CN1884430A - 一种荧光碳纳米管及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种荧光碳纳米管及其制备方法和应用,该材料的结构和组成为:(1)内核为多壁碳纳米管;(2)以聚阳离子化合物的静电作用力与内核相连的量子点外层。本发明还提供该材料制备纳米生物荧光探针的方法及其在生物分子检测中的应用。本发明的荧光碳纳米管系统制备方法简单、快速。碳纳米管生物荧光探针以其高效、简便的特点在细胞成像、病理组织检测、基因检测、免疫检测、生物组织内的同步检测、基因芯片等方面具有重要应用前景。
Description
技术领域
本发明属纳米材料领域,更具体地,是涉及应用于生物技术领域的纳米材料。
背景技术
碳纳米管(CNTs)自1991年被发现以来,因其独特的性质成为世界范围内的研究热点之一。纳米材料在生物领域方向的研究以零维的纳米颗粒为多,碳纳米管作为一种具有良好生物相容性的一维纳米材料在生物领域的应用则很少有报道。
一维碳纳米管在空间有两维处于纳米尺度。根据碳纳米管中碳原子层数的不同,碳纳米管大致可以分为两类:单壁碳纳米管(SWNTs)和多壁碳纳米管(MWNTs)。SWNTs是由单层碳原子绕合而成的,结构具有较好的对称性和单一性。MWNTs是由许多柱状碳管同轴套构而成。
与传统的零维纳米颗粒相比,碳纳米管(如图3)在生物领域的应用具有如下特点:
(1)碳纳米管特别是功能化的碳纳米管具有良好的生物相容性,对生物体系毒性小,这为将碳纳米管应用到生物领域提供了可能。
(2)碳纳米管可以通过简单的化学处理将其打断成任意长度,适用于不同领域。
(3)在通常情况下碳纳米管不溶于水或有机溶剂,通过简单的化学修饰使其壁表面带上亲水性的官能团,增加它的溶解度,得到在水溶液中均匀分散的碳纳米管溶液体系。
(4)通过化学修饰可以使碳纳米管管壁带有不同功能的官能团,适于不同生物体系的研究。
(5)管状结构的碳纳米管具有很高比表面积,在其壁表面修饰生物体系可以提高负载量。
量子点(QDs)又称半导体纳米晶体(如图2),是一种由2-4族和3-5族元素组成的纳米颗粒,如CdS、CdSe、CdTe、ZnS等。与传统的有机荧光染料和镧系配合物相比,荧光量子点具有以下优点:
(1)单个波长可激发所有的量子点,而不同荧光染料分子需多个激发波长。
(2)量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成来调谐。
(3)量子点具有很高的荧光强度和荧光稳定性。
(4)量子点具有很好的生物相容性,而有机荧光染料或镧系配合物则不具有这种优越性。
目前尚无利用量子点的荧光特性使碳纳米管具备荧光激发标记的报道,也没有以这种荧光纳米材料与抗体、抗原、低分子量单链DNA、RNA、生物素、蛋白等生物分子结合应用于生物检测的文献。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明需要解决的技术问题是提供一种荧光碳纳米管及其制备方法和应用,以克服现有的纳米荧光材料生物相容性低、制备复杂、在溶液中分散性和颗粒大小不易控制、荧光强度低、稳定性差、发射波长不可调谐且需由多个波长激发的缺陷。
技术方案
本发明的技术方案之一是提供一种荧光碳纳米管,其结构和组成为:
(1)内核为多壁碳纳米管;
(2)以聚阳离子化合物的静电作用力与内核相连的量子点外层。
上述的荧光碳纳米管的优选方案之一为,所说的聚阳离子化合物选自聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA,壳聚糖Chitosan,聚乙烯亚铵PEI,聚丙烯基胺PAH中的一种或一种以上。
上述的荧光碳纳米管的优选方案之二为,所说的量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS中的一种或一种以上。
