KR20240004592A - 재조합 i형 인간화 콜라겐 폴리펩티드 및 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드 및 이의 제조방법 및 용도를 공개하였다. 본 발명에서 제공되는 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드는 SEQ ID No. 1로 표시되는 서열의 n개의 반복 서열을 포함하고, 여기서 n이 1 이상의 정수이고 n이 2 이상의 정수인 경우, 각 반복 서열끼리 직접 연결되고, 필요에 따라 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 제공되는 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드는 세포 접착을 촉진하는 활성을 가지며, 상기 재조합 단백질의 아미노산 서열은 천연 콜라겐 아미노산 서열에서 선택되고 인간에게 이용될 때 면역 반응을 일으키지 않으며, 또한 제조방법이 간단하고 저비용으로 비교적 많은 생산량의 콜라겐을 얻을 수 있다.
Description
본원은 2021년 8월 23일에 제출된, 발명의 명칭이 "재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드 및 이의 제조방법 및 용도"이고 출원번호가 202110968550.2호인 중국 발명특허출원의 우선권을 주장하며, 그 부록을 포함한 모든 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 유전자공학 기술분야에 속하며, 구체적으로 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
콜라겐(collagen)은 단백질의 일종으로 일반적으로 백색 투명하고 분지가 없는 원섬유이고 피부와 뼈의 기본적인 지지물이며 전체 단백질의 25% 내지 35%를 차지한다. 콜라겐은 주로 인체의 피부, 혈관, 골격, 근육·힘줄, 치아 및 연골 등에 분포하고 이러한 조직들의 주요 매트릭스 및 지지물이며 각 조직을 보호하고 연결하며 인체 내에서 중요한 생리학적 기능을 발휘한다. 따라서 콜라겐은 의약품이나 화장품 등의 업계에서 널리 이용될 수 있다. 콜라겐은 인체 내 분포 및 기능적 특징에 따라 간질성 콜라겐, 기저막 콜라겐 및 세포외 콜라겐으로 나눌 수 있다. 간질성 콜라겐 분자는 몸 전체 콜라겐의 대부분을 차지하며 I형, II형, III형 콜라겐 분자를 포함하고, I형 콜라겐은 주로 피부, 근육·힘줄 등의 조직에 분포하며 의학적으로 가장 널리 이용되고 있다.
그러나 천연 콜라겐은 물에 불용성이고 성질이 불균일하기 때문에 인체에서 직접 이용하기가 곤란하여 화학적 수단에 의한 처리를 거치고 나서 이용하는 경우가 많다. 또한 현재 시장에서 판매되고 있는 콜라겐 제품은 모두 돼지, 소, 생선 등의 동물 조직에서 채취한 것으로 바이러스 감염 위험을 피하기 어렵다. 또한 인체와 적합하지 않기 때문에 면역 거부 반응이나 알레르기 증상을 일으킬 수 있다. 인간 태반 원료에서 콜라겐을 추출하려면 공급원이 한정될 뿐만 아니라 위법이기 때문에 엄격한 법적 처벌도 부과된다. 따라서, 현재 콜라겐은 화장품이나 건강 식품에만 사용되고 있으며 콜라겐 본래의 생물학적 기능을 전혀 발휘하지 못하고 있다.
종래의 콜라겐 제조방법은 동물 유래 조직을 산, 알칼리, 효소에 의한 분해법으로 처리하여 콜라겐 유도체를 추출함으로써 이루어지는 방법이다. 이러한 방법으로 추출된 콜라겐은 그 자체로 이미 본래의 생물 활성을 상실하여 생물의학 분야에 응용하여 그 본래의 기능을 발휘할 수 없다. 제조된 콜라겐 제품은 대부분 인장 강도가 낮고 순수한 콜라겐은 인체 내에서 빠르게 분해되기 때문에 잠재적인 항원성을 가질 가능성이 있다. 또한 콜라겐의 유래, 가공기술이나 원료 배합비에 따라 제품의 영양 성분이나 사료 가치가 다르다. 그리고 피혁 재료는 가공 중에 많은 화학 물질에 노출될 뿐만 아니라 세균에 오염되기도 쉽다. 이러한 문제들로 인해 콜라겐의 이용이 엄격하게 제한되고 있다. 해외 연구 기관에서는 인간화 콜라겐을 포함한 유전자를 갖는 마우스를 사육하여 인간화 콜라겐을 포함한 유즙을 얻고 있지만, 이러한 생산은 비용이 지나치게 높고 생산 기간이 지나치게 길어 대규모 생산에는 적용할 수 없다.
TEV Protease는 대장균에서 재조합 발현시킨 His 태그(6ХHis tag)를 갖는 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus, TEV)의 시스테인산 프로테아제로, 헵타펩티드 서열 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser을 특이적으로 식별하고, Gln과 Gly/Ser 아미노산 잔기 사이에서 효소 소화할 수 있으며, 융합 단백질로부터 Glutathione S-transferase(GST), His 또는 다른 태그를 제거하는 데에 자주 이용된다.
이에, 인체에 신속하게 흡수되고 제조방법이 간단하며 비용이 낮고, 동시에 인간화 콜라겐의 기능 및 특성을 발휘할 수 있는 제품 개발이 시급하다.
본 발명은 상기 본 분야에서 이종 콜라겐은 생물 활성이 낮고 면역 반응을 유발하기 쉬우며, 또한 인간화 콜라겐은 생산 비용이 높고 주기가 길며 대규모 생산이 불가능한 점 등으로 인해 콜라겐 이용률이 낮다는 일련의 문제를 고려하여, 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드, 나아가 이의 제조방법 및 용도를 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드로서, SEQ ID No. 1로 표시되는 서열의 n개의 반복 서열을 포함하고, 여기서 n이 1 이상의 정수이고 n이 2 이상의 정수인 경우, 각 반복 서열끼리 직접 연결되고, 필요에 따라 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드를 제공한다.
또한 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드에 있어서, 상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 SEQ ID No. 4로 표시되는 서열을 포함하고, 바람직하게는 SEQ ID No. 4로 표시되는 서열과 SEQ ID No. 1로 표시되는 서열이 직접 연결된다.
