EA044776B1 - Последовательность n-концевого удлинения для экспрессии рекомбинантных терапевтических пептидов - Google Patents
Последовательность n-концевого удлинения для экспрессии рекомбинантных терапевтических пептидов Download PDFInfo
- Publication number
- EA044776B1 EA044776B1 EA202290863 EA044776B1 EA 044776 B1 EA044776 B1 EA 044776B1 EA 202290863 EA202290863 EA 202290863 EA 044776 B1 EA044776 B1 EA 044776B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- lyrapeptide
- expression
- terminal extension
- sequence encoding
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 82
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 21
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 48
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 claims description 46
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 42
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 17
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 description 14
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 14
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 description 14
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 11
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- GRSIQCSSMDOXBZ-IBGZPJMESA-N (4s)-4-amino-5-hexadecoxy-5-oxopentanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCOC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O GRSIQCSSMDOXBZ-IBGZPJMESA-N 0.000 description 3
- -1 1-methylpalmitylglutamic acid Chemical compound 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 2
- 229940089838 Glucagon-like peptide 1 receptor agonist Drugs 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003877 glucagon like peptide 1 receptor agonist Substances 0.000 description 2
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- TZCYLJGNWDVJRA-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1-hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(O)N=NC2=C1 TZCYLJGNWDVJRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 1
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000788682 Homo sapiens GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N [(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-acetyl-6-formyl-3-methoxy-10,13-dimethyl-1,2,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl] acetate Chemical compound C1C[C@@H]2[C@](CCC(OC)=C3)(C)C3=C(C=O)C[C@H]2[C@@H]2CC[C@](OC(C)=O)(C(C)=O)[C@]21C KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 1
- MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N incretin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001679 solitary nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Description
Область изобретения
Изобретение относится к последовательности N-концевого удлинения для экспрессии на высоком уровне рекомбинантных терапевтических пептидов. Изобретение также относится к способу экспрессии на высоком уровне рекомбинантных терапевтических пептидов с использованием указанной последовательности N-концевого удлинения.
Уровень техники изобретения
Пептидные терапевтические средства играют значительную роль в медицинской практике с появлением инсулиновой терапии в 1920-х. В настоящее время в продаже существует более 60 одобренных пептидных лекарственных средств, и ожидается, что их количества значительно вырастут.
Глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) представляет собой пептидный гормон длиной 31 аминокислоту, образующийся в результате тканеспецифического посттрансляционного процессинга пептида проглюкагона. Он продуцируется и секретируется кишечными энтероэндокринными L-клетками и определенными нейронами в ядре солитарного тракта в стволе головного мозга в ходе приема пищи. Лираглутид является производным инкретина (метаболический гормон) человека, глюкагонподобного пептида-1 (GLP-1), который используется в качестве агониста рецептора глюкагонподобного пептида-1 длительного действия, связывающегося с теми же рецепторами, что и эндогенный метаболический гормон GLP-1, который стимулирует секрецию инсулина.
Терипаратид представляет собой рекомбинантную белковую форму паратиреоидного гормона, состоящую из первых (N-концевых) 34 аминокислот, которые являются биологически активной частью гормона. Он является эффективным анаболическим (способствующим формированию костей) средством, используемым для лечения некоторых форм остеопороза.
Экспрессионную плазмиду конструируют так, чтобы она содержала регуляторные последовательности, которые выступают в качестве энхансерных и промоторных областей и обеспечивают эффективную транскрипцию гена, содержащегося в экспрессионном векторе. Целью хорошо сконструированного экспрессионного вектора является эффективное продуцирование белка, и оно может достигаться посредством синтеза значительного количества стабильной матричной РНК.
Является возможным конструирование экспрессионних векторов, которые проявляют строгий контроль экспрессии и белок продуцируется в высоких количествах, только когда это необходимо, посредством использования подходящих условий экспрессии. В отсутствии строго контроля экспрессии гена белок также может экспрессироваться конститутивно.
В патенте США № 4916212 описана последовательность ДНК, кодирующая предшественники биосинтеза инсулина, и способ получения предшественников инсулина и человеческого инсулина в дрожжевых клетках.
В патенте США № 7572884 описан способ получения рекомбинантного лирапептида, предшественника лираглутида, в Saccharomyces cerevisiae.
В 201741024763 A описан способ получения лираглутида посредством экспрессии синтетического олигонуклеотида, кодирующего лирапептид, который функционально связан с олигонуклеотидной последовательностью сигнального пептида в дрожжевой клетке.
В WO 1998/008871 A1 описаны производные GLP-1 и их аналоги, полученные с использованием способа рекомбинантных ДНК.
В WO 1998/008872 A1 описаны производные GLP-2, полученные с использованием способа рекомбинантных ДНК.
В WO 1999/043708 A1 описаны производные эксендина и GLP-1(7-C), полученные с использованием способа рекомбинантных ДНК.
