CN101618221A - 功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗癌药物载体,功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备方法及功能化碳纳米管喜树碱复合物在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。本发明包括以下步骤:将硫酸和硝酸混合,制备混酸;将碳纳米管置于混酸中,超声波处理;离心分离;蒸馏水洗涤至中性,得短碳纳米管;将其与三嵌段共聚物水溶液混合;混合物用200nm微孔滤膜过滤;得多壁碳纳米管水相体系;取喜树碱溶液加入水相体系、离心分离、过滤,制得三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱;将上述复合体均匀分散到生理盐水中,得稳定的喜树碱多壁碳纳米管复合体。本发明的优点是:在体外Hela宫颈癌细胞治疗中抑制肿瘤细胞效果明显;广谱抗肿瘤活性;制备方法简单。
Description
技术领域
本发明属于抗癌药物载体,具体地说是一种功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备方法及功能化碳纳米管喜树碱复合物在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。
背景技术
癌症是当代严重危害人类健康的疾病,目前治疗癌症的三大医学手段:手术疗法、化学疗法、放射疗法都对人体存在着明显的付作用。因此如何有效地治疗癌症,发明一种治疗效果好,无副作用的抗癌药物,是人类共同关心的重大科学难题。
以天然生物为原料,制备具有抗癌活性的新药物是抗癌医药研究的一个重要内容。借助现代化的提取、修饰技术,从天然产物中提取有效抗癌成分,通过选择合适的药物载体输送,可大大提高治疗恶性肿瘤的效果。喜树原产于中国,喜树碱(camptothecin,CPT)是从喜树中分离提取的一种单萜吲哚类生物碱。喜树碱可以使肿瘤细胞DNA单链/双链断裂,作用于细胞核中DNA拓扑异构酶I来抑制DNA复制、转录和有丝分裂,并最终导致细胞死亡,因此具有显著的广谱抗肿瘤活性。已有技术美、英、法、日等国家已先后开发出喜树碱衍生物,其中已有部分喜树碱衍生物进入抗肿瘤药市场,例如拓朴替康、伊利替康和10-氢基喜树碱等等。但是这些药物都因为喜树碱水溶性差和毒副作用大等缺点,限制了喜树碱类药物在临床上的使用。为使喜树碱类药物能够更好地应用于临床,提供一种负载喜树碱的高性能药物载体,改善喜树碱类药物的溶解度和稳定性,使喜树碱的抗肿瘤功能得以更好地发挥,对于克服现有喜树碱类药物的缺点,有效治疗癌症具有重要的理论和实际意义。
碳纳米管(CNTs)自上世纪90年代被发现,因其独特的性质在世界范围被广泛研究和应用。纳米材料在生物医学领域中的应用研究多以零维的纳米颗粒为主,而利用其特殊结构特点,开发研制功能化碳纳米管作为抗癌药物载体则很少报道。
碳纳米管与传统的零维纳米颗粒相比,在药物载体上的应用具有如下特点:
碳纳米管具有很高比表面积,可以提高负载量,表面有大量的π共轭体系,为具有π共轭体系的抗癌药物通过π-π负载到其表面提供了可能。
功能化的碳纳米管具有良好的生物相容性,对生物体系毒性小,同时可以大大提高水溶性,能够更好的适用于生物领域的应用,功能化后不影响其π共轭体系。
本发明提供了一种以三嵌段聚合物修饰的多壁碳纳米管为载体,通过非共价π-π作用将抗癌药物喜树碱(CPT)负载到纳米管表面,形成水溶性的碳纳米管喜树碱药物复合体。通过作用于体外培养的Hela宫颈癌细胞实验表明,该复合体可大大提高喜树碱(CPT)对Hela宫颈癌细胞的抑制作用效率。
本发明首次以三嵌段共聚物修饰的碳纳米管作为抗癌药物喜树碱(CPT)的载体,发明了一种功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备方法,可以有效提高抗癌药物喜树碱的抗癌效率。经广泛查阅国内外专利文件和公开出版物,均未见有与本发明相同技术方案的报道,因此本发明具有新颖性和创造性;本发明方法简便、可靠,制得的碳纳米管喜树碱抗癌药物具有显著的广谱抗肿瘤活性,具有抑制肿瘤细胞效果明显的特点,具有实用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备方法及其应用。
本发明的目的是这样实现的:
功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备方法,包括以下步骤:
(1)将3份体积硫酸(98%)和1份体积硝酸(63%)混合,制备混酸;将碳纳米管(MWNTs)置于混酸中,50Hz超声波处理16小时;
(2)将上述混合物离心分离;分离的固体物质,用蒸馏水洗涤至中性,得短碳纳米管;
(3)取1份重量处理碳纳米管,与10000份0.5%三嵌段共聚物(PluronicP123)水溶液混合,50Hz超声波处理3小时;
(4)将上述混合物用200nm微孔滤膜过滤,弃去滤液,所得物质离心分离后,再置入10ml水中,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系(P123-MWNTs);
(5)将上述水相体系,以滤膜过滤方法灭菌待用;
(6)取1份喜树碱(CPT)溶液加入到10份0.01mg/ml的多壁碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系中;
(7)将步骤(6)水相体系,进行摇床反应12小时,离心分离、过滤,制得喜树碱碳纳米管三嵌段共聚物(P123-MWNTs-CPT复合体);
(8)将上述复合体均匀分散到0.9%NaCl生理盐水中,得稳定的喜树碱(CPT)的多壁碳纳米管复合体。
碳纳米管喜树碱复合物在宫颈癌细胞体外治疗中的应用。
本发明的要点在于:
(1)用浓硫酸和浓硝酸的混合物氧化多壁碳纳米管,达到打断碳纳米管的效果,再将三嵌段共聚物Pluronic P123修饰到碳纳米管管壁上,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系。
(2)利用碳纳米管的π共轭体系与抗癌药物的π共轭体系通过π-π作用将抗癌药物喜树碱(CPT)组装到功能化多壁碳纳米管上,得到了负载抗癌药物喜树碱(CPT)的多壁碳纳米管复合体。
本发明方法简便、可靠,制得的碳纳米管喜树碱抗癌药物具有显著的广谱抗肿瘤活性,抑制肿瘤细胞效果明显的特点。
本发明过程是:
1、实验试剂:三嵌段共聚物、碳纳米管、喜树碱从市场购买。
三嵌段共聚物(Pluronic P123)购自西格玛贸易有限公司;碳纳米管购自深圳市纳米港有限公司;喜树碱购自上海高银科技开发有限公司;实验其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
2、酸化MWNTs的制备:
将碳纳米管(MWNTs)置于混酸(H2SO4与HNO3的体积比为3∶1)之中,超声16小时,离心分离后,蒸馏水洗涤至中性,得到打断的长度约200nm的短碳纳米管,如图1所示。
3、三嵌段共聚物(Pluronic P123)-碳纳米管(MWNTs)水相分散体系的制备:
将1mg MWNTs与10ml 0.5%P123混合,超声处理,用200nm微孔滤膜过滤所得到的混合物,离心再分散到水中,得到稳定的三嵌段共聚物-碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系,灭菌待用。
4、功能化碳纳米管喜树碱复合物的制备:
制备原理:利用π-π作用,将喜树碱(CPT)分散到二甲亚砜溶液中。取50μl喜树碱(CPT)溶液加入到3ml 0.01mg/ml的三嵌段共聚物-碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系中,摇床反应12小时,离心过滤。图2是功能化碳纳米管负载喜树碱前后的紫外-可见光谱图。由图可见,喜树碱已成功负载到碳纳米管表面形成三嵌段共聚物-碳纳米管(P123-MWNTs-CPT)复合体。该复合体再重新分散到0.9%NaCl生理盐水中,得到稳定的三嵌段共聚物-碳纳米管(P123-MWNTs-CPT)水相体系。
5、Hela宫颈癌细胞的培养:
Hela宫颈癌细胞株购自中科院上海细胞库。Hela宫颈癌细胞在含10%小牛血清的MEM培养基,37℃、5%CO2饱和温度下培养,实验选用对数生长期细胞。
6、细胞抑制率的测定:
将喜树碱(CPT)、三嵌段共聚物碳纳米管(P123-MWNTs)和三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT)分别加入到对数生长期的Hela宫颈癌细胞中,在37℃、5%CO2饱和温度下培养36h。取未经任何处理的对数生长期的Hela宫颈癌细胞,作为阴性对照。如图3所示,通过噻唑蓝(MTT)法检测,经三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT)作用的Hela宫颈癌细胞抑制率可达32%,而经单纯喜树碱作用的细胞抑制率仅约为7%,表明通过π-π作用制备的多壁碳纳米管-抗癌药物喜树碱(CPT)复合体,可有效运载喜树碱进入细胞并大大提高其对肿瘤细胞的抑制作用效率;显示了功能化碳纳米管是一种合适的药物载体;提高喜树碱抗癌药物的抗癌效率。
本发明的优点是:
1.抑制肿瘤细胞效果明显;
2.广谱抗肿瘤活性;
3.制备方法简单;
4.原料易购。
附图说明
图1为经过混酸氧化超声打断16h后的碳纳米管透射电镜(TEM)图(a,b);
图2为功能化碳纳米管负载喜树碱前后的紫外-可见光谱图。纯喜树碱(CPT)的紫外特征吸收峰(A线);三嵌段共聚物碳纳米管(P123-MWNTs)的紫外特征吸收峰(B线);三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT)的紫外特征吸收峰(C线)。
图3为采用噻唑蓝(MTT)法分别检测喜树碱(CPT)、三嵌段共聚物碳纳米管(P123-MWNTs)和三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT)对Hela宫颈癌细胞生长的抑制率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1:
按照以下步骤,制备功能化碳纳米管抗癌药物载体:
(1)将15ml硫酸(98%)和5ml硝酸(63%)混合制备混酸;将20mg碳纳米管(MWNTs)置于混酸中,50Hz功率超声波处理16小时;
(2)将上述混合物离心分离;分离的固体物质,用蒸馏水洗涤至中性,得短碳纳米管;
(3)取10mg短碳纳米管,与50mg三嵌段共聚物(Pluronic P123)水溶液混合,50Hz超声处理3小时;
(4)将上述混合物用200nm微孔滤膜过滤,弃去滤液,所得物质离心分离后,再置入10ml水中,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系(P123-MWNTs);
(5)将上述水相体系,以滤膜过滤方法灭菌待用;
(6)取50μl喜树碱(CPT)溶液加入到1ml 0.01mg/ml的多壁碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系中;
(7)将步骤(6)水相体系,进行摇床反应12小时,离心分离、过滤,制得喜树碱碳纳米管三嵌段共聚物(P 123-MWNTs-CPT复合体);
(8)将上述复合体均匀分散到0.9%NaCl生理盐水中,得稳定的喜树碱(CPT)的多壁碳纳米管复合体;置入试剂瓶中保存。
实施例2:
按照以下步骤,制备功能化碳纳米管抗癌药物载体:
(1)将30ml硫酸(98%)和10ml硝酸(63%)混合制备混酸;将30mg碳纳米管(MWNTs)置于混酸中,50Hz功率超声波处理16小时;
(2)将上述混合物离心分离;分离的固体物质,用蒸馏水洗涤至中性,得短碳纳米管;
(3)取15mg短碳纳米管,与100mg三嵌段共聚物(Pluronic P123)水溶液混合,50Hz超声处理3小时;
(4)将上述混合物用200nm微孔滤膜过滤,弃去滤液,所得物质离心分离后,再置入20ml水中,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系(P123-MWNTs);
(5)将上述水相体系,以滤膜过滤方法灭菌待用;
(6)取100μl喜树碱(CPT)溶液加入到2ml 0.01mg/ml的多壁碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系中;
(7)将步骤(6)水相体系,进行摇床反应12小时,离心分离、过滤,制得喜树碱碳纳米管三嵌段共聚物(P123-MWNTs-CPT复合体);
(8)将上述复合体均匀分散到0.9%NaCl生理盐水中,得稳定的喜树碱(CPT)的多壁碳纳米管复合体;置入试剂瓶中保存。
实施例3:
按照以下步骤,制备功能化碳纳米管抗癌药物载体:
(1)将45ml硫酸(98%)和15ml硝酸(63%)混合制备混酸;将40mg碳纳米管(MWNTs)置于混酸中,50Hz功率超声波处理16小时;
(2)将上述混合物离心分离;分离的固体物质,用蒸馏水洗涤至中性,得短碳纳米管;
