KR20220058631A - 재조합 치료 펩타이드의 발현을 위한 n-말단 연장부 서열 - Google Patents

재조합 치료 펩타이드의 발현을 위한 n-말단 연장부 서열 Download PDF

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나렌더 데브 만테나
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Abstract

본 발명은 재조합 치료 펩타이드의 발현을 향상시키기 위해 사용되는 N-말단 연장부 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 N-말단 연장부 서열을 사용하는 재조합 치료 펩타이드의 고-수준 발현을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 리라펩타이드와 같은 생물학적 활성 단백질의 효율적인 생산을 위한 핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포를 제공한다.

Description

재조합 치료 펩타이드의 발현을 위한 N-말단 연장부 서열
본 발명은 재조합 치료 펩타이드의 고-수준 발현을 위한 N-말단 연장부 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 N-말단 연장부 서열을 사용한 재조합 치료 펩타이드의 고-수준 발현을 위한 방법에 관한 것이다.
1920년대에 인슐린 치료법이 출현한 이후로 의료 행위에서 펩타이드 치료제가 주목할 만한 역할을 하고 있다. 현재, 시장에 60개 이상의 승인된 펩타이드 약물이 나와 있으며, 그 수는 크게 증가할 것으로 예상되고 있다.
글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1)은 프로글루카곤 펩타이드의 조직-특이적 번역후 프로세싱으로부터 유래된 31개 아미노산 길이의 펩타이드 호르몬이다. 이는 식품 소비 시에 뇌간에 있는 단일 경로(solitary tract)의 핵 내의 특정 뉴런 및 장의 장내분비 L-세포에 의해 생산 및 분비된다. 리라글루타이드는 지속성 글루카곤-유사 펩타이드-1 수용체 효능제로서 사용되어, 인슐린 분비를 자극하는 내인성 물질 대사 호르몬 GLP-1과 동일한 수용체에 결합하는 인간 인크레틴(물질 대사 호르몬), 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1)의 유도체이다.
테리파라타이드(teriparatide)는 호르몬의 생활성 부분인, 첫번째 (N-말단) 34개의 아미노산으로 이루어진 재조합 단백질 형태의 부갑상선 호르몬이다. 이는 일부 형태의 골다공증의 치료에서 사용되는 효과적인 단백 동화(골 형성을 증진시키는) 제제이다.
발현 플라스미드는 인헨서 및 프로모터 영역으로서 작용하는 조절 서열을 함유하고 발현 벡터 상에 보유된 유전자의 효율적인 전사로 이어지도록 조작된다. 잘 설계된 발현 벡터의 목표는 단백질의 효율적인 생산이며, 이는 상당한 양의 안정한 메신저 RNA를 합성함으로써 달성될 수 있다.
발현의 엄격한 통제를 가하는 발현 벡터를 설계하는 것이 가능하며, 단백질은 적합한 발현 조건의 사용을 통해 필요할 때에만 대량으로 생산된다. 유전자 발현의 엄격한 통제가 없는 경우에도, 단백질은 또한, 구성적으로 발현될 수 있다.
미국특허 제4,916,212호에는 DNA-서열 코딩 생합성 인슐린 전구체, 및 효모 세포에서 인슐린 전구체 및 인간 인슐린을 제조하기 위한 공정이 개시되어 있다.
미국특허 제7,572,884호에는 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 리라글루타이드의 전구체인 재조합 리라펩타이드를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
IN 201741024763 A호에는 효모 세포에서 신호 펩타이드의 올리고뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 합성 올리고뉴클레오타이드 코딩 리라펩타이드의 발현에 의한 리라글루타이드의 제조 공정이 개시되어 있다.
WO 1998/008871 A1호에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 GLP-1의 유도체 및 이의 유사체가 개시되어 있다.
WO 1998/008872 A1호에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 GLP-2의 유도체가 개시되어 있다.
WO 1999/043708 A1호에는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된, 유도체 엑센딘(exendin) 및 GLP-1(7-C)이 개시되어 있다.
WO 2017/021819 A1호에는 유비퀴틴 융합 작제물로서 원핵 세포에서 원하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드의 발현에 의한 펩타이드 또는 단백질 또는 이의 유도체의 제조 공정이 개시되어 있다.
문헌[Avicenna J Med Biotech 2017; 9(1): 19-22]에는 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 인간 부갑상선 호르몬(PTH)의 재조합 생활성 부분인 테리파라타이드(1-34)의 과발현이 개시되어 있다.
본 발명의 발명자는, 재조합 치료 펩타이드의 발현을 여러 배수만큼 향상시키려는 이의 노력으로, 상기에 언급된 종래 기술에 개시되지 않은 짧은 N-말단 연장부 서열의 사용을 제시하였다.
본 발명의 목적
본 발명의 목적은 치료 펩타이드의 여러 배수의 고-수준 발현을 제공하는 것이다.
