JPH04207198A - 有用蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、医薬品などに有用な蛋白質をカイコを利用し
た遺伝子組換え法により効率良く生産する際に、カイコ
体液中に存在する蛋白質分解酵素ならびに多角体生産能
を欠如した遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスを不
活性化させる方法に関する。

［従来の技術］ 遺伝子操作技術の進歩により、ヒト・インターフェロン
α、ブタ・成長ホルモンなどの有用蛋白質が、遺伝子組
換えしたカイコ核多角体病ウィルスをカイコに接種して
増殖させ、カイコ体内に蓄積されたことが報告されてい
る。

しかしながら、カイコ体液中には蛋白質分解酵素が存在
することが知られており、従って体液抽出操作中もしく
は体液の保存中に目的とする蛋白質が分解されることが
考えられる。さらに、遺伝子組換え核多角体病ウィルス
をカイコに接種して増殖させて蛋白質を生産する方法で
は、カイコ体液中にはこのウィルスが存在するため、ウ
ィルスの封じ込めが必要となる。

［発明が解決しようとする課題］ そこで、カイコ抽出液中に存在する蛋白質分解酵素およ
び遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスの不活性化が
可能となれば、カイコを利用した有用蛋白質の量産の途
が開かれると期待される。

本発明は、カイコを用いた有用蛋白質の製造を効率良く
行ない、以って有用蛋白質を大量生産することを目的と
する。

［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる状況に鑑み、創意工夫をなし、抽
出したカイコ体液を酸性にすることにより、カイコ体液
中に存在する蛋白質分解酵素および多角体生産能を欠如
した遺伝子組換え核多角体病ウィルスを不活性化するこ
とに成功し、以って有用蛋白質をカイコを用いて大量に
製造する方法を確立し、かくして本発明を完成するに至
った。

すなわち本発明は、有用蛋白質をコードする遺伝子によ
り組換えられた組換えカイコ核多角体病ウィルスをカイ
コに接種して有用蛋白質を製造する際に、カイコ体液を
ｐＨ０，５〜３．０にすることを特徴とする有用蛋白質
の製造方法、ならびに遺伝子組換えウィルスの封じ込め
方法である。

以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。

本発明の有用蛋白質としては特に限定されないが、酸に
安定な蛋白質が好ましい。酸に安定な蛋白質としては種
々のものが報告され、今後も多（のものが報告されるで
あろうが、それらへの応用が可能である。例えば、酸に
安定な有用蛋白質として、ヒトインターフェロンβ、ネ
コインターフェロン（以下ＦｅＩＦＮと略す）、マウス
インターフェロンβなどのインターフェロン類などが挙
げられる。本発明では、特にＦｅＩＦＮが好ましく用い
られる。

遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスは、例えば次の
ようにして作製することができる。

すなわち、有用蛋白質をコードするＤＮＡの上流に核多
角体病ウィルス由来のプロモーター領域を含むＤＮＡ断
片、下流に終止シグナル以下のＤＮＡ断片を有する組換
えプラスミドと核多角体病ウィルスのＤＮＡとを、例え
ばＢＭ−Ｎ細胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染さ
せることによって、ｉｎ　　ｖｉｖｏ的に外来の有用蛋
白質をコードするＤＮＡのウィルスＤＮＡの組換えが起
こり、遺伝子組換えウィルスが作製される。このように
して作製された遺伝子組換え核多角体病ウィルスは、核
多角体病ウィルスの多角体蛋白の遺伝子領域に外来のＤ
ＮＡが置換または挿入されているため、多角体を生産す
ることができない。従って非組換え体ウィルスと容易に
区別できる。このような遺伝子組換え核多角体病ウィル
スとして、例えばＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮ
Ａが組換えられたｒＢＮＶｌｏｏを挙げることができる
。

ｒＢＮＶｌｏｏは、例えばＥ、ｃｏｌ　ｉ　　（ｐＦｅ
　Ｉ　ＦＮＩ）（微工研条寄第１６３３号）から抽出し
たプラスミドからＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮ
Ａを切り出して、カイコのクローニングベクター（文献
１）に連結して作製した組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウィルスＤＮＡとを、カイコ樹立細胞にコ・ト
ランスフェクションして作製することができる。

