HUT55049A - Process for expressing functional insect specific toxin gene in mammalian cells - Google Patents

Description

Bizonyos fajta skorpiók mérge olyan fehérjéket tartalmaz, amelyek szelektive toxikusak rovarokra. Ezek a rovartoxinok, jóllehet a rovarok esetében erős idegmérgek.

ártalmatlanok rákokra, pókfélékre, és emlősökre. A toxin neurotoxikus hatása irreverzibilis növekedést okoz az axon nátrium-permeabilitásában, ennek eredménye az áldozat megbénulása és halála. Ezeknek a toxinoknak a specifitása, kapcsolva biológiai lsbonthatóságukkal, vonzó természetes alternatívát jelent a kémiai rovarirtószerekkel szemben.

Az Androctonus australis rovartoxin (AalT) fehérje egy olyan neurotoxin, amely az Androctonus australis skorpió mérgében természetesen fordul elő. Az AalT fehérje természetes forrásból való izolálása nagyobb mennyiségben nem használható, ha nem lehetetlen, mivel a fehérje mennyisége a skorpióméreg összfehérje tartalmának kevesebb mint 1 %-a. A találmány tárgya uj eljárás az AalT fehérje előállítására rekombináns DNS technológiával, amelynek alkalmazásával nagymennyiségű működőképes rovartoxin fehérje állítható elő.

A korábbi erőfeszítések ennek a génnek prokarióta rendszerben való sxprssszálására nem eredményeztek működőképes terméket. A sejten belüli kompartmentalizáció és szekréció az eukarióta rendszerben lényeges a megfelelő harmadlagos szerkezettel rendelkező fehérje képződéséhez. Az AalT fehérje erősen rögzített keresztkötésekkel, mivel a 70 aminosavas fehérjében 4 diszulfid híd található. Ezeknek a kötéseknek a megfelelő konformációja kritikus az AalT fehérje

működése szempontjából [Zlotkin, E, Insect Selective Toxins Derivsd from Scorpion venoms, Insect Blochemistry, 13, 219-236 (1983)]. Az AalT fehérje, mint egy szskretálódó fehérje, jellegzetesen irányítottan kerül ki, a transzlációval egyidőben, az sndoplazmatikus hálózat lumenébe. Az nyilvánvaló, hogy az ER lumen szubcelluláris környezete rendelkezik azzal az ionos és poláris jellemzővel, amely az AalT fehérje megfelelő háromdimenziós szerkezetének kialakulásához szükséges. A találmány tárgya módszer szekréciós fehérjék előállítására olyan eukarióta sejttenyészetben, amely lehetővé teszi a gazdaságos előállítást. Ez a rendszer továbbá lehetővé teszi az AalT szekrécióját a tápközegbe, igy nincs szükség az expresszáló sejtek feltárására az AalT fehérje izolálásához.

A szignál fehérje-szekvenciák nélkülözhetetlen jellemzői a megfelelő transzlációnak és a szekréciós fehérjék, vagy a szubcelluláris membránnal határolt kompartmentekre lokalizált fehérjék irányított ürítésének. [Davis B. and Tai P. Natúré 283, 433-438 (1980)]. A különböző forrásokból izolált szignál-peptidek aminosav-szekvenciájának összehasonlítása az elsődleges szerkezet nagyon csekély konzerválódásét mutatja, ha egyáltalán létezik ilyen [Von Heijne G. , Eur. □. Biochem. , 133, 12-21 (1983)]. A vizsgálatok a szignál-peptid teljes konformációjának fontosságát

- 4 mutatják, bármely megkívánt elsődleges szekvenciával szemben. Más szakemberek azonban szükségesnek vélik, hogy a szignál peptiddel szomszédos N-terminális aminosav-szekvenciát meg kell őrizni ahhoz, hogy a megfelelő transzlokációt megtartsuk. EEar. s.U, st el., O.Cell. Biology, 86· 701-711 (1980)i Wiren K.M. st al,, □. Bioi· Chem., 263, 19771-19777 (1988)]. Ennek a szomszédos bevezető szakasznak a beépítésének gyakorlata olyan szekretált terméket eredményez, amely eltér az expresszálni kívánt fehérje igazi szerkezetétől. Ennek következtében a terméket a későbbiekben módosítani szükséges (ha lehetséges), hogy a kívánt fehérjét kapjuk. A jelen találmány szerinti módszer szükségtelenné teszi ezt a lépést azáltal, hogy egy fehérje szignál szekvenciáját közvetlenül az AalT strukturgénjéhez kapcsoljuk, ennek következtében olyan működőképes AalT molekulákból álló terméket kapunk, amelynél nincs szükség a későbbi módosításra. Továbbá ennek a bevezető szekvenciának a hiánya eliminálja a jelenléte által okozott esetleges konformációs problémákat.

A megfelelő bevezető szekvencia a fehérje megfelelő térszerkezetének kialakuláeához is szükséges. Úgy vélik, hogy a fehérje amlno-terminális részének konformációja egy kooperációé hatást eredményez, amelynek eredményeként a fehérje térszerkezete gyrssn kialakul. Tehát a szignál-szekvenciával szomszédos bevezető szekvencia • · · • ··

használata módosítja a fehérje amino terminálisát, amely érintheti a térszerkezet megfelelő kialakulását, ennek következtében a működőképességét gátolhatja.

Az alábbiakban ismertetett találmány leírásában az alábbiakban ismertetett szakkifejezéseket használjuk.

A	- dezoxi-adenozin
Alá	- alanin-csoport

Analóg - egyímásik molekula szerkezetéhez és

ApR	funkciójához hasonló molekula - ampicillin rezisztens fenotipus, vagy az ezt kódoló gén
Arg	- arginin-csoport
Asn	- aezparagin-csoport
Asp	- aszparaginsav-csoport
C	- dezoxi-citozin
Cys	- cisztein-csoport
G	- dezoxiguanozin
Gin	- glutamin-csoport
Glu	- glutaminsav-csoport
Gly	- glicin-csoport
His	- hisztidin-csoport
Ile	- izoleucin-csoport

• · · · ·· ··· ·

Rovartoxin - néhány állat mórgében talált fehérjs-toxin, amelynek neurotoxikus hatása van a legtöbb rovarra, míg nincs hatása a pókokra, rákokra vagy emlősökre

Integrálódó szekvencia - olyan DNS szekvencia, amely autonóm replikádét vagy kromoszómális integrációt biztosit egy vektornak egy adott gazdasejtben·

Leu - leucin-csoport

Lys - lizin-csoport

Met - metionin-csoport

Naszcensz fehérje - egy mRNS transzlációjakor keletkező polipeptid, bármely poszt - transzlációs módosítás előtt, pA - poliadenilezési jelet kódoló DNS szekvencia

Phe - fenilalanin-csoport pL - a lambda bakteriofág baloldali promoterének promoter-aktivitásával rendelkező DNS szakasz

Pro - prolin-csoport

Promoter - DNS szekvencia, amely a DNS-nek RNS-sé való átírását szabályozza.

rAalT - a natív AalT rekombinánc származéka

Rekombináns DNS klónozó vaktor - bármely autonóm replikádéra képes ágens, ideértve, de nem korlátozva magunkat a plazmidokra és fjgokra, egy olyan DNS molekula, amelyhez egy vagy több DNS szekvenciát lehet hozzáadni, vagy adtak már hozzá,

Rekombináns DNS expresezióe vektor - bármely rekombináns DNS klónozó vektor, amelybe promotert építettek be·

Replikon - Az a DNS szekvencia, amely szabályozza és lehetővé teszi egy plazmid vagy más vektor autonóm replikációját·

Restrikcióé fragment - bármely lineáris DNS szekvencia, amely egy vagy több restrikciós endonukleáz enzim hatására keletkezik·

Szelekciós markor - olyan DNS szekvencia, amely antibiotikum rezisztenciát, tápigény függetlenséget biztosit, vagy az organizmusban morfológiai változásokat eredményez, ezek alapján lehetővé teszi a rekombinánsok szelekcióját a szülő-tipusok mellett· ··· ·· · *

- 8 Érzékeny gazdasejt - olyan gazdasejt, amely nem képéé egy adott antibiotikum vagy máé toxikus vegyűlet jelenlétében növekedni egy DNS szekvencia jelenléte nélkül, amely az adott anyagra való rezisztenciát kódol.

Ser - szerin-csoport

Szignál-peptid - olyan változó hosszúságú amino-terminális polipeptid, amelynek elsődleges szerkezete szükséges és jellemző a fehérjék megfelelő irányított ürítésére a membránnal határolt kompartmentekbe. Ez a szekvencia ko- vagy poszt-transzléciósan lehasad a etrukturgén termékéről.

Szignál-felismerő részecske - egy olyan, meghatározatlan összetételű, citoszolban lévő részecske, amelyről úgy vélik, hogy a transzláció kezdeti lépéseiben a naszcenez szignál-fehérje központi régiójával lép kölcsönhatásba, és leállítja a transzlációt addig amíg a transzlációs apparátus kölcsönhatásba lép a membránhoz kötött fehérjével (fehérjékkel), amely(ek) megkönnyiti(k) a polipeptid irányított kiürítését a membránon keresztül.

• · ··♦·

1. ábra:

SP-IT gén - olyan rekombinéns DNS szekvencia, amely olyan emlős szignál-peptid szekvenciát kódol, amely közvetlenül egy rovartoxin gént vagy funkcionális származékát kódoló DNS szekvenciához kapcsolódik,

Strukturgén - bármely DNS szekvencia, amely egy funkcionális polipeptidet kódol, beleértve a transzlációs start és stop jeleket,

T - dezoxit imidin

R

Te - tetraciklin-rezisztencia fenotipus, illetve az ezt kódoló gén,

Thr - treonin-csoport.

Transzlációs apparátus - a mRNS polipeptid szekvenciává való megfelelő transzlációjához szükséges faktorok összessége, ideértve, de nem kizárólagosan a riboszómális komplexet, mRNS-t, GTP-t, GMP-t, és a szabályozó faktorokat.

Trp - triptofén-csoport,

Tyr - tirozin-csoport,

Val - valin-csoport.

A pKC283 plazmid restrikciós és funkciós térképe, előállítása az 1. példa leirésa szerint.

»··* *· ··* ·

2. ábra: A pKC283 pX plazmid restrikciós és funkciós térképe, előállítása a 2. példa leírása szerint· 3« ábra: A pKC283-L plazmid restrikciós és funkciós térképe, előállítása a 4. példa leírása szerint.

4. ábra: A pKC283-LB plazmid restrikciós és funkciós tér- képe, előállítása az 5. példa leírása szerint.

5. ábra: A pKC283-PRS plazmid restrikciós és funkciós tér- képe, előállítása a 6. példa leírása szerint.

6. ábra: A pL-32 plazmid restrikciós és funkciós térképe, előállítása a 6. példa leirása szerint.

7. ábra: A pNM 789 plazmid restrikciós és funkciós térképe, előállítása a 7. példa leírása szerint.

8. ábra: A p120 plazmidnak a pNM 789 plazmidból és a PvuII-

-BamHI szintetikus fragmentből való előállításának sematikus ismertetése, a 7. példában lévő leírás alapján,

9. ábra: A pL 47 plazmid restrikciós és funkciós térképe, előállítása a 7. példa leirása szerint.

10. ábra: A pRB-IT plazmid restrikciós és funkciós tér- képe, előállítása a 9. példa leirása szerint.

11. ábra: Az SP-IT hibrid gént kódoló DNS szekvencia po- zitív száljának kódoló szekvenciája. Az ábra még bemutatja az SP-IT génterméknek magfelelő aminosav-szskvenciát.

• * «·4·

• ·

12, ábra: A pMSV-IT plazmid restrikciós és funkciós térképe j előállítása a 10. példa leírása szerint.

A jelen találmány tárgya eljárás funkcionális szskretált rovartoxin előállítására rekombináns eukarióta gazdasejtben, azzal jellemezve, hogy:

A) Az említett eukarióta gazdasejtet rekombináns DNS expressziós vektorral transzformáljuk, melynek összetétele :

1. replikációs origó vpgy integrálódási szekvencia,

2. az említett gazdasejtben működő promoter vagy transzlációs aktiváló szekvencia,

3. emlős szignál-psptldst kódoló DNS-szekvencia,

4. rovartoxint kódoló gén, és

5. szelekciós narksr, majd

B) az említett eukarióta gazdasejtst az említett funkcionális rovartoxin expresszálására alkalmas körülmények között tenyésztjük.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a szintetikus toxin-gén a humán interleukin-2 szignál-peptidet (IL-2-SP) kódoló DNS szekvenciát tartalmaz, az Androctonus australis skorpió rovarspecifikus toxin génjéhez (AalT) illesztve. A Jelen találmány tárgyai továbbá az IL-2-SP és a rovartoxin aminosavsorrendjével azonos amino12 ··*· savsorrendet kódoló polinukleotid szekvenciával funkcionálisan ekvivalens, illetve származék polinukleotidok. A funkcionálisan ekvivalens, illetve származék szakkifejezés jelen-tése annak a nukleotid szekvenciának a fragmentjel, variánsai vagy analógjai, amely a bejelentett preproteinnel ekvivalens tulajdonságokkal és biológiai funkcióval rendelkező preproteint kódolja.