또한 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드는 다음을 포함한다: a. SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열; b. SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열과 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열이면서, SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 아미노산 서열; c. SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가, 치환, 결실 또는 삽입되는 아미노산 서열이면서, SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 아미노산 서열; 또는 d. SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이면서, SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 아미노산 서열이다. 상기 엄격한 조건은 중(中) 엄격한 조건, 중-고(中－高) 엄격한 조건, 고(高) 엄격한 조건 또는 초고(超高) 엄격한 조건이다.
제2 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
제4 측면에서, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
제5 측면에서, 본 발명은 ① 본 발명의 제4 측면의 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 폴리펩티드를 제조하는 공정; ② 상기 폴리펩티드를 획득하여 정제하고, 바람직하게는 Ni 칼럼 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 폴리펩티드를 정제하는 공정; 및 ③ 임의로 상기 폴리펩티드를 효소 소화하고, 바람직하게는 TEV 프로테아제로 상기 폴리펩티드를 효소 소화하는 공정;을 포함하는, 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
제6 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 조직 공학 제품, 화장품, 건강 식품 또는 의약품 제품의 제조에 있어서, 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
제7 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드를 포함하는 제품을 제공하고, 상기 제품은 바람직하게는 조직 공학 제품, 화장품, 건강 식품 또는 의약품이다.
제8 측면에서, 본 발명은 세포 접착 촉진 작용을 갖는 제품의 제조에 있어서, 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
상기 기술적 해결 수단을 실시함으로써, 본 발명에서 제조된 재조합 I형 인간화 콜라겐은 I형 콜라겐의 다른 단편보다 우수한 세포 접착 효과를 가지며, 그 아미노산 서열이 천연 콜라겐 아미노산 서열에서 선택되기 때문에 인체에 적용해도 면역 반응을 일으키지 않고, 동시에 그 제조방법이 간단하며 저비용으로 보다 많은 생산량의 콜라겐을 얻을 수 있다.
도 1은 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4 유도 발현 후의 단백질 전기영동도이다. 제1 레인은 분자량 마커이고, 제2 레인은 정제 후 TC1R4 단백질이고, TC1R4 단백질을 전기영동하여 검출된 분자량이 약 38kDa으로, SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대응한다.
도 2는 인간화 콜라겐, C1S4T, C1S5T, TC1R4 단백질 폴리펩티드의 생물 접착 활성을 측정한 결과이다.
도 2는 인간화 콜라겐, C1S4T, C1S5T, TC1R4 단백질 폴리펩티드의 생물 접착 활성을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해 설명하나, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 특별히 언급되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 기기, 장치, 시약, 재료 등은 종래의 상업적 수단을 통해 입수할 수 있다.
본 명세서에서 "해도 된다"라는 용어는 어떠한 처리를 하는 경우와 하지 않는 경우를 모두 포함한다. 본 명세서에서 "임의의" 또는 "임의로"란, 다음에 설명하는 사태 또는 상황이 발생해도 되거나 발생하지 않아도 되는 것을 의미하고, 이러한 설명은 이러한 사태가 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 모두 포함한다.
본 명세서에서 "의료 기기"란, 인체에 직접 또는 간접적으로 사용되는 기기, 장치, 기구, 체외 진단용 의약품 및 교정품, 재료 및 기타 유사품이나 관련 물품을 가리킨다.
본 명세서에서 "조직 공학 제품"이란, 조직 공학에 사용되는 제품을 말한다. 조직 공학이란, 세포 생물학과 재료 공학을 결합하여 인비트로 또는 인비보에서 조직이나 기관을 구축하기 위한 새로운 학문이다.
본 발명의 일부는 하기 발명자의 선행 연구 지식에 기초한다. 대장균에서 예를 들면 GEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID No. 1)를 반복 서열로서 복수개 포함하는 폴리펩티드가 발현될 경우, 폴리펩티드는 일반적으로 단축 단백질이기 때문에 전장 단백질의 힌지 영역 구조가 결여되어 있다. 그러므로 재조합 발현 폴리펩티드의 겔화성을 높이기 위해서는 통상적으로 폴리펩티드의 C 말단에 힌지 영역 아미노산 GPPGPCCGGG(SEQ ID No. 2) 등의 서열을 부가하여 겔화를 도울 필요가 있다(참고문헌: Journal Of Biochemistry. 2004; 136: 643-649). 따라서, 출원번호가 201811438582.6인 발명특허출원에서는 예를 들면 T16a와 같이 C 말단에 SEQ ID No. 2를 포함하는 폴리펩티드 서열을 설계하였으나, T16a와 같은 서열의 폴리펩티드는 진탕 배양하거나 발효 배양할 때 대부분의 목적 폴리펩티드가 콜로이드 침전물을 형성하여 용해 및 정제할 수 없기 때문에 수율이 매우 낮다는 것을 발견하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 반복 서열을 복수개 포함하는 폴리펩티드를 얻도록 각 반복 서열(SEQ ID No. 1) 사이에 비-콜라겐 아미노산 링커를 부가함으로써, 이러한 폴리펩티드의 변형도 주로 링커 아미노산 잔기 및 C 말단 힌지 영역 아미노산, 즉 C 말단 안정화 서열에 집중되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
놀랍게도 발명자는 SEQ ID No. 1의 결정 구조를 해석한 결과, SEQ ID No. 1 영역은 힌지 영역이 관여하지 않는다는 전제하에 매우 안정적인 콜라겐 삼량체 구조를 형성할 수 있음을 발견하였다. 출원번호가 201811438582.6인 발명특허출원에서, 발명자는 폴리펩티드 서열을 더 변경하였을 때 상기 출원에 따른 폴리펩티드에서 C 말단 안정화 서열의 관여를 필요로 하지 않는다는 것을 발견하였다. 또한 이 경우, 폴리펩티드는 재조합 발현하는 동시에 조기에 콜로이드 구조를 형성하여 후기 단백질 정제에 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 사용되는 SEQ ID No. 1 반복 서열은 GEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID No. 1)이다. 본 발명의 폴리펩티드는 반복 서열 사이에 링커가 존재하지 않는다는 전제하에 SEQ ID No. 1로 표시되는 반복 서열을 복수개 포함할 수 있다. 본 명세서에서 링커는 1개 이상의 아미노산 잔기일 수 있다. 본 발명에 있어서, 접착 실시예에서 검증된 특성을 구현할 수 있는 한, 반복 서열의 수는 특별히 제한되지 않는다. 반복 서열의 수는 4개, 즉 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열을 포함하는 폴리펩티드가 바람직하다.
GEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID No. 3).
본 발명의 폴리펩티드 서열은 발현시에 그 N 말단에 ENLYFQ(SEQ ID No. 4) 서열이 부가되어야 하며, TEV 프로테아제 절단에 의해 예를 들면 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 직접 얻을 수 있다. ENLYFQ(SEQ ID No. 4) 서열은 첫 반복 서열의 N 말단에 직접 연결되고, 즉,
ENLYFQGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID No. 5)가 바람직하다.
연구를 통해, 발명자는 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열의 폴리펩티드가 출원번호 201811254050.7의 발명특허출원에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐보다 높은 활성을 갖는 것을 발견하였다.
본 발명에서, 폴리펩티드는 재조합 I형 인간화 콜라겐이고, 본 명세서에서 재조합 인간화 콜라겐과 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 재조합 인간화 콜라겐은 본 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, (1) 대장균 유전자 공학균의 구축, (2) 대장균 유전자 공학균의 발효 배양, (3) 재조합 인간화 콜라겐의 유도 및 발현, (4) 재조합 인간화 콜라겐의 정제, 및 필요에 따라서 효소 소화와 같은 공정으로 제조될 수 있다.
상기 공정 (1)에서 대장균 유전자 공학균의 구축은 a. 목적 유전자 단편을 얻는다; b. 얻어진 목적 유전자 단편을 pET-32a 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 플라스미드를 얻는다; c. 재조합 발현 플라스미드를 대장균 감수성 세포 BL21(DE3)에 도입하고 스크리닝하여 양성 대장균 유전자 공학균을 얻는다;와 같은 공정으로 수행할 수 있다.
상기 공정 (2) 및 (3)에서, 대장균 유전자 공학균의 발효 배양 및 재조합 인간화 콜라겐의 유도 및 발현은 a. 형질전환된 LB 플레이트에서 스크리닝 후의 대장균 유전자 공학균 단콜로니를 선택하고, 암피실린 항생물질이 포함된 1000ml의 LB 배지 중에서 37℃, 220rpm으로 균액 OD600이 0.9 내지 1.1이 되도록 배양하고, b. 최종 농도 0.5mM의 IPTG를 첨가하여 유도하고, 18℃에서 하룻밤 배양하고 원심분리하여 균체를 수집하는 것과 같은 공정으로 수행할 수 있다.
상기 공정 (4)에서, 재조합 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 정제 및 효소 소화는 a. Tris 완충액(25mM Tris, 200mM NaCl, pH 8.0)으로 균체를 재현탁하고, 균체를 파쇄하고 원심분리하여 상등액을 수집하고, b. Ni6FF 친화성 칼럼에 의해 재조합 인간화 콜라겐을 결합하고, 20mM 이미다졸 함유 세척 완충액으로 불순한 단백질을 헹군 후, 250mM 이미다졸 함유 용액 목적 단백질을 용출하고, TEV 프로테아제를 첨가하여 16℃에서 2h 효소 소화하고, 마지막으로 목적 콜라겐 폴리펩티드를 얻는 것과 같은 공정으로 수행할 수 있다.
숙주 세포는 진균이나 효모 등의 진핵 세포여도 되고, 장내세균과 세균 등의 원핵 세포여도 된다. 당업자는 상기 대장균 균주 대신에 다른 발현 균주를 숙주 세포로 사용할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산은 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 핵산 분자는 주로 본 발명에 기재된 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로 구성되어도 되고, 또는 본 발명에 기재된 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로만 구성되어도 된다. 이러한 핵산 분자는 당업자에게 이미 알려진 방법을 통해 합성할 수 있다. 유전 암호의 축퇴성으로 인해, 당업자는 상이한 핵산 서열의 핵산 분자가 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 적절한 벡터는 벡터 구축 분야에서 알려진 것으로, 프로모터 선택이나 예를 들면 인핸서 등 다른 조절 요소를 포함한다. 본 발명에 기재된 벡터는 세포내 도입에 적합한 서열을 포함한다. 예를 들면, 벡터는 발현 벡터일 수 있으며, 상기 벡터에서 상기 폴리펩티드의 코딩 서열은 그 자체의 시스 작용 조절 요소에 의해 제어되고, 벡터는 숙주 세포의 유전자 통합이나 유전자 치환 등이 용이하도록 설계된다.
당업자라면, 본 발명에서 "벡터"라는 용어는 DNA 분자, 예를 들면 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 하나 또는 복수개의 이종 또는 재조합 핵산 서열을 포함하는 다른 벡터를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 적절한 파지 및 바이러스 벡터는 λ-파지, EMBL 파지, 원숭이 바이러스, 소 사마귀 바이러스, Epstein-Barr 바이러스, 아데노 바이러스, 헤르페스 바이러스, 마우스 육종 바이러스, 마우스 유방암 바이러스, 슬로우 바이러스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 한, SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열 또는 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 서열을 포함한다. "복수개"는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개일 수 있다.
아미노산의 부가란, 본 발명의 폴리펩티드가 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 한, 아미노산 서열, 예를 들면 SEQ ID No. 3의 C 말단 또는 N 말단에 아미노산을 부가하는 것을 가리킨다.
아미노산의 치환이란, 본 발명의 폴리펩티드가 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 한, 아미노산 서열, 예를 들면 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열의 어느 위치에 존재하는 어느 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 가리킨다.
