CN110201178A - 聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒及其制备与应用，具体涉及一种可以克服多重胃肠道吸收屏障的聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒及其该纳米粒制备的药物递送系统，还涉及该纳米粒作为难溶性药物载体在促进口服药物吸收中的应用。本发明首先将壳聚糖共价修饰到介孔碳纳米粒表面，用于提高载体的肠道摄取；再将一种亲水的荷负电的N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(pHPMA)通过静电作用力吸附到纳米载体表面，提高载体的粘液渗透能力。本发明所构建的给药体系，使药物以纳米尺寸大小高度分散在载体的介孔孔道中，使药物以非晶态状态存在，促进难溶性药物的口服吸收。

Description

聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒及其制备与应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒及其制备与应用，具体涉及一种可以克服多重胃肠道吸收屏障的聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒及其该纳米粒制备的药物递送系统，还涉及该纳米粒作为难溶性药物载体在促进口服药物吸收中的应用。
背景技术
在众多给药途径中，口服给药具有良好的安全性和患者顺应性，是临床上大多数药物首选的给药途径。然而相当一部分药物由于自身的溶解性、渗透性和在胃肠道内的稳定性差，其口服给药受到严重限制。最近的研究表明纳米载体可以作为难溶性药物的口服递送载体，在提高难溶性药物口服递送效率方面取得了相当大的进展，但其在克服胃肠道多重吸收屏障方面仍存在巨大挑战，例如粘液屏障和小肠上皮细胞吸收屏障。其中粘液层是经常被忽视的吸收屏障，会极大地影响口服纳米载体的体内吸收行为。该层由恒定光滑的分泌物组成，可以快速捕获和清除外来颗粒和病原体，保护其下面覆盖的上皮细胞，特别是具有疏水性和表面荷正电的粒子。有报道用亲水的中性聚合物如PEG修饰纳米载体，可以使纳米粒快速扩散通过粘液层，但降低了纳米粒与细胞膜的亲和力，导致纳米粒的上皮细胞吸收受限。因此，口服纳米载体不仅应该能够促进粘液渗透，而且还应该能够促进上皮吸收。
无机介孔材料的出现，为纳米给药系统的研发开辟了蹊径，介孔碳是指孔径大小在2-50nm，孔道呈周期性有序排列且孔径分布均一的碳材料。与传统的聚合物纳米粒或脂质纳米粒等有机纳米粒不同，介孔碳纳米粒具有比表面积大、粒径和孔径可控、载药量高、载药条件温和、生物相容性良好和表面易于修饰等优势，在提高难溶性药物口服生物利用度方面扮演着十分重要的角色，相关研究也越来越受到人们的关注。
壳聚糖及其衍生物具有其优异的安全性和生物相容性，更重要的是，基于壳聚糖的纳米粒可以通过短暂打开细胞间的紧密连接来增强小肠上皮组织对纳米粒的摄取，被广泛应用于口服药物递送系统。
本发明开发了一种聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒，旨在克服粘液屏障和上皮细胞吸收屏障，用于提高难溶性药物的口服递送效率。
发明内容
本发明的目的是制备一种聚合物功能化修饰的介孔碳纳米粒，并将该纳米粒作为难溶性药物的口服给药载体，应用于药物递送系统中，达到同时克服粘液屏障和小肠上皮细胞吸收屏障的目的，进而提高难溶性药物的口服生物利用度。
本发明所采用的技术方案如下：
本发明首先将壳聚糖共价修饰到介孔碳纳米粒表面，用于提高载体的肠道摄取；再将一种亲水的荷负电的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(pHPMA)通过静电作用力吸附到纳米载体表面，提高载体的粘液渗透能力。