A funkcionális kimére gén számos összetevőből áll;

a) ^Θ9Υ promotsr vagy transzlációs aktiváló szekvencia,

b) egy DNS szekvencia, amely egy emlős szignál-peptidet kódol egy vele leolvasási fázisban lévő transzlációs aktiváló szekvencia - beleértve egy ATG start kodont - után, és

c) közvetlenül a ezignál-peptidet kódoló szekvencia után lévő,vele leolvasási fázisban lévő DNS szekvencia, amely egy rovartoxint kódol.

Az egy ismert polipeptid-szekvenciát kódoló nukleotid szekvenciát úgy határozhatjuk meg,hogy könnyen hozzáférhető genetikai kód szekvenciákat, például a Stanford kódokat használjuk a DNS redundanciák felismeréséhez. A DNS szekvenciákat úgy állíthatjuk elő, hogy a fehérje-szekvenciát egy DNS szintetizátorral (pl. Applied Biosystems Módel 380-A DNS szintetizátor) készített oligonukleotid fragmen13 ·’ ^:·*. :.:. :··· ,;ζ.

·· ... · tekké fordítjuk vissza, majd ezeket az ismert standard módszerekkel összeligáljuk [Mánlatis T. et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1982)].

A gént két darabban állítjuk elő. Egy szekréciós fehérje preprotein formája aminosav-sorrendjének leírásánál elfogadott gyakorlat, hogy a számozás kiindulási pontja a hasitási pont. Az ez előtt lévő aminosavakat (azaz a szignál szekvenciát) -1, -2, -3 számozással látjuk el, ahogy a szignál-peptid hasitási pontjától távolodunk. A hasitási pont után lévő aminosavak hasonló megfontolások alapján a +1, +2, stb. számozást kapják.

Az AalT skorpió-toxin származék rágcsáló sejtekben való előállítására és szakretálására használt plazmidot három lépésben állítjuk elő. Az első lépésben kémiailag megszintetizáljuk és klónozzuk az AalT származék génjét pBR322 plazmidban. A 226 bp méretű szintetikus fragmentet az Androctonus australis skorpió rovarellenes toxinjának publikált aminosav sorrendje alapján [Zlotkin, E. Insact Selective Toxins Dérived from Scorpion venoms, Insect Biochemistry, 13. 219-236 (1983)] állítjuk elő, a szakterületen ismert mód» szerekkel. A szintetikus oligonukleotld fragment az AalT gén +1—tői +69-ig terjedő aminosavait kódoló szekvencia, mindkét végén BamHI restrikciós endonukleáz felismerési helyet tartalmaz, pozitív szálának szekvenciája a következő:

5 -GATCCAA ATAATGAAAA AAAACGGCTA CGCTGTTGAC TCTTCT

GGCAAAGCTC TAAAGTTCAT GCTTCGGCCT AAATCTTACT

CGGAATGCCT

TACGCTGACA GAACGACGAC GCGACACTAC

GCTGTCTAAC AAGGCTACTG AAAAAAGTTC TATCAACTAA

TACTGCAACA CTGCCTGCTG TGGAAATCTC TAG-3*

ACCAGTGCAC

TCCTGCTACT

TGACACTCGT

Miután a fragmentet T4 polinukleotid kinázzal fosztorileztük (Pharmacia-LKB Biotechnology, Inc. , 800 Centennlal Avenue, Piscataway, NO 08854) a T4 DNS ligázzal való ligáláshoz szükséges 5*-foszfát, csoportok beépítése céljából a szintetikus szekvenciát a pBR322 plazmid (New England Biolabs, 32 Tozer Road , Beverly, MA 01915) BamHI restrikciós helyére építjük be a pBR322-IT plazmid előállítása céljából.

A második lépésben a humán interleukin-2 20 aminosavból álló s£lgnál-peptidjét (IL2-SP), valamint az AalT első 8 aminosavát kódoló DNS fragmentet, amely az 5* végen BglII, a 3* végen HinF1 felismerési helyet tartalmaz (A szeg mene) állítjuk elő kémiai szintézissel. Ennek a fragmentnek a pozitív szála a kővetkező szekvenciável rendelkezik:

GAT	CTA	TAA	ATA	ATG	TAC	AGG	ATG	CAA	CTC
CTG	TCT	TGC	ATT	GCA	CTA	AGT	CTT	GCA	CTT
GTC	ACA	AAC	AGT	AAA	AAA	AAC	GGC	TAC	GCT

GTT G • · · ·

- 15 A pBR322-IT plazmidot ezután BamHl és HinFl restrikciós endonukleázokkal emésztjük, Így állítjuk elő a B szegmenst, A B DNS szegmens tartalmazza az AalT származék fehérje +9 - +69-as aminosavai kódoló szekvenciát, amelynek a pozitív ezála a következő szekvenciával rendelkezik :

	AC	TCT	TCT	GGC	AAA	GCT	CCG	GAA	TGC
CTG	CTG	TCT	AAC	TAC	TGC	AAC	AAC	CAG	TGC
ACT	AAA	GTT	CAT	TAC	GCT	GAC	AAA	GGC	TAC
TGC	TGC	CTG	CTG	TCT	TGC	TAC	TGC	TTC	GGC
CTG	AAC	GAC	GAC	AAA	AAA	GTT	CTG	GAA	ATC
TCT	GAC	ACT	CGT	AAA	TCT	TAC	TGC	GAC	ACT
ACT	ATC	AAC	TAA	TAG

A rovar endotoxin expresszálására végülis használt plazmid előállításának harmadik lépése az, amikor az A és B szegmenseket ligáijuk, így állítjuk elő azt a hibrid gént, amely a humán interleukin-2- szignál-peptidjét, valamint a skorpió AalT rovarölő endotoxin származékot kódolja, az 5* végen BglII , s 3* végen BamHl restrikciós endonukleáz felismerési helyet tartalmaz, A hibrid gént ezután a pL47 plazmid BglII és BamHl helyére épitjük be,

A pL47 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a kisérő rajzok között a 9. ábrán közöljük, A pL47 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy először a pKC283 plazmidot izoláljuk az E.coli K12 BE120l/pKC283 törzsből.

A tenyészet beszerezhető az NRRL-től, ahol NRRL B-15830 sorezám alatt található. A pKC283 a lambda fág lpp-pL hibrid promotarét tartalmazza. Ezt a plazmidot E.coli K12 BE12Ű1 sejtekből nyerjük ki, mivel ezek a sejtek egy hőmérséklet-érzékeny cl repreeszort tartalmaznak a kromoszómába integrálódva, a pKC283 plazmid szükség télén lacZ részét PvuII restrikciós enzimmel emésztve távolitjuk el a pKC283 plazmidból. Az emésztett DNS-hez specifikus DNS- linkereket adunk hogy a PvuII helyeket Xhol helyekké alakítsuk, igy állítjuk elő a pKC283PX plazmidot. (A pKC283 ée pKC283PX plazmidok izolásának részletes leírását az 1. illetve a 2« példában mutatjuk be.) A pKC283 és pKC283PX plazmidok restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között az 1. illetve

2. ábrán mutatjuk be. A pKC283PX plazmidot standard módszerekkel klónozzuk E.coli K12 M0(lambda⁺) törzsekbe. Az E.coli K12 M0(lambda⁺) beszerezhető az NRRL-től, ahol NRRL B-15993 sorszám alatt található.

A pKC283PX plazmidot ezután BglII és Xhol restrikciós enzimekkel emésztjük. Miután a vektort megtisztítottuk, a vektorba BglII és Xhol végekkel rendelkező DNS-linkereket klónozunk, igy állítjuk elő a pKC283-L plazmidot. A BglII-Xhol linkér egy Xbal helyet is tartalmaz. A pKC283-L plazmid Xhol helyét ezután BamHI hellyé konvertáljuk.Ezt úgy végezzük, hogy a pKC283-L plazmidot Xhol restrikciós enzimmel teljesen megemésztjük, majd Klsnow fragmenttel kezeljük.

• ··· · · · · • · ········· ·· ··· · ·

BamHI linkereket adunk hozzá, lg/állítjuk elő a pKC283-LB plazmidot, A pKC283-L ée pKC283-LB plazmidok előállításának részletes leírását a 4, illetve 5. példában mutatjuk be. A pKC283-L illetve pKC283-LB plazmidok restrikciós ée funkciós térképét a kísérő rajzok között a 3, illetve 4. ábrán mutatjuk be·

Ezután a fölösleges E.coli DNS-t kivágjuk a pKC283PX plazmidból, olymódon, hogy a plazmidot teljesen megemésztjük Sáli restrikciós enzimmel, majd a kb, 4,0 kb méretű vektort Klenow fragmenttel kezeljük, végűi EcoRI linkereket adunk hozzá· Ligálással végzett recirkularizálás után kapjuk a pKC283PRS plazmidot. A pKC283PRS plazmidot ezután PstI és Sphl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kb. 0.85 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentet izoláljuk· Analóg módon a pKC283-LB plazmidot PstI illetve Sphl restrikcióé enzimmel emésztjük, majd a kb. 3,0 kb méretű fragmentet izoláljuk· A pKC283PRS plazmid kb· 0,85 kb méretű Pstl-Sphl fragmentjét ezután a pKC283-LB plazmid kb· 3,0 kb méretű Pstl-Sphl vektor-fragmentjével ligáljuk, így állítjuk elő a pL32 plazmidot· A pKC283PRS és pL32 plazmidok előállításának részletes leiráeát a 6. példában mutatjuk be· A pKC283PRS illetve pL32 plazmidok restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között az 5. illetve 6· ábrán mutatjuk be· • ··

- 18 Ezután a pNM789 plazmidot állítjuk elő az NRRL

E.coli K12 RV3O8/pNM789 törzséből, amely B-18216 sorszám alatt található az NRRL-nél. A pNM7879 plazmid restrikciós és funkciós térképét a kísérő rajzok között a 7. ábrán mutatjuk be. A pNM789 plazmidot részlegesen emésztjük PvuII restrikciós enzimmel, majd teljesen megemésztjük BamHI restrikciós enzimmel, majd alkalikus foezfatázzal kezeljük. Ezután uj PvuII-BamHI linkért ligálunk az emésztett foszfatázozott pNM789 vektorba, Így állítjuk dLŐ a 120-as plazmidot· A 120-as plazmidot ezután teljesen megemésztjük Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel, majd a kb. 0,6 kb méretű, EK-BGH-t kódoló Xbal-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk. A pL32 plazmidot is emésztjük Sbal és BamHI restrikciós enzimekkel, majd a kb· 3,9 kb méretű vektor-fragmentet izoláljuk. A 120-as plazmid kb· 0,8 kb méretű Xbal-BamHI fragmentjét ezután a pL32 plazmid kb· 3,9 kb méretű vektorfragmentjébe klónozzuk, Így állítjuk elő a pL47 plazmidot· A 120-as plazmid és a pL47 plazmid előállításának részletes leírását a 6. illetve 7, példában mutatjuk be· A 120-as plazmid és a pL47 plazmid restrikciós és funkciós térképét a kisérő rajzok között, a 8· illetve 9. ábrán mutatjuk be· • · · · «

··· «· · • · • * ·· ·♦ · ·

- 19 Az A és B szegmensek, ha ősszellgáljuk, akkor olyan kínéra gén jön létre, amely egy hibrid IL1-sp-AaIT származék polipeptidet kódol, a találmány egy előnyös megvalósítására az alábbiakban bemutatott példában a kiméra gént, amely az ILl-SP-AaIT származék propeptidet kódolja, az 5* végen BglII feliserési helyet tartalmaz, a 3* végen BamHI felismerési helyet tartalmaz, a pL47 prokarióta klónozó vektorba klónozzuk a pL47 plazmid egyetlen BamHI helyére, igy kapjuk a pRB-IT plazmidot. A pRB-IT plazmid restrikciós térképét a 10. ábrán mutatjuk be. A plazmidot E.coli-ba transzformálva amplifikáljuk, ismert módszereket felhasználva, A plazmidot cézium-klorid egyensúlyi sürüséggradiens centrifugálással tisztítjuk.

A pRB-IT plazmidot BglII ée BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, Így izoláljuk az SP-IT gént kódoló 285 bp méretű fragmentet, amelynek a szekvenciáját a 11. ábrán mutatjuk be. A 285 bp méretű fragmentet agaróz gélelektroforézlesel izoláljuk. Az SP-IT gént kódoló DNS szekvenciát ezután egy expressziós vektorba építjük be, például eukarióta sejt transzformálására képes plazmid vagy vírus vektorba. Az előnyös vektor olyan retrovirus vektor, amely a genomjába beépítve egy provirus szekvenciát vagy annak egy részét tartalmazó plazmid, A retrovirus géneket két hosezu terminális ismétlődő szekvencia határolja. Az 5* és 3* hosszú terminális ismétlődő szekvencia elősegíti a vírus mRNS transzkripcióját és poliadenilezéeét. A szintetikus SP-IT gént a plaz• · • · ···· · · ··

- 20 mid provirális részébe építjük be, a virális hosszú terminális ismétlődő (LTR) szekvencia transzkripciós szabályozása alá. A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az SP-IT gént az előnyös pMSV retrovirus vektorba építjük be. A pMSV plazmid [leírása megtalálható a

775 624 sorszámú, 1988. október 4-én kibocsátott Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, a szabadalom teljes kitanitására hivatkozunk az alábbiakban] tartalmazza a teljes Mo.SV provirális szekvenciát, egy rágcsáló retrovirust [Stratowa, C. et al. , EMBO , 1£, 1973-78 (1982)].

