CN103990133A - 一种具有靶向定位释药的介孔碳纳米粒系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种由叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒的胃肠道粘附促吸收给药系统。叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒为首先通过硬模板法以球形介孔硅为模板制得均一化介孔碳球，再通过湿法氧化给均一化介孔碳球添加羧基，然后利用简单的静电聚合作用将叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰在羧基化的碳球表面，即得叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒。叶酸-聚乙烯亚胺复合物是利用经典的DCC-NHS酰胺反应制得。本发明以均一化介孔碳球作为载体，以叶酸作为靶向分子，实现药物的胃肠道粘附及促吸收。本发明能提高水难溶性药物溶出速率，增加粘附时间，促进药物的跨膜转运，提高药物的生物利用度，在口服给药领域有着广阔的应用前景。

Description

一种具有靶向定位释药的介孔碳纳米粒系统及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种具有靶向定位释药的介孔碳纳米粒系统及其应用，具体涉及由叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒的胃肠道粘附及促吸收给药系统及其制备。

背景技术

众所周知，口服给药因用药方便，易于被病人接受，已成为目前应用最广泛的给药方式，也是大多数药物的首选给药途径。据统计，在收录药品最多的美国药典中有1/3以上的药物被列为难溶性药物；在创新药物研究中，约有40%的药物为难溶性药物；高通量筛选获得的活性物质中也有约40%的药物是水难溶性药物。提高该类活性物质的生物利用度是当前药物制剂发展过程中面临的具有挑战性且亟待解决的一大难题。对于该类药物，我们可以增大药物在胃肠道内的溶出速率，增加药物以被动扩散的形式进入血液循环的几率或增大制剂的胃肠道主动转运，再进行释放药物等方式来提高口服给药药物生物利用度。

新兴的纳米技术为解决难溶性药物的溶解和吸收问题带来了极好的机遇，纳米技术可以降低药物粒子大小至纳米级，显著增加粒子的比表面积，从而可以增加水难溶药物的溶出速率；药物粒子粒度的下降和比表面积的增高还会促进纳米粒子与生物膜的接触，使得已溶解的药物分子与特殊大小的纳米粒子在胃肠道被高效吸收。目前，用纳米技术提高难溶性药物口服吸收的研究主要集中在：纳米结晶、固体脂质纳米粒及微乳等制剂的制备。这些研究存在的主要不足，包括：载体疏水性强、比表面积低、载药量低（通常不能满足临床用药剂量）、不能抑制药物再结晶或再聚积等。

无机多孔材料的出现，为纳米药物给药系统的研发开辟了蹊径。根据国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）的定义，无机多孔材料按照孔径的大小分为三类：孔径小于2nm的称为微孔材料，孔径介于2nm-50nm之间的称为介孔（mesopore）材料，孔径大于50nm的称为大孔材料。介孔材料作为药物载体的研究起步较晚，Vallet-Regi等于2001年率先报道了以介孔分子筛作为药物载体的研究，开辟了介孔材料在医药领域的应用研究。这一报道很快引起介孔材料和医药领域研究者的关注和兴趣。不久相继有几个研究小组分别报道了以介孔分子筛作药物载体的安全性、生物相容性、药物分子的组装及基因转换器等方面的研究成果。

介孔孔径的均一有序及特殊的孔道结构，作为难溶性药物的载体所具有的独特优势如下： 纳米级别的孔径载药后能够限制难溶性药物粒子的生长，使药物以纳米粒的形式存在，维持较高的药物的比表面积；空间网络结构的孔道能够维持药物粒子的分散状态，阻止药物粒子的再聚积，提高药物的物理稳定性；纳米级别的孔道能够抑制药物的再结晶过程，降低药物的结晶度，使药物以无定形或者亚稳定型的状态存在，提高药物的溶解度；相互连通、开放的三维孔道可降低难溶性药物的扩散阻力，可以使药物以一定的规律溶出或释放后，迅速被机体所吸收（BCSⅡ类药物）。

