JP2621656B2 - 有用蛋白質の製造方法 - Google Patents
有用蛋白質の製造方法Info
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- silkworm
- dna
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- recombinant
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、医薬品などに有用な蛋白質をカイコを利用
した遺伝子組換え法により効率良く生産する際に、カイ
コ体液中に存在する蛋白質分解酵素ならびに多角体生産
能を欠如した遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスを
不活性化させる方法に関する。
した遺伝子組換え法により効率良く生産する際に、カイ
コ体液中に存在する蛋白質分解酵素ならびに多角体生産
能を欠如した遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスを
不活性化させる方法に関する。
［従来の技術］ 遺伝子操作技術の進歩により、ヒト・インターフェロ
ンα、ブタ・成長ホルモンなどの有用蛋白質が、遺伝子
組換えしたカイコ核多角体病ウィルスをカイコに接種し
て増殖させ、カイコ体内に蓄積されたことが報告されて
いる。
ンα、ブタ・成長ホルモンなどの有用蛋白質が、遺伝子
組換えしたカイコ核多角体病ウィルスをカイコに接種し
て増殖させ、カイコ体内に蓄積されたことが報告されて
いる。
しかしながら、カイコ体液中には蛋白質分解酵素が存
在することが知られており、従って体液抽出操作中もし
くは体液の保存中に目的とする蛋白質が分解されること
が考えられる。さらに、遺伝子組換え核多角体病ウィル
スをカイコに接種して増殖させて蛋白質を生産する方法
では、カイコ体液中にこのウィルスが存在するため、ウ
ィルスの封じ込めが必要となる。
在することが知られており、従って体液抽出操作中もし
くは体液の保存中に目的とする蛋白質が分解されること
が考えられる。さらに、遺伝子組換え核多角体病ウィル
スをカイコに接種して増殖させて蛋白質を生産する方法
では、カイコ体液中にこのウィルスが存在するため、ウ
ィルスの封じ込めが必要となる。
［発明が解決しようとする課題］ そこで、カイコ抽出液中に存在する蛋白質分解酵素お
よび遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスの不活性化
が可能となれば、カイコを利用した有用蛋白質の量産の
途が開かれると期待される。
よび遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスの不活性化
が可能となれば、カイコを利用した有用蛋白質の量産の
途が開かれると期待される。
本発明は、カイコを用いた有用蛋白質の製造を効率良
く行ない、以って有用蛋白質を大量生産することを目的
とする。
く行ない、以って有用蛋白質を大量生産することを目的
とする。
［問題を解決するための手段］ 本発明者らは、かかる状況に鑑み、創意工夫をなし、
抽出したカイコ体液を酸性にすることにより、カイコ体
液中に存在する蛋白質分解酵素および多角体生産能を欠
如した遺伝子組換え核多角体病ウィルスを不活性化する
ことに成功し、以って有用蛋白質をカイコを用いて大量
に製造する方法を確立し、かくして本発明を完成するに
至った。
抽出したカイコ体液を酸性にすることにより、カイコ体
液中に存在する蛋白質分解酵素および多角体生産能を欠
如した遺伝子組換え核多角体病ウィルスを不活性化する
ことに成功し、以って有用蛋白質をカイコを用いて大量
に製造する方法を確立し、かくして本発明を完成するに
至った。
すなわち、本発明は、有用蛋白質をコードする遺伝子
により組換えられた組換えカイコ核多角体病ウィルスを