Egy rekombináns retrovirus vektor négy alkotórészből áll:

A. egy 5* LTR a retrovirusból, ezt követi a retrovirus pakoló szignál szekvenciát tartalmazó DNS szakasz;

B. az adott, expresszálandó gén, azaz a rovartoxin gén SP-IT;

C. egy szelektálható jelzőgén;

D. egy 3* LTR, amely tartalmaz egy teljes LTR-t, vagy egy olyat, amely deléciót szenvedett az erősítő régióban, illetve deléciót szenvedett a vírusnak mind az erősítő, mind a promoter régiójában^

Egy rekombináns retrovirus vektor képes átvinni géneket egy hordozó sejtvonalba, amelyben a transzformánsokat a szelekciós marker alapján azonosítjuk. Izolált telepeket izolálunk és szaporítunk el, igy kapunk egyetlen transzformált sejtből származó sejtvonalat·

Különböző marker gén típusok hozzáférhetők, amelyek morfológiai változást, kémiai függőséget vagy függetlenséget biztosítanak. Egy előnyös marker a v-mos onkogén, amely a Moloney rágcsáló szarkóma vírus (Mo-MSV) transzformáció specifikus génje [Van Beveren et al. , Natúré, 289, 258-262 (1981)], A v-mos onkogén transzformálja a gazdasejtet, könnyen megfigyelhető morfológiai változásokat okozva. Például a transzformálatlan 3T3 sejtek laposak és a kontakt gátlás érvényesül náluk. Azonban a v-mos szekvenciával tranaszformált 3T3 sejtek kerekek vagy orsóalakuak«erősen fénytörőek, és a kontakt gátlás nem érvényesül náluk. Az ilyen v-mos/ 3T3 transzformánsok néhány nappal a transzfekcló után jelennek meg, és két hét elteltével a transzformánsok gócpontja világosan látható. Az SP-IT gént ugyanazon LTR transzkripciós kontroll alá helyezve mint a v-mos gént, az SP-IT gént expresszáló rekombinénsokat a v-mos-ra jellemző morfológiai változások alapján lehet izolálni.

Más szelekciós markerek is hozzáférhetők. Az antibiotikum rezisztenciát kódoló géneket rutinszerűen használják transzformánsok izolálására, a transzformált sejteknek a tenyésztő táptalajban lévő antibiotikum elleni rezisztenciája alapján. Például a beépítendő és expresszálandó génekhez kapcsolt neomicin vagy higromicin rezisztencia gének lehetővé teszik a transz formánsok izolálását a sejteket ••9« ··«· ·

- 22 olyan táptalajban tenyésztve, amely egyébként toxikus koncentrációjú antibiotikumot tartalmaz,

A hibrid gént a retrovirális plazmidba restrikciós endonukleázos emésztéssel és ligáláesal építjük be, A linsarizált kiméra génszekvenciát, amelyet a pRB-IT plazmid BglII-BamHI emésztésével kapunk, a pMSV plazmidba a pMSV egyetlen BglII helyét felhasználva építjük be.A kapott pMSV-IT plazmldot E, coli-ban szaporítjuk el, lényegében a 3, példában ismertetett eljárással, A pMSV-IT plazmldot CsCl egyensúlyi sürüséggradiens centrifugálással izoláljuk,

A retrovirális vektort használjuk ez SP-IT génnek a gazdasejtbe való bevitelére. Az SP-IT gént, a szelekciós markért, valamint az 5' és 3' LTR szekvenciát tartalmazó plazmidot a gazdasejtbe transzfekciós módszerrel, például a kalcium-foszfát módszerrel juttatjuk be [M.Wigler et al, , Cell, 14, 725 (1978); Μ,T, Lai and I.M, Verma, Virology, 104, 407-417 (1980)], Ezeknek a plazmid géneknek a transzlációját és transzkripcióját a gazdasejt transzlációs és transzkripciós mechanizmusa végzi, A szelekciós markor alapján azonosított transzfektált sejteket elszaporitjuk, így állítunk elő nagymennyiségű transzformált sejtet,

A rovartoxin izolálására, valamint a megfelelő extracelluláris szekréció biztosítására a sejteket 80-90 %os bsnővésig tenyésztjük, A szérumtartalmu táptalajt ezután szérum-mentes OMEM (Dulbecco féle módosított Eagle táptalaj)

- 23 táptalajjal helyettesítjük. A sejteket ezután 24 órán át tenyésztjük. A szővettenyészet táptalaját ezután kinyerjük, kissebességű cent rifugálás sál megtisztítjuk a sejttörmelékektől,majd egy YM 10 membránnal felszerelt Amicon ultraszürő berendezéssel betöményitjük. A további vizsgálatok céljára alikvot mintákat veszünk, amikor a betöményités körülbelül 5-szörös, 20-szoros, 50-szeres, 100-szoros, 200-szoros és 300-8zoros.

A szekretált rovartoxin működését azon a tulajdonságán mérjük le, hogy a pMSV-IT-vel transzformált NIH/T3 sejtek (ATCC CCL92) tőményitett tenyészfolyadéka mennyire képes a sárgaláz moszkitó (Aedes egypti) lárváját elpusztítani. A sárgaláz lárváját lényegében a 12, példában leirt módszerekkel állítjuk elő. Körülbelül 10-15 lárvát teszünk 50/ul keltető táptalajba, majd azonos térfogatú tőményitett tenyészfolyadékot adunk hozzá, amelyet a pMSV-IT plazmiddal transzformált 3T3 sejtekből (DC-1) nyerünk ki. A pusztulást a tőményitett tenyésztáptalaj hozzáadása után 2, 4, 24 órával vizsgáljuk. Az 1. táblázatban láthatók ennek a kísérletnek az eredményei. Az adatok tisztán mutatják, hogy a pMSV-IT-vel transzformált sejtek (DC-1) tenyészfolyadéka elpusztítja a moszkitókat, koncentráció-függő módon, A pMS-vel transzformált kontroll 3T3 sejtek (DB—2) nem mutattak ilyen inszekticid aktivitást, mutatva, hogy az inszekticid aktivitás közvetlen eredménye a 3T3 sejtek SP-IT génnel való transzformálásának. Az eredmények ···· ···· azt mutatják, hogy az AalT fehérje megfelelő háromdimenziós szerkezettel rendelkezik, megfelelően szekretálódik, ennek eredményeképpen egy működőképes AalT származék fehérje keletkezik, minden további kémiai vagy mesterséges módosítás nélkül.

1, táblázat

Az rAalT rovarölő aktivitása moszkitó lárvákban mérve

A tenyész- A moszkitó lárvák pusztulása azonos tárlogalé forrása tu, töményitett szövettenyésztő folyadékot tartalmazó táptalajban

	1X 5X	2OX	5OX	1OOX	2OOX	3OOX
DC-1	sejtek3	•B «	-Ac	+ c	c + +	c +++	+++ C
DB-2	b sejtek	-	-	-	mm		-

^apMSV-IT-vsl transzformált NIH/3T3 sejtek u

pMSV-vel transzformált NIH/3T3 sejtek ^CA moszkitó lárvák pusztulását a toxinnak a rovarokhoz való hozzáadása után 2,4 illetve 24 órával határozzuk meg

- 25 -/+: kevesebb mint 100 %-os pusztulás 24 óra alatt +: 100 %-os pusztulás 24 óra alatt ++: 100 %-os pusztulás 4 óra alatt +++: 100 %-os pusztulás 2 óra alatt egy héttel később megfigyelve.

A szignál-peptidek jellemzők azokra a fehérjékre, amelyek ezekretálódnak és lokalizálódnak bizonyos szubcelluláris kompartmentskben, A szignál-peptid megkönnyíti a rendes szubcelluláris lokalizációt vagy szekréciót, 3 fő funkciója alapján:

1. leállítja a fehérje-szintézist a szignál-felismerő részecskével (SRP) kölcsönhatásba lépve,

2. megkönnyit az irányított kiürülést a membránokon keresztül, és

3. támadási pontot nyuj$ a megfelelő proteáz aktivitásnak a -1 - +1 pontnál, a szignál-szekvencia strukturgén találkozási pontjánál.

□óllehet mindegyik ismert szignálpeptid hasonlómódon működik, a különböző forrásokból származó szignál-peptidek az aminosav-szskvenciának nagyon csekély konzerválódását mutatják, ha egyáltalán mutatnak ilyet [Von Heijne G. , Eur. □. Biochem., 133, 12-21 (1983)]. Ha azonban a szekunder és • · · · ··«··· « • · · ·

- 26 tercier strukturális elemek valamint a hidrofób/hidrofil interakciók fényében vizsgáljuk, vannak homológiát mutató régiók, amelyek egybeesnek a három említett funkcióval. A szerkezeti homológia három megőrzött régiója:

a) az amino-terminális régió

b) a központi régió

c) a karboxi-terminális régió.

Az amino-terminális régiót pozitív őssztöltés jellemzi. A negatív őssztöltés gátolná a processzálást. Ez a régió nem érzékeny a hat amlnosavnál kisebb változásokra. Azonban 10-13 aminosav hozzáadása vagy kivágása megakadályozza a transzlokációt· Habár a hossz nem tűnik kritikusnak, az amlno-terminális régiónak a többi funkcionálisan homogén régiótól való fizikai távolsága a szignál-peptid funkció szempontjából fontos lehet. Továbbá, miközben nincs egy bizonyos jellemző aminosav-ezekvencla, az ebben a régióban jelenlévő aminosavak gyakran egy béta hélix jelenlétét mutaják. A szignál-peptid amino-térni inál is régiójáról általában az a vélemény, hogy kapcsolatban áll a polipeptidnek a membránokon keresztül való megfelelő transzlokációjával·

A szignál-peptid központi régióját azoknak a csoportoknak a magas koncentrációja jellemzi, amelyek az alfa-hélix konformáció keletkezését segitik elő. Ez a terület erősen hidrofób. Ismét, nincs konzerválódott aminosav-szekvencia ebben a régióban. Erről a területről az a vélemény, hogy kölcsönhatásba kerül a szignál-felismerő részecskével • · • · · · · · « ··· · * ·· · • · ········· · • · · ·· · · ·*·· (SRP), ami leállítja a transzlációt, lehetővé teszi a membránhoz kötődő fehérjékhez való integrálódást, ezzel megkönnyíti az irányított átjutást a membránon keresztül.

A karboxi-terminális régiót magas fokú konzerválódás jellemzi a -1 és -3 pozíciókban. A -1-es pozícióban egy kisméretű csoportnak kell lennie, általában alaninnak, szerinnék, glicinnék, ciszteinnek, treoninnak vagy glutaminnak. A -3-as pozícióban lévő csoport nem lehet aromás, töltött, vagy nagy és poláris. Ezenkívül prolin sem lehet a -3 - -1 régióban £Von Heijne, G. , Nucleic Acide Research, 14, 4683-90 (1986)].

Ezek a tények egymás mellé rakva azt demonstrálhatják, hogy a megfelelő szingál-szekvencia funkció inkább a jellegzetes szekunder és tercier szerkezetnek köszönhető, és nem bármely Jellemző primer szerkezetnek. Mások azonban ahhoz a véleményhez ragaszkodnak, hogy a szignál-peptid megfelelő hasításához és funkcionálásához szükséges tulajdonságok a szignál peptid elsődleges szerkezetéhez és az adott szignál-peptidhez normálisan kapcsolódó első néhány aminosavhoz kötődnek [Emr. S.D. et al. , □. Cell. Biology, 86, 701-711 (1980)} Wiren K.M. et al. , □. Bioi. Chem., 263, 19771-19777 (1988)]. Ezek a példák azonban elhanyagolják a primer, szekunder és tercier szerkezetek közötti alapvető kapcsolatot. Egy olyan bevezető szekvenciát használva köz• · ·· ···· · • · · • ··· · * vétlenül a szignál-peptidhez kapcsolva, amely abból a néhány aminosavból áll, amely a természetben a szignál-pepiidhez kapcsolódik, a transzlációs termék nem pontosan az expresszálni kívánt termék, hanem a fehérjének egy származéka, egy amino-terminális bevezető szekvenciával. Ezek a változások az amino-terminálison jóllehet néha nincsenek káros hatással, mégis az előállítandó fehérje tulajdonságaitól függően inaktív strukturgén termékhez vezetnek.

A találmány szerinti eljárás azt az utat mutatja, be, amelynek eredménye olyan strukturgén-termék, amely a humán interleukin-2- amino-terminális bevezető szekvenciája nélkül expresszálódik. Ez a módszer megelőzi a potenciális térbeli torzulásokat, amelyeket a bevezető szekvencia okoz. A módszer további előnye, hogy nincs szükség a szekvencia eltávolításához további kémiai kezelésre.