В WO 2017/021819 A1 описан способ получения пептидов или белков, или их производных, посредством экспрессии синтетического олигонуклеотида, кодирующего желаемый белок или пептид, в прокариотической клетке в качестве слитой конструкции убиквитина.
В Avicenna J Med Biotech 2017; 9(1): 19-22 описана сверхэкспрессия терипаратида (1-34), рекомбинантной биологически активной части паратиреоидного гормона (PTH) человека, в Escherichia coli.
Авторы настоящего изобретения в попытках усилить экспрессию рекомбинантных терапевтических пептидов в несколько раз, предложили использовать короткую последовательность N-концевого удлинения, которая не описана в упомянутых выше документах уровня техники.
Задача изобретения
Задачей настоящего изобретения является обеспечение повышенной в несколько раз экспрессии терапевтических пептидов.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к N-концевым удлинениям, нуклеиновым кислотам, векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам для эффективного продуцирования биологически активных пептидов, таких как лирапептид.
Изобретение охватывает многомерный подход для достижения высокого выхода пептидов, таких как лирапептид, в клетке-хозяине путем предоставления экспрессирующей конструкции, в которой нуклеиновая кислота, кодирующая лирапептид, функционально слита с модифицированной последователь- 1 044776 ностью гена, кодирующей участок расщепления TEV (вирус гравировки табака) и N-концевое удлинение (NE-3).
Настоящее изобретение относится к последовательности N-концевого удлинения, как указано под SEQ ID NO: 1 (NE-3), для повышения экспрессии терапевтического пептида в бактериях или дрожжах.
Также настоящее изобретение относится к экспрессионным векторам и рекомбинантным клеткамхозяевам для экспрессии на высоком уровне лирапептида, где экспрессионный вектор содержит модифицированную последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения NE3, модифицированную последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV (вирус гравировки табака), и модифицированную последовательность гена, кодирующую лирапептид.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1A: Схематическая диаграмма экспрессирующих кассет без N-концевого удлинения.
Фиг. 1B: Схематическая диаграмма экспрессирующих кассет с N-концевым удлинением (NE1).
Фиг. 1C: Схематическая диаграмма экспрессирующих кассет с N-концевым удлинением (NE3).
Фиг. 2A: Экспрессионная плазмида без N-концевого удлинения.
Фиг. 2B: Экспрессионная плазмида с N-концевым удлинением-1 (NE1).
Фиг. 2C: Экспрессионная плазмида с N-концевым удлинением-3 (NE3).
Фиг. 3: Экспрессия лирапептида согласно ELISA.
Фиг. 4: Сухая масса клеток с лирапептидом.
Описание списка последовательностей
SEQ ID NO: 1 (аминокислотная последовательность последовательности N-концевого удлинения NE-3)
EEQAE
SEQ ID NO: 2 (аминокислотная последовательность модифицированного участка расщепления TEV):
ENLYFQ
SEQ ID NO: 3 (аминокислотная последовательность лирапептида):
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
SEQ ID NO: 4 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность Nконцевого удлинения NE-3, для Pichia pastoris):
gaagaacaagccgaa
SEQ ID NO: 5 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный участок расщепления TEV для Pichia pastoris):
gagaacttgtacttccaa
SEQ ID NO: 6 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лирапептид, для Pichia pastoris):
cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
SEQ ID NO: 7 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность Nконцевого удлинения NE-3, для Corynebacterium glutamicum):
gaagaacaggcagaa
SEQ ID NO: 8 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный участок расщепления TEV, для Corynebacterium glutamicum):
gaaaacctgtacttccag
SEQ ID NO: 9 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лирапептид, для Corynebacterium glutamicum) cacgcagaaggcacctttacctccgatgtgtcctcctacctggaaggccaggcagcaaaagaattcattgcatggctggttcgcggtcgcggttag
SEQ ID NO: 10 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность Nконцевого удлинения NE-3, для Escherichia coli):
gaagaacaggcagaa
SEQ ID NO: 11 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный участок расщепления TEV, для Escherichia coli):
gaaaacctgtacttccag
SEQ ID NO: 12 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лирапептид, для Escherichia coli):
catgcggaaggcaccttcaccagcgatgttagcagctacctggagggtcaggcggcgaaggaatttatcgcgtggctggttcgtggccgtggttaa
SEQ ID NO: 13 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность Nконцевого удлинения NE-3, для Bacillus subtilis):
gaagaacaagccgaa
SEQ ID NO: 14 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный участок расщепления TEV, для Bacillus subtilis):
gagaacttgtacttccaa
SEQ ID NO: 15 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая лирапептид. для Bacillus subtilis):
- 2 044776 cacgctgagggtacttttacctctgacgtgtcctcttacttggagggtcaagctgccaaagagttcattgcctggttggttagaggtagaggttag
SEQ ID NO: 16 (аминокислотная последовательность терипаратида)
SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF
SEQ ID NO: 17 (аминокислотная последовательность последовательности N-концевого удлинения
NE-1):
EEA
SEQ ID NO: 18 (последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая последовательность Nконцевого удлинения NE-1):
gaggaagcg
SEQ ID NO: 19 (слитый белок, содержащий лирапептид, функционально слитый с последовательностью N-концевого удлинения NE-3 и участком расщепления TEV):
EEQAEENLYFQHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
SEQ ID NO: 20 (слитый белок, содержащий лирапептид, функционально слитый с последовательностью N-концевого удлинения NE-1 и участком расщепления TEV):
EEAENLYFQHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG
Определения
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относятся способы. Хотя для применения на практике или тестирования векторов, клеток-хозяев, способов и композиций также можно использовать любые векторы, клетки-хозяева, способы и композиции, сходные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем описании, далее описаны репрезентативные примеры.