본 발명의 개요
본 발명은 리라펩타이드와 같은 생물학적 활성 펩타이드의 효율적인 생산을 위한 N-말단 연장부, 핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 리라펩타이드를 코딩하는 핵산이 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위 및 N-말단 연장부(NE-3)를 코딩하는 변형된 유전자 서열에 작동 가능하게 융합된 발현 작제물을 제공함으로써 숙주 세포에서 고수율의 펩타이드, 예를 들어, 리라펩타이드를 달성하기 위한 다차원 방식을 고려한다.
본 발명은 박테리아 또는 효모에서 치료 펩타이드의 발현을 향상시키기 위한 서열번호 1에 기술된 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 제공한다.
본 발명은 또한, 리라펩타이드의 고-수분 발현을 위한 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서, 발현 벡터는 N-말단 연장부 서열 NE-3을 코딩하는 변형된 유전자 서열, TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열, 및 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열을 포함한다.
도 1a: N-말단 연장부가 없는 발현 카세트의 개략도.
도 1b: N-말단 연장부(NE1)를 갖는 발현 카세트의 개략도.
도 1c: N-말단 연장부(NE3)를 갖는 발현 카세트의 개략도.
도 2a: N-말단 연장부가 없는 발현 플라스미드.
도 2b: N-말단 연장부-1(NE1)을 갖는 발현 플라스미드.
도 2c: N-말단 연장부-3(NE3)을 갖는 발현 플라스미드.
도 3: ELISA에 의한 리라펩타이드 발현.
도 4: 리라펩타이드의 건조 세포 중량.
서열 목록의 설명
서열번호 1(N-말단 연장부 서열 NE-3의 아미노산 서열)
EEQAE
서열번호 2(변형된 TEV 절단 부위의 아미노산 서열)
ENLYFQ
서열번호 3(리라펩타이드의 아미노산 서열)
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
서열번호 4(파키아 파스토리스( Pichia pastoris )에 대한 N-말단 연장부 NE-3 서열을 코딩하는 핵산 서열)
gaagaacaagccgaa
서열번호 5(파키아 파스토리스에 대한 변형된 TEV 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열)
gagaacttgtacttccaa
서열번호 6(파키아 파스토리스에 대한 리라펩타이드를 코딩하는 핵산 서열)
cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
서열번호 7(코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum )에 대한 N-말단 연장부 NE-3 서열을 코딩하는 핵산 서열)
gaagaacaggcagaa
서열번호 8(코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 변형된 TEV 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열)
gaaaacctgtacttccag
서열번호 9(코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 리라펩타이드를 코딩하는 핵산 서열)
cacgcagaaggcacctttacctccgatgtgtcctcctacctggaaggccaggcagcaaaagaattcattgcatggctggt tcgcggtcgcggttag
서열번호 10(에셔리키아 콜라이( Escherichia coli )에 대한 N-말단 연장부 NE-3 서열을 코딩하는 핵산 서열)
gaagaacaggcagaa
서열번호 11(에셔리키아 콜라이에 대한 변형된 TEV 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열)
gaaaacctgtacttccag
서열번호 12(에셔리키아 콜라이에 대한 리라펩타이드를 코딩하는 핵산 서열)
catgcggaaggcaccttcaccagcgatgttagcagctacctggagggtcaggcggcgaaggaatttatcgcgtggctggttcgtggccgtggttaa
서열번호 13(바실러스 서브틸리스( Bacillus subtilis )에 대한 N-말단 연장부 NE-3 서열을 코딩하는 핵산 서열)
gaagaacaagccgaa
서열번호 14(바실러스 서브틸리스에 대한 변형된 TEV 절단 부위를 코딩하는 핵산 서열)
gagaacttgtacttccaa
서열번호 15(바실러스 서브틸리스에 대한 리라펩타이드를 코딩하는 핵산 서열)
cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
서열번호 16(테리파라타이드의 아미노산 서열)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF
서열번호 17(N-말단 연장부 서열 NE-1의 아미노산 서열)
EEA
서열번호 18(N-말단 연장부 NE-1 서열을 코딩하는 핵산 서열)
gaggaagcg
서열번호 19(N-말단 연장부 서열 NE-3 및 TEV 절단 부위에 작동 가능하게 융합된 리라펩타이드를 포함하는 융합 단백질)
EEQAEENLYFQHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
서열번호 20(N-말단 연장부 서열 NE-1 및 TEV 절단 부위에 작동 가능하게 융합된 리라펩타이드를 포함하는 융합 단백질)
EEAENLYFQHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
정의
달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 방법이 속하는 당업자에 의해 통상적 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 벡터, 숙주 세포, 방법, 및 조성물이 또한 벡터, 숙주 세포, 방법, 및 조성물의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 대표적인 예시가 여기에 기술된다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 그러한 범위의 상한치와 하한치 사이의 각 중간 값 및 그러한 기술된 범위에서 임의의 다른 기술된 또는 중간 값이 방법 및 조성물에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 더 작은 범위에 독립적으로 포함될 수 있고, 또한, 방법 및 조성물 내에 포함되며, 단, 기술된 범위에서 한계를 특별히 제한하지 않는다. 기술된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우에, 그러한 포함된 한계 중 어느 하나 또는 둘 모두를 배제한 범위는 또한, 방법 및 조성물에 포함된다.
