CN102343101A - 一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法及其应用 Download PDF

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一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法及其应用，其步骤为：将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在甲苯中，再加入高岭土纳米管粉末；超声波分散；将混合物回流搅拌反应后，通过过滤得到反应产物；用甲苯和水洗涤处理得到的上述反应产物除去未反应的有机硅烷，烘干干燥后即获得功能化高岭土纳米管粉末；取功能化高岭土纳米管粉末溶解在水中，配成功能化高岭土纳米管水溶液；取一定量的功能化高岭土纳米管水溶液中加入反义寡聚核苷酸，反义寡聚核苷酸；再加入无菌二次蒸馏水，室温下摇床反应；待反应结束后，经若干次离心处理，去掉上清液；将所得物质重新分散到二次蒸馏水中，得到稳定的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸溶液。

Description

一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗癌药物载体，具体地说，是一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法及在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。 
背景技术
癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，有效地治疗癌症一直是世界瞩目的研究课题。反义核酸技术是近年发展的一种基因治疗肿瘤的有效方法，它以肿瘤发生相关基因为靶点，通过人工合成的反义寡核苷酸与之特异性互补结合，抑制靶向基因的表达而导致肿瘤细胞凋亡，具有高选择性、高效率、低毒性等特点。但是由于单纯的反义寡聚核苷酸很难进入肿瘤细胞或被降解而达不到治疗效果。研究表明通过选择合适的药物载体输送，可大大提高治疗恶性肿瘤的效果。因此，发展高效安全的基因载体系统在生物医学领域中具有重要意义。 
图1为已知的高岭土纳米管的透射电镜图。高岭土纳米管是一种类似碳纳米管的一维纳米管状结构材料。高岭土纳米管是层状结构硅酸盐矿物，是由一层硅氧四面体和一层铝氧八面体通过共同的氧原子互相连接形成一个晶层单元，为1∶1型层状硅酸盐。高岭土纳米管的表面含有如下官能团：-Si(Al)-OH，-Si-O-Al-和-Si(Al)-O，这些活性官能团使高岭土的内表面带正电荷，外表面带负电荷，表面所带电荷的不同为高岭土纳米管表面改性打下了基础。高岭土纳米管表面改性可以通过物理、化学方法对高岭土纳米管表面进行处理，以改变其表面的物理化学性质(如表面电性、表面能、官能团、表面吸附性和反应特性等)。通过功能化修饰的高岭土纳米管在聚合物/纳米高岭土复合材料、生物医学、抗菌材料、贮能材料等领域有着广阔的应用 前景。 
与传统的零维纳米颗粒相比，高岭土纳米管在药物载体上的应用具有如下优点：1)功能化的高岭土纳米管具有良好的生物相容性，对生物体系的毒性小；2)高岭土纳米管具有较大的比表面积，为药物、蛋白质、DNA及核酸等提供了更多的负载空间，大大提高负载量；3)高岭土纳米管的表面特性使其可以被有效地表面功能化，通过修饰带有不同功能的官能团，应用于不同生物体系的研究。 
生存素(survivin)是近年来发现的一种凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效应蛋白酶caspase3和caspase7来介导凋亡的抑制。在多数恶性肿瘤组织中表达丰富，但在相应正常组织中不表达，这种选择性表达特性使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。而针对生存素(survivin)基因作为药物治疗靶点，负载其反义寡聚核苷酸的高岭土纳米管基药物载体未见报道。 
发明内容
本发明的目的，在于提出一种新型功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法。 
本发明的另一目的，在于提出一种新型功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体对体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。 
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是： 
一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备，其特征在于包括以下步骤： 
A)将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在甲苯中，其体积比为2∶25，再加入高岭土纳米管粉末，高岭土纳米管粉末与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量体积比为0.6g∶2ml；30-80HZ超声波分散10-20分钟； 
B)将上述混合物在65℃条件下回流搅拌反应20小时后，通过过滤得到反应产物； 
C)用甲苯和水洗涤处理得到的上述反应产物3-5次除去未反应的有机硅烷，烘干干燥后即获得功能化高岭土纳米管粉末； 
D)取步骤C)中的功能化高岭土纳米管粉末溶解在水中，配成0.2g/L的功能化高岭土纳米管水溶液；
E)取一定量的功能化高岭土纳米管水溶液中加入20μmol/L的反义寡聚核苷酸，反义寡聚核苷酸与功能化高岭土纳米管的体积比为1.5∶1；再加入无菌二次蒸馏水，室温下摇床反应4小时； 
F)待反应结束后，经1-2次离心处理，去掉上清液； 
G)将步骤F)所得物质重新分散到二次蒸馏水中，得到稳定的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸溶液。 
一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的应用，其特征在于，介导反义寡聚核苷酸进入细胞，以较高的细胞转染率，在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。 
采用上述技术方案后，本发明的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备及应用具有以下优点： 
1、制备方法简单、快速； 
2、该载体具有转染率高、靶向性强，抑制肿瘤细胞效果明显； 
3、对不同的生物体系以功能化高岭土纳米管为载体输送不同的靶向性生物分子或药物为其它肿瘤或疾病的治疗提供了一条新途径。 
附图说明
图1为已知的高岭土纳米管的透射电镜图； 
图2为本发明实施例的功能化高岭土纳米管的透射电镜图； 
图3为本发明实施例的带有FAM荧光素标记的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体和Hela细胞孵育4小时后流式细胞仪测定其转染率图，未处理的Hela细胞作为对照； 
图4为本发明实施例的采用噻唑蓝法分别检测功能化高岭土纳米管，裸露的反义寡聚核苷酸，功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体对Hela细胞孵育不同时间(24、48、72小时)后的细胞抑制率示意图，未处理的Hela细胞作为对照。 
具体实施方式