口服缓控释制剂可使药物按一定规律缓慢或恒速地释放，即可按需要在预定的期间内向人体提供适宜的血药浓度。具有降低给药频率；方便用药，提高病人的顺应性；吸收完全，提高药物疗效；减小血药浓度波动；降低毒副作用；降低药物对胃肠道的刺激；降低全程治疗费用及适于儿童及吞咽困难的老年患者等特点。我国于二十世纪八十年代初开始研制缓释控释制剂，在过去的二十年里，由于缓控释制剂开发的复杂性及其所需费用较大，至今上市的缓/控释制剂数量有限。因此，近年来口服缓控释制剂的研制已成为国内外医药发展的重要方向。

利用聚乙烯亚胺对介孔碳进行修饰后，形成优势叠加：介孔碳具有较高的比表面积，载药量明显高于其他的载体；通过调节聚乙烯亚胺吸附在介孔碳表面的用量可对药物的释放速率进行程序调控；聚乙烯亚胺带有的强正电性易于吸附在带有负电的胃肠道表面从而延长药物的平均滞留时间，进而增加或促进药物的吸收；④叶酸靶向因子能够共价接枝在聚乙烯亚胺的氨基上，通过胃肠道表面的叶酸受体来促进纳米粒的跨膜转运，提高药物的生物利用度。

因此，本项目制备了叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒，在增加胃肠道粘附时间的同时，对药物进行缓慢释放，降低给药次数，并且通过叶酸受体的介导增加了制剂的跨膜转运，多级提高候选活性物质的口服生物利用度。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有靶向定位释药的介孔碳纳米粒载药系统，具体是制备一种由叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒，以实现对装载药物的释放速率进行调控及增加胃肠道粘附时间，促进药物吸收。

所述的纳米粒由荷正电的叶酸-聚乙烯亚胺复合物与荷负电的羧基化碳纳米粒经简单的静电复合作用自组装而成。

本发明所采用的技术方案如下:

1）球形介孔硅的制备：

利用球形介孔硅为模板，在其孔道中添加碳源糠醇和引发剂草酸溶解在三甲苯中的混合物，经过程序升温，聚合、碳化得到碳硅复合物。

2）羧基化球形介孔碳的制备：

利用10-20%的氢氟酸进行硅模板出去，再利用湿法氧化即得羧基化的均一化介孔碳球。

3）叶酸-聚乙烯亚胺修饰的介孔碳纳米粒的制备：

利用经典的DCC-NHS酰胺反应将叶酸分子接枝在聚乙烯亚胺上，然后将该叶酸-聚乙烯亚胺复合物与荷负电的羧基化碳球通过静电复合作用自组装成叶酸-聚乙烯亚胺-介孔碳纳米粒。

本发明所述的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的介孔碳纳米粒的制备中：

1) 球形介孔硅的制备：

本发明利用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）形成胶束作为致孔剂，正硅酸乙酯（TEOS）作为硅源，室温下水解制得。

具体纯化步骤如下所述：

精确称取0.5-0.8 g CTAB 于200 mL的烧杯中， 分别加入50-100 mL去离子水和10-30mL无水乙醇，500-1000 rpm磁力搅拌至透明状态，之后在上述混合溶液中加入 10-30 mL无水乙醚，800-1200 rpm磁力搅拌至均匀分散乳液，随后加入0.6-1.0 mL氨水，继续搅拌 2-6 h 后逐滴加入2.0-3.0 mL TEOS，常温下继续搅拌12-24 h。之后过滤得到白色固体，蒸馏水充分洗涤后，于40-80°C 烘箱内充分干燥，最后，在500-700°C 马弗炉内煅烧6-18 h除去有机组分，过80-120目筛，得白色产物即为介孔二氧化硅纳米球（SNM）。