pHPMA是亲水的“粘液惰性”材料，从而促进纳米粒的粘液渗透，并且pHPMA在粘液中会逐渐降解，当纳米粒渗透通过粘液层到达小肠上皮细胞时暴露出壳聚糖，进而促使纳米粒有效克服粘液屏障和上皮细胞吸收屏障。此外，壳聚糖在酸性条件下的溶胀作用以及在相对碱性条件下的收缩作用会调节载药体系中药物在胃肠液中的释放行为，从而防止药物在胃中过早释放。
本发明所述的聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒为经过聚合物功能化修饰的介孔碳纳米粒，所述的聚合物为壳聚糖和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(pHPMA)。
所述的壳聚糖粘度为200-400mPa.s，所述的pHPMA聚合物的分子量为45-55kDa。
本发明通过如下方法制备：首先制备羧基化介孔碳纳米粒，再将壳聚糖通过酰胺键共价修饰到羧基化介孔碳纳米粒表面，之后通过静电作用将合成的pHPMA吸附到修饰壳聚糖的介孔碳纳米粒表面，即得所述的聚合物功能化修饰的介孔碳纳米粒。
1)pHPMA的合成
在自由基引发剂存在条件下，使N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸(MA-GG-OH)单体在溶剂中发生自由基聚合反应，最后通过透析冻干制得N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(pHPMA)。
2)羧基化介孔碳的制备
采用一步法，将硅源、碳源通过溶胶-凝胶过程直接得到碳-硅混合物，在此过程中，介孔硅分子筛的生成与碳源聚合反应同步发生，再经程序升温，聚合、碳化得到碳硅混合物，用5％-15％的氢氟酸溶液去除硅模板后获得介孔碳。最后通过对介孔碳进行氧化处理，使介孔碳表面带有羧基基团，制得羧基化介孔碳纳米粒(MCN-COOH)。
3)聚合物功能化修饰介孔碳的制备
采用EDC-NHS催化的酰胺合成反应，将聚合物壳聚糖先共价接枝到羧基化介孔碳表面。再将带负电性的聚合物pHPMA通过静电作用吸附到上述纳米粒表面，形成pHPAM-壳聚糖修饰的介孔碳。
所述的两种聚合物壳聚糖和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(pHPMA)均为水溶性聚合物，接枝顺序为先在羧基化介孔碳表面接枝带正电性的壳聚糖，再接枝带负电性的pHPMA。
其中，
步骤1)中的自由基引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)，自由基溶液聚合反应的溶剂为无水乙醇。
步骤1)中HPMA和MA-GG-OH的总量占反应体系的重量体积比为10-15wt％；
步骤1)中HPMA与MA-GG-OH的摩尔比为4:1-9:1；
步骤1)中自由基引发剂占反应体系的重量体积比为2-5wt％；
步骤1)中反应温度为50-60℃，反应时间为24h-36h；
步骤2)中所述的硅源为：正硅酸乙酯(TEOS)；所述的碳源为：酚醛树脂(由间苯二酚和甲醛合成)；所述的硅模板为：介孔硅。
步骤2)中加入到过硫酸铵溶液中进行羧基化处理；所述的过硫酸铵溶液为用1-2M的硫酸溶液配制的含0.5-1M过硫酸铵的氧化剂。
所述的氧化剂也可选用浓硝酸和浓硫酸的混合溶液，二者的体积比为1:2-1:4。
步骤3)反应中羧基化介孔碳纳米粒、壳聚糖和pHPMA的质量比为1:0.8-1.2:0.1-0.3。
具体制备步骤如下所述：
称取适量HPMA和MA-GG-OH溶解到无水乙醇中，使反应物总量占体系的10-15wt％，其中HPMA与MA-GG-OH的摩尔比为4:1-9:1。再向上述体系中加入2-5wt％的AIBN，在50℃条件下反应24h。反应结束后，通过透析冻干提纯产物，得到pHPMA。具体HPMA，MA-GG-OH和pHPMA的化学结构及pHPMA的1H-NMR谱图见图1。
