CN108218997B

CN108218997B - 一种用于纯化蛋白的表达载体

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Publication number: CN108218997B
Application number: CN201711489413.0A
Authority: CN
Inventors: 王天泽; 郝淑静
Original assignee: Beijing Zhongke Weixin Biomedical Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongke Weixin Biomedical Research Institute Co ltd
Priority date: 2017-12-30
Filing date: 2017-12-30
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2037-12-30
Also published as: CN108218997A

Abstract

本发明提供了一种用于纯化蛋白的表达载体，上述表达载体包括S100蛋白家族基因编码序列以及其他载体元件，上述S100蛋白家族基因编码序列位于能够正常表达的区域。本发明提供了一种用于纯化蛋白的表达载体，以至少解决现有技术中用于纯化蛋白的表达载体操作复杂成本高的技术问题，本发明提出的新的纯化蛋白的表达载体，操作方便，成本低，纯化效果好。

Description

一种用于纯化蛋白的表达载体

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及一种用于纯化蛋白的表达载体。

背景技术

对于纯化分子量小于60千道尔顿(kDa)的蛋白，现有技术采用的方法是电泳、离子交换、蛋白沉淀、亲和层析等，但这些纯化方法单一使用各有缺陷，比如蛋白沉淀纯化效果差；电泳的分离效果好，但制备量太低，不适用于大规模制备；离子交换：即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤；亲和层析：单抗非常昂贵，而且也需先纯化，单抗与目的蛋白结合力太强.要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单抗，混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合，某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从终产物中去除。即便是这些方法和其他方法配合使用，也很难得到纯化度很高的蛋白，并且操作复杂，现有技术中纯化蛋白较好的蛋白纯化仪(AKTA)价格太昂贵，故有待提出一种新的用于纯化蛋白的表达载体，以方便纯化蛋白使用。

发明内容

本发明提供了一种用于纯化蛋白的表达载体，以至少解决现有技术中用于纯化蛋白的表达载体操作复杂成本高的技术问题。

本发明提供了一种用于纯化蛋白的表达载体，上述表达载体包括S100蛋白家族基因编码序列以及其他载体元件，上述S100蛋白家族基因编码序列位于能够正常表达的区域。

可选的，上述其他载体元件包括多克隆位点、筛选标记、操纵子、启动子以及终止子，上述多克隆位点区内包括上述S100蛋白家族基因编码序列。

可选的，上述表达载体是原核表达载体或真核表达载体。

可选的，上述S100蛋白家族基因编码序列为S100A蛋白家族基因编码序列、S100B蛋白家族基因编码序列、S100C蛋白家族基因编码序列、S100D蛋白家族基因编码序列、S100E蛋白家族基因编码序列、S100F蛋白家族基因编码序列、S100P蛋白家族基因编码序列、S100G蛋白家族基因编码序列、S100L蛋白家族基因编码序列或S100Z蛋白家族基因编码序列。

可选的，上述S100A蛋白家族基因编码序列为S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、S100A12、S100A13、S100A14、S100A15或S100A16。

一种制备任一上述的表达载体的方法，包括如下步骤：

1)合成上述S100蛋白家族基因编码序列，上述S100蛋白家族基因编码序列上游添加第一限制性内切酶酶切割位点识别序列，上述S100蛋白家族基因编码序列下游添加第二限制性内切酶酶切割位点识别序列；

2)用上述第一限制性内切酶与上述第二限制性内切酶对上述S100蛋白家族基因编码序列和第二表达载体进行酶切反应，得到酶切产物，上述第二表达载体包含上述其他载体元件；

3)将上述步骤2)的上述酶切产物进行连接，得到连接产物；

4)将上述步骤3)的上述连接产物转化感受态细胞，进行培养，得培养产物；

5)对上述步骤4)中的上述培养产物进行筛选鉴定；

6)将上述步骤5)中鉴定为阳性的上述培养产物进行扩大培养，得扩大培养产物；

7)收集上述步骤6)中含扩大培养产物的液体，离心获得沉淀；

8)提取收集上述沉淀中的质粒，即为含S100蛋白家族基因编码序列的表达载体。

一种任一上述的表达载体在纯化蛋白中的应用，包括如下步骤：

a)使用上述表达载体构建待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体；

b)上述重组融合蛋白的表达:得到表达细胞；

c)上述重组融合蛋白的分离纯化:收集上述表达细胞，破碎上述表达细胞，离心并收集含上述重组融合蛋白的上清液,上述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向上述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl₂),上疏水层析柱，得到上述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；

d)电泳鉴定；

f)酶切纯化上述疏水层析柱纯化后的融合蛋白，得到待纯化蛋白。

可选的，上述应用，满足下列中的一项或几项：

上述步骤a)中选择载体pET32a-S100构建上述待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体，鉴定上述重组融合蛋白的基因序列,获得阳性的重组表达载体；和/或