명확성을 위해 별도의 구현예의 맥락에서 기술된 방법의 특정의 특징이 또한, 단일 구현예에서 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인식된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에 기술된 방법 및 조성물의 다양한 특징은 또한, 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다. 본원에서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것이 주지된다. 청구항이 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 것이 추가로 주지된다. 이와 같이, 이러한 기술은 청구항 요소의 인용 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독으로," 및 "오직" 등으로서 이러한 배타적인 용어의 사용에 대한 선행 근거로서 제공하도록 의도된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 개별적인 구현예들 각각은 본 방법의 범위 또는 사상을 벗어나지 않고 임의의 다른 구현예의 특징과 용이하게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개의 요소 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건들의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 발현 작제물의 대상에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함한다. 본 발명의 목적을 위한 숙주 세포는 본 발명의 목적을 위해 적합하게 사용될 수 있는 파키아 파스토리스, 사카로미세스 세레비시애, 코리네박테리움 글루타미쿰, 에셔리키아 콜라이, 및 바실러스 서브틸리스의 임의의 균주를 지칭한다.
용어 "재조합 균주" 또는 "재조합 숙주 세포"는 본 발명의 발현 작제물 또는 벡터와 트랜스펙션되거나 변형된 숙주 세포를 지칭한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은 숙주로의 변형 후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 설계된 임의의 벡터, 플라스미드 또는 비히클을 지칭한다.
용어 "프로모터"는 유전자의 전사가 시작하는 위치를 규정하는 DNA 서열을 지칭한다. 프로모터 서열은 통상적으로, 전사 개시 부위의 5' 단부의 바로 업스트림에 또는 이의 5' 단부에 위치된다. RNA 폴리머라제 및 필요한 전사 인자는 프로모터 서열에 결합하고, 전사를 개시한다. 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 프로모터는 이의 발현이 일반적으로 환경적 및 발달적 인자에 의해 컨디셔닝되지 않기 때문에, 이의 관련된 유전자의 지속적인 전사를 허용하는 프로모터이다. 구성적 프로모터가 유도인자-부재 조건 하에서 유전자 발현을 유도하고 종종 통상적으로 사용되는 유도성 프로모터보다 더 양호한 특징을 나타내기 때문에 구성적 프로모터는 유전 공학에서 매우 유용한 툴이다. 유도성 프로모터는 생물학적 또는 비생물학적 및 화학적 또는 물리적 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도되는 프로모터이다. 유도성 프로모터는, 이러한 것에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현이 유기체, 또는 특히, 조직 또는 세포의 발달 또는 성장의 특정 단계에서 작동하거나 작동하지 않을 수 있기 때문에, 유전 공학에서 매우 강력한 툴이다.
용어 "발현"은 코딩 서열에 의해 코딩된 생성물의 생물학적 생산을 지칭한다. 대부분의 경우에, 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열은 메신저-RNA(mRNA)를 형성하기 위해 전사된다. 메신저-RNA는 이후에, 관련된 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드 생성물을 형성하기 위해 번역된다. 또한, 발현 공정은 인트론을 제거하기 위한 스플라이싱(splicing) 및/또는 폴리펩타이드 산물의 번역후 프로세싱과 같은 전사의 RNA 산물에 대한 추가 프로세싱 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 핵산"은 서열번호 19 또는 서열번호 20으로 나타낸 변형된 리라펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 지칭하기 위해 사용된다. 기능적 변이체는 서열번호 19 또는 서열번호 20과 실질적인 또는 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 임의의 핵산을 포함하며, 이는 단백질의 생물학적 활성을 보유한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 펩타이드 결합 또는 변형된 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 본원에서 서로 교환 가능하게 사용된다. 이러한 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공의 화학적 모방체(mimetic)뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 폴리머, 변형된 잔기를 함유하는 것, 및 비-자연 발생 아미노산 폴리머인 아미노산 폴리머에 적용한다. "폴리펩타이드"는 통상적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 올리고머로서 지칭되는 짧은 사슬, 및 일반적으로, 단백질로서 지칭되는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다. 폴리펩타이드는 20개의 유전자-코딩된 아미노산이 아닌 아미노산을 함유할 수 있다. 마찬가지로, "단백질"은 적어도 2개의 공유 결합된 아미노산을 지칭하며, 이는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함한다. 단백질은 자연 발생 아미노산 및 펩타이드 결합, 또는 합성 펩티도미메틱 구조로 구성될 수 있다. 이에 따라, 본원에서 사용되는 "아미노산", 또는 "펩타이드 잔기"는 자연 발생 아미노산 및 합성 아미노산 둘 모두를 의미한다. "아미노산"은 프롤린 및 하이드록시프롤린과 같은 이미노산 잔기를 포함한다. 측쇄는 (R) 또는 (S) 배열일 수 있다.