2) 羧基化球形介孔碳的制备：

本发明选用糠醇作为碳源试剂，具体制备方法如下所述：

首先利用比表面积分析测试球形介孔硅的比表面积和孔容，然后根据球形介孔硅的孔容乘以取得的球形介孔硅的质量，得出一定质量的球形介孔硅的总孔容，采用初湿浸润法添加其总孔容1.0-1.2倍体积的糠醇的草酸溶液（1mL糠醇中加入10mg草酸）。经过60-80℃的程序聚合后，在700-1200℃，氮气气氛下碳化，制得碳硅复合物，用10-20%氢氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球，再通过湿法氧化得羧基化的球形介孔碳。具体过程是将300-700mg均一化介孔碳球放入20-50mL的0.5-1M 过硫酸铵的硫酸（1-2M）溶液中，50-70℃回流反应4-8小时，回流反应结束后利用大量的去离子水和无水乙醇冲洗，即得羧基化球形介孔碳。Zeta电位结果显示羧基化的介孔碳球带有较强的负电性。

3) 叶酸-聚乙烯亚胺修饰的介孔碳纳米粒的制备：

叶酸-聚乙烯亚胺复合物的制备：

具体的制备步骤如下：

叶酸溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，分别加入叶酸摩尔量1.0-1.5倍的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在室温下搅拌过夜，进行羧基活化，然后过滤，除去不溶的副产物二环己基脲，加入聚合物聚乙烯亚胺进行酰胺化反应。

将叶酸-聚乙烯亚胺和羧基化碳纳米粒按质量比为(0.5-2):1的比例接枝在碳纳米粒的表面。

具体的制备步骤如下：

将0.2mg的羧基化介孔碳球加入10-40mL的0.1%的叶酸-聚乙烯亚胺的复合物水溶液中进行超声5-15min，搅拌2-4h，然后经过离心、洗涤、干燥制得叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒。

本发明制备了叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒，粒径分布为380-450nm，Zeta电位为+20-28mV在pH=7.2条件下。

本发明选用叶酸作为靶向分子，赋予纳米粒主动靶向的功能，增加纳米粒的跨膜转运几率，提高药物的生物利用度。所述的药物可以为：阿霉素，喜树碱，紫杉醇等

以紫杉醇为例：

可以将紫杉醇装载入步骤2）制备的羧基化球形介孔碳，然后再按照步骤3）制备含药的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的介孔碳纳米粒。

紫杉醇装载入羧基化球形介孔碳的制备：

称取 10-30 mg 紫杉醇溶于10-20 mL的二氯甲烷中，称取10-30 mg羧基化介孔碳载体加入到紫杉醇的二氯甲烷溶液中；超声分散 5-10 min 后，置于电磁恒温搅拌仪，搅拌子转速为100-300 rpm，恒温20℃搅拌12-24h后，将混悬液于12000-15000 rpm 离心 10-20min ，沉淀纳米粒子。弃去上层有机层，将沉淀纳米粒子减压干燥10-20 h后除去有机溶剂，既得载药纳米粒。

本发明制备的由叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒在模拟小肠上皮细胞的Caco-2细胞的摄取实验中，修饰叶酸后被摄取量明显增加。

共聚焦显微镜成像表明，本发明制备的由叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒可较大量的进入表面表达有叶酸受体的Caco-2细胞，该结果与流式细胞术结果相符。

附图说明

图1. 实施例6制备的均一化介孔碳球的扫描电镜结果（A）和透射电镜结果（B）。

图2. 实施例6制备的球形介孔碳及羧基化球形介孔碳，实施例12制备的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒的氮吸附吸附等温线

为均一化介孔碳球（UMCS），为羧基化的均一化介孔碳球（COOH-UMCS），为叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰的均一化介孔碳球（FA-PEI-UMCS）。

图3. 实施例6制备的球形介孔碳及羧基化球形介孔碳，实施例12制备的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒的氮吸附孔径分布

为均一化介孔碳球（UMCS），为羧基化的均一化介孔碳球（COOH-UMCS），为叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰的均一化介孔碳球（FA-PEI-UMCS））。

图4. 羧基化介孔碳及叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒的Zeta电位随着pH变化的测试结果。

图5. 球形介孔碳（a），羧基化球形介孔碳（b）与叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒（c）的红外图谱