すなわち、微工研条寄第１６３３号の大腸菌形質転換体
から一般的な方法により抽出したプラスミドｐＦｅＩＦ
Ｎ１から、ＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部分
を、例えばｐ　ＢＭＯ３０（文献１）などのカイコのク
ローニングベクターの発現調節部分の下流に連結すると
いう一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを
作製することができる。この組換え体プラスミドとカイ
コ核多角体病ウィルスＤＮＡ　（文献１）とを、文献１
のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文
献１）にコ・トランスフェクションした後、培養を続け
、培養液中に出現した非組換え体（野生型）と組換え体
のウィルスの中から限界希釈法およびプラーク法などの
一般的な方法によって、組換え体ウィルスをクローニン
グすることができる。組換え体ウィルスは多角体の形成
能がないことから、野生型ウィルスと容易に区別できる
。

有用蛋白質の生産は、前記の組換えカイコ核多角体病ウ
ィルスをカイコ生体中で増殖させることにより行なう。

すなわち、前記の組換え体ウィルスを含む培養液をカイ
コ幼虫に接種（注射）して、クワの葉または人工飼料を
与えて飼育する。飼育後、カイコを開腹し、そこから得
られる液をカイコ体液とする。

カイコ体液を酸性にするには、カイコ体液に酸を加える
方法、酸中に体液を受ける方法、もしくは開腹したカイ
コをそのまま酸中に入れ撹拌する方法が可能である。こ
れらの操作は氷水浴中で行なうのが好ましいが、限定さ
れない。

使用する酸としては塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸、また
は蟻酸、酢酸などの有機酸を用いることができる。この
中でも塩酸が特に好ましく用いられる。

酸性の範囲はｐＨ０，５〜３．０とする。好ましいｐＨ
は１．０〜２．５であり、特にｐＨ１゜３〜２．０にす
るのが好ましい。

このようにして作った酸性液中には、酸により変性凝固
した物質が生じるため、遠心分離機を用いるなどして除
去し、必要ならば後続の精製プロセスに使用する。

［実　施　例コ 以下に、主にＦｅＩＦＮの例を挙げて本発明をさらに具
体的に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるも
のではない。

実施例１ プラスミドｐＦｅＩＦＮ１　（特開平２−１９５８８４
）から、第１図に示す方法でＦｅＩＦＮをコードするＤ
ＮＡを含む組換えプラスミドを作製した。

すなわち、プラスミドｐＦｅＩＦＮ１　５０μｇを制限
酵素ＸｈｏＩで完全分解し、得られた複数のＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動で分け、約１．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片をエレクトロエリューションで取り出し、約１０
μｇを回収した。

次に、このＤＮＡ断片１０μｇを制限酵素５ｆａＮＩと
ＨｉｎｃＩＩで完全分解し、得られたＤＮＡ断片のうち
約７５０ｂｐのものを同様にして約３μｇ回収した。こ
うしてＦｅＩＦＮ構造遺伝子を含む５ｆａＮＩ−Ｈｉｎ
ｃＩＩ断片を得た。この断片と制限酵素ＢａｍＨＩとＨ
ｉｎｃｎとで切断した市販のｐＵｃ１８　（宝酒造■製
）の断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ｐＵＣＩ
　ＦＮ４を作製した。ｐＵＣＩＦＮ４　２５μｇを制限
酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ、ＨｉｎｃＩＩで完全分解し、得
られた複数のＤＮＡ断片をアガロース電気泳動で分け、
約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をエレクトロエリューション
で取り出し、約２μｇを回収した。

