CN101732720A - 具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于癌症治疗技术，具体地说是一种具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备及其应用。本发明载体的制备方法是：配制浓硫酸与浓硝酸的混酸溶液；制备短碳纳米管；制备碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系：制备靶向和荧光双功能化的碳纳米管药物载体。本发明的应用方法是：制备抗癌药物紫杉醇-功能化碳纳米管复合物；培养宫颈癌细胞、人脐静脉内皮细胞：检测多功能药物载体的靶向性；测定细胞调亡率。本发明的优点是：碳纳米管具有高比表面积，提高负载量；量子点具有发射光谱狭窄、较高的量子产率、优良的稳定性；叶酸分子提高药物载体的靶向性；本发明功能化碳纳米管的药物载体大大提高了药物在靶部位的聚集，提高了药物治疗癌症的效果。

Description

具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备及其应用
技术领域
本发明属于癌症治疗技术，具体地说是一种具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备及其应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的重大疾病，当前治疗癌症的三大手段：放疗、化疗、手术疗法，都有着重大的缺陷。肿瘤的非手术治疗方法是放疗和化疗，放射疗法和化学疗法在杀死肿瘤细胞的同时，也严重损伤了人体正常细胞。为了有效地治疗癌症，攻克癌症大敌发明一种具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备及其应用方法是生物医学领域中的十分重要任务。
本发明将具有靶向功能的叶酸分子和荧光探针量子点，通过化学键的方法连接到多壁碳纳米管(MWNTs)表面，形成具有靶向和荧光双功能的药物载体，再通过π-π作用将抗癌药物紫杉醇(PTX)负载到叶酸靶向的碳纳米管表面，形成具有靶向功能的水溶性药物复合物。通过体外培养的Hela宫颈癌细胞实验表明，该药物载体具有高效的靶向功能，大大提高了紫杉醇对靶细胞的抑制作用效率，达到了靶向药物治疗的目的。
经检索国内外专利文献，广泛查阅国内外公开出版物，未见有与本发明完全相同的技术方案，因此本发明具有新颖性和创造性；同时本发明在治疗癌症中的有益效果，使本发明具有广泛的实用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备及其应用方法。
本发明的目的是这样实现的：
具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备，步骤如下：
(1)配制混酸溶液：将3倍体积的98％浓硫酸与1体积的浓硝酸混合；
(2)制备短碳纳米管：将微米级长度的多壁碳纳米管置于混酸中；功率350W超声16小时；蒸馏水洗涤至中性，得打断的碳纳米管；
(3)制备碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系：将碳纳米管与0.5％聚乙烯亚铵混合，350W超声3小时；用200nm微孔滤膜过滤所得到的混合物，离心再分散到水中，得稳定的碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系；
(4)制备靶向和荧光双功能化的碳纳米管药物载体：将0.05mg的叶酸，50μl的量子点与0.05mg的碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系在碳化二亚胺交联剂的作用下，摇床反应3小时，离心过滤处理，再分散到水中，得具有靶向和荧光双功能的碳纳米管药物载体。
具有双功能抗癌药物载体的应用，步骤如下：
(1)制备抗癌药物紫杉醇-碳纳米管复合物：取1体积0.15mg/ml浓度紫杉醇溶液加入到2倍体积0.05mg/ml的多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸复合物水相体系中，摇床反应12小时，离心过滤，重新分散到磷酸缓冲溶液中，得到稳定的紫杉醇-多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸复合物水相体系；