아미노산의 삽입이란, 본 발명의 폴리펩티드가 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 한, 아미노산 서열, 예를 들면 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열의 적절한 위치에 아미노산 잔기가 삽입되고, 삽입된 아미노산 잔기가 전부 또는 일부 서로 인접해 있어도 되고, 삽입된 아미노산끼리 서로 인접해 있지 않아도 된다. 본 명세서에서 아미노산의 삽입 위치는 각 반복 서열 사이가 아니다.
아미노산의 결실이란, 본 발명의 폴리펩티드가 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 한, 아미노산 서열, 예를 들면 SEQ ID No. 3으로 표시되는 서열에서 1개, 2개 또는 3개 이상의 아미노산을 결실시킬 수 있는 것을 가리킨다.
본 발명에서 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있고, SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열과 비교해서 3개, 보다 바람직하게는 2개의 아미노산 또는 1개의 아미노산이 유사하거나 가까운 성질을 갖는 아미노산으로 치환되어 펩티드를 형성하는 것을 가리킨다. 이러한 보존적 변이 펩티드들은 하기 표 1에 따라 아미노산 치환을 실시하여 제조할 수 있다.
| 최초 잔기 | 대표적 치환 | 바람직한 치환 |
| Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
| Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
| His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
| Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
| Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "중(中) 엄격한 조건", "중-고(中－高) 엄격한 조건", "고(高) 엄격한 조건" 또는 "초고(超高) 엄격한 조건"이라는 용어는 핵산 혼성화 및 세척 조건을 나타낸다. 혼성화 반응을 실시하기 위한 지침은 본문에 포함된 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6을 참조할 수 있다. 이 문헌에는 수성 방법 및 비수성 방법이 기재되어 있으며 어느 것이든 이용 가능하다. 예를 들면, 구체적인 혼성화 조건은 다음과 같다. (1) 저 엄격한 혼성화 조건이란, 6×염화나트륨/구연산나트륨(SSC)로 약 45℃, 이어서 적어도 50℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 2회 세척하는 조건이다(저 엄격한 조건에서는 세척 온도를 55℃까지 상승시킬 수 있음); (2) 중(中) 엄격한 혼성화 조건이란, 6×SSC, 약 45℃, 이어서 60℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 복수회 세척하는 조건이다; (3) 고(高) 엄격한 혼성화 조건이란, 6×SSC, 약 45℃, 이어서 65℃에서 0.2×SSC, 0.1% SDS로 1회 또는 복수회 세척하는 조건이며 바람직한 조건이다; (4) 초고(超高) 엄격한 혼성화 조건이란, 0.5M 인산나트륨, 7% SDS로 65℃, 이어서 65℃에서 0.2×SSC, 1% SDS로 1회 또는 복수회 세척하는 조건이다.
실제 사용에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 그 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 상기 복합체, 상기 다량체 및 상기 조성물을 의약품으로서 환자에게 직접 투여해도 되고, 또는 적절한 벡터 또는 부형제와 혼합한 뒤 환자에게 투여해도 된다. 여기서, 벡터 재료는 수용성 벡터 재료(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 유기산 등), 난용성 벡터 재료(예를 들면, 에틸셀룰로오스, 스테아르산 콜레스테롤 등), 장용성 벡터 재료(예를 들면, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트 및 카르복시메틸셀룰로오스 등)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 수용성 벡터 재료이다. 이러한 재료들을 사용하여 정제, 캡슐, 펠릿, 에어로졸제, 환제, 산제, 액제, 현탁제, 유제, 과립제, 리포좀, 경피제, 경구 정제, 좌제, 동결건조 분말 주사제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 제형으로 제조할 수 있다. 좌제는 질 좌약이어도 되고, 질 링이어도 되고, 질 용도에 적합한 연고, 크림 또는 겔이어도 된다. 상기 폴리펩티드 제형은 일반 제제, 서방 제제, 제어 방출 제제 및 다양한 미립자 투여 시스템일 수 있다. 단위 투여 제형을 정제로 제조하기 위해, 본 분야에서 공지된 다양한 벡터를 널리 이용할 수 있다. 벡터의 예로는 예를 들면 전분, 덱스트린, 황산칼슘, 락토오스, 만니톨, 수크로오스, 염화나트륨, 글루코오스, 우레아, 탄산칼슘, 카올린, 미결정 셀룰로오스, 규산알루미늄 등의 희석제 및 흡수제, 예를 들면 물, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 프로판올, 전분 페이스트, 덱스트린, 시럽, 꿀, 글루코오스 용액, 아라비아 고무 페이스트, 젤라틴 페이스트, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 셸락, 메틸셀룰로오스, 인산칼륨, 폴리비닐피롤리돈 등의 습윤제 및 결합제, 예를 들면 건조 전분, 알긴산염, 한천 분말, 갈조 전분, 탄산수소나트륨과 구연산, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌, 소르비톨 지방산 에스테르, 도데실술폰산나트륨, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 등의 붕괴제, 예를 들면 수크로오스, 스테아르산 글리세리드, 카카오 버터, 수소화유 등의 붕괴 억제제, 예를 들면 4급 암모늄염, 도데실황산나트륨 등의 흡수 촉진제, 예를 들면 탈크 분말, 실리카, 옥수수 전분, 스테아르산염, 붕산, 액체 파라핀, 폴리에틸렌글리콜 등의 윤활제를 들 수 있다. 또한 정제는 예를 들면 당의정, 필름 코팅정, 장용성 코팅정, 또는 2층 정 및 다층 정과 같은 코팅정으로 제조할 수 있다. 단위 투여 제형을 환제로 제조하기 위해, 당업자에게 공지된 다양한 벡터를 널리 이용할 수 있다. 벡터의 예로는 예를 들면 글루코오스, 락토오스, 전분, 카카오 버터, 수소화 식물유, 폴리비닐피롤리돈, Gelucire, 카올린, 탈크 분말 등의 희석제 및 흡수제, 예를 들면 아라비아 고무, 트라가칸트 고무, 젤라틴, 에탄올, 꿀, 액상 당, 쌀 페이스트 또는 소맥분 페이스트 등의 결합제, 예를 들면 한천 분말, 건조 전분, 알긴산염, 도데실술폰산나트륨, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 등의 붕괴제를 들 수 있다. 단위 투여 제형을 좌제로 제조하기 위해, 당업자에게 공지된 다양한 벡터를 널리 이용할 수 있다. 벡터의 예로는 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 레시틴, 카카오 버터, 고급 알코올, 고급 알코올의 에스테르, 젤라틴, 반합성 글리세리드 등을 들 수 있다. 단위 투여 제형을 예를 들면 용액, 유제, 동결건조 분말 주사제 및 현탁제 등의 주사용 제제로 제조하기 위해, 예를 들면 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 1,3-프로판디올, 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 산화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르 등, 당업자가 통상적으로 사용하는 모든 희석제를 사용할 수 있다. 또한 등장 주사액을 제조하기 위해 주사용 제제에 적당량의 염화나트륨, 글루코오스 또는 글리세린을 첨가할 수 있고, 또한 일반적인 조용제, 완충제, pH 조정제 등을 첨가할 수도 있다. 또한 필요에 따라 의약품 제제에 착색제, 방부제, 향료, 교미제, 감미료 또는 다른 재료를 첨가할 수도 있다.