进一步地，在锥形瓶中加入8-15mL蒸馏水，0.05-0.1mL氨水，2mL无水乙醇和0.52g十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)溶液(20-30wt％)，搅拌均匀后，加入0.1g间苯二酚并在室温条件下继续搅拌30min。向上述反应体系中缓慢滴加0.18mL TEOS和0.14mL甲醛溶液，滴加完毕后，在30℃水浴条件下继续搅拌24h。搅拌结束后，离心弃去上清液，将收集的沉淀经水洗醇洗后烘干。将干燥的固体研磨过100目筛后，在氮气保护下于700℃碳化3h，得到C-Si混合物。通过将C-Si混合物在5-15％HF溶液中搅拌24h，除去混合物中的硅模板，抽滤洗涤收集滤渣，经干燥后将所得的介孔碳进行羧基化处理。将100-150mg介孔碳加入到10-20mL的过硫酸铵溶液中，50-70℃下搅拌回流2-4h。。具体粒径见附图说明中的图2。羧基化后载体的亲水性明显提高，且表面的Zeta电位在-25mV至-45之间，具体羧化后的参数变化见图4和图5。
将25-35mg的羧基化介孔碳超声分散于10-30mL pH 4-5的溶液中，然后加入1-3M的EDC和NHS来活化羧基，将配制的壳聚糖溶液(0.5-1mg/mL)逐滴缓慢加入到体系中，在室温条件下搅拌过夜。反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。将pHPMA溶解到5-10mL蒸馏水中，将上述制得的MCN-CTS超声均匀分散到20-30mL蒸馏水后，逐滴加入到聚合物溶液中，搅拌10-12h，反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。
本发明制备了聚合物功能化修饰的介孔碳，在蒸馏水中，表面Zeta电位为-20-30mV，粒径为350-390nm。
本发明还提供了所述的聚合物功能化修饰的介孔碳作为载体在提高口服难溶性药物生物利用度中的应用。
本发明将制备的聚合物功能化修饰的介孔碳作为口服难溶性药物的载体，药物高度分散在介孔碳的孔道中，以非晶体的形式存在。
所述的难溶性药物可以为：普罗布考、非诺贝特、硝苯地平、尼莫地平等。
所述难溶性药物以普罗布考(PB)为例，属于生物药剂学分类系统Ⅱ类药物，特征为水溶性差，溶出速率低、跨膜转运好，口服生物利用度低。
可以采用溶剂挥干法将普罗布考装载在步骤2)制备的羧基化介孔碳载体中，然后再按照步骤3)制备负载普罗布考的聚合物功能化修饰介孔碳载药体系(PB:HCMCN)。
所述的含药的聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒通过如下方法制备：将药物溶于甲醇中，在药物溶液中加入羧基化介孔碳载体，分散均匀，磁力搅拌至药物与载体达到吸附平衡，挥干溶剂。其中，药物与羧基化介孔碳载体的质量体积比例为0.8-1.5:1。所述的药物溶液的浓度为：15-25mg/mL。
本发明所构建的给药体系，使药物以纳米尺寸大小高度分散在载体的介孔孔道中，使药物以非晶态状态存在，促进难溶性药物的口服吸收，见附图6。
本发明所构建的给药体系，由于修饰在载体表面的壳聚糖具有在酸性条件下发生膨胀而在相对碱性条件下收缩的性质，所以药物在模拟胃液中释放较慢，而在模拟肠液中释放较快，可以防止药物在胃中过早释放；在漏槽条件下，与原料药和市售制剂相比，PB:HCMCN中药物的释放速度最快，120min药物的累计释放量超过80％，见附图7。
本发明所构建的给药体系，与未修饰聚合物前相比，对小肠的生物粘附性和跨小肠转运的能力显著提高，且在回肠部位的粘附和转运明显高于十二指肠和空肠，见附图8。
本发明所构建的给药体系，PB:HCMCN载药体系的AUC为市售制剂的2.76倍，见附图9，说明所构建的HCMCN可以有效提高药物的口服生物利用度。
本发明所构建的给药体系，考察其对细胞存活率的影响。在人结肠癌细胞(Caco-2)毒性实验中，在载体浓度为50-1000μg/mL的范围内，载体对细胞的存活率没有影响，见附图10。
本发明所构建的给药体系，考察其对胃肠道的刺激性。研究表明，本发明制备的聚合物功能化修饰介孔碳对胃肠道粘膜没有刺激作用，该结果与细胞毒性实验相符，见附图11。
附图说明
图1为pHPMA的合成路线和1H-NMR谱图。