上述的荧光碳纳米管的优选方案之三为,所说的多壁碳纳米管长度范围为150~1000nm。
本发明的技术方案之二是提供上述的荧光碳纳米管的制备方法,包括如下步骤:
(1)用浓硫酸和浓硝酸的混合物氧化多壁碳纳米管,使多壁碳纳米管管壁带上羧基,通过超声将之裁剪成150~1000nm的短管;
(2)利用基团之间的静电作用力将聚阳离子化合物修饰到碳纳米管管壁上,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系;
(3)利用基团之间的静电作用力将量子点组装到多壁碳纳米管上,得到荧光多壁碳纳米管。
上述的荧光碳纳米管的制备方法的优选方案之一为,所说的制备方法还包括如下步骤:在荧光多壁碳纳米管表面化学修饰生物探针分子,得到具有荧光标记功能的碳纳米管生物探针。
上述的荧光碳纳米管的制备方法的优选方案之二为,所说的生物探针分子为蛋白质、核酸或多糖。
本发明的技术方案之三是提供上述的荧光碳纳米管的应用,即在荧光多壁碳纳米管表面化学修饰生物探针分子,并以此碳纳米管生物探针与相应的目标分子特异性反应,通过荧光检测目标分子。
上述的荧光碳纳米管的应用的优选方案之一为,所说的碳纳米管生物探针为PDDA-MWNTs抗体荧光探针、Chi tosan-MWNTs抗原荧光探针、PEI-MWNTs DNA荧光探针、或者PAH-MWNTs mRNA荧光标记。
上述的荧光碳纳米管的应用的进一步优选方案为,以所说的PDDA-MWNTs抗体荧光探针、Chitosan-MWNTs抗原荧光探针、PEI-MWNTs DNA荧光探针、或者PAH-MWNTs mRNA荧光标记分别检测相应的抗原细胞、病毒抗体、人类基因DNA或者细胞中的mRNA。
有益效果
与传统的荧光纳米材料相比,本发明的荧光碳纳米管具有如下特点:
(1)本发明的荧光碳纳米管可以通过简单的化学处理将其打断成任意长度,适用于不同领域。
(2)在通常情况下碳纳米管不溶于水或有机溶剂,通过简单的化学修饰使其壁表面带上亲水性的官能团,增加它的溶解度,得到在水溶液中均匀分散的荧光碳纳米管溶液体系。
(3)通过化学修饰可以使本发明的碳纳米管管壁带有不同功能的官能团,适于不同生物体系的研究。
(4)管状结构的碳纳米管具有很高比表面积,在其壁表面修饰生物体系可以提高负载量。
(5)利用单个波长可激发所有的量子点的特性,本发明的荧光碳纳米管可以被单一波长所激发进行检测,使检测的过程、条件和仪器大大简化,而不同的荧光染料分子则需多个激发波长,不具有这些优点。
(6)本发明的荧光碳纳米管还具备量子点的发射波长可通过控制大小和组成来调谐的特点。
(7)本发明的荧光碳纳米管具有很高的荧光强度和荧光稳定性。
(8)本发明功能化的荧光碳纳米管采用量子点作为荧光功能团,具有很好的生物相容性,对生物体系毒性小,为其应用到生物领域提供了可能,而有机荧光染料或镧系配合物则不具有这种优越性。
附图说明
图1是荧光显微镜下的荧光MWNTs。
图2量子点的示意图。
图3未经过修饰的碳纳米管示意图。
图4酸化后的MWNTs红外光谱。1719cm-1是羧基的吸收带。
图5是未经过处理的MWNTs的透射电镜(TEM)图。
图6是经过混酸氧化超声16小时的MWNTs的TEM图。
图7碳纳米管的制备和应用示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如:化工产品手册,或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂。聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚乙烯亚铵(PEI)、聚丙烯基胺(PAH)购自Aldrich,壳聚糖(Chitosan)购自上海生化试剂公司;碳化二亚胺(EDC,购自SIGMA)及其他常见生物耦联剂的使用方法见《生物耦联技术》(Greg Hermanson,Academic press,New York);量子点CdS、CdSe、CdTe、ZnS根据文献自制或购自武汉珈源量子点开发技术有限公司;人类白细胞CD4单克隆抗体、乙肝病毒表面抗原HbsAg、DNA探针、Oligo-dT来源于上海生工生物工程有限公司。