(2)宫颈癌细胞、人脐静脉内皮细胞的培养：
A.选用对数生长期细胞：
B.宫颈癌细胞在含10％小牛血清的MEM细胞培养基中培养；
C.人脐静脉内皮细胞在含10％小牛血清的DMEM细胞培养基中，37℃5％CO2饱和温度下培养；
(3)多功能药物载体靶向性的检测：将多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸-量子点复合物(MWNTs-PEI-FA-Qdots)分别加入到对数生长期的宫颈癌细胞和人脐静脉内皮细胞中，在37℃ 5％ CO2饱和温度下培养4h，用磷酸缓冲溶液冲洗三次，使用共聚焦显微镜观察，叶酸靶向的药物载体能够对癌细胞进行有效的识别；
(4)细胞调亡率的测定：将紫杉醇、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸、功能化多壁碳纳米管-紫杉醇、紫杉醇-功能化多壁碳纳米管-叶酸分别加入到对数生长期的宫颈癌细胞中，在37℃ 5％ CO2饱和温度下培养48h；取未经处理的对数生长期的宫颈癌细胞，使用噻唑蓝法(MTT)检测，证明具有叶酸靶向的碳纳米管药物载体能够提高抗癌药物紫杉醇的抗肿瘤的效率。
本发明的要点是：
(1)用浓硫酸和浓硝酸的混合物氧化多壁碳纳米管，达到打断碳纳米管的效果，再将聚乙烯亚胺(PEI)修饰到碳纳米管管壁上，得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系。
(2)将具有靶向功能的叶酸分子和新型的荧光探针量子点，通过化学键的方法连接到多壁碳纳米管表面，形成具有靶向和荧光双功能的药物载体。
(3)利用碳纳米管的π共轭体系与抗癌药物的π共轭体系通过π-π作用将抗癌药物紫杉醇组装到功能化多壁碳纳米管上，得到了具有靶向功能紫杉醇-多壁碳纳米管复合物。
近年来国际医学界使用靶向药物治疗癌症，利用药物对肿瘤的靶向作用，将药物选择性地集中在靶部位，提高靶部位药物浓度和对肿瘤的杀伤力，增强治疗效果，同时减少对正常组织的不良反应，降低药物的毒副作用，取得了良好的效果。靶向药物治疗的关键是选择合适的药物载体并提高药物载体的靶向性。随着分子生物学和分子医学的发展，随着对肿瘤分子水平研究的深入，人们在肿瘤细胞表面和肿瘤血管表面发现了一系列的受体与肿瘤生长增殖密切相关，受体与其配体的结合具有高亲和性。因此通过受体的介导作用，用配体作为药物载体靶向分子来提高疗效，达到靶向治疗目的是十分有效的。叶酸(FA)作为一种小分子量的靶向分子在卵巢、结肠、乳腺、前列腺、鼻咽、脑等的大多数肿瘤细胞中高度表达。生命科学的快速发展对荧光探针的性能提出了更高的要求，原位、实时、多色，可视化的快速检测越来越成为实际工作的需要，新的荧光探针开发及在生物医学应用尤为重要。量子点(Qdots)的出现为解决上述问题提供了有利条件，与传统的荧光化合物相比，量子点发射光谱狭窄，具有宽广的激发带等优点，量子点在生物医学中的应用将加速从细胞与分子水平对疾病的理解，从而推进肿瘤靶向给药系统的进一步发展。
紫杉醇(Paclitaxel，Taxol)是从太平洋红豆杉的树皮中提取的一种四环二萜类化合物。紫杉醇是一种抗微管药物，通过阻止微蛋白形成，抑制微管解聚，使有丝分裂停留在G2期和M期而发挥抗肿瘤作用。但是由于紫杉醇水溶性低、口服生物利用度差、易引起过敏反应等缺点限制了其在临床上的使用。利用紫杉醇类药物开发具有靶向和荧光双功能的药物载体，提高药物在病灶部位的聚集，推进肿瘤靶向给药治疗，提高紫杉醇的抗肿瘤效率是十分有意义的。开发高效、无毒的靶向和荧光双功能的药物载体，对于提高抗肿瘤药物的药效具有极其重要的意义。
本发明载体制备方法简便、易得、可靠；具有靶向和荧光双功能；具有转染率高、抑制肿瘤细胞效果明显等特点。连接叶酸靶向分子的功能化碳纳米管药物载体，为非水溶性抗癌药物在生物体内效率的研究提供了基础。
本发明具有靶向和荧光双功能的碳纳米管药物载体具有如下优点：
1.碳纳米管具有很高比表面积，可以提高负载量。
2.荧光探针量子点具有发射光谱狭窄、具有宽广的激发、具有较高的量子产率、优良的稳定性等优点，从而对药物载体的荧光示踪研究提供了依据，亦可证明药物载体的靶向性。