结果表明球形介孔碳经羧基化修饰后在1725cm^-1出现羰基特征峰，经叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰后，在1600-1700cm^-1出现了明显的酰胺键伸缩振动峰。

图6. 紫杉醇原料药（a）与羧基化球形介孔碳制剂组（b），紫杉醇与羧基化球形介孔碳物理混合物（c）及空白载体（d）的X射线衍射图谱

结果表明，与原料药相比，载药后制剂中药物的全部以无定形的形式存在。

图7. 紫杉醇原料药（a）与羧基化球形介孔碳制剂组（b），紫杉醇与羧基化球形介孔碳物理混合物（c）及空白载体（d）的差示扫描量热分析图谱

结果表明，与原料药相比，载药后制剂中药物的全部以无定形的形式存在。

图8. 紫杉醇的不同制剂在pH7.4的磷酸盐缓冲液中的释放曲线。(a)市售紫杉醇制剂Taxol^®， (b)紫杉醇装载于羧基化介孔碳制剂，(c) 紫杉醇装载于叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒制剂，叶酸-聚乙烯亚胺复合物和介孔碳纳米粒的质量比为0.5:1，(d) 紫杉醇装载于叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒制剂，叶酸-聚乙烯亚胺复合物和介孔碳纳米粒的质量比为1:1，(e) 紫杉醇装载于叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒制剂，叶酸-聚乙烯亚胺复合物和介孔碳纳米粒的质量比为2:1，(f)紫杉醇原料药。

图9. FA-PEI-FITC-UMCS和PEI-FITC-UMCS纳米粒被Caco-2细胞摄取实验的共聚焦成像结果。

图10. 不同的紫杉醇制剂的表观渗透系数（Papp），N=3，数据为平均值±标准差，* P <0.05是与Taxol®比较，** P<0.05是与Taxol®和维拉帕米混合物及PTX-PEI-UMCS比）。

具体实施方式

实施例1

精确称取0.5 g CTAB 于200 mL的烧杯中， 分别加入50 mL去离子水和10 mL无水乙醇，500 rpm磁力搅拌至透明状态，之后在上述混合溶液中加入 20 mL无水乙醚，800 rpm磁力搅拌至均匀分散乳液，随后加入0.6 mL氨水，继续搅拌 2 h 后逐滴加入2.0 mL TEOS，常温下继续搅拌12 h。之后过滤得到白色固体，蒸馏水充分洗涤后，于40°C 烘箱内下充分干燥，最后，在500°C 马沸炉内煅烧6 h除去有机组分，过80目筛，得白色产物即为介孔二氧化硅纳米球（SNM）。

实施例2

精确称取0.6 g CTAB 于200 mL的烧杯中， 分别加入60 mL去离子水和20 mL无水乙醇，600 rpm磁力搅拌至透明状态，之后在上述混合溶液中加入 20 mL无水乙醚，900 rpm磁力搅拌至均匀分散乳液，随后加入0.8 mL氨水，继续搅拌 4 h 后逐滴加入2.5 mL TEOS，常温下继续搅拌18 h。之后过滤得到白色固体，蒸馏水充分洗涤后，于60°C 烘箱内下充分干燥，最后，在600°C 马沸炉内煅烧12 h除去有机组分，过100目筛，得白色产物即为介孔二氧化硅纳米球（SNM）。

实施例3

精确称取0.7 g CTAB 于200 mL的烧杯中， 分别加入80 mL去离子水和20 mL无水乙醇，800 rpm磁力搅拌至透明状态，之后在上述混合溶液中加入 20 mL无水乙醚，900 rpm磁力搅拌至均匀分散乳液，随后加入0.8 mL氨水，继续搅拌 4 h 后逐滴加入2.5 mL TEOS，常温下继续搅拌18 h。之后过滤得到白色固体，蒸馏水充分洗涤后，于60°C 烘箱内下充分干燥，最后，在600°C 马沸炉内煅烧12 h除去有机组分，过100目筛，得白色产物即为介孔二氧化硅纳米球（SNM）。