图2为所制备的MCN-COOH和HCMCN的透射电镜及原子力显微镜照片。
其中A是实施例4中制备的MCN-COOH的透射电镜照片，粒径约为100nm；
B和C是实施例7中制备的HCMCN的透射电镜照片；
D是实施例7中制备的HCMCN的原子力显微镜照片。
图3为所制备的MCN-COOH和HCMCN的氮气吸附脱附等温线和孔径分布。MCN-COOH的N2吸附/解吸等温线为IV型等温线，而MCN-CTS和HCMCN的等温线不是IV型等温线，说明pHPMA和CTS修饰到MCN-COOH表面后，载体的介孔孔道被遮蔽，MCN-COOH的孔径约为3.8nm。
图4为实施例4制备的MCN-COOH和实施例7制备的HCMCN的粒度分布及聚合物修饰过程中的Zeta电位变化，结果显示聚合物依次修饰上。
图5为实施例4制备的MCN-COOH和实施例7制备的HCMCN的红外光谱，结果显示羧基已成功修饰在介孔碳表面，并聚合物也依次修饰上。
图6为普罗布考原料药(PB)、实施例10制备的聚合物功能化修饰介孔碳(HCMCN)和聚合物功能化修饰介孔碳载药后制剂(PB:HCMCN)的X射线衍射图谱和差式量热扫描分析图谱。
图7为普罗布考原料药(PB)、普罗布考市售片、实施例10制备的聚合物功能化修饰介孔碳(HCMCN)和聚合物功能化修饰介孔碳载药后制剂(PB:HCMCN)在模拟胃肠液和漏槽条件下的体外溶出曲线。
图8为实施例4制备的MCN-COOH和实施例7制备的HCMCN对小肠的生物粘附和跨小肠转运的Papp。
图9为普罗布考市售片、实施例10制备的聚合物功能化修饰介孔碳载药后制剂(PB:HCMCN)的血药浓度-时间曲线图(给药剂量：25mg/kg)。
图10为实施例4制备的MCN-COOH和实施例7制备的HCMCN在五种不同浓度(50μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)下对Caco-2细胞的存活率的影响。
图11为实施例4制备的MCN-COOH和实施例7制备的HCMCN对胃肠刺激性的影响。
具体实施方式
实施例1
称取适量HPMA和MA-GG-OH溶解到无水乙醇中，使反应物总量占体系的12.5wt％，其中HPMA与MA-GG-OH的摩尔比为4:1。再向上述体系中加入2wt％的AIBN，在50℃条件下反应24h。反应结束后，通过透析冻干提纯产物，得到pHPMA，其分子量为49.8kDa，PDI为1.42。
实施例2
称取适量HPMA和MA-GG-OH溶解到无水乙醇中，使反应物总量占体系的10wt％，其中HPMA与MA-GG-OH的摩尔比为6:1。再向上述体系中加入3wt％的AIBN，在50℃条件下反应24h。反应结束后，通过透析冻干提纯产物，得到pHPMA，其分子量为48.5kDa，PDI为1.76。
实施例3
称取适量HPMA和MA-GG-OH溶解到无水乙醇中，使反应物总量占体系的15wt％，其中HPMA与MA-GG-OH的摩尔比为8:1。再向上述体系中加入4wt％的AIBN，在50℃条件下反应24h。反应结束后，通过透析冻干提纯产物，得到pHPMA，其分子量为45.2kDa，PDI为1.57。
实施例4
在锥形瓶中加入9.5mL蒸馏水，0.1mL氨水，2mL无水乙醇和0.52g CTAC溶液(25wt％)，搅拌均匀后，加入0.1g间苯二酚并在室温条件下继续搅拌30min。向上述反应体系中缓慢滴加0.18mL TEOS和0.14mL甲醛溶液，滴加完毕后，在30℃水浴条件下继续搅拌24h。搅拌结束后，离心弃去上清液，将收集的沉淀经水洗醇洗后烘干。将干燥的固体研磨过100目筛后，在氮气保护下于700℃碳化3h，得到C-Si混合物。通过将C-Si混合物在10％HF溶液中搅拌24h，除去混合物中的硅模板，抽滤洗涤收集滤渣，经干燥后将所得的介孔碳进行羧基化处理。将100mg介孔碳加入到10mL的过硫酸铵溶液中，60℃下搅拌回流3h。过硫酸铵溶液是用1M的硫酸溶液配制的含0.5M过硫酸铵的氧化剂。制得的羧基化介孔碳纳米粒的粒径为197.2±6.4nm，Zeta电位为-35.7±4.3mV，比表面积为785m2/g，孔径为3.8nm。
