュに播種し、接着のために一晩インキュベートした。次いで、当該細胞にBODIPYを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターを添加し、37℃あるいは4℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、細胞核をHoechst 33342（1 μg mL-1, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）で10分間染色した。その3分後にPBS緩衝液で洗浄し、フェノールレッドフリーのRPMI 1640培地（Thermo Scientific）を加え、細胞のライブイメージングを実施した。BODIPYを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターの細胞内分布を調べるためにLysoTracker Red（Thermo Scientific）を用い、マニュアルに従いながら下記の要領で同時染色した。まず、BODIPYを封入した表面化学修飾CND複合ナノクラスターで細胞を4時間処理した後、LysoTracker試薬（100 nM）を37℃、2時間インキュベートした。細胞を新鮮なPBS緩衝液で3回洗浄後、Hoechst 33342（1 μg mL-1）を共に10分間インキュベートした。染色した細胞はフェノールレッドフリーの培地中でミラーユニット（IX3-FGFPXL, Olympus）とEM-CCDカメラ（DP80; Olympus）を搭載した蛍光顕微鏡（IX73; Olympus）を用いて観察した(図4(c)、図4(e))。
ウエスタンブロッティング
細胞はprotease inhibitor cocktail （Roche Applied Science, Mannheim, Germany）を添加したRIPA緩衝液（Thermo Scientific）を用いて採取した。各種タンパク質濃度はPierce BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific）により決定した。ウエスタンブロッティングは既報（非特許文献：Yu et al. Cell Death and Disease (2017) 8, e2755; doi:10.1038/cddis.2017.33）に従い、rabbit anti-LAMP1（ab24170; Abcam, Cambridge, MA, USA）、anti-Bcl-xL（2762; Cell Signaling, MA, USA）、anti-Bcl-2（2876; Cell Signaling）、anti-caspase-8（06-775; Millipore, Billerica, MA, USA）、anti-caspase-3（H-277; Santa Cruz, CA, USA）、anti-PARP-1（H-250; Santa Cruz）、mouse anti-β-Tubulin（T5293; Sigma-Aldrich）、anti-p53（DO-1; Santa Cruz）、anti-β-actin（AC-15; Abcam）の各種抗体を用いて実施した(図4(d)、図6(f))。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーはアポトーシスを検出可能なAnnexin-Vと7-AADによる二重染色により実施した。細胞を3×105cells well-1の密度になるように6-wellプレート上に播種後、接着のために一晩インキュベートした。24時間後、細胞を採取し、アポトーシスアッセイをマニュアルに従い、Guava Nexin Reagent（Millipore）、Annexin V-PEならびに 7-AADを含むカクテル溶液を用いてGuava PCA flow cytometer（Millipore）により解析した。アポトーシス細胞の割合はFlowJo software（Version 7.6, FlowJo LLC, Oregon, USA）により算出した(図6(d)、図6(e))。
In vivo抗癌実験と毒性評価
5週齢のメスのヌードマウス（n = 5; average weight = 18 g; C57BL/6NCrSlc）をJapan SLC, Inc (Shizuoka, Japan)より購入し、specific pathogen-free（SPF）環境下で一週間馴化させた。全ての動物実験は、産業技術総合研究所ならびにJapan SLC, Incの動物実験委員会の承認を得て実施した。HT-29細胞分散液（1 × 106 cells）（100 μL）とculture medium/matrigel（Corning, NY, USA）から成る混合溶液（v/v, 1:1）をマウス腹部皮下に投与し、癌モデルマウスを作成した。8日後、固形癌を形成させたマウスの腹腔内に表面化学修飾CND複合ナノクラスター（3.56 mg kg-1）、CPT（2.78 mg kg-1）、CPTを内包した表面化学修飾CND複合ナノクラスター（CPT, 2.78 mg kg-1; CND-SNP, 3.56 mg kg-1）、PBS緩衝液を各200 μL投与した。マウスの行動や性状、固形癌サイズ測定、マウス体重の推移は、二日に一度実施した(図8(a)-(d))。なお、固形癌のサイズは下式により算出した。
V = L × W2/2
このとき、Vは固形癌体積、Lは固形癌の長さ、Wは固形癌の幅をそれぞれ示している。
　一方、表面化学修飾CND複合ナノクラスター(CND-SNP)のin vivo毒性評価は、5週齢のメスのヌードマウス（n = 5; average weight = 18 g、C57BL/6NCrSlc）に表面化学修飾CND複合ナノクラスター（3.56 mg kg-1）あるいはPBS緩衝液を経口投与し、28日間、2日に一回の頻度でマウス体重（図9）と行動・性状を注意深く調査した。マウス血液検査は、表面化学修飾CND複合ナノクラスター（3.56 mg kg-1）あるいはPBS緩衝液を11週齢のメスのマウス（n = 6; average weight = 21 g、BALB/cAJcl）の尾静脈に各200 μL投与し、28日後、腹部大動脈より血液採取した。全血球数（complete blood cell count：CBC）ならびに生化学検査は、Japan SLC, Inc.とOriental Yeast Co., Ltd. (Tokyo, Japan)により解析された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
データの統計解析
データ中の±は標準偏差、nは使用したサンプル数を示している。データの統計解析は、Student's t-testを用いた。*、**、***は、それぞれ< 0.05、< 0.005、< 0.001のp値を示している。

Claims (12)

  1. 下記式（Ｉ）
    　　－Ｙ1－Ｒ　　　（Ｉ）
    （式中、Ｙ1は２価の連結基を示す。Ｒは有機基を示す。）
    で表される官能基で修飾されたカーボンナノ材料が自己組織化したナノクラスター。
  2. Ｙ1で表される２価の連結基が、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、及び、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１に記載のナノクラスター。
  3. Ｒで表される有機基が、フルオロ有機基、パーフルオロ有機基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいシクロアルキル基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアラルキル基又は置換されていてもよい複素環基である、請求項１又は２に記載のナノクラスター。
  4. 前記カーボンナノ材料がＯＨ、ＣＯＯＨ及びＮＨ2からなる群から選ばれる少なくとも１種の表面基を有し、式（Ｉ）で表される官能基は前記表面基を介してカーボンナノ材料に導入されている、請求項１～３のいずれか１項に記載のナノクラスター。
  5. 有効成分と複合化した、請求項１～４のいずれか１項に記載のナノクラスター。
  6. 有効成分が生理活性物質、標識物質、香料、精油又は有機色素である、請求項５に記載のナノクラスター。
  7. カーボンナノ材料がカーボンナノダイヤモンド又はカーボンナノドットである、請求項１～６のいずれか１項に記載のナノクラスター。
  8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のナノクラスターを含む、有効成分の送達担体。
  9. 下記式（Ｉ）
    　　－Ｙ1－Ｒ　　　（Ｉ）
    （式中、Ｙ1は２価の連結基を示す。Ｒはフルオロ有機基又はパーフルオロ有機基を示す。）
    で表される官能基で修飾されたカーボンナノ材料。
  10. Ｙ1で表される２価の連結基が、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、及び、－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－からなる群から選ばれるいずれかである、請求項９に記載のカーボンナノ材料。
  11. カーボンナノ材料がカーボンナノダイヤモンドである、請求項９又は１０に記載のカーボンナノ材料。
  12. 医薬と複合化した請求項１に記載の自己組織化したナノクラスターを含む医薬組成物。
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