上述步骤c)中，上述上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF(DEAE-sephrose FF)阴离子交换柱进行初步的分离,上述上样的缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，100毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，上述洗脱的缓冲液是25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为7.5，1摩尔/升氯化钠(NaCl)；向上述样品中加入5毫摩尔/升氯化钙(CaCl₂),水系滤器过滤,过滤后的上述样品上疏水层析柱，加入上述上疏水层析柱的平衡缓冲液三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，上述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)和乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)。

本发明技术方案中“DEAE-sephrose FF”为“DEAE-琼脂糖凝胶FF”，“EK酶”为“肠激酶”。

本发明提供了一种用于纯化蛋白的表达载体，以至少解决现有技术中用于纯化蛋白的表达载体操作复杂成本高的技术问题，本发明提出的新的纯化蛋白的表达载体，操作方便，成本低，纯化效果好。

附图说明

图1为本发明实施例的一种可选的pET32a-S100A1质粒表达载体的结构图谱；

图2为本发明实施例的一种可选的融合蛋白的分离纯化步骤中阴离子交换柱进行初步分离的结果；

图3为本发明实施例的一种可选的融合蛋白的疏水层析图；

图4为本发明实施例的一种可选的电泳鉴定结果图；

图5为本发明实施例的一种可选的EK酶切试验的结果示意图；

图6为本发明实施例的一种可选的pET28a-S100B质粒表达载体的结构图谱；

图7为本发明实施例的一种可选的pET28a-S100P质粒表达载体的结构图谱。

下面具体实施方式用于进一步说明但不限于本发明，下面实施例仅为本发明一种优选地实施方式。

具体实施方式

实施例1

1、一种pET32a-S100A1质粒表达载体:

一种pET32a-S100A1质粒表达载体，其中多克隆位点区内包括S100A1蛋白家族基因编码序列，S100A1蛋白家族基因编码序列位于NdeI(还可以是其他限制性内切酶)限制性内切酶识别位点下游。

S100A1基因编码序列为序列表中SEQ ID NO:1所示序列，其中上游划线CATATG为NdeI限制性内切酶识别序列，下游划线GAATTC为EcoRI限制性内切酶识别序列。

表达载体包含的其他元件，如启动子、操纵子、氨苄青霉素抗性基因、终止子等为pET32a所含元件。

pET32a-S100A1质粒表达载体的结构图谱如图1所示。

pET32a-S100A1质粒表达载体的全序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

2、质粒表达载体的制备

1)合成S100A1基因编码序列，S100A1基因编码序列上游添加NdeI酶切割位点识别序列，即CATATG序列，S100A1基因编码序列下游添加EcoRI酶切割位点识别序列，即GAATTC序列；

2)用NdeI与EcoRI酶对S100A1基因编码序列和pET32a进行酶切反应，得酶切产物；

3)将步骤2)中的酶切产物进行连接，得连接产物；

4)将步骤3)中的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在含氨苄青霉素的固体LB培养基中培养，得菌落；

5)对步骤4)中的菌落进行筛选鉴定；

6)将鉴定为阳性(含pET32a-S100A1重组质粒)的菌株进行扩大培养；7)收集菌液，离心获得沉淀即为菌体；

8)提取收集菌体中的质粒即为含pET32a-S100A1重组质粒表达载体。

实施例2：

重组质粒表达载体的应用：

1、构建pET32a-S100A1-D4K-hGH融合蛋白表达载体

1)合成D4K-hGHDNA序列，D4K序列上游添加EcoRI酶切割位点识别序列，即GAATTC序列，hGH序列下游添加HindIII酶切割位点识别序列，即AAGCTT序列；

D4K-hGH序列为序列表中SEQ ID NO:3所示序列。

2)用EcoRI与HindIII酶对pET32a-S100A1和D4K-hGH进行酶切反应；3)将上述步骤2)中酶切产物进行连接，得连接产物；

4)将上述步骤3)中的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在含氨苄青霉素的固体LB培养基中培养，得菌落；

5)对上述步骤4)中的菌落进行筛选鉴定；

6)将鉴定为阳性(含pET32a-S100A1-D4K-hGH重组表达载体)的菌株进行扩大培养；

7)收集菌液，离心获得沉淀即为菌体；

8)提取收集步骤7)中菌体中的质粒，即为含pET32a-S100A1-D4K-hGH重组表达载体。

2、重组融合蛋白的表达

将经测序鉴定为阳性的重组表达载体转入BL21感受态细胞中，于含氨苄青霉素的液体LB培养基中37℃培养过夜。

重组表达的融合蛋白序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，分子量如下：理论上的等电点/分子量(pI/MW):4.65/33521.67。