용어 "N-말단 연장부"는 원하는 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산에 제거 가능하게 연결된 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, N-말단 연장부는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 리라펩타이드와 같은 생물학적 활성 펩타이드의 효율적인 생산을 위한 N-말단 연장부, 핵산, 벡터, 및 재조합 숙주 세포를 개시한다.
본 발명은 리라펩타이드를 코딩하는 핵산이 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위 및 N-말단 연장부(NE-3)를 코딩하는 변형된 유전자 서열에 작동 가능하게 융합된 발현 작제물을 제공함으로써 숙주 세포에서 고수율의 재조합 리라펩타이드를 달성하기 위한 다차원적 접근 방식을 고려한다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1에 기술된 N-말단 연장부 서열(NE-3)에 관한 것이다. 본 발명은 박테리아 또는 효모에서, 서열번호 1에 기술된 짧은 N-말단 연장부 서열을 사용하여 재조합 치료 펩타이드의 여러 배수만큼 향상된 발현을 위한 공정에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 서열번호 1에 기술된 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 핵산은 또한, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
재조합 치료 펩타이드의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 파키아 파스토리스 및 사카로미세스 세레비시애를 포함하는 효소와 같은(이로 제한되지 않음) 진핵 숙주로부터 선택된다. 코리네박테리움 글루타미쿰, 에셔리키아 콜라이 및 바실러스 서브틸리스와 같은(이로 제한되지 않음) 박테리아 숙주가 또한 사용될 수 있다.
용어 치료 펩타이드는 펩타이드, 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 리라펩타이드, 테리파라타이드, 및 엑세나타이드 등을 포함한다.
당업자에게 공지된 구성적 또는 유도성 프로모터는 본 발명의 하나 이상의 구현예에서 발현 카세트에서 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 프로모터, 신호 서열, N-말단 연장부(NE-3), 리라펩타이드 또는 테리파라타이드를 위해 코딩하는 유전자, TEV 절단 부위 및 종결인자를 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 효모에서 치료 펩타이드의 발현을 향상시키기 위해 서열번호 1에 기술된 N-말단 연장부 서열을 제공하며, 여기서, 효모는 파키아 파스토리스, 사카로미세스 세레비시애, 코리네박테리움 글루타미쿰, 에셔리키아 콜라이 및 바실러스 서브틸리스이다.
본 발명은 또한, 서열번호 2에 기술된 아미노산 서열을 갖는 TEV 절단 부위를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1에 기술된 N-말단 연장부 서열을 사용하여 박테리아 또는 효모에서 서열번호 3에 기술된 리라펩타이드 및 서열번호 16에 기술된 테리파라타이드의 발현 향상을 제공한다.
원핵 단백질 또는 진핵 단백질의 발현을 위한 당업자에게 공지된 발현 작제물은 본 발명의 하나 이상의 구현예에서 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. N-말단 연장부 서열(NE3)을 코딩하는 변형된 유전자 서열,
2. TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열, 및
3. 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열
을 포함하는, 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 발현 작제물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. 서열번호 4에 기술된 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 유전자 서열,
2. 서열번호 5에 기술된 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 유전자 서열, 및
3. 서열번호 6에 기술된 리라펩타이드를 코딩하는 유전자 서열
을 포함하는, 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 발현 작제물을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6에 기술된 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터(발현 작제물)의 작제화,
2. 발현 작제물의 파키아 파스토리스로의 변형,
3. 클론의 평가 및 이의 선택,
4. 선택된 클론의 발효 공정 처리,
5. 리라펩타이드의 단리 및 정제, 및
6. 정제된 리라펩타이드로부터 N-말단 연장부 서열의 절단
을 포함하는, 파키아 파스토리스에서 서열번호 3에 기술된 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. 서열번호 7에 기술된 N-말단 연장부 서열을 코딩하는 유전자 서열,
2. 서열번호 8에 기술된 TEV 절단 부위를 코딩하는 유전자 서열, 및
3. 서열번호 9에 기술된 리라펩타이드를 코딩하는 유전자 서열
을 포함하는, 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 발현 작제물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9에 기술된 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터(발현 작제물)의 작제화,
2. 발현 작제물의 코리네박테리움 글루타미쿰로의 변형,
3. 클론의 평간 및 이의 선택,
4. 선택된 클론의 발효 공정 처리,
5. 리라펩타이드의 단리 및 정제, 및
6. 정제된 리라펩타이드로부터 N-말단 연장부 서열의 절단
을 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 서열번호 3에 기술된 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 방법을 제공한다.