カイコに接種して有用蛋白質を製造する際に、カイコ体
液をpH0.5〜3.0にすることを特徴とする有用蛋白質の製
造方法、ならびに遺伝子組換えウィルスの封じ込め方法
である。
により組換えられた組換えカイコ核多角体病ウィルスを
カイコに接種して有用蛋白質を製造する際に、カイコ体
液をpH0.5〜3.0にすることを特徴とする有用蛋白質の製
造方法、ならびに遺伝子組換えウィルスの封じ込め方法
である。
以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。
本発明の有用蛋白質としては特に限定されないが、酸
に安定な蛋白質が好ましい。酸に安定な蛋白質としては
種々のものが報告され、今後も多くのものが報告される
であろうが、それらへの応用が可能である。例えば、酸
に安定な有用蛋白質として、ヒトインターフェロンβ、
ネコインターフェロン（以下FeIFNと略す）、マウスイ
ンターフェロンβなどのインターフェロン類などが挙げ
られる。本発明では、特にFeIFNが好ましく用いられ
る。
に安定な蛋白質が好ましい。酸に安定な蛋白質としては
種々のものが報告され、今後も多くのものが報告される
であろうが、それらへの応用が可能である。例えば、酸
に安定な有用蛋白質として、ヒトインターフェロンβ、
ネコインターフェロン（以下FeIFNと略す）、マウスイ
ンターフェロンβなどのインターフェロン類などが挙げ
られる。本発明では、特にFeIFNが好ましく用いられ
る。
遺伝子組換えカイコ核多角体病ウィルスは、例えば次
のようにして作製することができる。
のようにして作製することができる。
すなわち、有用蛋白質をコードするDNAの上流に核多
角体病ウィルス由来のプロモーター領域を含むDNA断
片、下流に終止シグナル以下のDNA断片を有する組換え
プラスミドと核多角体病ウィルスのDNAとを、例えばBM-
N細胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させること
によって、in vivo的に外来の有用蛋白質をコードするD
NAのウィルスDNAの組換えが起こり、遺伝子組換えウィ
ルスが作製される。このようにして作製された遺伝子組
換え核多角体病ウィルスは、核多角体病ウィルスの多角
体蛋白の遺伝子領域に外来のDNAが置換または挿入され
ているため、多角体を生産することができない。従って
非組換え体ウィルスと容易に区別できる。このような遺
伝子組換え核多角体病ウィルスとして、例えばFeIFNの
蛋白質をコードするDNAが組換えられたrBNV100を挙げる
ことができる。
角体病ウィルス由来のプロモーター領域を含むDNA断
片、下流に終止シグナル以下のDNA断片を有する組換え
プラスミドと核多角体病ウィルスのDNAとを、例えばBM-
N細胞のようなカイコ培養細胞に同時に感染させること
によって、in vivo的に外来の有用蛋白質をコードするD
NAのウィルスDNAの組換えが起こり、遺伝子組換えウィ
ルスが作製される。このようにして作製された遺伝子組
換え核多角体病ウィルスは、核多角体病ウィルスの多角
体蛋白の遺伝子領域に外来のDNAが置換または挿入され
ているため、多角体を生産することができない。従って
非組換え体ウィルスと容易に区別できる。このような遺
伝子組換え核多角体病ウィルスとして、例えばFeIFNの
蛋白質をコードするDNAが組換えられたrBNV100を挙げる
ことができる。
rBNV100は、例えばE.coli（pFeIFN1）（微工研条寄第
1633号）から抽出したプラスミドからFeIFNの蛋白質を
コードするDNAを切り出して、カイコのクローニングベ
クター（文献１）に連結して作製した組換え体プラスミ
ドとカイコ核多角体病ウィルスDNAとを、カイコ樹立細
胞にコ・トランスフェクションして作製することができ
る。
1633号）から抽出したプラスミドからFeIFNの蛋白質を