以下结合实施例及其附图对本发明作更进一步说明。 
图2为本发明实施例的功能化高岭土纳米管的透射电镜图。本发明的新型功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备中，首先对高岭土纳米管进行功能化修饰，提高了其水溶性并使其表面带正电荷，并通过静电组装负载反义寡聚核苷酸，构建成一种新型功能化高岭土纳米管反义核酸复合体。该复合体作用于体外培养的Hela宫颈癌细胞，可有效地介导反义核酸进入细胞，具有较高的细胞转染率，并且显著提高反义核酸促进肿瘤细胞凋亡效率，增强其抗肿瘤活性。 
实施例1 
本发明的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备，其特征在于包括以下步骤： 
a、将1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在12.5ml甲苯中，加入约0.3克的高岭土纳米管粉末，充分30-80HZ超声波分散10-20分钟； 
b、将上述混合物在65℃条件下回流搅拌反应20小时后，通过过滤得到反应产物； 
c、用甲苯和水洗涤处理得到的上述反应产物3-5次除去未反应的有机硅烷，烘干干燥后即获得功能化高岭土纳米管粉末； 
d、取2mg功能化高岭土纳米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0.2mg/ml的高岭土水溶液； 
e、取上述高岭土水溶液10μL，加入20μM反义寡聚核苷酸15μL，再加入无菌的二次蒸馏水至1ml，室温下摇床反应4小时； 
f、待反应结束后，经1-2次离心处理，去掉上清液(即弃除溶液中游离的反义寡聚核苷酸)； 
g、将步骤f所得物质重新分散到二次蒸馏水中，得到稳定的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸溶液。 
实施例2 
本发明的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备，其特征在于包括以下步骤： 
a、将2ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在25ml甲苯中，加入约0.6克的高岭土纳米管粉末，充分30-80HZ超声波分散10-20分钟； 
b、将上述混合物在65℃条件下回流搅拌反应20小时后，通过过滤得到反应产物； 
c、用甲苯和水洗涤处理得到的上述反应产物3-5次除去未反应的有机硅烷，烘干干燥后即获得功能化高岭土纳米管粉末； 
d、取2mg功能化高岭土纳米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0.2mg/ml的高岭土水溶液； 
e、取上述高岭土水溶液10μL，加入20μM反义寡聚核苷酸15μL，再加入无菌的二次蒸馏水至1ml，室温下摇床反应4小时； 
f、待反应结束后，经1-2次离心处理，去掉上清液(即弃除溶液中游离的反义寡聚核苷酸)； 
g、将步骤f所得物质重新分散到二次蒸馏水中，得到稳定的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸溶液。 
实施例3 
本发明的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备，其特征在于包括以下步骤： 
a、将3ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在37.5ml甲苯中，加入约0.9克的高岭土纳米管粉末，充分30-80HZ超声波分散10-20分钟； 
b、将上述混合物在65℃条件下回流搅拌反应20小时后，通过过滤得到反应产物； 
c、用甲苯和水洗涤处理得到的上述反应产物3-5次除去未反应的有机硅烷，烘干干燥后即获得功能化高岭土纳米管粉末； 
d、取2mg功能化高岭土纳米管粉末溶解在10毫升的水中，配成0.2mg/ml的高岭土水溶液； 
e、取上述高岭土水溶液10μL，加入20μM反义寡聚核苷酸15μL，再加入无菌的二次蒸馏水至1ml，室温下摇床反应4小时； 
f、待反应结束后，经1-2次离心处理，去掉上清液(即弃除溶液中游离的反义寡聚核苷酸)； 
g、将步骤f所得物质重新分散到二次蒸馏水中，得到稳定的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸溶液。 
实施例4 
功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的应用 
功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的细胞转染率的测定 
用带有FAM荧光素标记的反义寡聚核苷酸取代单纯的反义寡聚核苷酸制备功能化高岭土纳米管反义核酸复合体来考察该药物载体的细胞转染率。将带有FAM荧光素标记的功能化高岭土纳米管反义核酸复合体加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO2饱和温度下培养4小时。取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照。胰酶消化后，用70％的乙醇固定。用流式细胞仪检测他们的转染率。该复合药物的转染率可以达到95％以上，说明功能化高岭土纳米管可以作为一种很好的药物载体应用于生物领域。 
Hela宫颈癌细胞的培养： 
Hela宫颈癌细胞株购买自中科院细胞库。取每孔6000个Hela宫颈癌细胞在含10％胎牛血清的MEM培养基，37℃5％CO2饱和湿度下培养，实验选用对数期生长细胞。 
细胞抑制率的测定： 
将功能化高岭土纳米管(f-HNTs)，裸露的反义寡聚核苷酸(naked ASODNs)和功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸(f-HNTs-APTES-ASODNs)分别加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO2饱和温度下培养24h。取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照，通过噻唑蓝法(MTT)检测细胞的抑制率。与裸露的反义寡聚核苷酸相比，功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸 药物载体可明显提高反义寡聚核苷酸的抑制肿瘤细胞的效率。裸露的反义寡聚核苷酸的肿瘤细胞抑制率为6％，而功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的肿瘤细胞抑制率达到20％。 
实施例5 
功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的应用 
除在37℃5％CO2饱和温度下培养48h，裸露的反义寡聚核苷酸的肿瘤细胞抑制率为7％，功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的肿瘤细胞抑制率达到25％外，其余同实施例2。 
实施例6 
除在37℃5％CO2饱和温度下培养72h，裸露的反义寡聚核苷酸的肿瘤细胞抑制率为9％，功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的肿瘤细胞抑制率达到26％外，其余同实施例2。 
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变化。因此，所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求限定。 