实施例4

精确称取0.8 g CTAB 于200 mL的烧杯中， 分别加入100 mL去离子水和30 mL无水乙醇，1000 rpm磁力搅拌至透明状态，之后在上述混合溶液中加入 30 mL无水乙醚，1200 rpm磁力搅拌至均匀分散乳液，随后加入1.0 mL氨水，继续搅拌 6 h 后逐滴加入3.0 mL TEOS，常温下继续搅拌24 h。之后过滤得到白色固体，蒸馏水充分洗涤后，于80°C 烘箱内下充分干燥，最后，在700°C 马沸炉内煅烧18 h除去有机组分，过120目筛，得白色产物即为介孔二氧化硅纳米球（SNM）。

实施例5

称取实例1中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面积分析仪测试，球形介孔硅的比表面积为1333.01m²/g和孔容为0.967cm³/g，0.967的1.0倍等于0.967。称取球形介孔硅1g，量取糠醇0.97mL，称取草酸9.7mg，加到糠醇中溶解，混合均匀，采用初湿浸润法将1.0倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。将混合物放入在马弗炉中，空气气氛下经过60℃，15h和80℃，15h的程序聚合后，在700℃，氮气气氛下碳化3h，制得碳硅复合物，用40mL的10%氢氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。扫描电镜结果显示纳米粒呈均匀的单分散球形，投射电镜结果显示介孔碳球具有均匀的裂缝状孔道。配制0.5M的过硫酸铵的硫酸（1M）溶液20mL，称取均一化介孔碳球300mg，将碳球加入过硫酸铵溶液中，在50℃下回流反应4h，过滤，用大量的去离子水冲洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta电位结果显示羧基化的介孔碳球带有较强的负电性。

实施例6

称取实例1中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面积分析仪测试，球形介孔硅的比表面积为1333.01m²/g和孔容为0.967cm³/g，0.967的1.1倍等于1.0637。称取球形介孔硅1g，量取糠醇1.06mL，称取草酸10.6mg，加到糠醇中溶解，混合均匀，采用初湿浸润法将1.1倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。将混合物放入在马弗炉中，空气气氛下经过60℃，15h和80℃，15h的程序聚合后，在900℃，氮气气氛下碳化3h，制得碳硅复合物，用40mL的15%氢氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。扫描电镜结果显示纳米粒呈均匀的单分散球形，投射电镜结果显示介孔碳球具有均匀的裂缝状孔道。配制1M的过硫酸铵的硫酸（2M）溶液20mL，称取均一化介孔碳球500mg，将碳球加入过硫酸铵溶液中，在60℃下回流反应6h，过滤，用大量的去离子水冲洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta电位结果显示羧基化的介孔碳球带有较强的负电性。其均一化介质碳球的扫描电镜结果和透射电镜结果见图1。

实施例7

称取实例1中合成的球形介孔硅74.5mg，利用比表面积分析仪测试，球形介孔硅的比表面积为1333.01m²/g和孔容为0.967cm³/g，0.967的1.2倍等于1.1604。称取球形介孔硅1g，量取糠醇1.16mL，称取草酸11.6mg，加到糠醇中溶解，混合均匀，采用初湿浸润法将1.2倍量的糠醇、草酸溶液添加到球形介孔硅的孔道中。将混合物放入在马弗炉中，空气气氛下经过60℃，15h和80℃，15h的程序聚合后，在1200℃，氮气气氛下碳化3h，制得碳硅复合物，用40mL的20%氢氟酸除去硅模板，得均一化介孔碳球。扫描电镜结果显示纳米粒呈均匀的单分散球形，投射电镜结果显示介孔碳球具有均匀的裂缝状孔道。配制1M的过硫酸铵的硫酸（2M）溶液20mL，称取均一化介孔碳球700mg，将碳球加入过硫酸铵溶液中，在70℃下回流反应8h，过滤，用大量的去离子水冲洗，最后用乙醇淋洗，干燥，即得羧基化介孔碳球。Zeta电位结果显示羧基化的介孔碳球带有较强的负电性。