A megfelelő térbeli szerkezetre kifejtett lehetséges hatások különösen fontosak a rovartoxin fehérjék esetében. Az AalT fehérje négy diszulfid rudat tartalmaz. Ezeknek a diszulfid kötéseknek a megfelelő kialakulása kritikus a fehérje müköd_jőképessége szempontjából EZlotkin, E,, Insect. Biochem., 13, 219-236 (1983)]. Az eukarióta szignál-szekvencia expressziós rendszer fontosságát a szekréciós fehérjékkel kapcsolatban azoknak a kísérleteknek a kudarca mutatja, amelyek működőképes rovartoxinfehérje előállítására ···· ····

- 29 irányultak E.coliban. A rovartoxin fehérjék szekréciós fehérjék, ennélfogva normális körülmények között a transzlációval egyidőben választódnak ki az endoplazmikus retikulum (ER) lumenébe. Nyilvánvaló, hogy elektromos, hidrofil és/vagy strukturális következményei vannak az ER-be való kotranszlációs kiválasztódásnak, amelyek szükségesek ahhoz, hogy a rovartoxin fehérje megfelelő térszerkezetet vegyen fel és megőrizze működőképességét. A találmány tárgya eljárás működőképes szekréciós fehérjék előállítására, rekombináns DNS rendszerben, megőrizve azokat a feltételeket, amelyek szükségesek a működőképes géntermék megfelelő expreszsziójához, a strukturgén-termékkel szomszédos szignálpeptidtől eltekintve.

Amint azt az előző szövegben vizsgálat tárgyává tettük, a humán interleukin-2- szignál-peptid szekvenciát más emlős szekréciós szignál-peptid szekvenciákkal helyettesítve megfelelő tercier szerkezet alakul ki, és az AalT géntermék a sejten kívülre kerül. Számos ilyen szignál-peptid aminosav-szekvenciáját közük von Heijne cikkében, melynek cime Patterns of Amino Acids near Signal-Ssquence Cleavage Sites [Eur. □. Biochem. , 133, 12-21 (1983)], ehhez kapcsolódik az említett szerzőnek egy ezt követő cikke: A new method fór predicting signal sequence cleavage sites, Nucleic Acids Research, 14, 4683-4690 (1986)], ezekre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk, és a ··· · · · ·

- 30 szekvenciák azt mutatják, hogy az emlős szignál-peptid szekvenciák funkcionálisan hasonlóak. Tehát az AalT kódoló szekvencia kapcsolható más, szekréciós fehérjékből származó szignál peptidet kódoló szekvenciához, ennek eredményeképpen kapunk aktiv szekretált AalT rovartoxint vagy annak egy származékát. Az ilyen funkcionális kombinációkra lehet példa az amikor egy funkcionális rovartoxin gén kapcsolódik a patkány inzulin II szignál-peptidet kódoló DNS szekvenciához, vagy a patkány növekedési hormon szignál-peptidet kódoló DNS szekvenciához, vagy a humán növekedési hormon szignál-peptidet kódoló szekvenciához, □óllehet a szekréciós fehérjék megfelelő extracelluláris lokalizációját főleg a szignál-peptid szekvencia vezérli, a fehérje géntermék működőképessége, végülis az aminosav-szekvenciájuktól függ. Bizonyos aminosavak jellemző tagjai a szekunder szerkezeti elemeknek, például az cc-hélixnek és a β-redőzött lemeznek. Hasonlóképpen, bizonyos aminosavak fizikai tulajdonságai befolyásolják a tercier szerkezetet, Egy megfelelő tercier fehérje-szerkezet kialakulása és stabilizálódása főleg 4 tipusu kölcsönhatásnak köszönhető:

(1) hidrogén-kötések a peptid-csoportok között, mint például az oc-hélixben vagy a β-redőzött lemezben , hidrogén-kötések az aminosav oldalláncok között.

(2) • · · · · · ········ · • · ········· · ·· ··· · · ·· · ♦ (3) hldrofób kölcsönhatás az apoláros aminosav oldalláncok között, (4) Ionos kötések a pozitívan és negatívan töltött oldalláncok között, [Lehninger, A,, Biochemistry, 2d Ed., 214. old,, 142 Worth Publishing, NY (1975)]. Azonban egynél több aminosav rendelkezhet hasonló fizikai tulajdonságokkal, az említett faktorok szempontjából. Tehát a natív fehérjével szomszédos aminosavhoz hasonló fizikai tulajdonságokkal rendelkező aminosavakkal helyettesítve azt, általában egy funkcióképes fehérjét kapunk. Amig az igaz, hogy bizonyos aminosavak jelenléte lényeges a fehérje működéséhez, mint például az enzim aktiv helyében szerepet játszó aminosavaké, az elsődleges szekvencia legnagyobb része nem kell hogy aminosav specifikus legyen ahhoz, hogy a fehérje megőrizze működőképességét. Hasonlóképpen, egy vagy több aminosav kihagyása vagy hozzáadása még működőképes fehérjét eredményezhet.

Az AalT fehérje sem kivétel. Az aminosavak csekély me9yáltoztatáea az AalT fehérje szerkezetileg nem lényeges részein funkcionálisan hasonló, ha nem azonos rovartoxint eredményez. Ezeket az AalT származékokat szintén jól elő lehet állítani a jelen találmány szerinti expressziós rendszerrel. Az ilyen funkciós származékok előállítását demonstráljuk a szabadalmi leírásban. Az expresszált fehérje pontos aminosav szekvenciájának a natív AalT fehérje • · «······· · • · ··«······ * • · ··· · » · · · ·

- 32 aminosav-szakvenciájával való összehasonlítása azt mutatja, hogy az exprssszált fehérjéről egy izoleucin hiányzik a C-terminális végen. Azonban ez az AalT származék megtartja a natív AalT toxin funkcionális tulajdonságait.

Az emlős fehérjék poszttranszlációe módosítása változik az emlős sejtvonalak között, valószínűleg bizonyos proteázok jelenlététől függően [Ramabhandran, T, V, et, al. , Hőst Cell-specific Variations in the Posttranslational Modification of Engineered Proteins, Gene Transfer Vectors fór Mammalian Cells, 85-93. old, szerk, Miller, □, és Calos M, , Cold Spring Harbor (1987)], □óllehet ezámos fehérje extenziv poszttranszlációs módosításon megy keresztül a glikozilezés, stb, következtében, ami fontos lehet a funkció szempontjából, az AalT fehérje csak egyetlen poszttranszlációs processzálási lépésen megy keresztül, azaz a szignál-peptid lehasitásán a preprotein formáról. Amint azt az előzőkben bemutattuk, az emlős szignál-peptidek szignál-szekvenciái, főleg a kritikus hasítási zóna konformációját illetően majdnem univerzálisak a teljes szerkezetre és funkcióra vonatkoztatva [von Heijne, i,m.], Továbbá nincs különösebb homológia a szignál-szekvencia hasitási helyében egy adott szervezet különböző szekréciós fehérjéinél. Az nyilvánvaló, hogy a szignál-peptidek preproteinekről való hasításának funkciója • · k · « • · ·«· «

• · • · ·· közel univerzális funkció és nem gazdasejt specifikus. Tehát a pre-AalT szignál-szekvenciájának a helyes lehasitását majdnem bármelyik emlős gazdasejtben elérhetjük.

Mások kimutatták a helyes szignál-szekvencia hasítást a nem-nativ szekréciós fehérjékről számos sejtvonalban, Tanaguchi és munkatársai például leírják a szignál-peptid helyes lehasitását humán interleukin-2-ről tenyésztett majom-sejtekben [Natúré, 304, 305-310 (1983)]. Tehát az AalT preprotein formája megfelelően módosul poszttranszlációsan más közismert emlős sejtekben, például a Hela Av12, 3T3, BHK és 293 sejtekben.

Az AalT mellett az A.australis skorpió nyers mérge tartalmaz még három egértoxint (AaMT). Ezek közül az egyik, az AaMT₁ és az AalT azonos helyzetű három diszulfid híddal rendelkezik a létező négy közül [Zlotkin, E. Insect S₉lective Toxins Derived from Scorpion venoms, Insect Biochemistry, 13, 219-238 (1983)]. Úgy vélik, hogy a negyedik diszulfid hid lokalizációjában lévő különbség az AalT molekulában kritikus lehet az AalT neurotoxikus szelektivitására [i.m], Ennélfogva fontos volt azt igazolni, hogy a pMSV-IT által transzformált 3T3 sejtek (DC-1 ) által termelt AalT szelektíven toxikus a rovarokra és ártalmatlan az emlősökre.

Az egérben végzett toxicitásvizsgálatot a legmagasabb koncentrációjú (300x) tenyészlé koncentrátummal • · · végeztük, mind a pMSV-IT-3T3 sejtekből származó, mind a pMSV-vel transzformált 3T3 (DB-2) kontroll sejtek tenyészleve esetében. Az AalT mennyiségét a pMSV-IT-3T3 (DC-1) re becsüljük. Mindegyik koncentrátumból körülbelül 0,5 ml-t adunk intravénásán a csoportonként három ICR nőstény egérnek (Charles River Laboratörlés* Inc. 251 Ballardvale Street Wilmington, MA 01887). A vizsgálat állatoknak adott AalT

csülik. Mivel nincs hozzáférhető tisztított skorpió egértoxin, ezért pozitiv kontrollként az A.australisnak egy nyers méregpreparátumát (Sigma, P. 0, Box 14508, St. Louis, MO

63178) használjuk. l5-20_zug nyers mérget adunk mindegyik e gérnek. A dózis körülbelül megfelelt az irodalomban leirt x LD_5Q-nek [Zlotkin et al., Biochimie, 53, 1073-1078 (1971)] Pusztulás és toxicitási jelek figyelhetők meg (például hipoaktivitás, letargia, kómás állapot, első láb bénulása, remegés, hasmenés és egyéb jelek) figyelhetők meg óránként a beadás napján és naponta két hétig. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók. A megfigyelési periódus végén mindazok az egerek, amelyeket vagy a pMSV-IT-3T3 (DC-1), vagy a pMSV-3T3 (DB-2) sejtvonal tenyészlevének 300x-szoros koncentrátumával injektáltunk, egészségesek maradtak, és nem mutattak toxicitási jeleket. Azok az állatok, amelyek skorpió-mérget kaptak, általában néhány órával az injekció után elpusztultak.

··♦· ·4«· 4 4·* • · « 4· Λ • ··* 4 · · «· • · · *··· ♦··· · ·· *·* r ···«· □óllehet vizsgálatunkban nem szerepelt tisztított egértoxin a párhuzamos kísérletekhez, közelitő összehasonlitSs tehető a Zlotkin és munkatársai által közölt eredményekkel [Zlotkin et al. , Biochimie, 53., 1073-1078 (1971 )1. Ők kimutatták, hogy a tisztított A.australis skorpió egértoxinok (AaMT₁, AaMTg és AaMT^) LD^g értéke 0,18 - 0,45^ug között változott egerenként. Ha a pMSV-IT (DC-1) sejtek által termelt AalT toxikus lenne az egerekre, akkor a vizsgálatainkban alkalmazott dózisnak (7-8/ug egér) klinikai szimptómákat kellett volna okoznia, ha nem pusztulást. Viszont nem volt toxicitásra utaló jel egyik egércsoportban sem a kéthetes megfigyelési periódus során. Ebből arra a következtetésre jutottunk, hogy a pMSV-IT-3T3 (DC-1) sejtek által szintetizált AalT úgy viselkedik mint a természetes AalT, a toxinnak ebből a két fontos aktivitásából következtethetően.

2, táblázat

Az rAalT toxicitása egérben vizsgálva⁸

Vegyület	Pusztulás	Toxicitás
(A) DC-1 tenyészléc (300x koncéntrátum)	0/3	0/3
(B) DB-2 tenyészlé (300x koncéntrátum)	0/3	0/3
(C) nyers méregd	3/3	3/

* ·««· ^a/ Három ICR nőstény egér vegyületenként

A megfigyelés ideje két hét az (A) és (B) csoportnál, egy nap a (C) csoportnál ^C// Az alkalmazott rAalT mennyisége kb.

0,3-0,4/ug/tes tsulygram

A Sigma-tól vásárolva. Az alkalmazott dózis kb.

/ug/ testsulygram.

Az alábbi példák tovább illusztrálják és leírják a találmányt. A találmány oltalmi körét az alábbi példák nem korlátozzák} a berendezések ée reagensek forrását csak tájékoztatásul adjuk meg, semmiképpen nem a találmány oltalmi körének korlátozására. Az aktuális eljárásnak mind a magyarázata mind leírása szerepel ott ahol szükséges.