コードするDNAを切り出して、カイコのクローニングベ
クター（文献１）に連結して作製した組換え体プラスミ
ドとカイコ核多角体病ウィルスDNAとを、カイコ樹立細
胞にコ・トランスフェクションして作製することができ
る。
すなわち、微工研条寄第1633号の大腸菌形質転換体か
ら一般的な方法により抽出したプラスミドpFeIFN1か
ら、FeIFNの蛋白質をコードするDNA部分を、例えばpBM0
30（文献１）などのカイコのクローニングベクターの発
現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作
に従って組換え体プラスミドを作製することができる。
この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルスDN
A（文献１）とを、文献１のような方法でカイコ樹立細
胞、例えばBM-N株（文献１）にコ・トランスフェクショ
ンした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体
（野生型）と組換え体のウィルスの中から限界希釈法お
よびプラーク法などの一般的な方法によって、組換え体
ウィルスをクローニングすることができる。組換え体ウ
ィルスは多角体の形成能がないことから、野生型ウィル
スと容易に区別できる。
ら一般的な方法により抽出したプラスミドpFeIFN1か
ら、FeIFNの蛋白質をコードするDNA部分を、例えばpBM0
30（文献１）などのカイコのクローニングベクターの発
現調節部分の下流に連結するという一般的な遺伝子操作
に従って組換え体プラスミドを作製することができる。
この組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルスDN
A（文献１）とを、文献１のような方法でカイコ樹立細
胞、例えばBM-N株（文献１）にコ・トランスフェクショ
ンした後、培養を続け、培養液中に出現した非組換え体
（野生型）と組換え体のウィルスの中から限界希釈法お
よびプラーク法などの一般的な方法によって、組換え体
ウィルスをクローニングすることができる。組換え体ウ
ィルスは多角体の形成能がないことから、野生型ウィル
スと容易に区別できる。
有用蛋白質の生産は、前記の組換えカイコ核多角体病
ウィルスをカイコ生体中で増殖させることにより行な
う。すなわち、前記の組換え体ウィルスを含む培養液を
カイコ幼虫に接種（注射）して、クワの葉または人工飼
料を与えて飼育する。飼育後、カイコを開腹し、そこか
ら得られる液をカイコ体液とする。
ウィルスをカイコ生体中で増殖させることにより行な
う。すなわち、前記の組換え体ウィルスを含む培養液を
カイコ幼虫に接種（注射）して、クワの葉または人工飼
料を与えて飼育する。飼育後、カイコを開腹し、そこか
ら得られる液をカイコ体液とする。
カイコ体液を酸性にするには、カイコ体液に酸を加え
る方法、酸中に体液を受ける方法、もしくは開腹したカ
イコをそのまま酸中に入れ攪拌する方法が可能である。
これらの操作は氷水浴中で行なうのが好ましいが、限定
されない。
る方法、酸中に体液を受ける方法、もしくは開腹したカ
イコをそのまま酸中に入れ攪拌する方法が可能である。
これらの操作は氷水浴中で行なうのが好ましいが、限定
されない。
使用する酸としては塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸、ま
たは蟻酸、酢酸などの有機酸を用いることができる。こ
の中でも塩酸が特に好ましく用いられる。
たは蟻酸、酢酸などの有機酸を用いることができる。こ
の中でも塩酸が特に好ましく用いられる。
酸性の範囲はpH0.5〜3.0とする。好ましいpHは1.0〜
2.5であり、特にpH1.3〜2.0にするのが好ましい。
2.5であり、特にpH1.3〜2.0にするのが好ましい。
このようにして作った酸性液中には、酸により変性凝