实施例8

13mg叶酸溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，分别加入叶酸摩尔量1.0倍的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在室温下搅拌过夜，进行羧基活化，然后过滤，除去不溶的副产物二环己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亚胺，室温搅拌12h，进行酰胺化反应，然后利用Sephadex G-100柱进行纯化，即得叶酸-聚乙烯亚胺复合物。

实施例9

13mg叶酸溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，分别加入叶酸摩尔量1.1倍的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在室温下搅拌过夜，进行羧基活化，然后过滤，除去不溶的副产物二环己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亚胺，室温搅拌12h，进行酰胺化反应，然后利用Sephadex G-100柱进行纯化，即得叶酸-聚乙烯亚胺复合物。

实施例10

13mg叶酸溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，分别加入叶酸摩尔量1.5倍的N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在室温下搅拌过夜，进行羧基活化，然后过滤，除去不溶的副产物二环己基脲，加入45mg聚合物聚乙烯亚胺，室温搅拌12h，进行酰胺化反应，然后利用Sephadex G-100柱进行纯化，即得叶酸-聚乙烯亚胺复合物。

实施例11

配制叶酸-聚乙烯亚胺复合物的0.1%的去离子水溶液10mL，称取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超声混合物5min，然后搅拌0.5h，离心，用大量的去离子水洗，再离心，干燥，得叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒。

实施例12

配制叶酸-聚乙烯亚胺复合物的0.1%的去离子水溶液20mL，称取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超声混合物10min，然后搅拌0.5h，离心，用大量的去离子水洗，再离心，干燥，得叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒。

实施例13

配制叶酸-聚乙烯亚胺复合物的0.1%的去离子水溶液40mL，称取羧基化介孔碳球20mg加入上述溶液中，超声混合物15min，然后搅拌0.5h，离心，用大量的去离子水洗，再离心，干燥，得叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒。

实施例14

取球形介孔碳、羧基化球形介孔碳和叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰的碳纳米粒利用比表面积仪分析，结果如图2和图3，比表面积在经叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰后明显下降而孔径大小分布不变，说明聚乙烯亚胺成功的包覆在羧基化球形介孔碳表面，而不是介孔孔道内。分别取羧基化介孔碳球、和叶酸-聚乙烯亚胺修饰的羧基化介孔碳球1mg，分散在10^-3 mol/L的氯化钠溶液中，利用纳米粒度及动电电位测定仪马尔文Nano ZS90测定其在不同pH条件下的动电电位，结果如图2。在羧基化介孔碳球表面修饰上叶酸-聚乙烯亚胺复合物后，电位有负逆转为正，说明叶酸-聚乙烯亚胺复合物成功地接枝在羧基化介孔碳球表面。球形介孔碳，羧基化球形介孔碳与叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒的红外图谱（图5）结果表明球形介孔碳经羧基化修饰后在1725cm^-1出现羰基特征峰，经叶酸-聚乙烯亚胺复合物修饰后，在1600-1700cm^-1出现了明显的酰胺键伸缩振动峰，说明叶酸-聚乙烯亚胺复合物成功地接枝在羧基化介孔碳球表面。

实施例15—采用溶剂挥发法载药

取实施例6 制备得到的羧基化球形介孔碳30mg。精密称取约10mg 紫杉醇、 溶解于10ml 二氯甲烷中， 得到药物的二氯甲烷溶液。将30mg羧基化球形介孔碳加入到10ml药物二氯甲烷溶液，使药物：载体比例分别为1:3搅拌混合平衡12h，加热至 40℃挥发除去有机溶剂，真空干燥，得到载药的羧基化球形介孔碳给药系统。