1. példa

Az E, coli K12 BEl20l/pKC283 törzs liofilezett formában a Northern Régiónál Research Laboratory-tól szerezhető be (Peoris, Illionis 61604} letéti sorszám NRRL B-15830). A liofilezett port 10 ml LB táptalajt tartalmazó csövekbe tesszük (LB; 10 g Bacto-Tryptone, 5 g Bacto-Yeast Extráét, 10 g NaCL literenként} a pH-t 7,5-re állítjuk), majd két órán át 32 °C-on inkubáljuk, akkor a tenyészetekhez 50/ug/ml koncentrációban ampicillint adunk, majd éjszakán át 32 °C-on inkubáljuk.Az E. coli K12 BEl2l20l/pKC283 sejteket 32 °C-on tenyésztjük, mivel a sejtek a hőmérséklet-érzékeny cl represszor gént tartalmazzák a kromoszómális DNS-be integrá.... .... . , « ··· · · · · • · · ···· ···· ·· ··· · · •· ·

·«··

- 37 lódva, Ha olyan sejteket használunk ebben a plazmid-izolálási eljárásban, amelyek a vad-tipusu lambda pL represzszor gént tartalmazzák, vagy nem tartalmaznak lambda pL promotert, akkor az alábbi példákban ismertetett módón az inkubálás hőmérséklete 37 °C,

Az éjszakán ét növesztett tenyészet egy kis részét LB-agarlemezekre szőlésztjük (LB táptalaj 15 g/1 Bacto-agar), amelyek 50 ^ug/ml ampicillint tartalmaznak, igy kapunk izolált telepeket az E,coli K12 BEl2ö1/pKC283 törzsből, A kapott izolált telepet 10 ml olyan LB táptalajba oltjuk, amely 50^ug/ml ampicillint tartalmaz, majd éjszakán át 32 °C-on inkubáljuk erős rázatás közben, A 10 ml-es egynapos tenyészetet 500 ml-es LB táptalajba oltjuk, amely 50/ug/ml ampicillint tartalmaz, majd 32 °C-on addig inkubáljuk, amíg a tenyészet el nem éri a stacioner fázist,

A következő eljárást a Maniatis kézikönyvből adaptáltuk LMolecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)],

A sejteket centrifugálással nyerjük ki (4000 x g, 10 perc, 4 °C) majd a felüluszót slöntjük, A sejtüledéket 100 ml jéghideg STE:pufferben mossuk (0,1 mól NaCl; 10 mmól Tris-HCl; pH= 7,8; 1 mmól EDTA). Mosás után a sejtüledéket 10 ml 1-es oldatban szuszpendáljuk (50 mmól glükóz; 25 mmól Tris-HCl, pH=8,0; lOmmól EDTA), amely 5 mg/ml lizozimet tartalmaz, majd szobahőmérsékleten hagyjuk állni 10 percig.

• · φ · ··· φ · · * • · ···· ···· — ~ _φ • · ··· φφ • < « ····

Húsz ml 2-ss oldatot adunk (0,2 N NaOH és 1 % SDS) a lizozimmel kezelt sejtekhez, majd az oldatot forgatással enyhén megkeverjük. Az elegyet ezután 10 percig jégen inkubáljuk.

ml jéghideg 5 mólos kálium-acetátot adunk (pH=4,8) a lizált sejtkeverékhez, majd az oldatot forgatással megkeverjük. Az oldatot 10 percig jégen inkubáljuk. Az 5 mólos kálium-acetát oldatot úgy állítjuk elő, hogy 11,5 ml jégecetet adunk 28.5 ml vízhez és 60 ml 5 mólos kálium-acetáthoz; a kapott oldat 3 mólos káliumra nézve, 5 mólos acetátra nézve.

A lizált sejtkeveréket Beckman SW27 rotorban (vagy azzal ekvivalens rotorban) centrifugáljuk 20 000/perc fordulatszámmal 20 percig 4 °C-on. A kromoszómális DNS és a törmelék csapadékot képez a cső fenekén. Körülbelül 36 ml felüluszót lehet kinyerni, majd 0,6 térfogat izopropanolt adunk hozzá, összekeverjük, és a kapott oldatot szobahőmérsékleten hagyjuk állni 15 percig, A plazmid DNS-t centrifugálással nyerjük ki (12 000 x g, 30 perc, szobahőmérséklet). A felüluszót elöntjük, majd a DNS-csapadékot 70 %-os etanollal mossuk szobahőmérsékleten. Az etanolos mosófolyadékot elöntjük, majd az üledéket vákuum-száritóban szárítjuk. A csapadékot ezután 8 ml TE pufferben szuszpendáljuk (10 mmól Tris-HCl, pH=8.0; 1 mmól EDTA).

A DNS oldathoz nyolc gram CsCl-t adunk. Körülbelül 0,8 ml 10 mg/ml koncentrációjú vizes etidium-bromid oldatot adunk a CsCl-DNS oldat minden 10 ml-éhez. Az oldat végső sűrűsége körülbelül 1,55 g/ml, az etidium-bromid vég• · · • *

centrifuga-csőbe tesszük, teljesen feltöltjük paraffinolajjal, lezárjuk, majd 24 órán át 20 °C-on centrifugáljuk 45 000/perc fordulatszámmal. A centrifugálás után két DNS-csikot látunk napfényben. A cső kupakjának eltávolítása után az alsó DNS csikót eltávolítjuk //21 injekcióstüvel, amelyet a centrifugacső oldalába szúrunk.

Az etidium-bromidot néhányszor vizzel telitett

1-butanollal extrahálva eltávolítjuk. A CsCl-t dialízissel távolitjuk el TE pufferrel szemben. Puffereit fenollal majd kloroformmal végzett extrakciók után a DNS-t kicsapjuk, 70 %-os etanollal mossuk,majd megszárltjuk« Körülbelül 1mg pKC283 plazmidot kapunk, majd 4 °C-on TE pufferben tároljuk körülbelül 1 ^ug/^ul koncentrációban.A pKC283 plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között az

1. ábrán mutatjuk be.

2, példa

A pKC283PX plazmid előállítása

Az 1, példa szerint előállított lO^ul pKC283 plazmid DNS-t 20 ^ul 10 X közepes ionerősségü restrikciós pufferrel elegyítjük (500 mmól NaCl; 100 mmól MgC^i mmól DTT).majd 20_/U 1 1 mg/ml BSA-val, 5/ul PvuII restrikciós enzimet (kb. 50 egység, a Bethasda Research Laboratories (BRL) meghatározása szerint, amely cégtől az • · összes használt restrikciós enzimet vásároltuk) és 145 izet adunk hozzá, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át °C-on inkubáljuk. Az alábbiakban leirt restrikciós enzimes reakciókat rutinszerűen fenolos majd kloroformos extrakcióval állítjuk le, ezt követi a DNS kicsapása, egy etanolos mosás, majd a DNS oldása TE pufferben. A PvuII emésztést a fentiek szerint leállítva a PvuII restrikciós enzimmel emésztett pKC283 plazmid DNS-t kicsapjuk, majd 5/ul TE pufferbsn szuszpendáljuk.

Körülbelül 600 pikomól Xhol linkért rsakcióelegyben: lO.ul 5 x kinéz puffer (300 mmól TREIS-HC1, pH=7,8j 50 mmól MgCl₂í 25 mmól DTT), 5/ul 5 mmólos ATP, 24 /ul víz, 0,5 /ul polinukleotid-kináz (körülbelül 2,5 egység a P-L Biochemicals meghatározása szerint), 5,ul percig 37 °C-on inkubáljuk.

A kinázolt Xhol linkerekből körülbelül 12,5

PvuII restrikciós enzimmel emésztett adunk az 5

x ligáz puffért (300 mmól TRIS-CH1, pH=7,6; 100 mmól

gyet 4 °C-on inkubáljuk éjszakán át. A. ligálási reakció után a reakcióelegy koncentrációját úgy változtatjuk meg, hogy öszetétele megfeleljen a magas sótartalmú pufferének (0,1 mól NaCl; 0,05 mól TRIS-HC1, pH=7,5; 10 mmól MgClg és 1 mmól DTT). Körülbelül lO^ul (100 egység) Xhol restrikciós enzimet adunk a reakcióelegyhez , majd az elegyet 37 °Con inkubáljuk 2 órán át.

A reakciót leállítjuk, majd az Xhol restrikciós enzimmel emésztett DNS-t kicsapjuk, visszaoldjuk, majd a fentiek szerint ligáijuk, azzal a kivétellel, hogy Xhol linkereket nem adunk a ligáló elegyhez, A ligáit DNS a keresett pKC283PX plazmid. A pKC283PX plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 2. ábrán mutatjuk be.

3. ábra

Az E, coli K12 MO (lambda⁺)/pKC183PX törzs előállítása

Az E.coli K12 M0(lambda⁺) törzset a Northern

Régiónál Research Laboratories-tól szerezhetjük be NRRL B-15993 sorszám alatt. Az E. coli K12 M0(lambda⁺) tartalmazza a vadtipusu lambda cl represszor gént, ezáltal a találmány szerinti hibrid pL-lpp promoterről nincs transzkripció az E.coli K12 M0(lambda⁺) sejtekben. A liofilezett sejteket felélesztjük, az M0(lambda⁺) sejtek izolált telepeit izoláljuk, majd egy 10 ml-es éjszakán át növesztett M0(lambda⁺) tenyészetet állitunk elő lényegében az 1. példában leírtak szerint, azzal a különbséggé, hogy az inkubálás • · hőmérséklete 37 °C, és a táptalajba nem teszünk ampicillint.

Az éjszakán át növesztett tenyészetből 50 használunk 5 ml LB-táptalaj beoltására, amelymég 10 mmól MgSO^-et és 10 mmól MgCl₂-t tartalmaz, A hígított tenyészetet 37 °C-on inkubáljuk erős rázatás közben, amíg az 550 nm-en mért abszorbancia (Α^^θ) körülbelül 0,5 lesz, ami körülbelül 1 x 10 sejt/ml sejtsürüséget jelent, A tenyészetet 10 percre jeges vízbe hütjük, majd a sejteket lecentrifugáljuk (4000 x g, 10 perc, 4 °C). A sejteket 100 ml hideg 10 mmólos MgS0₄-ben szuszpendáljuk, majd azonnal újra lecentrifugáljuk. A sejt-üledéket 100 ml 30 mmólos CaCl₂“ben szuszpendáljuk, majd jégen tartjuk 20 percig.

Ezután újra lecentrifugáljuk a sejteket, és ml 30 mmólos CaCl₂-ben szuszpendáljuk. A sejtek egy ml-es alikvot részét adjuk a 2. példa szerint előállított ligáit DNS preparátumhoz} a DNS oldatban 30 mmól CaCl₂ koncentrációt állítunk be. A sejt-DNS keveréket egy órán át inkubáljuk jégen, hősokkoljuk 42 °C-on 90 másodpercig, majd újra jégbehűtjük két percre. A sejt-DNS keveréket 125 ml-es lombikban lévő 10 ml LB táptalajba higitjuk, majd 37 °C-on inkubáljuk egy órán ét. lOO^ul-es alikvot részeket veszünk ki és ampicillin-tartalmu LB-agarlemezekre szőlésztjük, majd addig inkubáljuk 37 °C-on, amig telepek jelennek meg.

« • · β · r • · · · ·

- 43 A telepeket külön-külön tenyésztjük, majd az egyes telepekből származó plazmid DNS-t restrikciós enzimes emésztéssel és gélelektrofarézissel vizsgáljuk, A plazmid DNS izolálását kisebb mennyiségben az 1. példában leirt módszerrel végezzük, de a CsCl'tkihagy juk, amíg a keresett

E.coli K12 MO(lambda⁺)pKC283PX transzformánsokat azonosítjuk. A pKC283PX plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 2. ábrán mutatjuk be,

4. példa

Az E.coli K12 MO(lambda*)/pKC283-L törzs előállítása

TiZ/ug, az 1, példa szerint előállított pKC283PX plazmid DNS-t oldunk 20^υ1 10 x magas sótartalmú pufferben, hozzáadunk 2O/ul 1 mg/ml BSA-t, 5^ul (kb, 50 egység) BglII restrikciós enzimet, 5/ul (kb. 50 egység) Xhol restrikciós enzimet, majd 150/ul vizet, és a kapott reakcióelegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk, A reakciót leállítjuk, majd a BglII-XhoI restrikciós enzimekkel emésztett DNS kicsapása után a DNS-t 5^ul TE pufferben oldjuk.

Egy BglII és Xhol restrikciós enzim hasitási helyre jellemző egyszálu végekkel rendelkező DNS linkért szintetizálunk és kinázolunk. A linkért lényegében a 2. példában leirt eljárás szerint kinázoljuk, A DNS linker szerkezete a következő:

········« · • · · · • · · e · · ·» • ♦ ········ • · · · · · ·

- 44 5 '-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3'

I I | II II I H I I III III

3'-ATAAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5'

A fenti linkért egyszálu dezoxi-oligonukleotídokból szintetizáljuk az irodalomból jól ismert módon. Az egyszálu dezoxi-oligonukleotidokat a kereskedelemben kapható berendezéssel szintetizáljuk, például az Applied Biosystems által forgalmazott 380A DNA Synthesizer-rel (Lincoln Centre űrivé. Fos tér City, CA 94404), amely foszforamidit kémiát alkalmaz. Más módszerek is ismertek az irodalomban a DNS szintézisére, A konvencionális módosított foszfo,.triésztér módszert egyszálu DNS szintézisére Itakura és munkatársai Írják le ESciencs, 198, 1056 (1977)], valamint Crea és munkatársai EProc. Natl, Acad, Sci, USA 75, 5765 (1978)]. Emellett egy különösen előnyös DNS-szintézis módszert írnak le Hsiung és munkatársai ENuclei Acid Research, 22, 3227 (1983)]. valamint Narang és munkatársai EMethods in Enzymology, 68, 90 (1980)],

A linksrt és a BglII-Xhol restrikciós enzimekkel emésztett pKC283PX plazmidot lényegében a 2, példában leirt eljárás szerint ligáljuk. A ligáit DNS a keresett pKC283-L plazmid, A pKC283-L plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 3. ábrán mutatjuk be, A pKC283-L plazmidot használjuk E.coli K12 (M0(lambda⁺) sejtek transzformálására, és a keletkező K12 M0(lambda⁺)/pKC283-L transz········· · ·· • · · · · · «······· « • · ····«···· » ·* · · · · · ·»· β formálására, és a keletkező K12 MO(lambda⁺)/pKC283-L transzformánsokat lényegében a 3, példában leírtak szerint azonosítjuk.