3.靶向分子叶酸具有非免疫原性、稳定易得、亲和力强、非破坏性的细胞内吞等优点，通过靶向药物载体，可以大大提高药物在靶部位的聚集，提高药效。
附图说明
图1为叶酸连接的靶向碳纳米管紫外可见光谱图：
a线为叶酸的紫外特征吸收峰；b线为多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺(MWNTs-PEI)的紫外特征吸收峰；c线为多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸(MWNTs-PEI-FA)的紫外特征吸收峰。
图2为荧光量子点标记的多壁碳纳米管TEM图，箭头所指圆点为负载到多壁碳纳米管上的量子点。
图3为采用噻唑蓝法分别检测紫杉醇(PTX)、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺(MWNTs-PEI)、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸(MWNTs-PEI-FA)、功能化多壁碳纳米管-紫杉醇(f-MWNTs-PTX)、紫杉醇-功能化多壁碳纳米管-叶酸(PTX-f-MWNTs-FA)对宫颈癌细胞生长的抑制率。未处理的细胞，紫杉醇(PTX)、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺(MWNTs-PEI)、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸(MWNTs-PEI-FA)、功能化多壁碳纳米管-紫杉醇(f-MWNTs-PTX)、紫杉醇-功能化多壁碳纳米管-叶酸(PTX-f-MWNTs-FA)在宫颈癌细胞中孵育了48小时。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。
本发明选用的材料如下：
聚乙烯亚铵(Polyethylenimine，PEI)购自Sigma公司；碳纳米管购自深圳市纳米港有限公司；叶酸购自国药集团化学试剂有限公司；量子点购自武汉珈源量子点技术开发有限公司；紫杉醇购自上海高银科技开发有限公司。
实施例1：制备酸化多壁碳纳米管(MWNTs)和制备碳纳米管-聚乙烯亚铵(MWNTs-PEI)水相体系：
配制混酸溶液：将3倍体积的98％浓硫酸与1体积的浓硝酸混合；
将碳纳米管MWNTs置于混酸溶液中，超声16小时，离心分离后，蒸馏水洗涤至中性，得打断的酸化碳纳米管。
将1mg碳纳米管MWNTs与10ml 0.5％聚乙烯亚铵PEI混合，超声处理，用200nm微孔滤膜过滤所得到的混合物，离心再分散到水中，得到稳定的碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系。
实施例2：制备靶向和荧光双功能化的碳纳米管药物载体：
制备原理：利用碳化二亚胺(EDAC)交联剂的交联作用。
将0.05mg的叶酸，50μl的量子点与0.05mg的碳纳米管-聚乙烯亚铵(MWNTs-PEI)在碳化二亚胺(EDAC)交联剂的交联作用下，摇床反应3小时，离心过滤处理，再分散到水中，得到具有靶向和荧光双功能的碳纳米管药物载体，图1的紫外图证明叶酸成功的连接到碳纳米管上，图2的TEM图证明了量子点成功的连接到碳纳米管上。
实施例3：制备抗癌药物紫杉醇-功能化碳纳米管复合物：
制备原理：利用π-π作用。
取0.15mg/ml 0.5ml紫杉醇溶液加入到1ml 0.05mg/ml的多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸(MWNTs-PEI-FA)水相体系中，摇床反应12小时，离心过滤，重新分散到磷酸缓冲溶液中，得到稳定的紫杉醇-功能化多壁碳纳米管-叶酸(PTX-f-MWNTs-FA)水相体系。
实施例4：培养宫颈癌细胞：
Hela宫颈癌细胞株购自中科院上海细胞库。将Hela宫颈癌细胞在含10％小牛血清的MEM培养基，人脐静脉内皮细胞在含10％小牛血清的DMEM培养基中，37℃ 5％CO2饱和温度下培养，实验选用对数生长期细胞。
实施例5：多功能药物载体靶向性的检测：