实施例16—药物在载体中存在状态的表征

取实施例 15中药物与载体比例为 1:3的载药样品， 原料药， 物理混合物，空白载体做粉末X射线衍射，考察载体装载药物后，药物结晶度的变化，详细数据见附图6。

取实施例 15中药物与载体比例为 1:3的载药样品， 原料药， 物理混合物，空白载体做差示扫描量热分析，考察载体装载药物后，药物结晶度的变化，详细数据见附图7。

实施例17—叶酸-聚乙烯亚胺修饰载药后羧基化介孔碳纳米粒

取实施例 15中药物与载体比例为 1:3的载药样品，再按照实施例11、12、13将叶酸-聚乙烯亚胺复合物和羧基化球形介孔碳质量比为0.5:1、1:1、2:1的量修饰在载药后羧基化球形介孔碳表面。

实施例18—叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒装载紫杉醇的体外释放结果

取实施例17的叶酸-聚乙烯亚胺复合物和羧基化球形介孔碳质量比为1:1的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的PTX-介孔碳载药颗粒适量，精密称取一定量 （ 约相当于 PTX 0.5 mg ），以含有0.1%的tween80的200 mL pH7.4的磷酸盐缓冲液作为溶出介质，在温度 37±0.5 ℃，搅拌速率 100±1 rpm，分别于预先设定的 0.5、1、2、4、6、8、12、24h取样200 µL，并同时补充等量等温的溶出介质；所取样品经 13000 rpm离心后，吸取上清液，通过高效液相法，色谱柱为250mm的Kromasil C18柱，流动相为乙腈：水=65:35，于 227 nm 波长处测定吸光度值；按外标一点法进行紫杉醇的释放度测定。释放结果如图8所示。

紫杉醇原料药在24h内释放缓慢，达不到有效的治疗浓度，紫杉醇的市售制剂Taxol^®在有机溶剂聚氧乙烯蓖麻油和乙醇的帮助下释放迅速，但是聚氧乙烯蓖麻油具有较强的毒副作用，且Taxol^®在胃肠道被P-gp的外排作用明显。将紫杉醇包封在羧基化球形介孔碳中，由于药物以无定型状态存在，释放速率明显提高。将紫杉醇包封在叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒中，药物具有一定的缓释效果，且随着叶酸-聚乙烯亚胺复合物和羧基化介孔碳纳米粒质量的增加，紫杉醇释放速率逐渐降低，缓释给药系统减少了给药次数，且纳米粒在生理条件下，具有较强的正电性，与肠道的负电性表面产生较强的粘附作用，增加了给药时间，促进了药效。

实施例19—叶酸受体介导的促进FA-PEI-UMCS纳米粒被Caco-2细胞的摄取增加

将密度为5×10⁵的Caco-2细胞接种在12孔板上12h，然后移除培养液，用pH 7.2的PBS洗三遍，将浓度为10 µg/mL的FA-PEI-FITC-UMCS和PEI-FITC-UMCS纳米粒分别加入孔板中，在37 °C下培养2 h。然后用4 °C 缓冲液PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定10 min，罗丹明-鬼笔环肽将细胞膜着色，Hochst 33342将细胞核着色，送测共聚焦显微镜，结果见图9。

图9，1为蓝色通道成像，可见被Hoechst 33342染成蓝色的细胞核, 2为异硫氰酸荧光素（FITC）绿色通道成像，可见叶酸修饰的碳纳米粒组细胞膜内有大量的绿色荧光，而未被叶酸修饰的PEI-FITC-UMCS组显示进入Caco-2细胞中的绿色微弱，即叶酸对纳米粒的摄取促进作用显著；3是肌动蛋白为被罗丹明-鬼笔环肽着色的红色通道成像；图9，4为蓝色通道+绿色通道+红色通道成像。共聚焦显微镜成像表明，本发明制备的由叶酸受体介导的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒可较大量的被胃肠道细胞Caco-2吸收，提高装载药物的生物利用度。