实施例1
PDDA-MWNTs荧光碳纳米管的制备
(1)MWNTs悬浮液的制备
将MWNTs置于混酸之中(H2SO4与HNO3的体积比为3∶1),超声处理16小时。用100nm微孔滤膜过滤所得MWNTs悬浮液,用二次蒸馏水多次漂洗直至中性。将其重新分散到二次蒸馏水中,多次离心过滤(7000rpm,5min)除去其中的大颗粒MWNTs,得到长度分布在100-500nm之间且管壁上修饰有-COOH的MWNTs悬浮液(红外光谱如图4,TEM如图5)。
(2)PDDA-MWNTs水相体系的制备
制备原理:利用基团之间的静电作用力。
将0.1mg/mL MWNTs悬浮液与PDDA(MW 200000-350000)25μL混合,用二次蒸馏水稀释至5mL。超声15min,用200nm微孔滤膜过滤所得到的混合物,除去多余的未反应的PDDA后,重新分散到二次蒸馏水中,得到稳定的PDDA-MWNTs水相体系。
(3)荧光MWNTs的制备
制备原理:利用基团之间的静电作用力层层组装。
将25μL 0.1mg/mL的PDDA-MWNTs水相体系与30μL 0.013mol/mL的量子点CdS、CdSe、CdTe及ZnS的水溶液分别混合,静置30min,离心过滤(7000rpm,5min),除去未反应的量子点后,重新分散到二次蒸馏水中,分别得到稳定的以CdS、CdSe、CdTe或者ZnS量子点标记的PDDA-MWNTs/QDs水相体系(荧光图如图1)。
实施例2
Chitosan-MWNTs荧光碳纳米管的制备
将壳聚糖(Chitosan)溶解在1%HAC中,配成浓度为1mg/mL的溶液。以实施例1的相同方法即可制备Chitosan-MWNTs荧光碳纳米管。
实施例3
PEI-MWNTs荧光碳纳米管的制备
以聚乙烯亚铵(PEI)溶液取代实施例1中的PDDA,以实施例1的相同方法即可制备PEI-MWNTs荧光碳纳米管。
实施例4
PAH-MWNTs荧光碳纳米管的制备
以聚丙烯基胺(PAH)取代实施例1中的PDDA,其余方法和步骤同实施例1。即可制备PAH-MWNTs荧光碳纳米管。
实施例5
PDDA-MWNTs抗体荧光探针的制备
利用实施例1所制备的量子点纳米微球表面的-SCOOH,以碳化二亚胺(EDC)为耦联剂,与CD4单克隆抗体进行化学和生物化学修饰。得到能够与CD4细胞进行特异性识别的PDDA-MWNTs荧光探针。将此探针加入人的抗凝全血细胞样品,37℃温育1小时后,离心收集血细胞,以PBS缓冲液洗涤2次,制成细胞混悬液上荧光显微镜观察纳米免疫荧光探针的标记情况,结果显示表面有荧光探针结合的白细胞占白细胞的百分比与对照统计的CD4细胞百分比无显著差异。
实施例6
Chitosan-MWNTs抗原荧光探针的制备
以乙肝病毒表面抗原HbsAg取代实施例5中的CD4单克隆抗体,以Chitosan-MWNTs取代实施例5中的PDDA-MWNTs,其余方法和步骤同实施例5,制备能够与乙肝康复病人血清中的乙肝病毒表面抗体特异性结合的抗HBs检测试剂。将上述荧光检测试剂加入抗HBs阳性的人血清标准样品,以抗HBs酶联免疫检测试剂为对照,按照试剂盒说明书的相同方法处理,检测Chitosan-MWNTs抗原荧光探针的荧光强度。结果显示,与ELISA试剂盒相比,结果无显著差异。
实施例7
PEI-MWNTs DNA荧光探针的制备