Когда предоставлен диапазон величин, понятно, что каждая встроенная величина между верхним и нижним пределом этого диапазона и любая другая указанная или промежуточная величина в этом указанном диапазоне охватывается способами и композициями. Верхние и нижние пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны и также охватываются способами и композициями, за исключением какого-либо конкретно исключенного предела указанного диапазона. Когда указанный диапазон включает один или оба из пределов, диапазоны, не включающие один или оба из этих включенных пределов, также включены в способы и композиции.
Следует принять во внимание, что определенные признаки способов, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предоставлены в комбинации в одном варианте осуществления. Напротив, различные признаки способов и композиций, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены отдельно или в любой подходящей субкомбинации. Следует отменить, что, как используют в рамках изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, форма единственного числа включает множественное число упоминаемых объектов, если контекст явно не определяет иное. Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена для исключения какого-либо необязательного элемента. Таким образом, это утверждение предназначено для того, чтобы служить в качестве антецедентной основы для применения такой исключающей терминологии, как единственно, только и т.п. применительно к перечислению элементов формулы изобретения или применению негативного ограничения.
Как будет понятно специалистам в данной области при прочтении настоящего описания, каждый из индивидуальных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в настоящем описании, имеет характерные компоненты и признаки, которые могут быть без труда отделены от или скомбинированы с признаками любого из других вариантов осуществления без отклонения от объема или сущности настоящих способов. Любой приведенный способ можно проводить в указанном порядке событий или в любом другом порядке, который является логически возможным.
Термин клетка-хозяин включает индивидуальную клетку или клеточную культуру, которая может быть или является реципиентом рассматриваемых экспрессирующих конструкций. Клетки-хозяева включают потомство единичной клетки-хозяина. Клетка-хозяин для целей настоящего изобретения относится к любому штамму Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli и Bacillus subtilis, который может подходящим образом использоваться для целей настоящего изобретения.
Термин рекомбинантный штамм или рекомбинантная клетка-хозяин относится к клеткехозяину, которая трансфицирована или трансформирована экспрессирующими конструкциями или векторами по настоящему изобретению.
Термин экспрессионный вектор или экспрессирующая конструкция относится к любому вектору, плазмиде или носителю, сконструированным для обеспечения экспрессии встроенной последовательности нуклеиновой кислоты после трансформации хозяина.
Термин промотор относится к последовательностям ДНК, которые определяют, где начинается транскрипция гена. Промоторные последовательности, как правило, находятся непосредственно выше или на 5'-конце участка инициации транскрипции. РНК-полимераза и необходимые факторы транскрипции связываются с промоторной последовательностью и инициируют транскрипцию. Промоторы могут
- 3 044776 представлять собой либо конститутивные, либо индуцибельные промоторы. Конститутивные промоторы представляют собой промоторы, которые позволяют непрерывную транскрипцию ассоциированных с ними генов, поскольку их экспрессия обычно не обуславливается факторами внешней среды или факторами стадии развития. Конститутивные промоторы являются в высокой степени полезными инструментами генной инженерии, поскольку конститутивные промоторы обеспечивают экспрессию генов в свободных от индуктора условиях и часто демонстрируют лучшие характеристики, чем часто используемые индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы представляют собой промоторы, которые индуцируются присутствием или отсутствием биотических или абиотических и химических или физических факторов. Индуцибельные промоторы являются очень мощным инструментом генной инженерии, поскольку экспрессия генов, функционально связанных с ними, может быть включена или выключена на определенных стадиях развития или роста организма или в конкретной ткани или клетках.
Термин экспрессия относится к биологическому продуцированию продукта, кодируемого кодирующей последовательностью. В большинстве случаев, последовательность ДНК, включающая кодирующую последовательность, транскрибируется с образованием матричной РНК (мРНК). Затем матричная РНК транслируется с образованием полипептидного продукта, который имеет соответствующую биологическую активность. Также процесс экспрессии может вовлекать дальнейшие стадии процессинга в РНК-продукт транскрипции, такие как сплайсинг для удаления интронов и/или посттрансляционный процессинг полипептидного продукта.