⁵« P^éJ-^da

Az Ec.coli K12 MO(lambda⁺)/pl<C283-LB törzs előállítása

Körülbelül lO^ug, az 1. példa ezerint előállított pKC283-L plazmid-DNS-t oldunk 2O^ul 10 x magas sótartalmú pufferben, hozzáadunk 20/ul 1 mg/ml BSA-t, 5/ul (kb. 50 egység) Xhol restrikciós enzimet és 155^ul vizet, majd a kapott reakcióelegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk. Az Xhol restrikciós enzimmel emésztett pKC283-L DNS-t kicsapjuk a reakcióelegybői három térfogat 95 %-os alkohol és egytized térfogat 3 mól nátrium-acetát hozzáadásával, olymódon, hogy az elegyet öt percig szárazjég-etanol elegyben inkubáljuk öt percig, majd lecentrifugáljuk. A kapott DNS-csapadékot 70 %-os etanollal mossuk, szárítjuk, majd 2^ul 10 X nick-transzlációs pufferben oldjuk (0,5 mól TRIS-HC1, pH=7,2j 0,1 mól MgS0₄» 1 mmól DTT), hozzáadunk mindegyik dezoxinukleotid-trifogzfát 2 mmólos oldatából 1/ul-t, 15/ul vizet, 1/ul (kb. 6 egység a P-L Biochemicals meghatározása szerint) Klenow enzimet, ami az E.coli DNS polimeráz I nagy fragmentje, valamint 1/ul 1mg/ml BSA-t, A kapott reakcióelegyet 30 percig 25 °C-on inkubáljuk, a reakciót az elegyet öt percre 70 °C-ra melegítve állitjuk le.

BamHI linkereket (5'-CGGGATCCCG-3*) kináZozunk és az Xhol restrikciós enzimmel emésztett, Klenow enzimmel kezelt pKC283-L plazmid DNS-hez ligáljuk, lényegében a 2. példában leirt eljárással. A ligálási reakció után a DNS-t körülbelül 100 egység BamHI restrikciós enzimmel emésztjük 2 órán át 37 °C-on magas sótartalmú pufferben. A BamHI-es emésztés után a DNS-t ligáláshoz készítjük elő, lényegében a 2, példában leírt eljárás szerint.

A kb, 5,9 kb méretű BamHI restrikciós fragmentet ligáláesal cirkularizáljuk, majd E.coli K12 MO(lambda⁺) sejtekbe transzformáljuk, lényegében a 2, ée 3. példákban közölt eljárások szerint. Az E.coli K12 MO(lambda⁺)/ pKC283-LB transzformánsokat azonosítjuk, majd a pKC283-LB plazmid-DNS-t lényegében az 1, példában leirt eljárás szerint állítjuk elő, A pKC283-LB plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 4, ábrán mutatjuk be.

6, példa

Az E.coli K12 M0(lambda⁺)/pL32 törzs előállítása tűnk Sáli restrikciós enzimmel magas sótartalmú pufferben, Klenow enzimmel kezeljük, majd EcoRI linkerekhez (5*-GAGGAATTCCTC-3*) ligáljuk, lényegében az 5, példa alapján, azzal a különbséggel, hogy más a kiindulási plazmid,

* · • · ·· a használt restrikciós enzim és linker, EcoRI restrik ciós enzimmel való emésztés után, amelynek eredménye egy kb, 2,1 kb méretű DNS kihasadása, a kb, 4,0 kb méretű

EcoRI restrikciós fragmentet ligálással cirkularizáljuk , igy kapjuk a pKC283PRS plazmidot, A ligáit DNS-t használjuk az E,coli K12 M0(lambda⁺) sejtek transzformálására, lényegében a 3, példában leirt eljárás szerint. Az E.coli K12 M0(lambda⁺)/pKC283PRS transzformánsok azonosítása után a pKC283PRS plazmid DNS-t izoláljuk, lényegében az 1. példában leirt eljárás szerint. A pKC283P RS plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között az 5.

ábrán mutatjuk be.

Körülbelül 1 O^ug pKC283PRS plazmidot emésztünk 200/ul magas sótartalmú pufferben kb 50-50 egység PstI és Sphl restrikciós enzimmel. A reakcióelegyet 2 órán át 37°C on inkubáljuk, majd 0,6 %-os alacsony olvadásppntu agaróz-gélen (FMG Corporation, Marina Colloids Division, Rockland, Maine 04841) elektroforetizáljuk 2-3 órán át kb, 130 V és mA mellett TRIS-acetát pufferben.

A gélt híg etidium-bromid oldatban festjük, majd a kb, 0,85 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentet tartalmazó DNS-csikot, amely hosszuhullámu UV fényben látható, kivágjuk a gélből egy kis géldarabban, A géldarab térfogatát a súlya és sűrűsége alapján határozzuk meg, és azonos térfogatú 10 mmól TRIS-HC1 (pH=7,6) oldatot adunk a géldarabot tartalmazó kémcsőhöz. Ezután a géldarabot 72°C-os • · ·· · ·· • ·· · inkubálással megolvasztjuk, A pKC283PRS plazmid kb, 0,85 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentjéből körülbelül

1/ug-ot kapunk 100 fogatban, A_nalóg módon a pKC283-LB plazmidot is Pstl-Sphl restrikciós enzimmel emésztjük, és a kapott kb, 3,0 kb méretű restrikciós fragmentet agaróz gélelektroforézissel izoláljuk, majd ligáláshoz előkészít jük.

A pKC283PRS plazmid kb. 0,85 kb méretű Pstl

-Sphl restrikciós fragmentjét a pKC283-LB plazmid kb, 3, 0 kb méretű Pstl-Sphl restrikciós fragmentjéhez ligáijuk, lényegében a 2, példában leirt eljárás szerint, A ligáit DNS a keresett pL32 plazmid, A pL32 plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 6, ábrán mutatjuk be. A pL32 plazmidot E.coli K12 M0(lambda⁺) sejtekbe transzformáljuk, lényegében a 3, példában leirt eljárással, A pL32 plazmid DNS-t az E.coli K12 M0(lambda⁺)/pL32 transzformánsokból az 1. példában közölt eljárás szerint izoláljuk. A pL32 plazmid DNS elemzése azt mutatja, hogy több mint egy EcoRI linker kapcsolódott a Klenow enzimmel kezelt, Sáli végű pKC283PX plazmidhoz, A több mint egy EcoRI linker jelenléte nem érinti a pL323 plazmid, vagy a pL32 plazmid származékok használhatóságát, és egy Xhol restrikciós hely meglétével igazolható, ami akkor keletkezik, ha több mint-egy EcoRI linker ligálódik egymás mellé. Egy másik módszer szerint a pL32 plazmidot úgy állíthatjuk elő.

• · · · ··· ····· • ·· • ··« ·· • · ··«· •· ··· · ·· ·· ·

- 49hogy elvégezzük a Sall-EcoRI kivágást, valamint ennek a példának első pontja szerint a ligálást a pKC283-LB plazmidőn.

7. példa

Az E.coli K12 MOdambda⁴')/pL47 plazmid előállítása

Az E.coli K12 RV308/pNM789 törzset a Northern Régiónál Research Laboratories-től lehat beszerezni liofilezett formában, NRRL B-18216 letéti sorszám alatt. A pNM789 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között a 7. ábrán mutatjuk be. A plazmid DNS-t lényegében az 1, példában leírtak szerint izoláljuk a tenyészetből, azzal az eltéréssel, hogy az inkubálás hőmérséklete 37 °C. Tiz mikrogram pNM789 plazmid DNS_t szuszpendálunk 200/ul PvuII puffarben (50 mmól TRIS-HC1 (pH=7,5), 69 mmól NaCl, 6 mmól MgCl₂). Egy egység PvuII enzimet adunk hozzá, és a reakcióelegyet 5 percig 37 °-on inkubáljuk. Az enzimet úgy inaktiváljuk, hogy a reakcióelegyet 10 percre 65 °C-ra melegítjük. 30/ul

X BamHI puffért (200 mmól TRIS-HC1 (pH=8,0), 1 mól NaCl, 70 mmól MgCl₂), 70^υ1 vizet és 10 egység BamHI restrikciós enzimet adunk hozzá,majd a reakcióelegyet 1 órán át 37 °Con tartjuk. Ezt követően 5 egység alkalikus foszfatázt adunk hozzá, majd 1 órán át 65 °C-on tartjuk. A DNS fragmenteket 1 százalékos agaróz gélen választjuk szét, majd « · · · · · ······«· · • · ········· · ·· ··· · · ··«· azt a DNS fragmentet izoláljuk, amelynek a mérete megfelel az egyszeresen hasított fragmentnek.

DNS linkért szintetizálunk, amelynek az egyik vége tompa, a másik BamHI vég, lényegében a 4. példában szereplő leírás szerint. Ennek a linkernek (a 3. ábrán látható) a szerkezete az alábbi:

5'-CTGTGCCTTCTAG-3*

3'-GACACGGAAGATCCTAG-5·

A linkért kinázoljuk, majd a BamHI-PvuII restrikciós enzimekkel emésztett pNM789 plazmidba ligáljuk, lényegében a 2. példában szereplő leirás szerint. Ezt a ligáló elegyet használjuk E.coli K12 RV308 sejtek transzformálására, majd ezekből a 3. példában szereplő leirás szerint izoláljuk. Számos plazmidot szelektálunk, amelyek tartalmazzák a megfelelő méretű PvuII fragmentet (494 bp) és Xbal-BamHI fragmentet (628 bp). Ezek közül legalább kettőnek meghatározzuk a szekvenciáját a szekvenciáját a szekvenálást a BamHI helytől az egyetlen Smal hely irányába végezve, majd egy, a kivánt szekvenciával rendelkező kiónt választunk. Ez a közbenső plazmid a 120-as plazmid. Ennek az eljárásnak a sematikus vázlatát, valamint a 120-as plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt rajzok között a 8. ábrán mutatjuk be.

···· ···♦ s · ·· « · · * · · ♦··#·· 4· * • ♦ 4 ··**·*«· · ·· ·«* · · ··« ·

Az EK-BGH-t kódoló DNS izolálására körülbelül

pufferben, amely kb 50-50 egység Xbal-BamHI enzimet tartalmaz, Az emésztési termékeket agaróz gélelektroforézissel választjuk el, és a kb, 0,6 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentet izoláljuk és készítjük elő ligálásra - amely az EK-BGH-t kódolja - lényegében a 6, példában leírt eljá rás szerint.

A pL32 plazmidot is megemésztjük Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel, majd a kb, 3,9 kb méretű restrikciós fragmentet izoláljuk és készítjük elő ligálásra, A pL32 plazmid kb, 3,9 kb méretű resVikciós fragmentjét a 120-as plazmid kb 0,6 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentjéhsz ligáljuk, lényegében a 2, példában Isirt eljárás szerint, igy kapjuk a pL47 plazmidot, A pL47 plazmid restrikciós és funkcionális térképét>mellékelt rajzok között a 9, ábrán mutatjuk be. A pL47 plazmidot E.coli K12 M0(lambda⁺) sejtekbe transzformáljuk.lényegében a 3, példában eljárás szerint, és az E.coli K12 M0(lambda⁺)/pL47 transzformánsokat azonositjuk, A pL47 plazmid DNS-t a transzformánsokból lényegében az 1,példa szerinti eljárással izoláljuk.

8, példa

A PBR322-IT plazmid előállítása

Az AaIT-t kódoló szintetikus gént az And_roctonus australis skorpió inszekticid hatású neurotoxinjának ö ·

aminosav szekvenciája alapján EZlotkin, E. Insect Selective Toxins Derived from Scorpion venoms, Insect Biochemistry, ,13., 219-236 (1983)] állítottuk elő a szakmában ismert módszerekkel. A DNS-fragment tartalmazza az AalT +1 - +69 aminosavait kódoló anyagot, amelynek a pozitív szála a következő szekvenciával rendelkezik:

5*-GAT CCAAATAATG AAAAAAAACG GCTACGCTGT TGACTCTTCT GGCAAAGCTC CGGAATGCCT GCTGTCTAAC TACTGCAACA ACCAGTGCAC TAAAGTTCAT TACGCTGACA AAGGCTACTG CTGCCTGCTG TCCTGCTACT GCTTCGGCCT TAACGACGAC AAAAAAGTTC TGGAAATCTC TGACACTCGT AAATCTTACT GCGACACTAC TATCAACTAA TAG-3*

A szintetikus AalT gén tartalmaz felismerési helyeket a BamHI restrikciós endonukleáz számára mind az 5*, mind a 3* végen, hogy ezzel megkönnyítsük megfelelő beépülését a pBR322 plazmidba. A pBR322 plazmidot (New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915) BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük. T4 polinukleotid kinázzal (Pharmacia-LKB Biotechnology, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NO 08854) való foszforilezés után a szintetikus AalT gént BamHI restrikciós enzimmel emésztett pBR322 plazmidba klónozzuk, igy állítjuk elő a pBR322-lT plazmidot, lényegében a 3, példában közölt eljárás szerint.