Claims (2)

1.一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A)将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在甲苯中，其体积比为2∶25，再加入高岭土纳米管粉末，高岭土纳米管粉末与3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量体积比为0.6g∶2ml；30-80HZ超声波分散10-20分钟；
B)将上述混合物在65℃条件下回流搅拌反应20小时后，通过过滤得到反应产物；
C)用甲苯和水洗涤处理步骤B)得到的反应产物3-5次除去未反应的有机硅烷，烘干干燥后即获得功能化高岭土纳米管粉末；
D)取步骤C)中的功能化高岭土纳米管粉末溶解在水中，配成0.2g/L的功能化高岭土纳米管水溶液；
E)取一定量的功能化高岭土纳米管水溶液中加入20μmol/L的反义寡聚核苷酸，反义寡聚核苷酸与功能化高岭土纳米管的体积比为1.5∶1；再加入无菌二次蒸馏水，室温下摇床反应4小时；
F)待反应结束后，经1-2次离心处理，去掉上清液；
G)将步骤F)所得物质重新分散到二次蒸馏水中，得到稳定的功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸溶液。
2.一种功能化高岭土纳米管-反义寡聚核苷酸药物载体的应用，其特征在于：介导反义寡聚核苷酸进入细胞，以较高的细胞转染率，在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。
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