Термин модифицированная нуклеиновая кислота, как используют в рамках изобретения, используется для указания на нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный лирапептид, соответствующий SEQ ID NO: 19 или 20, или его функционально эквивалентный вариант. Функциональный вариант включает любую нуклеиновую кислоту, имеющую существенную или значительную идентичность или сходство последовательности с SEQ ID NO: 19 или 20 и сохраняющую биологическую активность белка.
Термины полипептид, пептид и белок используются в настоящем описании взаимозаменяемо для указания на два или более аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями. Эти термины применимы к полимерам аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными миметиками соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе полимерам аминокислот, полимерам аминокислот, содержащим модифицированные остатки, и к не встречающемуся в природе полимеру аминокислот. Полипептид относится как к коротким цепям, часто называемым пептидами, олигопептидами или олигомерами, и к более длинным цепям, обычно упоминаемым как белки. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Аналогично, белок относится по меньшей мере к двум ковалентно связанным аминокислотам, которые включают белки, полипептиды, олигопептиды и пептиды. Белок может состоять из встречающихся в природе аминокислот и пептидных связей, или синтетических структур-пептидомиметиков. Таким образом, аминокислота или пептидный остаток, как используют в рамках изобретения, означает как встречающиеся в природе, так и синтетические аминокислоты. Аминокислота включает остатки иминокислот, такие как пролин и гидроксипролин. Боковые цепи могут иметь конфигурацию либо (R), либо (S).
Термин N-концевое удлинение относится к пептидной или полипептидной последовательности, которая удаляемым образом связана с N-концевой аминокислотой желаемого полипептида. В предпочтительном варианте осуществления N-концевое удлинение содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к N-концевым удлинениям, нуклеиновым кислотам, векторам и рекомбинантным клеткам-хозяевам для эффективного продуцирования биологически активных пептидов, таких как лирапептид.
Изобретение относится к многомерному подходу для достижения высокого выхода рекомбинантного лирапептида в клетке-хозяина посредством предоставления экспрессирующей конструкции, в которой нуклеиновая кислота, кодирующая лирапептид, функционально слита с модифицированной последовательностью гена, кодирующей участок расщепления TEV (вирус гравировки табака) и N-концевое удлинение (NE-3).
В одном варианте осуществления изобретение относится к последовательности N-концевого удлинения, указанной в SEQ ID NO: 1 (NE-3). Изобретение относится к способу повышения в несколько раз экспрессии рекомбинантных терапевтических пептидов с использованием короткой последовательности N-концевого удлинения, указанной в SEQ ID NO: 1, в бактериях или дрожжах.
В другом варианте осуществления также объемом изобретения охватываются нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательность N-концевого удлинения, указанную в SEQ ID NO: 1 (NE-3).
Подходящая клетка-хозяин для экспрессии рекомбинантного терапевтического пептида выбрана из эукариотических хозяев, таких как, но не ограничиваясь ими, дрожжи, которые включают Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae. Также могут использоваться бактериальные хозяева, такие как, но не ограни- 4 044776 чиваясь ими, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli и Bacillus subtilis.
Термин терапевтический пептид относится к пептидам, таким как, но не ограничиваясь ими, дирапептид, терипаратид, эксенатид и т.п.
В одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения в экспрессирующих кассетах могут использоваться конститутивные или индуцибельные промоторы, известные специалисту в данной области.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к экспрессирующим кассетам, содержащим промотор, сигнальную последовательность, N-концевое удлинение (NE-3), ген, кодирующий лирапептид или терипаратид, участок расщепления TEV и терминатор.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к последовательности Nконцевого удлинения, как указано под SEQ ID NO: 1, для повышения экспрессии терапевтического пептида в дрожжах, где дрожжи представляют собой Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli и Bacillus subtilis.
Настоящее изобретение также относится к участку расщепления TEV, имеющему аминокислотную последовательность, указанную под SEQ ID NO: 2.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к повышенной экспрессии лирапептида, как указано под SEQ ID NO: 3, и терипаратида, как указано под SEQ ID NO: 16, в бактериях или дрожжах с использованием последовательности N-концевого удлинения, как указано под SEQ ID NO: 1.