固した物質が生じるため、遠心分離機を用いるなどして
除去し、必要ならば後続の精製プロセスに使用する。
固した物質が生じるため、遠心分離機を用いるなどして
除去し、必要ならば後続の精製プロセスに使用する。
［実施例］ 以下に、主にFeIFNの例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもの
ではない。
的に説明するが、本発明の範囲がこれに限定されるもの
ではない。
実施例１ （１）FeIFNをコードするDNAを含む組換えプラスミドの
作製 プラスミドpFeIFN1（特開平2-195884）から、第１図
に示す方法でFeIFNをコードするDNAを含む組換えプラス
ミドを作製した。
作製 プラスミドpFeIFN1（特開平2-195884）から、第１図
に示す方法でFeIFNをコードするDNAを含む組換えプラス
ミドを作製した。
すなわち、プラスミドpFeIFN1 50μｇを制限酵素XhoI
で完全分解し、得られた複数のDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動で分け、約1.2kbのDNA断片をエレクトロエリ
ューションで取り出し、約10μｇを回収した。
で完全分解し、得られた複数のDNA断片をアガロースゲ
ル電気泳動で分け、約1.2kbのDNA断片をエレクトロエリ
ューションで取り出し、約10μｇを回収した。
次に、このDNA断片10μｇを制限酵素SfaNIとHincIIで
完全分解し、得られたDNA断片のうち約750bpのものを同
様にして約３μｇ回収した。こうしてFeIFN構造遺伝子
を含むSfaNI-HincII断片を得た。この断片と制限酵素Ba
mHIとHincIIとで切断した市販のpUC18（宝酒造（株）
製）の断片とを、T4DNAリガーゼで連結し、pUCIFN4を作
製した。pUCIFN4 25μｇを制限酵素BamHI、HincIIで完
全分解し、得られた複数のDNA断片をアガロース電気泳
動で分け、約0.7kbのDNA断片をエレクトロエリューショ
ンで取り出し、約２μｇを回収した。
完全分解し、得られたDNA断片のうち約750bpのものを同
様にして約３μｇ回収した。こうしてFeIFN構造遺伝子
を含むSfaNI-HincII断片を得た。この断片と制限酵素Ba
mHIとHincIIとで切断した市販のpUC18（宝酒造（株）
製）の断片とを、T4DNAリガーゼで連結し、pUCIFN4を作
製した。pUCIFN4 25μｇを制限酵素BamHI、HincIIで完
全分解し、得られた複数のDNA断片をアガロース電気泳
動で分け、約0.7kbのDNA断片をエレクトロエリューショ
ンで取り出し、約２μｇを回収した。
次に、市販のM13mp19RFDNA（宝酒造（株）製）５μｇ
を制限酵素Bg1Iで完全分解し、次いでT4DNAポリメラー
ゼ３′末端を平滑末端にした後、T4DNAリガーゼで連結
し、Bg1I切断部位を欠いたM13ベクターを作製した。こ
のベクターを制限酵素BamHI、HincIIで完全分解後、前
述の0.7kbのBamHI-HincII断片とT4DNAリガーゼで連結し
た。この組換えDNA10μｇを制限酵素Bg1I、Eco0109Iで
完全分解し、バクテリアアルカリホスファターゼ（宝酒
造（株）製）反応後、アガロース電気泳動で分け、約7.
9kbのDNA断片をエレクトロエリューションで取り出し
た。
を制限酵素Bg1Iで完全分解し、次いでT4DNAポリメラー
ゼ３′末端を平滑末端にした後、T4DNAリガーゼで連結
し、Bg1I切断部位を欠いたM13ベクターを作製した。こ
のベクターを制限酵素BamHI、HincIIで完全分解後、前
述の0.7kbのBamHI-HincII断片とT4DNAリガーゼで連結し
た。この組換えDNA10μｇを制限酵素Bg1I、Eco0109Iで
完全分解し、バクテリアアルカリホスファターゼ（宝酒
造（株）製）反応後、アガロース電気泳動で分け、約7.