以人肌动球蛋白基因DNA序列5’CAA CTT TGG TAT CGT GGA A 3’(探针在基因的位置为573-591)取代实施例5中的CD4单克隆抗体,以PEI-MWNTs取代实施例5中的PDDA-MWNTs,其余方法和步骤同实施例5,制备能够与人肌动球蛋白基因DNA特异性结合的基因检测试剂。将上述荧光检测试剂加入经PCR反应扩增的人肌动球蛋白基因产物片断溶液,95℃解链处理1分钟,55℃下退火反应15分钟。将上述探针-反应产物进行常规凝胶电泳,荧光检测电泳胶显示DNA探针标记效果良好,从而实现了DNA特异性检测。
实施例8
PAH-MWNTs mRNA荧光标记的制备
以Oligo-dT(连续T碱基的寡聚核苷酸)取代实施例5中的CD4单克隆抗体,以PAH-MWNTs取代实施例5中的PDDA-MWNTs,其余方法和步骤同实施例5,制备能够与mRNA(信使RNA)特异性结合的mRNA标记试剂。将上述荧光检测试剂加入经裂解的K562白血病细胞样品中,在RNase存在的情况下95℃解链处理1分钟,50℃下退火反应30分钟。将上述PAH-MWNTs Oligo-dT荧光探针-白细胞提取液样品进行常规凝胶电泳,荧光检测电泳胶显示Oligo-dT探针标记效果良好,从而实现了mRNA的特异性标记。
Claims (10)
1.一种荧光碳纳米管,其结构和组成为:
(1)内核为多壁碳纳米管;
(2)以聚阳离子化合物的静电作用力与内核相连的量子点外层。
2.根据权利要求1所述的荧光碳纳米管,其特征在于,所说的聚阳离子化合物选自聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA,壳聚糖Chitosan,聚乙烯亚铵PEI,聚丙烯基胺PAH中的一种或一种以上。
3.根据权利要求1所述的荧光碳纳米管,其特征在于,所说的量子点选自CdS、CdSe、CdTe、ZnS中的一种或一种以上。
4.根据权利要求1所述的荧光碳纳米管,其特征在于,所说的多壁碳纳米管长度范围为150~1000nm。
5.权利要求1所述的荧光碳纳米管的制备方法,包括如下步骤:
(1)用浓硫酸和浓硝酸的混合物氧化多壁碳纳米管,使多壁碳纳米管管壁带上羧基,通过超声将之裁剪成150~1000nm的短管;
(2)利用基团之间的静电作用力将聚阳离子化合物修饰到碳纳米管管壁上,得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系;
(3)利用基团之间的静电作用力将量子点组装到多壁碳纳米管上,得到荧光多壁碳纳米管。
6.根据权利要求5所述的荧光碳纳米管的制备方法,其特征在于,所说的制备方法还包括如下步骤:在荧光多壁碳纳米管表面化学修饰生物探针分子,得到具有荧光标记功能的碳纳米管生物探针。
7.根据权利要求5所述的荧光碳纳米管的制备方法,其特征在于,所说的生物探针分子为蛋白质、核酸或多糖。
8.权利要求1所述的荧光碳纳米管的应用,即在荧光多壁碳纳米管表面化学修饰生物探针分子,并以此碳纳米管生物探针与相应的目标分子特异性反应,通过荧光检测目标分子。
9.根据权利要求8所述的荧光碳纳米管的应用,其特征在于,所说的碳纳米管生物探针为PDDA-MWNTs抗体荧光探针、Chitosan-MWNTs抗原荧光探针、PEI-MWNTs DNA荧光探针、或者PAH-MWNTs mRNA荧光标记。
10.根据权利要求8所述的荧光碳纳米管的应用,其特征在于,以所说的PDDA-MWNTs抗体荧光探针、Chitosan-MWNTs抗原荧光探针、PEI-MWNTs DNA荧光探针、或者PAH-MWNTs mRNA荧光标记分别检测相应的抗原细胞、病毒抗体、人类基因DNA或者细胞中的mRNA。
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