Экспрессирующие конструкции, известные специалисту в данной области, для экспрессии прокариотических или эукариотических белков могут использоваться в одном или нескольких вариантах осуществления настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к экспрессирующей конструкции для экспрессии на высоком уровне лирапептида, которая содержит:
1) модифицированную последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения (NE3),
2) модифицированную последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV (вирус гравировки табака), и
3) модифицированную последовательность гена, кодирующую лирапептид.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к экспрессирующей конструкции для экспрессии на высоком уровне лирапептида, которая содержит:
1) последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения (NE-3), как указано под SEQ ID NO: 4,
2) последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV (вирус гравировки табака), как указано под SEQ ID NO: 5, и
3) последовательность гена, кодирующую лирапептид, как указано под SEQ ID NO: 6.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к способу экспрессии на высоком уровне лирапептида, как указано под SEQ ID NO: 3, в Pichia Pastoris, который включает:
1) конструирование рекомбинантного вектора (экспрессирующая конструкция), содержащего последовательности гена, как указано под SEQ ID NO: 4, 5 и 6,
2) трансформацию экспрессирующей конструкции в Pichia Pastoris,
3) оценку клона и его селекцию,
4) проведение процесса ферментации отобранных клонов,
5) выделение и очистку лирапептида и
6) отщепление последовательности N-концевого удлинения от очищенного лирапептида.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к экспрессирующей конструкции для экспрессии на высоком уровне лирапептида, которая содержит:
1) последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения, как указано под SEQ ID NO: 7,
2) последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV, как указано под SEQ ID NO: 8 и
3) последовательность гена, кодирующую лирапептид, как указано под SEQ ID NO: 9.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение также относится к способу экспрессии на высоком уровне лирапептида, как указано под SEQ ID NO: 3, в Corynebacterium glutamicum, который включает:
1) конструирование рекомбинантного вектора (экспрессирующей конструкции), содержащего последовательности генов, как указано под SEQ ID NO: 7, 8 и 9,
2) трансформацию экспрессирующей конструкции в Corynebacterium glutamicum,
3) оценку клона и его селекцию,
4) проведение процесса ферментации отобранных клонов,
5) выделение и очистку лирапептида и
6) отщепление последовательности N-концевого удлинения от очищенного лирапептида.
Настоящее изобретение относится к экспрессирующей конструкции для экспрессии на высоком
- 5 044776 уровне лирапептида, которая содержит:
1) последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения, как указано под SEQ ID NO: 10,
2) последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV, как указано под SEQ ID NO: 11, и
3) последовательность гена, кодирующую лирапептид, как указано под SEQ ID NO: 12.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение также относится к способу экспрессии на высоком уровне лирапептида, как указано под SEQ ID NO: 3, в Escherichia coli, который включает:
1) конструирование рекомбинантного вектора (экспрессирующей конструкции), содержащего последовательности генов, как указано под SEQ ID NO: 10, 11 и 12,
2) трансформацию экспрессирующей конструкции в Escherichia coli,
3) оценку клона и его селекцию,
4) проведение процесса ферментации отобранных клонов,
5) выделение и очистку лирапептида и
6) отщепление последовательности N-концевого удлинения от очищенного лирапептида.
Настоящее изобретение относится экспрессирующей конструкции для экспрессии на высоком уровне лирапептида, которая содержит:
1) последовательность гена, кодирующую N-концевое удлинение последовательность, как указано под SEQ ID NO: 13,
2) последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV, как указано под SEQ ID NO: 14, и
3) последовательность гена, кодирующую лирапептид, как указано под SEQ ID NO: 15.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение также относится к способу экспрессии на высоком уровне лирапептида, как указано под SEQ ID NO: 3, в Bacillus subtilis, который включает:
1) конструирование рекомбинантного вектора (экспрессирующей конструкции), содержащего последовательности генов, как указано под SEQ ID NO: 13, 14 и 15,
2) трансформацию экспрессирующей конструкции в Bacillus subtilis,
3) оценку клона и его селекцию,
4) проведение процесса ферментации отобранных клонов,
5) выделение и очистку лирапептида и
6) отщепление последовательности N-концевого удлинения от очищенного лирапептида.
Настоящее изобретение относится к экспрессии на высоком уровне терипаратида, как указано под SEQ ID NO: 16, в Corynebacterium glutamicum с использованием экспрессирующей конструкции, содержащей последовательность N-концевого удлинения.
Настоящее изобретение относится к экспрессии на высоком уровне терипаратида, как указано под SEQ ID NO: 16, в Pichia pastoris с использованием экспрессирующей конструкции, содержащей последовательность N-концевого удлинения.
Настоящее изобретение относится к экспрессии на высоком уровне терипаратида, как указано под SEQ ID NO: 16, в Corynebacterium glutamicum, которая включает следующие стадии:
1) конструирование рекомбинантного вектора (экспрессирующей конструкции),
2) трансформацию экспрессирующей конструкции в Corynebacterium glutamicum,
3) оценку клона и его селекцию,
4) проведение процесса ферментации отобранных клонов,
5) выделение и очистку терипаратида и
6) отщепление последовательности N-концевого удлинения от очищенного терипаратида,
Настоящее изобретение также относится к последовательности N-концевого удлинения, как указано под SEQ ID NO: 1, для повышения экспрессии терипаратида в Pichia pastoris, которое включает следующие стадии:
1) конструирование рекомбинантного вектора (экспрессирующей конструкции),
2) трансформация сконструированного вектора в Pichia pastoris,
3) оценку клона и его селекцию,
4) проведение процесса ферментации отобранных клонов,
5) выделение и очистка терипаратида и
6) отщепление последовательности N-концевого удлинения от очищенного терипаратида.