9kbのDNA断片をエレクトロエリューションで取り出し
た。
次に、Bg1I部位からEco0109I部位までになる２本鎖DN
Aを合成した。すなわち、Abllied Biosystems社製のDNA
シンセサイザーで合成した。
Aを合成した。すなわち、Abllied Biosystems社製のDNA
シンセサイザーで合成した。
41mer（TGGCGCTGGGCTGCAACTCCGTCTGCGTGCTGGGCTGTGA
C）と32mer（CTGCCTCAGACCCACGGCCTGCTGAACAGGAG）と38
mer（GCCCAGCACGCAGACGGAGTTGCAGCCCAGCGCCACCA）と41m
er（GCCCTCCTGTTCAGCAGGCCGTGGGTCTGAGGCAGGTCACA）の
４種のオリゴマーを混合し、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造（株）製）でカイネーシング後、90℃で２分
間加熱したあと、放冷することによってアニーリングし
た。この２本鎖DNAと上記で得た約7.9kbのBg1I-Eco0109
I断片とを、T4DNAリガーゼで連結した。20μｇを制限酵
素BamHI、HincIIで完全分解し、得られた複数のDNA断片
をアガロースゲル電気泳動で分け、約750bpのDNA断片を
エレクトロエリューションで取り出し、約２μｇを回収
した。こうしてFeIFNをコードするDNAを含むBamHI-Hinc
II断片を得た。
C）と32mer（CTGCCTCAGACCCACGGCCTGCTGAACAGGAG）と38
mer（GCCCAGCACGCAGACGGAGTTGCAGCCCAGCGCCACCA）と41m
er（GCCCTCCTGTTCAGCAGGCCGTGGGTCTGAGGCAGGTCACA）の
４種のオリゴマーを混合し、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造（株）製）でカイネーシング後、90℃で２分
間加熱したあと、放冷することによってアニーリングし
た。この２本鎖DNAと上記で得た約7.9kbのBg1I-Eco0109
I断片とを、T4DNAリガーゼで連結した。20μｇを制限酵
素BamHI、HincIIで完全分解し、得られた複数のDNA断片
をアガロースゲル電気泳動で分け、約750bpのDNA断片を
エレクトロエリューションで取り出し、約２μｇを回収
した。こうしてFeIFNをコードするDNAを含むBamHI-Hinc
II断片を得た。
クローニングベクターpBM030（文献１）５μｇを制限
酵素Bg1II、SmaIで完全分解し、上記のBamHI-HincII断
片とT4DNAリガーゼでライゲーションした。この反応液
をコンピテント化したE.coli HB101（宝酒造（株）製）
と混合し、形質転換を行なった。100μg/mlのアンピシ
リンを含むLBプレート上に生育するコロニーの中から、
アルカリミニスクリーン法で抽出したプラスミドのHind
IIIでの制限分析により、クローニングベクターpBM030
に約750bpのDNA断片が組込まれているプラスミドを得
た。そのプラスミドのFeIFNをコードするDNAのシーケン
スを行なって、pB030にFeIFNをコードするDNAが組込ま
れているプラスミドを得た。この組換え体プラスミドを
pYU871とした。
酵素Bg1II、SmaIで完全分解し、上記のBamHI-HincII断
片とT4DNAリガーゼでライゲーションした。この反応液
をコンピテント化したE.coli HB101（宝酒造（株）製）
と混合し、形質転換を行なった。100μg/mlのアンピシ
リンを含むLBプレート上に生育するコロニーの中から、
アルカリミニスクリーン法で抽出したプラスミドのHind
IIIでの制限分析により、クローニングベクターpBM030
に約750bpのDNA断片が組込まれているプラスミドを得
た。そのプラスミドのFeIFNをコードするDNAのシーケン
スを行なって、pB030にFeIFNをコードするDNAが組込ま
れているプラスミドを得た。この組換え体プラスミドを
pYU871とした。
（２）FeIFNをコードするDNAで組換えられた組換えカイ
コ核多角体病ウィルスの作製 文献１の方法で組換え体ウィルスを作製した。
コ核多角体病ウィルスの作製 文献１の方法で組換え体ウィルスを作製した。
すなわち、50mM HEPESバッファーpH7.1、0.28M NaC
1、0.7mMNa2HPO4、0.7mM NaH2PO4からなる2.5mlの溶液
に、2.5mlのDNA混合液（0.25M CaCl2、カイコ核多角体
病ウィルスBmNPV T3株（文献１）のDNA10μｇ、組換え
体プラスミドpYU871のDNA65μｇを含む）を滴下し、生
じた懸濁液の0.5mlを5mlの10％FBSを添加したTC-10培地
（文献２）中、25cm2のフラスコで平面培養した約３×1
05個のBM-N細胞（文献１）の培養基に加え、カイコ細胞