···· ···· * 9 ·· • · · · · · • a·· « * · « · • · · ···· ···· · s· ♦·» « f> «·«·

9. példa

A pRB-IT plazmid előállítása

Ahhoz, hogy humán interleukin-2· szignál peptidjét kódoló DNS szekvenciát közvetlenül az AalT gén elé építsük megfelelő leolvasási fázisban, az AalT +8 -9-es aminosavainak megfelelő pozícióban lévő HinF1 restrikciós endonukleáz hasítási helyét használjuk az A szintetikus DNS szekvencia kapcsolásához. Az A DNS szekvencia a humán interleukin-2 szignál-peptidje -20 - -1-es aminosavait kódoló, valamint az AalT első nyolc aminosavát kódoló oligonukleotid, pozitív szálának szekvenciája az alábbi:

GAT	CTA	TAA	ATA	ATG	TAC	AGG	ATG	CAA	CTC
CTG	TCT	TGC	ATT	GCA	CTA	AGT	CTT	GCA	CTT
GTC	ACA	AAC	AGT	AAA	AAA AAC GGC TAC	: gct

GTT G

Az A DNS szakasz BglII és HinF1 felismerési helyet tartalmaz az 5' illetve a 3* végén, szintézise ismert módszerekkel történik EBrown, E,L,, Belagaje, R, , Ryan, M.O, and Khorana, H.G. : Methods in Enzymology, 68, 109-151 (1979); szerk. Wu, R., Academic Press, NY], a teljes leírásra hivatkozunk a továbbiakban.

Körülbelül lO^ul, a fentiek szerint előállított pBR322-IT plazmidot elegyítünk 20/ul 10 X magas sótartáLmu ·· • · ·♦·· • · * ··· f · · «· *·· restrikciós pufferral (2, példa), 20/ul 1 mg/ml BSA-t adunk hozzá, 5/ul BamHI-et, 5^ul HinF1-et és végül 75/ul vizet. A reakcióelegyet 2 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A BamHI restrikciós enzimmel emésztett DNS-t ezután kicsapjuk etanollal és 3 mólos NaŰAc-tal, majd elektroforézissel tisztítjuk 1 %-os alacsony olvadáspontu agaróz gélen. A kisebb fragmentet kivágjuk a gélből, és a DNS-t Elutip-d oszlop módszerrel izoláljuk (Schleicher and Schuell, Keene, N.H.) Kicsapás és centrifugálás után a DNS-fragmentet 1O_/Ul X HinF1 restrikciós pufferben oldjuk (1 mól NaCl, 60 mmól TRIS-HC1 pH=7,4, 60 mmól MgCl₂, 60 mmól 2-merkapto-etanol, 1O^ul 1 mg/ml BSA). A HinF1 - BamHI szekvenciát (B szakasz) elektroforézissel választjuk el 1 %-os alacsony olvadáspontu agaróz gélen, A nagyobb fragmentet, amely megfelel a B szakasznak, kivágjuk a gélből és az Elutip-d módszerrel tisztítjuk. Kicsapás és szárítás után a DNS-t 20/ul 10 mmólos TRlS-HCl-ben tároljuk (pH=8,0).

A B DNS szakasz az AalT +9 - +69 aminosavait kódolja, pozitív szálának szekvenciája az alábbi:

	AC	TCT	TCT	GGC	AAA	GCT	CCG	GAA	TGC
CTG	CTG	TCT	AAC	TAC	TGC	AAC	AAC	CAG	TGC
ACT	AAA	GTT	CAT	TAC	GCT	GAC	AAA	GGC	TAC
TGC	TGC	CTG	CTG	TCT	TGC	TAC	TGC	TTC	GGC
CTG	AAC	GAC	GAC	AAA	AAA	GTT	CTG	GAA	ATC
TCT	GAC	ACT	CGT	AAA	TCT	TAC	TGC	GAC	ACT
ACT	ATC	AAC	TAA	TAG

« · · ·

4444 ···· ·

• ··*

9 4 • 4 *·· «4 * ·

4444

Az A és B szakaszt ha megfelelően összeligáljuk a HinF1 helynél, akkor egy kiméra gén keletkezik, az SP-IT, amely a humán interleukin-2 szignál-peptidjének -1 - -20-as aminosavait kódolja, valamint az AalT +1 - +69-es aminosavait, az 5‘ végén BglII helyet, a 3* végén BamHI helyet tartalmaz, A hibrid SP-IT gén pozitív száljának szekvenciája az alábbi:

GAT	CTA	TAA	ATA	ATG Met	TAC Tyr	AGG Arg	ATG Met	CAA Gin	CTC Leu
CTG	TCT	TGC	ATT	GCA	CTA	AGT	CTT	GCA	CTT
Leu	Ser	Lys	He	Alá	Leu	Ser	Leu	Alá	Leu
GTC	ACA	AAC	AGT	AAA	AAA	AAC	GGC	TAC	GCT
Val	Thr	Asn	Ser	Lys	Lys	Asn	Gly	Tyr	Alá
GTT	GAC	TCT	TCT	GGC	AAA	GCT	CCG	GAA	TGC
Val	Asp	Ser	Ser	Gly	Lys	Alá	Pro	Glu	Cys
CTG	CTG	TCT	AAC	TAC	TGC	AAC	AAC	CAG	TGC
Leu	Leu	Ser	Asn	Tyr	Cys	Asn	Asn	Gin	Cys
ACT	AAA	GTT	CAT	TAC	GCT	GAC	AAA	GGC	TAC
Thr	Lys	Val	His	Tyr	Alá	Asp	Lys	Gly	Tyr
TCG	TGC	CTG	CTG	TCT	TGC	TAC	TGC	TTC	GGC
Cys	Cys	Leu	Leu	Ser	Cys	Tyr	Cys	Phe	Gly
CTG	AAC	GAC	GAC	AAA	AAA	GTT	CTG	GAA	ATC
Leu	Asn	Asp	Asp	Lys	Lys	Val	Leu	Glu	Ile
TCT	GAC	ACT	CGT	AAA	TCT	TAC	TGC	GAC	ACT
Ser	Asp	Thr	Arg	Lys	Ser	Tyr	Cys	Asp	Thr
ACT	ATC	AAC	TAA	TAG	- 3'
Thr	He	Asn	*	*

A 7, példában előállított pL47 plazmidból

10/ul-t elegyítünk 20/ul közepes sótartalmú pufferrel,

20/ul 1 mg/ml BSA-t adunk hozzá, majd 10-10 egység BglII és BamHI restrikciós enzimet és annyi vizet, hogy a vég térfogat 200 /ul legyen. Az elegyet két órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd a DNS-t 1 ml etanollal és 20/ul 3 mólos NaOAc-cal kicsapjuk. A DNS-t elektroforézissel tisztít juk , 1 %-os alacsony olvadáspontu agaróz gélen. A nagyobb fragmentet kivágjuk a gélből, és a DNS-t az Elutip-d el járással nyerjük ki. Kicsapjuk és száritás után a DNS csapadékot 70 ^ul 10 X CIAP pufferben oldjuk (50 mmól TRIS-HC1 pH=8,0, 10 mmól MgCl₂» 1 mmól ZnCl₂), hozzáadunk 85 /ul vizet és 5 ^ul borjubél alkalikus foszfatázt (Boehringer-Mannheim Biochemicals, P. 0, Box 50414, Indianapolis, IN 46250), A reákcióelegyet 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd 100/ul fenol/kloroform eleggyel (1:1, v/v) extraháljuk. A DNS-t kicsapjuk, úgy .hogy a reáccióelegyben 0,3 mól NaŰAc koncentrációt állitunk be, hozzáadunk 3 térfogat etanolt, összekeverjük, majd -70 °C-ra hűtjük és lecentrifuáljuk, A DNS csapadékot 20/ul 10 mmól TRIS-HC1 (pH=8,0). 1 mmól EDTA összetételű oldatban oldjuk, majd elektroforézissel tisztítjuk 1%-os alacsony olvadáspontu agaróz gélen. A DNS csikót kivágjuk a gélből és a DNS-t az Elutip-d eljárással tisztítjuk. Kicsapás és száritás után a DNS-t 20/ul TRIS-HC1 (pH=8,0) pufferben tároljuk. Ez a DNS a kb. 3,9 kb méretű BglII-BamHI fragmant, amely • · · megfelel a pL47 plazmid vektor-részének. Ezt a vektor DNS-t ligáljuk össze az A és B szakaszokkal, igy kapjuk a pRB-IT plazmidot. A plazmid transzfekcióját, amplifikálását és izolálását a 3, példában leirtak szerint végezzük. A pRB-IT plazmid restrikciós és funkciós térképét a 10, ábrán mutatjuk be a mellékelt rajzok között. Az SP-IT gén szekvenciáját a mellékelt rajzok között a 11, ábrán mutatjuk be.

10, példa

A pMSV-IT plazmid előállítása

A pRB-IT plazmidot cézium-klorid - etidium-bromid egyensúlyi sürüséggradiens centrifugálással izoláljuk, az 1. példában közöltek szecint.majd BglII és BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük a 10, példában leirtak szerint. Az SP-IT gént kódoló 285 bp méretű fragmentet agaróz gélelektroforézissel izoláljuk, majd kioldjuk a gél anyagából, A pMSV plazmidot (NRRL B-15929) E.coli K12 HB101 törzsben (NRRL B-15626) szaporítjuk el, majd lényegében a 3, példában leirt eljárás szerint izoláljuk.

A pMSV plazmidból körülbelül 1O^ul-t elegyítünk 20/ul 10 x közepes ionerősségü restrikciós pufferrel, hozzáadunk 20/ül 1 mg/ml BSA-t, 5 ^ul BglII restrikciós endonukleázt és 145 _zul vizet, majd két órán át 37 °C-on inkubáljuk. A restrikciós enzimes reakciót fenol/kloroform extrakcióval állitjuk. le. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd %-os etanollal mossuk és 5/ul TE pufferben oldjuk.

Körülbelül lO^ul linearizált SP-IT (285 bp) fragmentet adunk a BglII-vel emésztett pMSV plazmidhoz. Körülbelül 2,5 ^ul 10 x ligáz puffért, 2,5 ^ul lmg/ml BSA-t, 7/ul 5 mmólos ATP-t, 2,5 egység T4 DNS-ligázt,

2,5 /ul 10 mmólos spermidint és 5^ul vizet adunk a DNSslegyhez, és^r a reakcióelegyet éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk.

A pMSV plazmid és az SP-IT fúziójával előállított pMSV-IT plazmidot E.coli K12 HB101 plazmidba transzformáljuk (NRRL B-1526), a plazmidot elszaporitjuk, majd izoláljuk lényegében a 3, példában leírtak szerint. A pMSV-IT plazmid restrikciós és funkciós térképét a mellékelt rajzok között a 12. ábrán mutatjuk be.

11. példa

Az NIH/3T3 sejtek transzfakciója pMSV és pMSV-IT plazmidokkal

Körülbelül 0,5 x 10⁶ NIH/3T3 egér fibroblaszt sejtet (ATCC CCL92) szuszpendálunk 3 ml DMEM táptalajban, amely 10% borjumagzat szérumot (EF10) tartalmaz, majd 3,5 cmes szövettenyésztő csészébe tesszük. A tenyészeteket

nedvesített C02	inkubátorban tartjuk 37 °C-on éjszakán át.
10-10 /ul, CsCl pMSV és pMSV-IT	egyensúlyi sürüséggradiensen tisztított plazmidot oldunk kűlön-külön csövekben
450 /U1 HBS-ben	(20 mmól HEPES, 137 mmól NaCl, 5 mmól

• · · • · ········· · ·· ··· · · ·♦··

- 59 KC1, 0,7 mmól NagHPO^, 6 mmól glükóz, végső pH=7,0). Mindegyik csőhöz 3O/ul 2 mólos CaCl₂-ot adunk, ezzel 125 mmól CaCl₂ koncentrációt állitunk be, A csöveket ezután szobahőmérsékleten inkubáljuk 20-30 percig.