В другом варианте осуществления изобретение относится к модифицированному лирапептиду, где лирапептид функционально слит с участком расщепления TEV (вирус гравировки табака) и последовательностью N-концевого удлинения (NE-3), и где модифицированный лирапептид является таким, как указано под SEQ ID NO: 19.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу экспрессии лирапептида с использованием рекомбинантных клеток-хозяев по настоящему изобретению, где процесс ферментации включает:
a) культивирование рекомбинантных клеток-хозяев в среде BMGY в течение приблизительно 24 ч;
- 6 044776
b) сбор рекомбинантных клеток-хозяев посредством центрифугирования;
с) ресуспендирование рекомбинантных клеток-хозяев до OD600nm приблизительно 10 в среде
BMMY;
d) инкубацию клеток-хозяев в инкубаторе с перемешиванием в течение приблизительно 24 ч при 30°C;
e) сбор и очистку культуральных супернатантов с получением лирапептида.
Лираглутид является аналогом GLP-1 человека и действует в качестве агониста рецептора GLP-1. Лираглутид получают путем присоединения C-16 жирной кислоты (пальмитиновая кислота) со спейсером из глутаминовой кислоты на оставшемся остатке лизина в положении 26 пептидного предшественника (лирапептид, как указано под SEQ ID NO: 3).
В другом варианте осуществления изобретение относится к получению лираглутида, которое включает конъюгацию лирапептида, полученного в соответствии с изобретением, с производным пальмитилглутамата, таким как 1-метилпальмитилглутаминовая кислота, с использованием способов, известных в данной области.
В другом варианте осуществления изобретение относится к получению лираглутида, которое включает конъюгацию лирапептида, полученного в соответствии с изобретением, с производными пальмитилглутамата, где производные являются такими, как производные с метилом (1метилпальмитилглутаминовая кислота), этилом, пропилом, проп-2-илом, бутилом, бут-2-илом, 2метилпроп-1-илом, 2-метил-проп-2-илом (трет-бутилом), гексилом и т.п., с использованием способов, известных в данной области. Эту реакцию конъюгации проводят в присутствии конденсирующего реагента. Конденсирующий реагент может быть выбран из группы DIC/6-Cl-HOBt, DIC/HOBt, HBTU/HOBt/DIEA или DIC/Oxyma.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения лираглутида, причем указанный способ включает стадии:
a) культивирование рекомбинантной клетки-хозяина по настоящему изобретению в подходящей культуральной среде с получением лирапептида;
b) конвертирование лирапептида в лираглутид, где способ включает конъюгацию лирапептида, полученного на стадии (a), с производным пальмитилглутамата.
Приведенное выше описание описывает в общем настоящее изобретение. Более полное понимание может быть получено при помощи приведенных ниже конкретных примеров. Этот пример описан только для иллюстрации и не предназначен для ограничения объема изобретения. Хотя здесь используются конкретные термины, такие термины имеют описательное значение и не предназначены для целей ограничения.
Примеры
Пр имер 1. Модифицированная нуклеиновая кислота для экспрессии лирапептида
Экспрессирующие кассеты, кодирующие пептид-предшественник лираглутида, модифицировали для оптимальной экспрессии в Pichia pastoris, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli и Bacillus subtilis. Модифицированная открытая рамка считывания содержала нуклеотидную последовательность, кодирующую лирапептид, слитый с последовательностью, кодирующей участок расщепления TEV (вирус гравировки табака), и последовательность, кодирующую N-концевое удлинение (NE-3 или NE-1). Вместо редких кодонов использовались предпочтительные кодоны для экспрессии в Pichia pastoris, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli и Bacillus subtilis.
В качестве контроля получали открытую рамку считывания, содержавшую нуклеотидную последовательность, кодирующую лирапептид, без какого-либо N-концевого удлинения.
Для экспрессии в Pichia pastoris:
Для экспрессии в Pichia Pastoris проводили модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей лирапептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей участок расщепления TEV, и нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевое удлинение.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая лирапептид, представлена под SEQ ID NO: 6. Нуклеотидная последовательность участка расщепления TEV представлена под SEQ ID NO: 5. Нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевое удлинение (NE-3), представлена под SEQ ID NO: 4.
Эта модифицированная открытая рамка считывания была искусственно синтезирована с использованием последовательности лирапептида, последовательности участка расщепления TEV и последовательности N-концевого удлинения.
Модифицированная открытая рамка считывания, содержащая ДНК, кодирующую лирапептид без N-концевого удлинения (фиг. 1A) и с N-концевым удлинением 1 (NE1) (GAGGAAGCG - фиг. 1B), Nконцевым удлинением 3 (NE3) (GAAGAACAAGCCGAA - фиг. 1C), вместе с последовательностью расщепления TEV (вирус гравировки табака) (GAGAACTTGTACTTCCAA) и кассетами сигнальных последовательностей представлены на фиг. 1.