次に、市販のＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡ　（宝酒造■製
）５μｇを制限酵素Ｂｇｌ　Ｉで完全分解し、次いでＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで３′末端を平滑末端にした後、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、ＢｇｌＩ切断部位を欠い
たＭ１３ベクターを作製した。このベクターを制限酵素
ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｃＩＩで完全分解後、前述の０．７
ｋｂのＢ　ａ　ｍ　Ｈｌ−Ｈ１ｎｃｎ断片とＴ４ＤＮＡ
リガーゼで連結した。この組換えＤＮＡｌ０μｇを制限
酵素Ｂｇｌ■、Ｅｃｏ０１０９Ｉで完全分解し、バクテ
リアアルカリホスファターゼ（宝酒造■製）反応後、ア
ガロース電気泳動で分け、約７，９ｋｂのＤＮＡ断片を
エレクトロエリューションで取り出した。

次に、Ｂｇｌ　１部位からＥｃｏ０１０９　Ｉ部位まで
になる２本鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、Ａｂｌｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏｓ７ｓｊｅｍｓ社製のＤＮＡシンセサイザ
ーで合成した。

４１ｍｅ　ｒ　（ＴＧＧＣＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＡＣ
ＴＣＣＧＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣ）
と３２ｍｅ　ｒ　（ＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＧ
ＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧ）と３８ｍｅ　ｒ　
（ＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＴＴＧＣＡ
ＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡ）と４１ｍｅ　ｒ　（Ｇ
ＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＧＧＴ
ＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡ）の４種のオリゴマー
を混合し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造■製
）でカイネーシング後、９０℃で２分間加熱したあと、
放冷することによってアニーリングした。この２本鎖Ｄ
ＮＡと上記で得た約７．　９ｋｂのＢｇｌＩ−ＥｃｏＯ
１０９Ｉ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。２
０μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎｃｎで完全分解
し、得られた複数のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳
動で分け、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片をエレクトロエリ
ューションで取り出し、約２μｇを回収した。こうして
Ｆｅ１ＦＮをコードするＤＮＡを含むＢａｍＨＩ−Ｈｉ
ｎｃ■断片を得た。

クローニングベクターｐＢＭＯ３０（文献１）５μｇを
制限酵素Ｂｇｌｎ、ＳｍａＩで完全分解し、上記のＢａ
ｍＨＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したＥ、
ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ（宝酒造■製）と混合し、形質
転換を行なった。

１００μｇ　／　ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレー
ト上に生育するコロニーの中から、アルカリミニスクリ
ーン法で抽出したプラスミドのＨｉｎｄｕでの制限分析
により、クローニングベクターｐＢＭ０３０に約７５０
ｂｐのＤＮＡ断片が組込まれているプラスミドを得た。

そのプラスミドのＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡのシー
ケンスを行なって、ｐ　ＢＭＯ３０にＦｅＩＦＮをコー
ドするＤ　Ｎ　Ａ　ｉ）＜組込まれているプラスミドを
得た。この組換え体プラスミドをｐＹＵ８７１とした。

文献１の方法で組換え体ウィルスを作製した。

すなわち、５０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７，
１，０，２８Ｍ　　ＮａＣ１，０，７ｍＭＮａ２ＨＰＯ
４，０，７ｍＭ　　ＮａＨ２ＰＯ４からなる２、５ｍｌ
の溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０，２５Ｍ　　
ＣａＣｌ２、カイコ核多角体病ウィルスＢｍＮＰＶ　　
７３株（文献１）のＤＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミ
ドｐＹＵ８７１のＤＮＡ６５μｇを含む）を滴下し、生
じた懸濁液の０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加
したＴＣ−１０培地（文献２）中、２５ｃｆｆｌのフラ
スコで平面培養した約３Ｘ１０Ｓ個のＢＭ−Ｎ細胞（文
献１）の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入した
。

２０時間後、新鮮な培地と交換し、さらに５日間培養後
、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄化した
上清を希釈して平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の培養基に
添加して７日間培養後、顕微鏡観察によりウィルス感染
が見られ、かつ多角体が形成していない培養基を選択し
た（限界希釈法）。