将多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸-量子点复合物(MWNTs-PEI-FA-Qdots)分别加入到对数生长期的Hela宫颈癌细胞和人脐静脉内皮细胞中，在37℃ 5％ CO2饱和温度下培养4h，用磷酸缓冲溶液冲洗三次，通过共聚焦显微镜的检测，通过对比实验说明叶酸靶向的药物载体可以对叶酸受体高表达的癌细胞进行有效的识别。
实施例6：细胞调亡率的测定：
将紫杉醇(PTX)、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺(MWNTs-PEI)、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸(MWNTs-PEI-FA)、功能化多壁碳纳米管-紫杉醇(f-MWNTs-PTX)、紫杉醇-功能化多壁碳纳米管-叶酸(PTX-f-MWNTs-FA)分别加入到对数生长期的Hela宫颈癌细胞中，在37℃ 5％ CO2饱和温度下培养48h。取未经任何处理的对数生长期的Hela宫颈癌细胞，通过噻唑蓝法(MTT)检测，图3的实验结果证明了具有叶酸靶向的碳纳米管药物载体能提高抗癌药物紫杉醇的抗肿瘤的效率。
上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改、变化、变通或替换方案，均在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种具有靶向和荧光双功能抗癌药物载体的制备，步骤如下：
(1)配制混酸溶液：将3倍体积的98％浓硫酸与1体积的浓硝酸混合；
(2)制备短碳纳米管：将微米级长度的多壁碳纳米管置于混酸中；功率350W超声16小时；蒸馏水洗涤至中性，得打断的碳纳米管；
(3)制备碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系：将碳纳米管与0.5％聚乙烯亚铵混合，350W超声3小时；用200nm微孔滤膜过滤所得到的混合物，离心再分散到水中，得稳定的碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系；
(4)制备靶向和荧光双功能化的碳纳米管药物载体：将0.05mg的叶酸，50μl的量子点与0.05mg的碳纳米管-聚乙烯亚铵水相体系在碳化二亚胺交联剂的作用下，摇床反应3小时，离心过滤处理，再分散到水中，得具有靶向和荧光双功能的碳纳米管药物载体。
2.一种具有双功能抗癌药物载体的应用，步骤如下：
(1)制备抗癌药物紫杉醇-碳纳米管复合物：取1体积0.15mg/ml浓度紫杉醇溶液加入到2倍体积0.05mg/ml的多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸复合物水相体系中，摇床反应12小时，离心过滤，重新分散到磷酸缓冲溶液中，得到稳定的紫杉醇-多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸复合物水相体系；
(2)宫颈癌细胞、人脐静脉内皮细胞的培养：
A.选用对数生长期细胞：
B.宫颈癌细胞在含10％小牛血清的MEM细胞培养基中培养；
C.人脐静脉内皮细胞在含10％小牛血清的DMEM细胞培养基中，37℃ 5％CO2饱和温度下培养；
(3)多功能药物载体靶向性的检测：将多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸-量子点复合物(MWNTs-PEI-FA-Qdots)分别加入到对数生长期的宫颈癌细胞和人脐静脉内皮细胞中，在37℃ 5％ CO2饱和温度下培养4h，用磷酸缓冲溶液冲洗三次，使用共聚焦显微镜观察，叶酸靶向的药物载体能够对癌细胞进行有效的识别；
(4)细胞调亡率的测定：将紫杉醇、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺、多壁碳纳米管-聚乙烯亚胺-叶酸、功能化多壁碳纳米管-紫杉醇、紫杉醇-功能化多壁碳纳米管-叶酸分别加入到对数生长期的宫颈癌细胞中，在37℃ 5％ CO2饱和温度下培养48h；取未经处理的对数生长期的宫颈癌细胞，使用噻唑蓝法(MTT)检测，证明具有叶酸靶向的碳纳米管药物载体能够提高抗癌药物紫杉醇的抗肿瘤的效率。
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