Модифицированную последовательность, кодирующую рекомбинантный лирапептид, клонировали в экспрессионный вектор pD912 (Atum, США). Рекомбинантная плазмида содержит открытую рамку считывания и промотор.
- 7 044776
Карта вектора pD912 представлена на фиг. 1.
Экспрессия в Corynebacterium glutamicum
Для экспрессии в Corynebacterium glutamicum проводили модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей лирапептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей участок расщепления TEV, и нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевое удлинение.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая лирапептид, представлена под SEQ ID NO: 9. Нуклеотидная последовательность участка расщепления TEV представлена под SEQ ID NO: 8. Нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевое удлинение (NE-3), представлена под SEQ ID NO: 7.
Эта модифицированная открытая рамка считывания была искусственно синтезирована с использованием способа Thermo Fisher Scientific с использованием последовательности лирапептида, последовательности участка расщепления TEV и последовательности N-концевого удлинения.
Эту модифицированную последовательность, кодирующую рекомбинантный лирапептид, клонировали в экспрессионный вектор pD912 (Atum, США). Рекомбинантная плазмида содержит открытую рамку считывания и промотор.
Экспрессия в Escherichia coli
Для экспрессии в Escherichia coli проводили модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей лирапептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей участок расщепления TEV, и нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевое удлинение.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая лирапептид, представлена под SEQ ID NO: 12. Нуклеотидная последовательность участка расщепления TEV представлена под SEQ ID NO: 11. Нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевое удлинение (NE-3), представлена под SEQ ID NO: 10.
Эта модифицированная открытая рамка считывания была искусственно синтезирована с использованием последовательности лирапептида, последовательности участка расщепления TEV и последовательности N-концевого удлинения.
Модифицированную последовательность, кодирующую рекомбинантный лирапептид, клонировали в экспрессионный вектор pD912 (Atum, США). Рекомбинантная плазмида содержит открытую рамку считывания и промотор.
Экспрессия в Bacillus subtilis
Для экспрессии в Bacillus subtilis проводили модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей лирапептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей участок расщепления TEV, и нуклеотидной последовательности, кодирующей N-концевое удлинение.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая лирапептид, представлена под SEQ ID NO: 15. Нуклеотидная последовательность участка расщепления TEV представлена под SEQ ID NO: 14. Нуклеотидная последовательность, кодирующая N-концевое удлинение (NE-3), представлена под SEQ ID NO: 13.
Эту модифицированную открытую рамку считывания искусственно синтезировали с использованием последовательности лирапептида, последовательности участка расщепления TEV и последовательности N-концевого удлинения.
Модифицированную последовательность, кодирующую рекомбинантный лирапептид, клонировали в экспрессионный вектор pD912 (Atum, США). Рекомбинантная плазмида содержит открытую рамку считывания и промотор.
Подтверждение линеаризации плазмидной ДНК
Синтетическую ДНК, кодирующую лирапептид, без N-концевого удлинения, N-концевого удлинения 1, N-концевого удлинения 3 и плазмиду pD912, расщепляли ферментами рестрикции EcoRI и BglII. Расщепленные фрагменты рестрикции лигировали и трансформировали в штамм Escherichia coli. Полученные плазмиды, содержавшие экспрессирующие кассеты лирапептида без N-концевого удлинения (фиг. 2A), N-концевого удлинения 1 (фиг. 2B), N-концевого удлинения 3 (фиг. 2C) секвенировали для подтверждения последовательности лирапептида, N-концевого удлинения и последовательности расщепления TEV. Плазмидную ДНК с подтвержденной последовательностью линеаризовывали посредством фермента Sac I.
Пример 2. Получение рекомбинантной клетки-хозяина посредством трансформации рекомбинантными плазмидами
Рекомбинантные плазмиды pD912, как описано в вышеуказанном примере, содержащие ген пептида-предшественника лираглутида, слитого с сигнальными пептидами, использовали для получения рекомбинантных хозяев.
Клетки-хозяева Pichia pastoris (полученные от Atum, США) трансформировали с использованием плазмид способом электропорации.