본 발명은
1. 서열번호 10에 기술된 N-말단 연장부 서열을 코딩하는 유전자 서열,
2. 서열번호 11에 기술된 TEV 절단 부위를 코딩하는 유전자 서열, 및
3. 서열번호 12에 기술된 리라펩타이드를 코딩하는 유전자 서열
을 포함하는, 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 발현 작제물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12에 기술된 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터(발현 작제물)의 작제화,
2. 발현 작제물의 에셔리키아 콜라이로의 변형,
3. 클론의 평가 및 이의 선택,
4. 선택된 클론의 발효 공정 처리,
5. 리라펩타이드의 단리 및 정제, 및
6. 정제된 리라펩타이드로부터 N-말단 연장부 서열의 절단
을 포함하는, 에셔리키아 콜라이에서 서열번호 3에 기술된 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 방법을 제공한다.
본 발명은
1. 서열번호 13에 기술된 N-말단 연장부 서열을 코딩하는 유전자 서열,
2. 서열번호 14에 기술된 TEV 절단 부위를 코딩하는 유전자 서열, 및
3. 서열번호 15에 기술된 리라펩타이드를 코딩하는 유전자 서열
을 포함하는, 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 발현 작제물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 또한,
1. 서열번호 13, 서열번호 14 및 서열번호 15에 기술된 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터(발현 작제물)의 작제화,
2. 발현 작제물의 바실러스 서브틸리스로의 변형,
3. 클론의 평가 및 이의 선택,
4. 선택된 클론을 발효 고정으로 처리함,
5. 리라펩타이드의 단리 및 정제, 및
6. 정제된 리라펩타이드로부터 N-말단 연장부 서열의 절단
을 포함하는, 바실러스 서브틸리스에서 서열번호 3에 기술된 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 N-말단 연장부 서열을 포함하는 발현 작제물을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 서열번호 16에 기술된 테리파라타이드의 고-수준 발현을 제공한다.
본 발명은 N-말단 연장부 서열을 포함하는 발현 작제물을 사용하여 파키아 파스토리스에서 서열번호 16에 기술된 테리파라타이드의 고-수준 발현을 제공한다.
본 발명은
1. 재조합 벡터(발현 작제물)의 작제화 단계,
2. 발현 작제물의 코리네박테리움 글루타미쿰으로의 변형 단계,
3. 클론의 평가 및 이의 선택 단계,
4. 선택된 클론을 발효 공정으로 처리하는 단계,
5. 테리파라타이드의 단리 및 정제 단계, 및
6. 정제된 테리파라타이드로부터 N-말단 연장부 서열의 절단 단계
를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 서열번호 16에 기술된 테리파라타이드의 고-수준 발현을 제공한다.
본 발명은 또한,
1. 재조합 벡터(발현 작제물)의 작제화 단계,
2. 작제화된 벡터를 파키아 파스토리스로의 변형 단계,
3. 클론의 평가 및 이의 선택 단계,
4. 선택된 클론을 발효 공정으로 처리하는 단계,
5. 테리파라타이드의 단리 및 정제 단계, 및
6. 정제된 테리파라타이드로부터 N-말단 연장부 서열의 절단 단계
를 포함하는, 파키아 파스토리스에서 테리파라타이드의 발현을 향상시키기 위한 서열번호 1에 기술된 N-말단 연장부 서열을 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 리라펩타이드가 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위 및 N-말단 연장부 서열(NE-3)에 작동 가능하게 융합되며, 변형된 리라펩타이드가 서열번호 19에 기술된 것인 변형된 리라펩타이드를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 숙주 세포를 사용하여 리라펩타이드를 발현시키는 방법으로서, 발효 공정은
a. BMGY 배지 중에서 재조합 숙주 세포를 약 24시간 동안 배양하는 단계;
b. 원심분리에 의해 재조합 숙주 세포를 수확하는 단계;
c. BMMY 배지 중에 재조합 숙주 세포를 약 10의 OD600nm까지 재현탁하는 단계;
d. 쉐이커 인큐베이터에서 30℃에서 약 24시간 동안 숙주 세포를 인큐베이션하는 단계;
e. 배양 상청액을 수확 및 정제하여 리라펩타이드를 수득하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
인간 GLP-1의 유사체인 리라글루타이드는 GLP-1 수용체 효능제로서 작용한다. 리라글루타이드는 펩타이드 전구체(서열번호 3에 기술된 리라펩타이드)의 위치 26에서 잔류 라이신 잔기 상에 글루탐산 스페이서와 C-16 지방산(팔미트산)을 결합시킴으로써 제조된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여, 1-메틸 팔미틸 글루탐산과 같은 팔미틸 글루타메이트 유도체와 본 발명에 따라 생성된 리라펩타이드의 컨쥬게이션을 포함하는, 리라글루타이드의 제조를 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 팔미틸 글루타메이트 유도체와 본 발명에 따라 제조된 리라펩타이드의 컨쥬게이션을 포함하는 리라글루타이드의 제조를 제공하며, 여기서, 유도체는 예를 들어, 메틸(1-메틸 팔미틸 글루탐산), 에틸, 프로필, 프로프-2-일, 부틸, 부트-2-일, 2-메틸프로프-1-일, 2-메틸-프로프-2-일(3차-부틸), 헥실 등이다. 이러한 컨주게이션 반응은 커플링 시약의 존재 하에서 수행된다. 커플링제는 DIC/6-Cl-HOBt, DIC/HOBt, HBTU/HOBt/DIEA 또는 DIC/옥시마의 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은
a. 적합한 배양 배지 중에서 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하여, 리라펩타이드를 수득하는 단계;
b. 리라펩타이드를 리라글루타이드로 전환시키는 단계
를 포함하며, 방법은 팔미틸 글루타메이트 유도체와 단계 (a)에서 수득된 리라펩타이드의 컨쥬게이션을 포함하는, 리라글루카이드를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 더욱 완전한 이해는 하기 특정 실시예를 참조함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 실시예는 예시의 목적을 위해서만 기술되고, 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 특정 용어가 본원에서 사용되었지만, 이러한 용어는 제한의 목적을 위한 것이 아니고 설명적인 의미로 의도된다.