상기 제형의 사용은 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사 및 복강내 주사, 뇌내 주사 또는 수액 등을 포함한 주사 투여, 예를 들면 직장, 질 및 설하 등의 강내 투여, 예를 들면 비내 투여, 점막 투여 등 호흡 투여를 통해 투여할 수 있다. 상기 투여 경로는 주사 투여인 것이 바람직하고, 주사 경로는 피하 주사인 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 그 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 상기 복합체, 상기 다량체 및 상기 조성물의 투여량은 예를 들면 예방 또는 치료하고자 하는 질환의 성질 및 중증도, 환자 또는 동물의 성별, 연령, 체중 및 개체 반응, 사용되는 특정 유효 성분, 투여 경로 및 투여 횟수 등 많은 요소에 의해 결정된다. 상기 투여량은 단일 투여량 형태, 또는 예를 들면 2개, 3개 또는 4개 등 복수 투여량 형태로 적용될 수 있다. 임의의 구체적인 환자에 대해, 구체적인 치료상 유효한 용량 수준은 치료할 장애와 그 장애의 중증도, 사용되는 구체적인 유효 성분의 활성, 사용되는 구체적인 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식사, 사용되는 구체적인 유효 성분의 투여 시간, 투여 경로 및 배설률, 치료 지속 시간, 사용되는 구체적인 유효 성분과 조합하여 사용하거나 동시에 사용되는 의약품, 및 의료 분야에서 공지된 유사 요소 등 다양한 요소에 기초하여 결정되어야 한다. 예를 들면, 이 분야에서 유효 성분의 투여량은 원하는 치료 효과를 얻기 위해 필요한 수준을 밑도는 수준에서 시작하고, 원하는 치료 효과가 얻어질 때까지 서서히 투여량을 증가시킨다.
본 발명에 기재된 인간화 콜라겐 C1S4T 및 인간화 콜라겐 C1S5T는 출원번호가 201811254050.7이고 발명의 명칭이 "폴리펩티드, 이의 제조방법 및 용도"인 특허출원에 기재되어 있다.
본 발명의 양태를 보다 명확하게 설명하기 위해 이하에 구체적인 실시예를 들어 설명하나, 본 발명은 이에 한정되지 않으며 본 발명의 일부 실시예에 불과하다.
실시예 1: 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4의 제조
1. TC1R4 유전자 발현 벡터의 구축
본 실시예에서 사용된 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4 전장 단백질 서열은 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열이며 전장 240aa이다. TC1R4 단백질 발현 후에 정제하기 위해, 본 발명에서 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단에 예를 들면 SEQ ID No. 4로 표시되는 아미노산 서열이 결합되어, 전장 246aa의 SEQ ID No. 5로 표시되는 아미노산 서열을 형성하였다. 대장균의 코돈에 대해, 이 아미노산 서열에 대응하는 코딩 서열에 대해 코돈 최적화를 실시하였고, 그 대응하는 유전자의 전장이 738bp이다(자세한 것은 SEQ ID No. 6에서 밑줄 친 서열을 참조). 그 후의 발현 벡터 구축이 용이하도록 코딩 서열의 5' 말단에 제한 효소 소화 부위 서열을 부가하고, 3' 말단에 종결 코돈 서열 및 제한 효소 소화 부위 서열을 부가하였다. 최적화된 유전자 서열은 GGTACC GAAAACCTGTATTTCCAGGGTGAAAAAGGTAGTCCGGGTGCAGATGGTCCGGCCGGTGCACCTGGTACACCGGGTCCTCAGGGCATTGCAGGCCAGCGTGGTGTTGTGGGCCTGCCGGGTCAGCGCGGTGAACGTGGTTTTCCGGGTCTGCCGGGTCCGAGCGGCGAACCTGGTAAACAGGGCCCGAGTGGTGCAAGCGGTGAAAAAGGCAGTCCGGGCGCAGATGGTCCTGCAGGTGCCCCTGGTACACCTGGTCCGCAGGGTATTGCAGGTCAGCGCGGCGTGGTGGGCCTGCCTGGTCAACGTGGCGAACGTGGTTTCCCGGGCCTGCCGGGACCGTCAGGTGAACCTGGCAAACAGGGCCCTAGCGGTGCAAGTGGCGAAAAAGGTAGCCCGGGCGCAGACGGCCCGGCAGGTGCACCTGGCACACCTGGTCCTCAGGGTATTGCGGGCCAGCGCGGCGTTGTTGGTCTGCCTGGCCAGCGTGGCGAACGCGGTTTTCCGGGCCTGCCTGGCCCGTCAGGCGAACCTGGAAAACAGGGCCCAAGTGGTGCAAGTGGTGAAAAAGGAAGTCCGGGCGCCGATGGCCCGGCCGGTGCGCCTGGTACGCCTGGTCCTCAAGGCATTGCCGGTCAGCGCGGAGTTGTTGGCCTGCCGGGCCAGCGTGGAGAACGCGGTTTCCCGGGTCTGCCTGGTCCGAGTGGTGAACCGGGTAAACAGGGTCCGAGCGGTGCATCA TAA CTCGAG(SEQ ID No. 6)이다.