Трансформированные клетки высевали на агар YPD (дрожжевой пептон-декстроза), содержавший 100 мкг/мл зеоцина. Трансформированные клетки Pichia pastoris выращивали в 20 мл среды BMGY в течение 24 ч. Клетки собирали посредством центрифугирования и ресуспендировали до OD600nm 10 в 20 мл среды BMMY. Клеточную сусиензию инкубировали в инкубаторе с перемешиванием в течение 24 ч при
-
Claims (8)
- 30°C.Пример 3. Анализ и оценка экспрессии лирапептидаЧерез 24 ч культуральные супернатанты собирали, очищали и анализировали в отношении экспрессии лирапептида посредством ELISA (фиг. 3) с использованием моноклонального антитела, специфичного к лирапептиду. Далее проводили измерение сухой клеточной массы с использованием анализатора влажности (фиг. 4).В табл. 1 и 2 приведено сравнение, показывающее эффективность N-концевых удлинений в отношении повышения выхода лирапептида.Таблица 1. Экспрессия различных N-концевых удлинений и лирапептида по сравнению с контролем без N-концевого удлиненияУдлинение Клоны Экспрессия LP (процент от контроля) OD при 450 нмНет (контроль) 100 0,52ЕЕА 1 103 0,561ЕЕА 2 75 0,409ЕЕА 3 87 0,474EEQAE 1 459 2,488EEQAE 2 479 2,598EEQAE 3 443 2,4Таблица 2. Различные N-концевые удлинения и кратность изменения экспрессии лирапептида по сравнению с контролем без N-концевого удлиненияУдлинение Клоны Кратность отличийЕЕА 1 1,0ЕЕА 2 0,8ЕЕА 3 0,9EEQAE 1 4,6EEQAE 2 4,8EEQAE 3 4,4Описанные выше данные отчетливо демонстрируют, что N-концевое удлинение способно повышать экспрессию лирапептида приблизительно в 5 раз по сравнению с контролем и известными Nконцевыми удлинениями.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. N-концевое удлинение, состоящее из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
- 2. Нуклеиновая кислота, кодирующая N-концевое удлинение по п.1.
- 3. Нуклеиновая кислота по п.2, где нуклеиновая кислота выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13.
- 4. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.3.
- 5. Вектор по п.4, где вектор представляет собой pD912.
- 6. Вектор по п.4, где вектор содержит модифицированный участок расщепления TEV, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 14.
- 7. Вектор для рекомбинантной экспрессии лирапептида, содержащий:a) модифицированную последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения (NE-3), выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 13;b) модифицированную последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV (вирус гравировки табака), выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 14; иc) модифицированную последовательность гена, кодирующую лирапептид, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 15.
- 8. Вектор по п.7, где вектор модифицирован для экспрессии на высоком уровне лирапептида в Pichia pastoris, включающий:a) модифицированную последовательность гена, кодирующую последовательность N-концевого удлинения (NE-3), включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4;b) модифицированную последовательность гена, кодирующую участок расщепления TEV (вирус гравировки табака), включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5; иc) модифицированную последовательность гена, кодирующую лирапептид, включающую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN201941009728 | 2019-09-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044776B1 true EA044776B1 (ru) | 2023-09-29 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102495283B1 (ko) | 재조합 숙주 세포에서 탄소 공급원 조절된 단백질 생산 | |
KR100959549B1 (ko) | 글루카곤 유사 펩타이드 1 glp-1(7-36)과 glp-1 유사체를 생산하는 방법 | |
CA2279836A1 (en) | Polynucleotides encoding proexendin, and methods and uses thereof | |
SK116896A3 (en) | Enhanced secretion of polypeptides | |
RU2007124369A (ru) | Производство белков | |
Koganesawa et al. | Expression and purification of a small cytokine growth-blocking peptide from armyworm Pseudaletia separata by an optimized fermentation method using the methylotrophic yeast Pichia pastoris | |
US8304210B2 (en) | Method for the secretory production of heterologous protein in Escherichia coli | |
US20160168226A1 (en) | Process for production of insulin and insulin analogues | |
CN110257347B (zh) | 硫氧还蛋白突变体、其制备方法及其在重组融合蛋白生产中的应用 | |
CN117466990A (zh) | 一种重组人源xvii型胶原蛋白及其制备方法与应用 | |
WO2022117044A1 (en) | Glp-1/gcg dual receptor agonist polypeptide and fusion protein thereof | |
US20230002468A1 (en) | N-terminal extension sequence for expression of recombinant therapeutic peptides | |
WO2005100388A1 (en) | Production of insulinotropic peptides | |
CN111388680A (zh) | 一种多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用、方法及其融合蛋白复合物 | |
EA044776B1 (ru) | Последовательность n-концевого удлинения для экспрессии рекомбинантных терапевтических пептидов | |
JPH04501204A (ja) | 異種タンパク発現を安定させる方法およびそれに使用するベクター | |
OA20681A (en) | N-terminal extension sequence for expression of recombinant therapeutic peptides. | |
CN112251444B (zh) | 一种改造的amh基因序列及利用其制备amh的方法 | |
Yan et al. | Overexpression of a small medicinal peptide from ginseng in the yeast Pichia pastoris | |
EP0361956A2 (en) | Increased expression of small molecular weight recombinant proteins | |
Wen et al. | Construction of secretory expression system suitable to express glucagon under the control of PL promoter | |
US20230312668A1 (en) | Insulin aspart derivative, and preparation method therefor and use thereof | |
WO2024119434A1 (zh) | 一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签 | |
CA2169567A1 (en) | The recombinant production of proteins in yeast | |
CN104672334B (zh) | 重组长链人胰岛素样生长因子-i的制备方法 |