实施例20—叶酸-聚乙烯亚胺修饰的碳纳米粒促进紫杉醇的Caco-2细胞单层膜跨膜转运

将密度为5×10⁵的Caco-2细胞接种在12孔板的聚碳酸酯插槽中，在孵箱中培养21天，前7天两天换一次培养液，后14天每天换液，待测得的电阻值达到500 Ω/cm²，说明上皮细胞已形成，可以进行小肠上皮细胞的模拟，对紫杉醇的跨膜转运进行考察。用pH 7.2的PBS对12孔板的上槽和下槽进行冲洗，然后将1500 µL的PBS加到孔板的下槽，在上槽中分别加入500 µL的紫杉醇浓度为10 µM的Taxol^®，Taxol^®和100 mM的维拉帕米的混合物，PTX-PEI-UMCS，PTX-FA-PEI-UMCS等不同制剂。在0.5h，1h，2h，4h从下槽中取样100 µL，同时补加100 µL缓冲液PBS，将取出样品采用高效液相法进行检测。

图10为不同紫杉醇制剂的表观渗透系数实验结果，在实验过程中，电阻值没有发生剧烈变化，说明制剂没有打开Caco-2细胞单层膜的紧密连接，保持了其完整性，在下槽中测得的紫杉醇都是经过跨膜转运得到。虽然表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油对P-糖蛋白外排泵有一定的抑制作用，，Taxol^®仍然表现出相当低的表观渗透系数（Papp）。与维拉帕米（P-gp的抑制剂）联合给药后，紫杉醇的跨膜转运得到了明显的提高。 PTX-PEI-UMCS纳米粒制剂的PTX跨膜转运量是Taxol^®的3.2倍，由于纳米颗粒表面的正电性更易于粘附在肠道粘膜（负电性）上，因此增加纳米颗粒的胞吞的几率。同时，纳米粒保护装载的紫杉醇分子绕过P-gp的外排。由于叶酸受体在肠道中的丰富表达，促进了PTX-FA-PEI-UMCS纳米颗粒摄取和转运，药物包封在叶酸修饰的纳米粒中具有最好的渗透性，增加了PTX的跨膜转运达5.7倍和Taxol^®相比。

Claims (10)

1. 一种具有靶向定位释药的介孔碳纳米粒系统，其特征在于，所述的纳米粒由荷正电的叶酸-聚乙烯亚胺复合物与荷负电的羧基化碳纳米粒经静电复合作用自组装而成。

2. 根据权利要求1所述的纳米粒系统，其特征在于，所述的静电复合作用为：将叶酸-聚乙烯亚胺复合物和羧基化碳纳米粒分别分散在去离子水中，混合后，经过超声5-15 min，制得纳米粒。

3. 根据权利要求1-2任何一项所述的纳米粒系统，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺重均分子量为20 kD-30KD。

4. 根据权利要求1或2所述的纳米粒系统，其特征在于，所述的叶酸-聚乙烯亚胺复合物是将3-6个叶酸分子接枝在一个聚乙烯亚胺分子上。

5. 制备权利要求1-4任何一项所述的纳米粒系统的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）球形介孔硅的制备：

（2）羧基化球形介孔碳的制备；

（3）叶酸-聚乙烯亚胺修饰的介孔碳纳米粒的制备。

6. 根据权利要求5所述的纳米粒系统，其特征在于，步骤（1）利用十六烷基三甲基溴化铵形成胶束作为致孔剂，正硅酸乙酯作为硅源，室温下水解制得；

步骤（2）的制备方法包括如下步骤：将300-700mg均一化介孔碳球放入20-50mL的0.5-1M 过硫酸铵的硫酸（1-2M）溶液中，50-70℃回流反应4-8小时。

7.权利要求1-4任何一项所述的纳米粒系统在促进药物吸收中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物优选阿霉素，喜树碱或紫杉醇。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将药物装入权利要求5所述的步骤2）中的羧基化球形介孔碳中，然后按照步骤3）的方法制备含药的叶酸-聚乙烯亚胺修饰的介孔碳纳米粒。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，取权利要求5所述的羧基化球形介孔碳，药物、 溶解于二氯甲烷中，得到药物的二氯甲烷溶液，将羧基化球形介孔碳加入到药物二氯甲烷溶液，使药物：羧基化球形介孔碳比例分别为1:3搅拌混合平衡，加热挥发除去有机溶剂，真空干燥，得到载药的羧基化球形介孔碳给药系统。