북경 성원과맹 유전자 바이오테크놀로지 유한공사에 유전자 단편 합성을 의뢰하였고, 합성한 TC1R4 유전자 단편을 KpnI(NEB사 제품번호: R0136L) 및 XhoI(NEB사 제품번호: R0146L)의 효소 소화 부위를 통해 pET-32a 발현 벡터(EMD Biosciences(Novagen)사)에 삽입하여 대응하는 재조합 발현 플라스미드를 얻었다.
2. 재조합 발현 플라스미드의 형질전환
상기 성공적으로 구축된 발현 플라스미드를 대장균 감수성 세포 BL21(DE3) (Merck사)로 형질전환하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다. ① 1μL의 플라스미드를 100μL의 대장균 감수성 세포 BL21(DE3)에 취하여 얼음 위에 30분간 정치하고, ② 이 혼합물을 42℃의 수조(water bath)에서 90초간 가열한 후 신속하게 얼음 위에 2분간 정치하고, ③ 이 혼합물에 700μL 비저항성 LB(10g/L 단백질 펩톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L 염화나트륨)를 첨가하고, 37℃, 220rpm의 조건하에 1시간 동안 배양하고, ④ 200μL의 균액을 취하여 암피실린 함유 LB 플레이트 상(10g/L 단백질 펩톤, 5g/L 효모 추출물, 10g/L 염화나트륨, 15g/L 한천, 100㎍/mL 암피실린)에 균일하게 도포하고, ⑤ 뚜렷하게 보이는 콜로니가 성장할 때까지 플레이트를 37℃의 항온조에서 약 16시간 동안 도치 배양하였다.
3. 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4의 발현 유도
형질전환된 LB 플레이트에서 단클론 콜로니를 선택하고, 1000ml LB(100㎍/mL 암피실린 항생물질 포함) 배지 중에서 37℃, 220rpm으로 균액 OD600이 0.9 내지 1.1이 되도록 배양하고, 최종 농도 0.5mM의 IPTG(Sigma사, 제품번호: I5502-1G)를 첨가하여 발현을 유도하고, 유도 조건은 18℃, 220rpm으로 하룻밤 배양하였다. 마지막으로 원심분리하여 균체를 수집하고 -20℃에서 보관하거나 바로 다음 단계인 정제로 진행하였다.
4. 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4의 정제
Tris 완충액(25mM Tris, 200mM 염화나트륨, pH 8.0) 약 100ml로 상기 균체(1L) 침전물을 재현탁하고, 호모지나이저(GEA)로 세균을 파쇄한 후 17000rpm으로 30분간 원심분리하여 가용성 단백질과 봉입체를 완전히 분리시켰다.
5배 칼럼 용적의 결합 완충액(Binding buffer)(25mM Tris, 200mM NaCl, pH 8.0)을 사용하여 Ni6FF(Cytiva사, 제품번호: 30210) 친화성 칼럼을 평형화시켰다. 이어서, 단백질 상청액을 첨가하고 목적 재조합 단백질을 칼럼에 충분히 결합시켰다. 다음으로, 20mM 이미다졸(Sigma사) 함유 세척 완충액(washing buffer)(20mM 이미다졸, 25mM Tris, 200mM NaCl, pH 8.0)으로 단백질 불순물을 헹구고, 250mM 이미다졸 함유 용액(250mM 이미다졸, 25mM Tris, 200mM NaCl, pH 8.0)으로 목적 단백질을 용출하였다. 이어서 적당량의 TEV 프로테아제(Sigma, T4455)를 첨가하고 16℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 벡터 단백질이 제거되는 목적 콜라겐인 관통액을 채취하였다. 얻어진 생성물을 하룻밤 투석한 후 동결건조하여 건조 분말로 사용하였다.
5. 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4의 순도 검출
얻어진 TC1R4 단백질에 대해 SDS-PAGE로 순도를 측정하였다. 구체적인 과정은 다음과 같다. 정제된 단백질 용액 20μL를 취하고 5μl 5Х의 단백질 담지 완충액(250mM의 Tris-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 50% 글리세린, 5% β-메르캅토에탄올)을 첨가하여 100℃의 끓는 물에서 5분간 끓이고, 이어서 1웰당 10㎕를 SDS-PAGE 단백질 겔에 첨가하고 전압 150V에서 1시간 전기영동한 후 쿠마시 브릴리언트 블루 염색용액(0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250, 25% 에탄올, 10% 빙초산)으로 단백질 염색을 3분간 실시한 후, 단백질 탈색액(10% 아세트산, 5% 에탄올)을 이용해서 탈색을 실시하였다.
그 결과, 도 1에 나타내는 바와 같이 TC1R4는 전기영동으로 얻어진 겉보기 분자량이 38kDa으로 분자량이 TC1R4의 폴리펩티드에 대응하여, 폴리펩티드 TC1R4가 올바르게 발현되는 것으로 나타났다.
실시예 2: 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4의 질량 분석에 의한 검출
표 2에 기재된 조건에 따라 TC1R4 단백질의 질량 분석 측정을 실시하였다.
| 기기명 | 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화-비행시간형 질량 분석기 MALDI-TOF/TOF UltraflextremeTM, Brucker, Germany | ||
| 매트릭스 | CHCA | 레이저 광 에너지 | 125 |
| 데이터 검색 소프트웨어 | Mascot | 검색 대상 | ALL entries 또는 human |
| 검색 데이터베이스 | Swissprot | ||
DTT 환원 및 요오드아세트아미드알킬화 처리를 한 후, TC1R4 단백질 샘플에 트립신을 첨가하여 하룻밤 효소 분해시켰다. 효소 분해 후에 얻어진 펩티드 단편을 C18ZipTip으로 탈염하고, 그 후 플레이트 상에서 매트릭스 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid(CHCA)와 혼합하였다. 마지막으로 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화-비행시간형 질량 분석기 MALDI-TOF/TOF UltraflextremeTM, Brucker, Germany로 분석하였다(펩티드 매스 핑거프린팅 기술은 Protein J. 201635: 212-7을 참조).