[실시예]
실시예 1: 리라펩타이드의 발현을 위한 변형된 핵산
리라글루타이드 전구체 펩타이드를 위해 코딩하는 발현 카세트를 파키아 파스토리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 에셔리키아 콜라이 및 바실러스 서브틸리스에서 최적의 발현을 위해 변형하였다. 변형된 개방 판독 프레임은 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 서열 및 N-말단 연장부(NE-3 또는 NE-1)를 코딩하는 서열에 융합된 리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 파키아 파스토리스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 에셔리키아 콜라이 및 바실러스 서브틸리스에서 발현을 위한 바람직한 코돈은 희귀 코돈 대신에 사용되었다.
대조군으로서, 어떠한 N-말단 연장부도 없이 리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 개방 판독 프레임을 제조하였다.
파키아 파스토리스에서 발현을 위한
파키아 파스토리스에서 발현하기 위해, 리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 N-말단 연장부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시켰다.
리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 6에 나타나 있다. TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 5에 나타나 있다. N-말단 연장부(NE-3)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4에 나타나 있다.
이러한 변형된 개방 판독 프레임은 리라펩타이드를 위한 서열, TEV 절단 부위를 위한 서열, 및 N-말단 연장부를 위한 서열을 사용하여 인공적으로 합성되었다.
N-말단 연장부가 없는(도 1a), 및 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 서열(GAGAACTTGTACTTCCAA) 및 신호 서열 카세트와 함께, N-말단 연장부-1(NE1)(GAGGAAGCG-도 1b), N-말단 연장부-3(NE3)(GAAGAACAAGCCGAA-도 1c)을 갖는, 리라펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함하는 변형된 개방 판독 프레임은 도 1에 나타나 있다.
재조합 리라펩타이드를 위해 코딩하는 변형된 서열을 pD912 발현 벡터(Atum, USA)에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 개방 판독 프레임 및 프로모터를 함유한다.
pD912의 벡터 맵은 도 1에 도시되어 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 발현을 위한
코리네박테리움 글루타미쿰에서 발현하기 위해, 리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드, TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 N-말단 연장부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시켰다.
리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 나타나 있다. TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8에 나타나 있다. N-말단 연장부(NE-3)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 7에 나타나 있다.
이러한 변형된 개방 판독 프레임은 리라펩타이드를 위한 서열, TEV 절단 부위를 위한 서열 및 N-말단 연장부를 위한 서열을 사용하여 Thermo Fisher Scientific 기술을 이용하여 인공적으로 합성되었다.
재조합 리라펩타이드를 위해 코딩하는 변형된 서열을 pD912 발현 벡터(Atum, USA)에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 개방 판독 프레임 및 프로모터를 함유한다.
에셔리키아 콜라이에서 발현을 위한
에셔리키아 콜라이에서 발현하기 위해, 리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 N-말단 연장부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시켰다.
리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 12에 나타나 있다. TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11에 나타나 있다. N-말단 연장부(NE-3)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 10에 나타나 있다.
이러한 변형된 개방 판독 프레임은 리라펩타이드를 위한 서열, TEV 절단 부위를 위한 서열 및 N-말단 연장부를 위한 서열을 사용하여 인공적으로 합성되었다.
재조합 리라펩타이드를 위해 코딩하는 변형된 서열을 pD912 발현 벡터(Atum, USA)에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 개방 판독 프레임 및 프로모터를 함유한다.
바실러스 서브틸리스에서 발현을 위한
바실러스 서브틸리스에서 발현하기 위해, 리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 및 N-말단 연장부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변형시켰다.
리라펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 15에 나타나 있다. TEV 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 14에 나타나 있다. N-말단 연장부(NE-3)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13에 나타나 있다.
이러한 변형된 개방 판독 프레임은 리라펩타이드를 위한 서열, TEV 절단 부위를 위한 서열 및 N-말단 연장부를 위한 서열을 사용하여 인공적으로 합성되었다.