实施例5
在锥形瓶中加入15mL蒸馏水，0.1mL氨水，2mL无水乙醇和0.52g CTAC溶液(30wt％)，搅拌均匀后，加入0.1g间苯二酚并在室温条件下继续搅拌30min。向上述反应体系中缓慢滴加0.18mL TEOS和0.14mL甲醛溶液，滴加完毕后，在30℃水浴条件下继续搅拌24h。搅拌结束后，离心弃去上清液，将收集的沉淀经水洗醇洗后烘干。将干燥的固体研磨过100目筛后，在氮气保护下于700℃碳化3h，得到C-Si混合物。通过将C-Si混合物在15％HF溶液中搅拌24h，除去混合物中的硅模板，抽滤洗涤收集滤渣，经干燥后将所得的介孔碳进行羧基化处理。将150mg介孔碳加入到10mL的过硫酸铵溶液中，70℃下搅拌回流4h。过硫酸铵溶液是用2M的硫酸溶液配制的含1M过硫酸铵的氧化剂。制得的羧基化介孔碳纳米粒的粒径为211.4±9.8nm，Zeta电位为-41.2±5.6mV，比表面积为749m2/g，孔径为3.8nm。
实施例6
在锥形瓶中加入8mL蒸馏水，0.05mL氨水，2mL无水乙醇和0.52g CTAC溶液(20wt％)，搅拌均匀后，加入0.1g间苯二酚并在室温条件下继续搅拌30min。向上述反应体系中缓慢滴加0.18mL TEOS和0.14mL甲醛溶液，滴加完毕后，在30℃水浴条件下继续搅拌24h。搅拌结束后，离心弃去上清液，将收集的沉淀经水洗醇洗后烘干。将干燥的固体研磨过100目筛后，在氮气保护下于700℃碳化3h，得到C-Si混合物。通过将C-Si混合物在12％HF溶液中搅拌24h，除去混合物中的硅模板，抽滤洗涤收集滤渣，经干燥后将所得的介孔碳进行羧基化处理。将120mg介孔碳加入到20mL的过硫酸铵溶液中，50℃下搅拌回流2h。过硫酸铵溶液是用1.5M的硫酸溶液配制的含0.75M过硫酸铵的氧化剂。制得的羧基化介孔碳纳米粒的粒径为184.5±7.4nm，Zeta电位为-39.4±2.8mV，比表面积为698m2/g，孔径为3.8nm。
实施例7
将30mg的羧基化介孔碳超声分散于30mL pH 4.5的溶液中，然后加入2M的EDC和NHS来活化羧基，将配制的壳聚糖溶液(3mg/mL，粘度：200-400mPa.s)逐滴缓慢加入到体系中，在室温条件下搅拌过夜。反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。将实施例3中所合成的pHPMA溶解到5mL蒸馏水中，将上述制得的MCN-CTS超声均匀分散到30mL蒸馏水后，逐滴加入到聚合物溶液中，搅拌10h，反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。其中羧基化介孔碳纳米粒，壳聚糖和pHPMA的质量比为5:5:1。制得的HCMCN的粒径为365.4±10.2nm，Zeta电位为-24.8±5.1mV。
实施例8
将30mg的羧基化介孔碳超声分散于30mL pH 4.5的溶液中，然后加入2M的EDC和NHS来活化羧基，将配制的壳聚糖溶液(3mg/mL，粘度：<200mPa.s)逐滴缓慢加入到体系中，在室温条件下搅拌过夜。反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。将实施例3中所合成的pHPMA溶解到5mL蒸馏水中，将上述制得的MCN-CTS超声均匀分散到30mL蒸馏水后，逐滴加入到聚合物溶液中，搅拌10h，反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。其中羧基化介孔碳纳米粒，壳聚糖和pHPMA的质量比为5:5:1。制得的HCMCN的粒径为768.4±8.3nm，Zeta电位为-17.6±4.4mV。当壳聚糖的粘度小于200mPa.s时，所制得的HCMCN粒径过大，难以被小肠组织摄取，不利于提高难溶性药物的口服生物利用度。
实施例9