데이터베이스 검색은 로컬 mascot 사이트의 Peptide Mass Fingerprint 웹페이지에서 처리하였다. 단백질 식별 결과는 효소 분해 후에 생성된 펩티드 단편의 1차 질량 분석에 기초해서 얻어졌다. 검색 파라미터: Trypsin 효소 분해, 2개의 결락된 절단 부위를 설정하였다. 시스테인의 알킬화는 고정 변형, 메티오닌의 산화는 가변 변형으로 하였다. 식별에 사용한 데이터베이스는 Swissprot이다.
질량 분석으로 검출된 분자량과 대응하는 폴리펩티드를 표 3에 기재하였다.
| 관측값 | Mr(예측값) | Mr(계산값) | 펩티드 |
| 2095.0960 | 2094.0888 | 2093.9339 | ADGAILVDFWAEWCGPCK(SEQ ID NO:7） |
| 2537.3652 | 2536.3579 | 2536.2306 | GERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEK(SEQ ID NO:8） |
| 2195.1865 | 2194.1792 | 2194.0655 | GFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEK(SEQ ID NO:9） |
| 4249.1329 | 4248.1256 | 4248.0585 | GERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR(SEQ ID NO:10） |
| 2971.5627 | 2970.5554 | 2970.4180 | QGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR(SEQ ID NO:11） |
| 2073.0969 | 2072.0896 | 2072.0036 | GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR(SEQ ID NO:12） |
| 882.5634 | 881.5561 | 881.5083 | GVVGLPGQR(SEQ ID NO:13） |
| 1224.7446 | 1223.7373 | 1223.6735 | GVVGLPGQRGER(SEQ ID NO:14） |
| 1638.9088 | 1637.9015 | 1637.8162 | GERGFPGLPGPSGEPGK(SEQ ID NO:15） |
| 2223.1981 | 2222.1909 | 2222.0716 | GERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID NO:16） |
| 1296.7342 | 1295.7269 | 1295.6510 | GFPGLPGPSGEPGK(SEQ ID NO:17） |
| 1880.9932 | 1879.9859 | 1879.9065 | GFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID NO:18） |
폴리펩티드의 서열과 비교함:
GEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGAS(SEQ ID NO:3)
계산 결과, 펩티드 단편의 피복률은 98.75%로 매우 신뢰성이 높은 검출 결과였다.
실시예 3: 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4의 생물 활성 검출
콜라겐 활성의 검출방법은 문헌 Juming Yao, Satoshi Yanagisawa, Tetsuo Asakura, Design, Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens, J Biochem. 136, 643-649(2004)를 참조할 수 있다. 구체적인 실시방법은 아래와 같다.
(1) 자외 흡수법에 의해, 상품화된 인간화 콜라겐(Sigma, C7774), 본 발명에서 제공된 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4, 재조합 III형 콜라겐 C1S4T, 재조합 III형 콜라겐 C1S5T(여기서, 상기 단백질 C1S4T, C1S5T의 서열은 출원번호가 201811254050.7인 특허출원을 참조)가 포함된 대상 단백질 샘플의 농도를 측정하였다.
구체적으로는 샘플에 대하여 215nm 및 225nm에서 자외 흡수를 각각 측정하고, 경험식 C(㎍/mL)=144Х(A215-A225)를 이용해서 단백질 농도를 계산하였다. A215<1.5인 경우에 검출해야 한다는 점에 유의해야 한다. 이 방법의 원리는 원자외광 하에서 펩티드 결합의 특징적 흡수를 측정하고, 발색단 함유량의 영향을 받지 않으며 간섭 물질이 적고 조작이 간단하며 쿠마시 브릴리언트 블루로 발색되지 않는 인간화 콜라겐 및 그 유사물을 검출하는 데에 적합하다(참고문헌: Walker JM. The Protein Protocols Handbook，second edition. HumanaPress. 43-45.). 단백질 농도를 측정한 후, PBS로 측정하고자 하는 모든 단백질의 농도를 0.5mg/ml로 조정하였다.
(2) 96 웰 플레이트에 각종 단백질 용액 및 블랭크 PBS 대조 용액을 100㎕ 첨가하고 실온에서 60분간 정치하였다.
(3) 각 웰에 (칭화대학 통페이 선생에게서 제공 받은) 배양 상태가 좋은 3T3 세포를 105개 넣고 37℃에서 60분간 인큐베이션하였다.
(4) 각 웰을 PBS로 4회 세척하였다.
(5) LDH 검출 키트(Roche, 04744926001)를 이용해서 OD492nm의 흡광도를 검출하였다. 빈 대조군의 수치로부터 세포 접착률을 산출할 수 있다. 계산식은 아래와 같다.
세포 접착률 = (시험 웰 - 빈 웰) × 100% / (양성 웰 - 빈 웰).
세포 접착률은 콜라겐의 활성을 반영할 수 있다. 단백질 활성이 높을수록 단시간에 세포가 벽에 접착하는 데에 도움이 되는 좋은 외부 환경을 제공할 수 있다.
도 2에 결과를 나타낸 바와 같이, 비교를 통해 본 발명의 재조합 I형 인간화 콜라겐 TC1R4는 상품화된 인간화 콜라겐, 재조합 III형 콜라겐 C1S4T, 재조합 III형 콜라겐 C1S5T보다 더 우수한 생물 접착 활성을 가지는 것을 알 수 있었다.
<110> SHANXI JINBO BIO-PHARMACEUTICAL CO., LTD.