재조합 리라펩타이드를 위해 코딩하는 변형된 서열을 pD912 발현 벡터(Atum, USA)에 클로닝하였다. 재조합 플라스미드는 개방 판독 프레임 및 프로모터를 함유한다.
플라스미드 DNA의 선형화의 확인
N-말단 연장부, N-말단 연장부-1, N-말단 연장부-3 및 플라스미드 pD912 없이 리라펩타이드를 코딩하는 합성 DNA를 EcoRI 및 BglII 제한 효소로 소화시켰다. 제한 소화된 단편을 에셔리키아 콜라이 균주에 결찰 및 변형시켰다. N-말단 연장부 없이(도 2a), N-말단 연장부-1(도 2b), N-말단 연장부-3(도 2c)을 갖는 리라펩타이드 발현 카세트를 함유한 얻어진 플라스미드를 리라펩타이드, N-말단 연장부, 및 TEV 절단 서열을 확인하게 위해 시퀀싱하였다. 서열 확인된 플라스미드 DNA를 Sac I 효소로 선형화하였다.
실시예 2: 재조합 플라스미드로의 변형에 의한 재조합 숙주 세포의 개발
신호 펩타이드에 융합된 리라글루타이드 전구체 펩타이드를 위한 유전자를 지닌 상기 실시예에 기술된 재조합 pD912 플라스미드를 재조합 숙주의 개발을 위해 사용하였다.
파키아 파스토리스 숙주 세포(Atum, USA로부터 획득됨)를 전기천공 방법에 의해 플라스미드를 사용하여 변형시켰다.
변형된 세포를 100 ㎍/ml 제오신을 함유한 YPD 아가(Yeast Peptone Dextrose) 플레이트 상에 플레이팅하였다. 변형된 파키아 파스토리스 세포를 20 ml BMGY 배지 중에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 20 ml BMMY 배지 중에서 10의 OD600nm까지 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 쉐이커 인큐베이터에서 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
실시예 3: 리라펩타이드 발현의 분석 및 평가
24시간 동안, 배양 상청액을 수확하고, 정제하고, 리라펩타이드에 대해 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 ELISA에 의해 리라펩타이드 발현에 대해 분석하였다(도 3). 또한, 건조 세포 중량을 수분 분석기를 이용하여 측정하였다(도 4).
표 1 및 표 2는 리라펩타이드의 수율을 개선시키는 데 N-말단 연장부의 효능를 규명하는 비교를 제공한다.
표 1: 상이한 N-말단 연장부, 및 N-말단 연장부가 없는 대조군과 비교한 리라펩타이드 발현
Figure pct00001
표 2: 상이한 N-말단 연장부, 및 N-말단 연장부가 없는 대조군과 비교한 리라펩타이드 발현의 배수 변화
Figure pct00002
상기 데이터는, N-말단 연장부가 대조군 및 공지된 N-말단 연장부와 비교하여 리라펩타이드의 발현을 약 5배만큼 개선시킬 수 있다는 것을 명확하게 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Biological E Limited <120> N-TERMINAL EXTENSION SEQUENCE FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT THERAPEUTIC PEPTIDES <130> IP46941 <150> IN201941009728 <151> 2019-09-13 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Amino acid sequence of N-terminal extension sequence NE-3 <400> 1 Glu Glu Gln Ala Glu 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Amino acid sequence of the modified TEV cleavage site <400> 2 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Amino acid sequence of Lirapeptide <400> 3 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the N-terminal extension NE-3 sequence for Pichia pastoris <400> 4 gaagaacaag ccgaa 15 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the modified TEV cleavage site for Pichia pastoris <400> 5 gagaacttgt acttccaa 18 <210> 6 <211> 96 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the lirapeptide for Pichia pastoris <400> 6 cacgctgagg gtacttttac ctctgacgtg tcctcttact tggagggtca agctgccaaa 60 gagttcattg cctggttggt tagaggtaga ggttag 96 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the N-terminal extension NE-3 sequence for Corynebacterium glutamicum <400> 7 gaagaacagg cagaa 15 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the modified TEV cleavage site for Corynebacterium glutamicum <400> 8 gaaaacctgt acttccag 18 <210> 9 <211> 96 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the lirapeptide for Corynebacterium glutamicum <400> 9 cacgcagaag gcacctttac ctccgatgtg tcctcctacc tggaaggcca ggcagcaaaa 60 gaattcattg catggctggt tcgcggtcgc ggttag 96 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the N-terminal extension NE-3 sequence for Escherichia coli <400> 10 gaagaacagg cagaa 15 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the modified TEV cleavage site for Escherichia coli <400> 11 gaaaacctgt acttccag 18 <210> 12 <211> 96 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the lirapeptide for Escherichia coli <400> 12 catgcggaag gcaccttcac cagcgatgtt agcagctacc tggagggtca ggcggcgaag 60 gaatttatcg cgtggctggt tcgtggccgt ggttaa 96 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the N-terminal extension NE-3 sequence for Bacillus subtilis <400> 13 gaagaacaag ccgaa 15 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the modified TEV cleavage site for Bacillus subtilis <400> 14 gagaacttgt acttccaa 18 <210> 15 <211> 96 <212> DNA <213> ARTIFICIAL <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the lirapeptide for Bacillus subtilis <400> 15 cacgctgagg gtacttttac ctctgacgtg tcctcttact tggagggtca agctgccaaa 60 gagttcattg cctggttggt tagaggtaga ggttag 96 <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> Amino acid sequence of teriparatide <400> 16 Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn 1 5 10 15 Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His 20 25 30 Asn Phe <210> 17 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of N-terminal extension sequence NE-1 <400> 17 Glu Glu Ala 1 <210> 18 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding the N-terminal extension NE-1 sequence <400> 18 gaggaagcg 9 <210> 19 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising lirapeptide operably fused to N-terminal extension sequence NE-3 and TEV cleavage site <400> 19 Glu Glu Gln Ala Glu Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr 1 5 10 15 Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu 20 25 30 Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 35 40 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein comprising lirapeptide operably fused to N-terminal extension sequence NE-1 and TEV cleavage site <400> 20 Glu Glu Ala Glu Asn Leu Tyr Phe Gln His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 1 5 10 15 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 20 25 30 Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 35 40

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단 연장부.