将30mg的羧基化介孔碳超声分散于30mL pH 4.5的溶液中，然后加入2M的EDC和NHS来活化羧基，将配制的壳聚糖溶液(3mg/mL，粘度：>400mPa.s)逐滴缓慢加入到体系中，在室温条件下搅拌过夜。反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。将实施例3中所合成的pHPMA溶解到5mL蒸馏水中，将上述制得的MCN-CTS超声均匀分散到30mL蒸馏水后，逐滴加入到聚合物溶液中，搅拌10h，反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。其中羧基化介孔碳纳米粒，壳聚糖和pHPMA的质量比为5:5:1。制得的HCMCN的粒径为1079±7.5nm，Zeta电位为-20.6±5.7mV。当壳聚糖的粘度大于400mPa.s时，所制得的HCMCN粒径过大，难以被小肠组织摄取，不利于提高难溶性药物的口服生物利用度。
实施例10
将30mg的羧基化介孔碳超声分散于30mL pH 4.5的溶液中，然后加入2M的EDC和NHS来活化羧基，将配制的壳聚糖溶液(3mg/mL，粘度：200-400mPa.s)逐滴缓慢加入到体系中，在室温条件下搅拌过夜。反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。将实施例1中所合成的pHPMA溶解到5mL蒸馏水中，将上述制得的MCN-CTS超声均匀分散到30mL蒸馏水后，逐滴加入到聚合物溶液中，搅拌10h，反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。其中羧基化介孔碳纳米粒，壳聚糖和pHPMA的质量比为5:5:1。制得的HCMCN的粒径为377.4±17.6nm，Zeta电位为-26.5±2.2mV，pHPMA聚合物的分子量在45-55kDa范围内对HCMCN的性能没有显著性影响，pHPMA聚合物的分子量低于45kDa或高于55kDa，所制得的HCMCN粒径大于500nm，不利于被小肠组织摄取。
实施例11
将30mg的羧基化介孔碳超声分散于15mL pH 4-5的溶液中，然后加入1M的EDC和NHS来活化羧基，将配制的壳聚糖溶液(1mg/mL，粘度：200-400mPa.s)逐滴缓慢加入到体系中，在室温条件下搅拌过夜。反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。将实施例1中所合成的pHPMA溶解到10mL蒸馏水中，将上述制得的MCN-CTS超声均匀分散到20mL蒸馏水后，逐滴加入到聚合物溶液中，搅拌11h，反应结束后将样品离心，洗涤，烘箱烘干备用。其中羧基化介孔碳纳米粒，壳聚糖和pHPMA的质量比为5:5:1。制得的HCMCN的粒径为384.4±6.9nm，Zeta电位为-29.8±1.1mV。
实施例12采用溶剂挥干法载药
取实施例4制备得到的MCN-COOH 50mg。精密称取50mg普罗布考(PB)，溶解于4mL的甲醇溶液，使药物：载体质量比为1.5:1，搅拌吸附平衡12h，挥干有机溶剂，使用乙醇：水为1:9的混合溶液淋洗上述载药颗粒，除去吸附在载体表面的药物(使药物存留在介孔孔道内)，真空干燥，获得载药的羧基化介孔碳给药系统，再按照实施例7将聚合物修饰到羧基化载药介孔碳表面，使用乙醇：水为1:9的混合溶液淋洗载药颗粒，真空干燥，即得最终载药颗粒(PB:HCMCN)，其载药量为(50.93±2.09)％。
载药量与药物和载体质量的投料比有关，其他条件对载药量的影响很小。当药物：载体质量比为1.5:1时，PB:HCMCN的载药量为(50.93±2.09)％；当药物：载体质量比为1.2:1时，PB:HCMCN的载药量为(43.74±3.67)％；当药物：载体质量比为0.8:1时，PB:HCMCN的载药量为(35.12±4.25)％。
实施例13药物在载体中存在状态的表征
取实施例12中制备的载药颗粒(PB:HCMCN)、原料药(PB)和空白载体(HCMCN)做差式扫描量热分析，考察装载药物后，药物结晶度的变化，详细数据见附图6。
结果表明，与原料药相比，载药后制剂中的药物大多数以无定形的形式存在。
实施例14聚合物功能化修饰介孔碳装载普罗布考的体外释放结果