<120> Recombinant Type I Humanized Collagen Polypeptide, and
Preparation Method therefor and Use thereof
<130> 23IP06003CN
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<151> 2021-08-23
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unit of Repeat sequence
<400> 1
Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly
1 5 10 15
Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu
20 25 30
Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser
50 55 60
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of hinge region
<400> 2
Gly Pro Pro Gly Pro Cys Cys Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 3
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of TC1R4
<400> 3
Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly
1 5 10 15
Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu
20 25 30
Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys Gly
50 55 60
Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro
65 70 75 80
Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg
85 90 95
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
100 105 110
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala
115 120 125
Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala
130 135 140
Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly
145 150 155 160
Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro
165 170 175
Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly
195 200 205
Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu
210 215 220
Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser
225 230 235 240
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequences cleaved off by TEV protease
<400> 4
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
1 5
<210> 5
<211> 246
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of TC1R4 with sequence that can be cleaved
off by TEV protease
<400> 5
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly
1 5 10 15
Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln
20 25 30
Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro
35 40 45
Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly
50 55 60
Ala Ser Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val
85 90 95
Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly
100 105 110
Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu
115 120 125
Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro
130 135 140
Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly
145 150 155 160
Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu
165 170 175
Pro Gly Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys Gly Ser Pro
180 185 190
Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly
195 200 205
Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu
210 215 220
Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln
225 230 235 240
Gly Pro Ser Gly Ala Ser
245
<210> 6
<211> 753
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> The DNA sequence of TC1R4 comprising the restriction site, stop
codon and sequence that can be cleaved off by TEV protease
<400> 6
ggtaccgaaa acctgtattt ccagggtgaa aaaggtagtc cgggtgcaga tggtccggcc 60
ggtgcacctg gtacaccggg tcctcagggc attgcaggcc agcgtggtgt tgtgggcctg 120
ccgggtcagc gcggtgaacg tggttttccg ggtctgccgg gtccgagcgg cgaacctggt 180
aaacagggcc cgagtggtgc aagcggtgaa aaaggcagtc cgggcgcaga tggtcctgca 240
ggtgcccctg gtacacctgg tccgcagggt attgcaggtc agcgcggcgt ggtgggcctg 300
cctggtcaac gtggcgaacg tggtttcccg ggcctgccgg gaccgtcagg tgaacctggc 360
aaacagggcc ctagcggtgc aagtggcgaa aaaggtagcc cgggcgcaga cggcccggca 420
ggtgcacctg gcacacctgg tcctcagggt attgcgggcc agcgcggcgt tgttggtctg 480
cctggccagc gtggcgaacg cggttttccg ggcctgcctg gcccgtcagg cgaacctgga 540
aaacagggcc caagtggtgc aagtggtgaa aaaggaagtc cgggcgccga tggcccggcc 600
ggtgcgcctg gtacgcctgg tcctcaaggc attgccggtc agcgcggagt tgttggcctg 660
ccgggccagc gtggagaacg cggtttcccg ggtctgcctg gtccgagtgg tgaaccgggt 720
aaacagggtc cgagcggtgc atcataactc gag 753
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 7
Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro
1 5 10 15
Cys Lys
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 8
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys
20 25
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 9
Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys
20
<210> 10
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 10
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala
20 25 30
Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala
35 40 45
Gly Gln Arg
50
<210> 11
<211> 34
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 11
Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser Gly Glu Lys Gly Ser Pro Gly Ala Asp
1 5 10 15
Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly
20 25 30
Gln Arg
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 12
Gly Ser Pro Gly Ala Asp Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly
1 5 10 15
Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg
20
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 13
Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg
1 5
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 14
Gly Val Val Gly Leu Pro Gly Gln Arg Gly Glu Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 15
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 16
Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly
1 5 10 15
Lys Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ser
20
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 17
Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys
1 5 10
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Partial sequence of mass spectrometry detection result of TC1R4
<400> 18
Gly Phe Pro Gly Leu Pro Gly Pro Ser Gly Glu Pro Gly Lys Gln Gly
1 5 10 15
Pro Ser Gly Ala Ser
20
Claims (10)
- 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드로서,
상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드는 SEQ ID No. 1로 표시되는 서열의 n개의 반복 서열을 포함하고, 여기서 n이 1 이상의 정수이고 n이 2 이상의 정수인 경우, 각 반복 서열끼리 직접 연결되고, 필요에 따라 상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 N 말단에 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함함.
- 청구항 1에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드로서,
상기 TEV 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 SEQ ID No. 4로 표시되는 서열을 포함하고, 바람직하게는 SEQ ID No. 4로 표시되는 서열과 SEQ ID No. 1로 표시되는 서열이 직접 연결됨.
- 청구항 1 또는 2에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드로서,
상기 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열;
b) SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열과 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열이면서 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 아미노산 서열;
c) SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기가 부가, 치환, 결실 또는 삽입된 아미노산 서열이면서, SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 아미노산 서열; 또는
d) SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 엄격한 조건하에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열이면서 SEQ ID No. 3으로 표시되는 아미노산 서열의 세포 접착 효과를 유지하는 아미노산 서열이고,
상기 엄격한 조건은 중(中) 엄격한 조건, 중-고(中－高) 엄격한 조건, 고(高) 엄격한 조건 또는 초고(超高) 엄격한 조건임.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 4에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 청구항 5에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 제조방법으로서,
① 청구항 6에 기재된 숙주 세포를 배지 중에서 배양하여 폴리펩티드를 제조하는 공정;
② 상기 폴리펩티드를 획득하여 정제하고, 바람직하게는 Ni 칼럼 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 상기 폴리펩티드를 정제하는 공정; 및
③ 임의로 상기 폴리펩티드를 효소 소화하고, 바람직하게는 TEV 프로테아제로 상기 폴리펩티드를 효소 소화하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
- 바람직하게는 조직 공학 제품, 화장품, 건강 식품 또는 의약품인 제품의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 용도.
- 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드를 포함하는 제품으로서, 이 제품이 조직 공학 제품, 화장품, 건강 식품 또는 의약품인 것이 바람직함.
- 세포 접착 촉진 작용을 갖는 제품의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 기재된 재조합 I형 인간화 콜라겐 폴리펩티드의 용도.
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