限界希釈法を５回繰り帰した後、プラーク法によって組
換え体ウィルスをクローニングした。っまり、６０１ｍ
［ｌ径の培養用プラスチックシャーレに５Ｘ１０６個の
ＢＭ−Ｎ細胞を培養し、培養液を取り除いた後にプレー
ト当り０．５ｍｌのライスル液を加えて、２７℃で１時
間保温した後、ウィルス液を除き、０．７５％のシー・
プラーク・アガロース（ＦＭＣ社製）と５％の牛胎児血
清を含むＴＣ−１０培地を５ｍｌ加え、アガロースを固
化させた後、２７℃で４〜６日間培養した。

次に、上記のアガロースを含む培養液に０．０１％の中
性界を加えたＴＣ−１０培地を２．５ｍ１重層し、２７
℃で１日保温した。多角体を形成しない透き通ったプラ
ークをパスツールピペットとアガロースとで吸いとり、
少量の培養液に浮遊させた後、さらにプラーク純化を２
回繰り返して、組換え体ウィルスをクローニングした。

ここで作製したＦｅ１ＦＮをコードするＤＮＡを含む組
換え体ウィルスをｒＢＮＶｌｏｏとした。

（３）　　組換え体ウィルス液の調整 ７５ｃｎｒのフラスコ底面で、１５ｍ１の１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０６の
ＢＭ−Ｎ細胞に、前記（２）項でクローニングした組換
え体ライスルを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢ
Ｍ−Ｎ細胞に添加して、２７°Ｃで５日間培養後、培養
液を３．０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清
を組換え体ウィルス液として得た。ウィルス液を１０−
７希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加し
て２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって
培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた。

（４）カイコ体液の調整 ５令２日目のカイコ幼虫に、前記（３）項で得た組換え
体ウィルスのライスル液を５０μｌ／頭注射し、２５°
Ｃで４日間、市販の人工飼料（ビタシルク販売■製）を
与えて飼育後、７頭のカイコの腹部を切り、体液および
牛腸内容物などを含む抽出液を氷冷したプラスチックチ
ューブに採取し、遠心分離の上清を得、０．２μｍのフ
ィルターで一過滅菌した。この液０．５ｍｌに、０．Ｉ
Ｎ塩酸もしくは蒸留水４．５ｍｌを添加した。塩酸を加
えたものはｐＨ１，５になった。４℃で１日保存後、両
液の抗ウィルス活性を測定した。その結果を表−１に示
す。

次に濾過液中のウィルス数をカイコＢＭ−Ｎ細胞を用い
て、ＴＣｒＤ５ｏを測定した。その結果を表−１に示す
。

表−１ なお、ＦｅＩＦＮの抗ウイルス活性測定は以下の方法に
より行なった。

ウィルスはＶｅｓｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ
　Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献３）用い
、ＣＰＥ法に従って抗ウィルス活性を測定した。スタン
ダードリフェランスとして、ＮＩＨのヒトの天然型αＴ
ＦＮ換算したＨｕＩＦＮαを用いた。

［発明の効果］ 本発明によれば、医薬品などに有用な蛋白質を、カイコ
を利用した遺伝子組換え法により大量生産することがで
きる。

［参考文献コ 文献１．　Ｔ、Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、　Ａｇｒｉｃ、　
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　　５１゜文献２．　Ｇ、
Ｒ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ　ａｎｄ　）Ｉ、５ｌｏｃｋｄａ
ｌｅ　；　Ｉ、　１ｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ｐａｔｈ
ｏｌａｇＹ、　２５．　３６３−３７０　（１９文献３
．　Ｉ、に、Ｙａｍａｍｏｌｏら；Ｖ’ｅｔ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、　　ａｎｄ　Ｉｎｍ＋ｒｎｏｐａｆｈｏ１
．、　　Ｉｌ、　　１−１９　（１９８６）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ネコインターフェロンをコードするＤＮＡを
含む組換え体プラスミドｐＹＵ８７１の作製の概略図で
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）有用蛋白質をコードする遺伝子により組換えられ
   た組換えカイコ核多角体病ウィルスをカイコに接種して
   有用蛋白質を製造する際に、カイコ体液をｐＨ０．５〜
   ３．０にすることを特徴とする有用蛋白質の製造方法。