取普罗布考原料药(PB)、普罗布考市售片和载药颗粒(PB：HCMCN)进行体外溶出实验：以模拟胃肠液和含40％异丙醇的pH6.8的PBS为溶出介质，温度为37℃，转速为100rpm，在波长242nm处测定吸光度，计算普罗布考的体外溶出量。结果表明，与原料药相比，载药后制剂中的药物的溶出速率明显增加，且可以防止药物在胃中过早释放，相关数据见附图7。
实施例15聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒的小肠生物粘附性结果
取实施例4制得的MCN-COOH和实施例7制得的MCN-CTS和HCMCN测定其对小肠的生物粘附性。SD大鼠9只，随机分为3组，禁食12h后解剖各取出10cm十二指肠、空肠和回肠。外翻肠囊，肠囊内加入2mL含氧K-R缓冲液，用细线系紧肠囊两端，浸入6mL样品的混悬液中(0.5mg/mL)，置于摇床中1h，温度为37℃，转速为100rpm。取出肠囊，通过测量样品混悬液在750nm下的吸光度值，并根据标准曲线计算出剩余样品的含量，最后通过公式计算得出样品的小肠生物粘附指数，相关数据见附图8-A。
实施例16聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒的跨小肠转运的Papp结果
取实施例4制得的MCN-COOH和实施例7制得的MCN-CTS和HCMCN测定其跨小肠转运的Papp。SD大鼠9只，随机分为3组，禁食12h后解剖各取出10cm十二指肠、空肠和回肠。肠段内加入2mL样品混悬液(0.75mg/mL)，用细线系紧肠段两端，浸入6mL的含氧K-R缓冲液中，置于摇床中，温度为37℃，转速为100rpm。在规定时间点取样测出跨肠段转运出来的样品量，并计算Papp，相关数据见附图8-B。
实施例17聚合物功能化修饰介孔碳装载普罗布考的体内药动学结果
SD大鼠15只，随机分为3组，测定普罗布考市售片和载药制剂(PB:HCMCN)的体内药动学。规定时间点1、2、4、6、8、10、12、24、36、48h眼眶取血，将血浆样品置于涂有肝素的离心管中，离心分离血浆，按血浆样品处理方法处理血浆，测定各时间点血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线图，用DAS计算药动学参数。PB:HCMCN载药体系的口服生物利用度比市售片剂提高了2.76倍，增加了难溶性药物的口服吸收，相关数据见附图9。
实施例18聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒的细胞毒性结果
取对数生长期的Caco-2细胞，调整细胞悬液浓度，接种于96孔板中，每孔加入100uL，置于培养箱中。待细胞贴壁后，分别加入系列不同浓度(50、100、250、500和1000μg/mL)的聚合物修饰的介孔碳，继续孵育24h，加入MTT溶液，4h后小心吸去孔内培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡15min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm处测量各孔的吸光值A，计算细胞的相对增值率RGR(Relative growth rate)。
结果表明，以不同浓度(50-1000μg/mL)的HCMCN混悬液对Caco-2细胞进行孵育，对细胞的成活率基本没有影响，细胞存活率一直维持在80％以上，相关数据见附图10。根据RGR结果对材料的细胞毒性进行分级，介孔碳在所测定浓度范围内细胞毒性均为1级，可以认为本发明所制备的纳米粒没有细胞毒性。

Claims (10)

1.聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒，其特征在于，所述的纳米粒为经过聚合物功能化修饰的介孔碳纳米粒，所述的聚合物为壳聚糖和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物，是由壳聚糖通过酰胺键共价接枝在羧基化介孔碳表面，再将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物通过静电作用吸附到纳米粒表面而成。