にDNAを導入した。20時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに５日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したBM-N細
胞の培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察により
ウィルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培
養基を選択した（限界希釈法）。
1、0.7mMNa2HPO4、0.7mM NaH2PO4からなる2.5mlの溶液
に、2.5mlのDNA混合液（0.25M CaCl2、カイコ核多角体
病ウィルスBmNPV T3株（文献１）のDNA10μｇ、組換え
体プラスミドpYU871のDNA65μｇを含む）を滴下し、生
じた懸濁液の0.5mlを5mlの10％FBSを添加したTC-10培地
（文献２）中、25cm2のフラスコで平面培養した約３×1
05個のBM-N細胞（文献１）の培養基に加え、カイコ細胞
にDNAを導入した。20時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに５日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したBM-N細
胞の培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察により
ウィルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培
養基を選択した（限界希釈法）。
限界希釈法を５回繰り帰した後、プラーク法によって
組換え体ウィルスをクローニングした。つまり、60mm径
の培養用プラスチックシャーレに５×106個のBM-N細胞
を培養し、培養液を取り除いた後にプレート当り0.5ml
のウィルス液を加えて、27℃で１時間保温した後、ウィ
ルス液を除き、0.75％のシー・プラーク・アガロース
（FMC社製）と５％の牛胎児血清を含むTC-10培地を5ml
加え、アガロースを固化させた後、27℃で４〜６日間培
養した。
組換え体ウィルスをクローニングした。つまり、60mm径
の培養用プラスチックシャーレに５×106個のBM-N細胞
を培養し、培養液を取り除いた後にプレート当り0.5ml
のウィルス液を加えて、27℃で１時間保温した後、ウィ
ルス液を除き、0.75％のシー・プラーク・アガロース
（FMC社製）と５％の牛胎児血清を含むTC-10培地を5ml
加え、アガロースを固化させた後、27℃で４〜６日間培
養した。
次に、上記のアガロースを含む培養液に0.01％の中性
赤を加えたTC-10培地を2.5ml重層し、27℃で１日保温し
た。多角体を形成しない透き通ったプラークをパスソー
ルピペットとアガロースとで吸いとり、少量の培養液に
浮遊させた後、さらにプラーク純化を２回繰り返して、
組換え体ウィルスをクローニングした。ここで作製した
FeIFNをコードするDNAを含む組換え体ウィルスをrBNV10
0とした。
赤を加えたTC-10培地を2.5ml重層し、27℃で１日保温し
た。多角体を形成しない透き通ったプラークをパスソー
ルピペットとアガロースとで吸いとり、少量の培養液に
浮遊させた後、さらにプラーク純化を２回繰り返して、
組換え体ウィルスをクローニングした。ここで作製した
FeIFNをコードするDNAを含む組換え体ウィルスをrBNV10
0とした。
（３）組換え体ウィルス液の調整 75cm2のフラスコ底面で、15mlの10％FBSを含むTC-10
培地中で平面培養した約３×106のBM-N細胞に、前記
（２）項でクローニングした組換え体ウィルスを含むBM
-N細胞の培養液50μｌをBM-N細胞に添加して、27℃で５
日間培養後、培養液を3,000rpmで５分間遠心分離して、
遠心上清を組換え体ウィルス液として得た。ウィルス液
を10-7希釈し、その1mlをBM-N細胞の培養基に添加して2
7℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養
基のBM-N細胞にウィルス感染が認められた。
培地中で平面培養した約３×106のBM-N細胞に、前記
（２）項でクローニングした組換え体ウィルスを含むBM
-N細胞の培養液50μｌをBM-N細胞に添加して、27℃で５
日間培養後、培養液を3,000rpmで５分間遠心分離して、
遠心上清を組換え体ウィルス液として得た。ウィルス液
を10-7希釈し、その1mlをBM-N細胞の培養基に添加して2
7℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培養
基のBM-N細胞にウィルス感染が認められた。
（４）カイコ体液の調整 ５令２日目のカイコ幼虫に、前記（３）項で得た組換
え体ウィルスのウィスル液を50μl/頭注射し、25℃で４
日間、市販の人工飼料（ビタシルク販売（株）製）を与