(3)取20mg短碳纳米管,与150mg三嵌段共聚物(Pluronic P123)水溶液混合,50Hz超声处理3小时;
(4)将上述混合物用200nm微孔滤膜过滤,弃去滤液,所得物质离心分离后,再置入75ml水中,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系(P123-MWNTs);
(5)将上述水相体系,以滤膜过滤方法灭菌待用;
(6)取150μl喜树碱(CPT)溶液加入到3ml 0.01mg/ml的多壁碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系中;
(7)将步骤(6)水相体系,进行摇床反应12小时,离心分离、过滤,制得喜树碱碳纳米管三嵌段共聚物(P123-MWNTs-CPT复合体);
(8)将上述复合体均匀分散到0.9%NaCl生理盐水中,得稳定的喜树碱(CPT)的多壁碳纳米管复合体;置入试剂瓶中保存。
Hela宫颈癌细胞的培养:
Hela宫颈癌细胞株购自中科院上海细胞库。取每孔6000个Hela宫颈癌细胞在含10%小牛血清的MEM培养基,37℃、5%CO2饱和温度下培养,实验选用对数生长期细胞。
细胞抑制率的测定:
将喜树碱(CPT)、三嵌段共聚物碳纳米管(P123-MWNTs)和三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT)分别加入到对数生长期的Hela宫颈癌细胞中,在37℃、5%CO2饱和温度下培养36h。取未经任何处理的对数生长期的Hela宫颈癌细胞,作为阴性对照。经噻唑蓝(MTT)法检测,三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPTs)作用的Hela细胞抑制率可达32%,而经单纯喜树碱作用的细胞抑制率仅约为7%。
实施例6:
Hela宫颈癌细胞的培养:
Hela宫颈癌细胞株购自中科院上海细胞库。取每孔6000个Hela宫颈癌细胞在含10%小牛血清的MEM培养基,37℃、5%CO2饱和温度下培养,实验选用对数生长期细胞。
细胞抑制率的测定:
将喜树碱(CPT)、三嵌段共聚物碳纳米管(P123-MWNTs)和三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT)分别加入到对数生长期的Hela宫颈癌细胞中,在37℃、5%CO2饱和温度下培养48h。取未经任何处理的对数生长期的Hela宫颈癌细胞,作为阴性对照。经噻唑蓝(MTT)法检测,三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPTs)作用的Hela细胞抑制率可达40%,而经单纯喜树碱作用的细胞抑制率仅约为9%。
上述实施例仅为本发明的优选例,并不用来限制本发明,凡在本发明的原则之内,所做的任何修改、变化、变通或替换方案,均在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种功能化碳纳米管抗癌药物载体的制备,包括以下步骤:
(1)将3份体积98%硫酸和1份体积63%硝酸混合,制备混酸;将碳纳米管(MWNTs)置于混酸中,50Hz超声波处理16小时;
(2)将上述混合物离心分离;分离的固体物质,用蒸馏水洗涤至中性,得短碳纳米管;
(3)取1份重量短碳纳米管,与10000份0.5%三嵌段共聚物(PluronicP123)水溶液混合,50Hz超声波处理3小时;
(4)将上述混合物用200nm微孔滤膜过滤,弃去滤液,所得物质离心分离后,再置入10ml水中,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系(P123-MWNTs);
(5)将上述水相体系,以滤膜过滤方法灭菌待用;
(6)取1份喜树碱(CPT)溶液加入到10份0.01mg/ml的多壁碳纳米管(P123-MWNTs)水相体系中;
(7)将步骤(6)水相体系,进行摇床反应12小时,离心分离、过滤,制得三嵌段共聚物碳纳米管喜树碱(P123-MWNTs-CPT复合体);
(8)将上述复合体均匀分散到0.9%NaCl生理盐水中,得稳定的喜树碱(CPT)的多壁碳纳米管复合体。
2.碳纳米管喜树碱复合物在体外Hela宫颈癌细胞治疗中的应用。
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