Miközben a DNS kicsapódik, az NIH/3T3 sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS)mossuk, amely 100 egység/ml penicillint és 1OO^ug/ml straptomicint tartalmaz, majd újra tápláljuk a sejteket 1 ml EF10 táptalajjal (Dulbecco minimál táptalaj + 10 % borjumagzat szérum), A DNS csapadékokat a sejttenyészethez adjuk. A lemezeket óvatosan mozgatjuk, hogy a DNS egyenletesen aloszoljon. A sejteket ezután 37 °C-on inkubáljuk 5 órán át C0₂ inkubátorban, A táptalaj eltávolítása után a sejteket egyszer mossuk PBS-sel, majd röviden kezeljük (45-60 másodperc) 25 %-os DMSO PBS-es oldatával. A DMSO sokk-kezelés után a sejteket egyszer mossuk PBS-sel, újra tápláljuk 2 ml EFlO-zel és vissza tesszük a C0₂ inkubátorba. A v-mos sál transzformált sejtek megjelenési formáját naponta ellenőrizzük mikroszkóposán. Amikor a v-mos-sal transzformált sejtek gócai megerősödnek és puszta szemmel is láthatók, akkor izoláljuk és 96 lukas mikrotiter lemezekre visszük át, hogy felerősítsük az egyes transzformált kiónokat. Amikor már egybefolynak, akkor tripszinnel kezeljük őket ée nagyobb tenyészetet csinálunk belőlük. Számos sejtvonalat hozunk • · ·

- 60 létre a pMSV-IT-vel transzformált NIH/3T3 sejtekből és a pMSV plazmiddal transzformált sejtekből.

Az RNS Northern biot analízisével azonosítjuk a magas AalT termelőképességü sejtvonalakat. Körülbelül 5 x 10⁵, 75-80 %-ig egybefolyóan nőtt sejtet használunk RNS készítésére. Az RNS preparátumokat NIH/3T3 DC-1 és DB-2 sejtekből készítjük a Chirgwin munkatársai által kifejlesztett guanidium-izotiocinátos módszerrel. Mindegyik mintából 20yU g RNS-t hőkezelünk glioxállal, és 1,25 ?-os formaldehid/agaróz gélra visszük. Elektroforézis után az RNS-t nitrocellulóz paprirra visszük át és a pRB-IT plazmidból izolált, az SP-IT szekvenciát tartalmazó 32

P-vel jelzett BglII-BamHI fragmenttel hibridizáljuk, A próbát nick-transzlációval jelöljük, BRL nick-transzlációs kittet használva. Az autoradiográfiát Kodak XAR-5 filmmel és Du-Pont Cronex erősítő fóliával végezzük.

Az ezekből a sejtekből származó citoplazmatikus RNS előzetes dot-blot hibridizációs vizsgálata azt mutatja, hogy mindegyik tartalmaz v-mos transzkriptumokat , mig csak a pMSV-IT-vsl transzformált sejtek expresszáltak AalT transzkriptumokat. A guanidium-izotiocinát eljárással izolált össz-RNS-t formaldehid/agaróz gélen elválasztjuk, nitrocellulóz papírra visszük át, és a kiméra SP-IT gént tartalmazó, ³²P-vel jelölt BglII-BamHI fragmenttel hibridizáljuk. A pMSV-IT-vel transzformált sejtekben az SP-IT • · • · · · • ··· · c · · • · ········ ·· ·«· · · szekvencia LTR-rel vezérelt, és az LTR R régiójában iniciált expressziója egy 5528 bázis méretű , genom-hosszuságu transzkriptumot eredményez. Amint várható, a pMSV-ITvel transzformált DC-1 és DC-1A sejtek egy 5,7 kilobázis hosszúságú, az AalT-vel hibridizálódó RNS transzkriptumot szintetizálnak. Ezzel ellentétben sem az NIH/3T3 sejtek, sem a kiindulási pMSV plazmiddal transzformált DB-2 sejtek nem termeltek olyan RNS transzkriptumot, amely az SP-IT próbához hibridizálódik.

Annak léellenőrzésére, hogy kiválasztódik-e aktiv rAalT a pMSV-IT-vel transzformált DC-1 sejtek táptalajába, amely sejtek a legmagasabb szinten szintetizálják az AalT-tartalmu transzkriptumot, valamint a pMSV-vel transzformált DB-2 sejtek tömeges tenyészetté nőttek (kb.

4-5 X 10 sejt mindegyik tenyészetben). Amikor a tenyészetek elérik a 75-80 %-os egybenövést, akkor a -normál, szérumtartalmu DME-t szérummentes DME-vel helyettesítjük. Huszonnégy órával később a kondicionált táptalajt kinyerjük, majd az eljárást még egyszer megismételjük. Az egyesített tápfolyadékokat kis sebességű centrifugálással megtisztítjuk a sejttörmelékektől, majd egy YM 10 membránszürővel ellátott Amicon koncentrátoron ultraszürjük. Alikvotokat veszünk amikor a tápfolyadék körülbelül 5-szörösre, 20-szorosra, 50-szeresre, 100-szorosra, 200-szorosra és 300-szorosra koncentrálódik, A koncentrátumokat közvetlenül hasz62 náljuk a toxicitási vizsgálatokra, rögtön a koncentrálási eljárás befejezése után.

12, példa

Moszkitó lárvaölő hatás vizsgálata

A szekrőtált toxin hatékonyságának vizsgálatára a szekretált toxint tartalmazó táptalajnak a moszkitó-lárva ölő hatását vizsgáljuk. Sárgaláz moszkitóknak (Aedes aegypti) vért adunk táplálékul, azután a tojásokat nedves papírtörülközőre tesszük. A tojásokat ezután keltetővizet tartalmazó tartályba tesszük, amelyet úgy állítunk elő, hogy egy liter steril desztillált-vizhez kismennyiségü (kevesebb mint 5 mg) élesztőt adunk, valamint finomra őrölt Purina laboratóriumi tápot. A tojások gyorsan (10-15 perc alatt) kikeltek. A lárvákat 5 mg finomra őrölt Purina labortáppal újra megetetjük a 2. napon. Körülbelül 3 nap elteltével a moszkitók elérik a második lárvaállapotot, ami ideális a teszteléshez.

Azonos térfogatú (50 mikroliter) keltetővizet, amely 10-15 lárvát tartalmaz, valamint a pMSV-IT-vel transzformált 3T3 (DC-1) sejtek szövettenyészet koncentrátumát 96 lukas mikrotiter lemezre tesszük. Ezt az 11. példában előállított tápfolyadék minden egyes koncentrátumával megismételjük, A pusztulást a táptalajjal való érintkezés után 2, 4 és 24 órával feljegyezzük. Az 1. táblázatban mutatjuk be a vizsgálat során kapott adatokat. A pMSV-vel transzformált • ·

- 63 ΝΙΗ/3Τ3 sejteket használjuk a pMSV-IT-vel transzformált (DB-1) sejtek kontrolljaként.

Az 1. táblázatban bemutatott adatokból nyilvánvaló, hogy a pMSV-IT-vel tranformált sejtek táptalaja rovartoxint tartalmaz, ami nem található meg a kontroll mintában. Az adatok azt is igazolják, hogy a rovartoxin hatása koncentráció-függő. Az adatok azt mutatják, hogy az SP-IT gént tartalmazó pMSV-IT plazmiddal transzformált NIH/3T3 sejtek hatásos rovartoxint szekretálnak a tápfolyadékba.

13. példa

Toxicitási vizsgálatok egérben

Annak igazolására, hogy a megfelelő toxin-gént izoláltuk , és a toxin nem toxikus emlősökre, egereket injekciózunk a pMSV-IT-vel transzformált 3T3 (DC-1) sejtek, valamint a pMSV-vel transzformált 3T3 (DB-2) sejtek tápfolyadékának koncentrátumával, valamint a nyers skorpio-méreggel (Sigma, P.0, Box 14508, St. Louis, MO 63178). A vizsgálatot a tápfolyadék 300-szoros koncentrátumával végezzük. A pMSV-IT-3T3 tápfolyadék 300-szoros koncentrátumában lévő AalT mennyiségét 15 ^ug/ml becsüljük. Az egyes koncentrátumokból körülbelül 0,5 ml-t adunk be intravénásán a 3-3 ICR nőstény egér mindegyikébe (Charles River Laboratories, Inc. 251 Ballardvale Street, Wilmington, MA 01887).

• ·

A beadó** AalT dózisa körülbelül 0,3-0,4 gramm/testsulygramm, A harmadik háromtagú egércsoportot 0,5 ml

zölt LDj-q értékének [Zlotkin et al, , Biochimie, 53, 1073-1078 (1971)], Az egereket óránként megfigyeljük az injekciózás napján, majd ezután két hétig naponta, hogy mutatják-e a toxicitáe jeleit, például a hipoaktivitáet, letargiát, kómás állapotot, első láb bénulását, reszketést és hasmenést.

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás hatékony, szekretálódó rovartoxin előállítására, rekombináns eukarióta gazdasejtben, azzal jellem ez ve , hogy

   A) az említett eukarióta gazdasejtet a következő szerkezetű rekombináns ONS klónozó vektorral trartszfektáljuk;

   i) replikációs origó vagy integrálódási szekvencia ii) az említett gazdasejtben működő promoter vagy transzlációs aktiváló szekvencia, iii) egy emlős szignál-peptidet kódoló DNS szekvencia , iv) egy rovartoxint kódoló DNS szekvencia, és

   v) szelektálható marker, majd

   B) az említett eukarióta gazdasejtet az említett hatékony rovartoxin expresszálására és szekretálására alkalmas körülmények között tenyésztjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az emlős szignál-peptidet kódoló DNS szekvenciát a következő csoportból választjuk: humán inzulin szignál-peptidet kódoló DNS-szekvencia, a patkány inzulin I szignál-peptidet kódoló DNS-szekvencia, a patkány inzulin II szignál-peptidet kódoló DNS-szekvencia, a patkány növekedési hormon szignál-peptidet kódoló DNS_szekvencia , a humán növekedési hormon szignál-peptidet kódoló DNS szekvencia, és a humán interlsukin-2 szignál-peptidet kódoló DNS_szekvencia,
3. 3, A 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az emlős szignál-peptidet kódoló DNS-szekvencia a humán interleukin-2 szignál-peptidet kódoló DNS-sze kvencia,
4. 4, Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti el járás, azzal jellemezve, hogy a rovartoxint kódoló DNS szekvenciát a következő csoportból választjuk: az AalT toxin gént kódoló DNS-szekvencia, a rovartoxin gén működőképes származékát kódoló DNS szekvencia, és a következő DNS szekvencia:

   AAA AAA AAC GGC TAC GCT GTT GAC TCT TCT GCG AAA GCT CCG GAA TGC CTG CTG TCT AAC TAC TGC AAC AAC CAG TGC ACT AAA GTT CAT TAC GCT GAC AAA GGC TAC TGC TGC CTG CTG TCT TGC TAC TGC TTC GGC CTG AAC GAC GAC AAA AAA GTT CTG GAA ATC TCT GAC ACT CGT AAA TCT TAC TGC GAC ACT ACT ATC AAC TAA TAG.
5. 5, A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett róvartoxin -gént kódoló DNS szekvencia az AalT rovartoxint kódoló DNS szekvencia,
6. 6, A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett rovartoxin gént kódoló DNS szekvencia az AalT rovartoxin funkcionális származékát kódoló DNS szekvencia.
7. 7, A 4, igénypont szerinti eljárás, azzal jelle mezve, hogy az említett DNS-szekvencia az alábbi:

   AAA AAA AAC TCT GCG AAA TCT AAC TAC AAA GTT CAT TGC TGC CTG GGC CTG AAC GAA ATC TCT TGC GAC ACT

   GGC TAC GCT GCT CCG GAA TGC AAC AAC TAC GCT GAC CTG TCT TGC GAC GAC AAA GAC ACT CGT ACT ATC AAC

   GTT GAC TCT TGC CTG CTG CAG TGC ACT AAA GGC TAC TAC TGC TTC AAA GTT CTG AAA TCT TAC TAA TAG.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eukarióta gazdasejtet a következő csoportból választjuk: AV12 sejtek, HeLa sejtek, BHK 21 sejtek, 293 sejtek és 3T3 sejtek.
9. 9. A 8, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eukarióta gazdasejt a 3T3 sejt.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett szelek_ciós markert az alábbi csoportból választjuk: a v-mos gént kódoló DNS-szekvsncia, a neomicin rezisztenciát kódoló DNS-szekvencia és a higromicin rezisztenciát kódoló DNS szekvencia.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett szelekciós marker a v-mos gént kódoló DNS-szekvencia.
12. 12. A 3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett rovartoxin gént kódoló DNS szekvencia az AalT rovartoxin gént kódoló DNS szekvencia.
13. 13. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,hogy az említett rovartoxin gént kódoló DNS szekvencia az AalT rovartoxin gén funkcionális származékát kódoló DNS szekvencia.
14. 14. A 3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett rovartoxin gént kódoló DNS szekvencia az alábbi:

    ··*· • · * ··*.

    • b ···

    AAA AAA AAC GGC TAC GCT GTT GAC TCT TCT GCG AAA GCT CCG GAA TGC CTG CTG TCT AAC TAC TGC AAC AAC CAG TGC ACT AAA GTT CAT TAC GCT GAC AAA GGC TAC TGC TGC CTG CTG TCT TGC TAC TGC TTC GGC CTG AAC GAC GAC AAA AAA GTT CTG GAA ATC TCT GAC ACT CGT AAA TCT TAC TGC GAC ACT ACT ATC AAC TAA TAG.
15. 15. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eukarióta gazdasejt a 3T3 sejt,
16. 16. A 13-15. igénypontok bármelyike szerinti eljá rás, azzal jellemezve, hogy az emlitett szelekciós marker a v-mos.
17. 17. A 13-16. igénypontok bármelyike szerinti eljá rás, azzal jellemezve, hogy az emlitett rekombináns vektor a pMSV-IT vektor.