えて飼育後、７頭のカイコの腹部を切り、体液および中
腸内容物などを含む抽出液を氷冷したプラスチックチュ
ーブに採取し、遠心分離の上清を得、0.2μｍのフィル
ターで過滅菌した。この液0.5mlに、0.1N塩酸もしく
は蒸留水4.5mlを添加した。塩酸を加えたものはpH1.5に
なった。４℃で１日保存後、両液の抗ウィルス活性を測
定した。その結果を表−１に示す。
え体ウィルスのウィスル液を50μl/頭注射し、25℃で４
日間、市販の人工飼料（ビタシルク販売（株）製）を与
えて飼育後、７頭のカイコの腹部を切り、体液および中
腸内容物などを含む抽出液を氷冷したプラスチックチュ
ーブに採取し、遠心分離の上清を得、0.2μｍのフィル
ターで過滅菌した。この液0.5mlに、0.1N塩酸もしく
は蒸留水4.5mlを添加した。塩酸を加えたものはpH1.5に
なった。４℃で１日保存後、両液の抗ウィルス活性を測
定した。その結果を表−１に示す。
次に過液中のウィルス数をカイコBM-N細胞を用い
て、TCID50を測定した。その結果を表−１に示す。
て、TCID50を測定した。その結果を表−１に示す。
なお、FeIFNの抗ウィルス活性測定は以下の方法によ
り行なった。
り行なった。
ウィルスはVesicular Stomatitis Virus、感受性細胞
はネコFC9（文献３）用い、CPE法に従って抗ウィルス活
性を測定した。スタンダードリフェランスとして、NIH
のヒトの天然型αIFN換算したHuIFNαを用いた。
はネコFC9（文献３）用い、CPE法に従って抗ウィルス活
性を測定した。スタンダードリフェランスとして、NIH
のヒトの天然型αIFN換算したHuIFNαを用いた。
［発明の効果］ 本発明によれば、医薬品などに有用な蛋白質を、カイ
コを利用した遺伝子組換え法により大量生産することが
できる。
コを利用した遺伝子組換え法により大量生産することが
できる。
［参考文献］ 文献1.T.Horiuchiら,Agric.Biol.Chem.,51,1573-1580
（1987） 文献2.G.R.Gardiner and H.Stockdale;J.Invertebrate
Patholagy,25,363-370（1975） 文献3.J.K.Yamamotoら;Vet.Immunol.and Immunopatho
l.,11,1-19（1986）
（1987） 文献2.G.R.Gardiner and H.Stockdale;J.Invertebrate
Patholagy,25,363-370（1975） 文献3.J.K.Yamamotoら;Vet.Immunol.and Immunopatho
l.,11,1-19（1986）
第１図は、ネコインターフェロンをコードするDNAを含
む組換え体プラスミドpYU871の作製の概略図である。
む組換え体プラスミドpYU871の作製の概略図である。
Claims (1)
- 【請求項１】有用蛋白質をコードする遺伝子により組換
えられた組換えカイコ核多角体病ウィルスをカイコに接
種して有用蛋白質を製造する際に、カイコ体液をpH0.5
〜3.0にすることを特徴とする有用蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2339736A JP2621656B2 (ja) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | 有用蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2339736A JP2621656B2 (ja) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | 有用蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04207198A JPH04207198A (ja) | 1992-07-29 |
| JP2621656B2 true JP2621656B2 (ja) | 1997-06-18 |
Family
ID=18330317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2339736A Expired - Lifetime JP2621656B2 (ja) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | 有用蛋白質の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2621656B2 (ja) |
-
1990
- 1990-11-30 JP JP2339736A patent/JP2621656B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04207198A (ja) | 1992-07-29 |
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