  2. 제1항에 청구된 N-말단 연장부를 코딩하는 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10 및 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택된 핵산.
  4. 제3항에 청구된 변형된 핵산을 포함하는 벡터.
  5. 제4항에 있어서, pD912인 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택된 변형된 TEV 절단 부위를 포함하는 벡터.
  7. 리라펩타이드(lirapeptide)의 재조합 발현을 위한 벡터로서,
    a. 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 10 및 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택된 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 변형된 유전자 서열;
    b. 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택된 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열; 및
    c. 서열번호 6, 서열번호 9, 서열번호 12 및 서열번호 15를 포함하는 군으로부터 선택된 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열
    을 포함하는, 리라펩타이드의 재조합 발현을 위한 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 벡터는
    a. 서열번호 4의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 변형된 유전자 서열;
    b. 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열; 및
    c. 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열
    을 포함하는, 파키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위해 변형된 것인 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 벡터는
    a. 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 변형된 유전자 서열;
    b. 서열번호 8의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열; 및
    c. 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열
    을 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서의 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위해 변형된 것인 벡터.
  10. 제7항에 있어서, 벡터는
    a. 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 변형된 유전자 서열;
    b. 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열; 및
    c. 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열
    을 포함하는, 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위해 변형된 것인 벡터.
  11. 제7항에 있어서, 벡터는
    a. 서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 N-말단 연장부 서열(NE-3)을 코딩하는 변형된 유전자 서열;
    b. 서열번호 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위를 코딩하는 변형된 유전자 서열; 및
    c. 서열번호 15의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 리라펩타이드를 코딩하는 변형된 유전자 서열
    을 포함하는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서의 리라펩타이드의 고-수준 발현을 위해 변형된 것인 벡터.
  12. 제7항에 청구된 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 파키아 파스토리스, 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 코리네박테리움 글루타미쿰, 에셔리키아 콜라이 및 바실러스 서브틸리스를 포함하는 군으로부터 선택된 재조합 숙주 세포.
  14. 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 리라펩타이드로서, 리라펩타이드는 TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위 및 N-말단 연장부 서열(NE-3)에 작동 가능하게 융합되어 있는 것인 변형된 리라펩타이드.
  15. 제12항에 청구된 재조합 숙주 세포를 사용하여 리라펩타이드를 발현시키는 방법으로서, 발효 공정은
    a. BMGY 배지 중에서 재조합 숙주 세포를 약 24시간 동안 배양하는 단계;
    b. 원심분리에 의해 재조합 숙주 세포를 수확하는 단계;
    c. BMMY 배지 중에서 재조합 숙주 세포를 약 10의 OD600nm까지 재현탁하는 단계;
    d. 쉐이커 인큐베이터(shaker incubator)에서 숙주 세포를 30℃에서 약 24시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및
    e. 배양 상청액을 수확 및 정제하여 리라펩타이드를 수득하는 단계
    를 포함하는, 리라펩타이드를 발현시키는 방법.
  16. 리라글루타이드(liraglutide)를 제조하는 방법으로서,
    c. 적합한 배양 배지 중에서 제12항에 청구된 재조합 숙주 세포를 배양하여 리라펩타이드를 수득하는 단계;
    d. 리라펩타이드를 리라글루타이드로 전환시키는 단계
    를 포함하며, 방법은 단계 (a)에서 수득된 리라펩타이드와 팔미틸 글루타메이트 유도체의 컨쥬게이션을 포함하는 것인, 리라글루타이드를 제조하는 방법.
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