2.根据权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述的壳聚糖粘度为200-400mPa.s，所述的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物的分子量为45-55kDa。
3.制备权利要求1-2任何一项所述的纳米粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物的合成；
(2)羧基化介孔碳的制备；
(3)N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-壳聚糖修饰的介孔碳纳米粒的制备。
4.根据权利要求3所述的制备纳米粒的方法，其特征在于：
(1)在自由基引发剂存在条件下，使N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺和N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸单体在溶剂中发生自由基聚合反应，最后通过透析冻干制得N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物；
(2)采用一步法，将正硅酸乙酯作为硅源、酚醛树脂为碳源通过溶胶-凝胶过程直接得到碳-硅混合物，硅模板与碳源聚合反应同步发生，再经程序升温，聚合、碳化得到碳硅混合物，用氢氟酸溶液去除硅模板后获得介孔碳，最后利用氧化剂，经水浴回流制得羧基化介孔碳；
(3)N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-壳聚糖修饰的介孔碳纳米粒的制备。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，自由基引发剂为偶氮二异丁腈，占反应体系的重量体积比为2-5wt％；
自由基溶液聚合反应的溶剂为无水乙醇。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺和N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸的总量占反应体系的重量体积比为10-15wt％；N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺与N-甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸的摩尔比为4:1-9:1。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的氧化剂为过硫酸铵溶液、浓硝酸和浓硫酸的混合溶液；优选地，所述的过硫酸铵溶液为用1-2M的硫酸溶液配制的含0.5-1M过硫酸铵的氧化剂，所述浓硝酸和浓硫酸的混合溶液中，二者的体积比为1:2-1:4。
8.载药聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒，其特征在于，将药物装入权利要求4所述的步骤(2)中的羧基化球形介孔碳中，然后按照步骤(3)的方法制备含药的聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒，所述的药物与羧基化介孔碳载体的质量体积比例为0.8-1.5:1。
9.权利要求1-2所述聚合物功能化修饰介孔碳纳米粒在提高难溶性药物口服吸收的药物系统中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的难溶性药物为普罗布考、非诺贝特、硝苯地平或尼莫地平。
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