3、融合蛋白的分离纯化

离心收集菌体，用缓冲液(25mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,100mmol/L NaCl)悬浮后，用超声破碎仪破碎细胞，细胞裂解液用15,000rpm的转速离心30min，离心后的上清液上DEAE-sephrose FF阴离子交换柱进行初步的分离，上样缓冲液是25mmol/L Tris-HCl，pH7.5，100m mmol/L NaCl，洗脱缓冲液是25mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1mol/L NaCl。

离心后的上清液经过DEAE-sephrose FF阴离子交换柱进行初步的分离的结果见图2所示，DEAE阴离子层析柱分离融合蛋白，图2中介于300至400毫升之间的蛋白峰为目的蛋白峰，即图中箭头所指为目的蛋白峰。

收集并混合在300-400ml范围内洗脱的样品，直接加入5mmol/L的CaCl2，16℃放置约一小时后用0.22um孔径的水系滤器过滤。过滤后的样品上柱体积为20ml疏水层析柱(Hiprep pheny,high sub)，平衡缓冲液是25mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，洗脱缓冲液是25mmol/LTris-HCl，pH 7.5，10mmol/L EGTA，洗脱两个柱体积后出现单一的峰，根据SDS-PAGE检测结果，纯度可达90％以上。

SDS-PAGE检测结果见图3所示，即融合蛋白的疏水层析图，图中箭头所指为目的蛋白。

4、电泳鉴定

12％SDS-PAGE电泳凝胶，点样10ul。然后用考马斯亮蓝R250染色4小时，然后脱色液脱色4小时，期间更换3次脱色液，最后将脱色后的凝胶浸泡于水中。

电泳鉴定结果见图4,泳道1、2、3为hGH蛋白对照，泳道4、5为DEAE柱纯化后，泳道6、7、8、9为疏水柱纯化后的融合蛋白。

5、酶切纯化融合蛋白

酶切体系：20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)

酶切温度：35－37摄氏度

酶切时间：16小时

加酶量：以融合蛋白4mg/U EK为基准

EK酶切试验的结果见图5,泳道1为蛋白质标记(Marker)，泳道2为疏水柱纯化后的融合蛋白，泳道3,4,5,6为EK酶切割后的产物。

本实施例证明使用本发明方法纯化的蛋白纯度可达90％以上。

实施例3：

构建pET32a-S100A1-TEV-hGH融合蛋白表达载体

1)合成TEV-hGHDNA序列，TEV序列上游添加EcoRI酶切割位点识别序列，即GAATTC序列，hGH序列下游添加XhoI酶切割位点识别序列，即CTCGAG序列，TEV-hGH序列为序列表中SEQ ID NO:5所示；

2)用EcoRI与XhoI酶对pET32a-S100A1和TEV-hGH进行酶切反应，得酶切产物；

3)将上述步骤2)中酶切产物进行连接，得连接产物；

5)对上述步骤4)中的菌落进行筛选鉴定；

6)将鉴定为阳性(含pET32a-S100A1-TEV-hGH重组表达载体)的菌株进行扩大培养；

7)收集菌液，离心获得沉淀即为菌体；

8)提取收集菌体中的质粒即为含pET32a-S100A1-TEV-hGH重组表达载体。

2、重组融合蛋白的表达

重组表达的融合蛋白序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，TEV蛋白酶切割识别序列为SEQ ID NO 13：GAAAACCTGTACTTCCAGGGA，切割位点为Glu Asn Leu Tyr Phe Gln↓Gly(简写为ENLYFQ↓G)。

可参照实施例2中重组质粒载体的应用方法纯化目标蛋白。

实施例4：

1、一种pET28a-S100B质粒表达载体

一种pET28a-S100B质粒表达载体，其中多克隆位点区内包括S100B蛋白家族基因编码序列，S100B蛋白家族基因编码序列位于NcoI(还可以是其他限制性内切酶)限制性内切酶识别位点下游。

S100B基因编码序列为序列表中SEQ ID NO:7所示，其中上游划线“CCATGG”为NcoI限制性内切酶识别序列，下游下划线“GAATTC”为EcoRI限制性内切酶识别序列。

表达载体包含的其他元件，如启动子、操纵子、卡那霉素抗性基因、终止子等为pET28a已知所含元件。

pET28a-S100B质粒表达载体的结构图谱如图6所示。

pET28a-S100B质粒表达载体的全序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。

2、质粒表达载体的制备

1)合成S100B基因编码序列，S100B基因编码序列上游添加NcoI酶切割位点识别序列，即CCATGG序列，S100B基因编码序列下游添加EcoRI酶切割位点识别序列，即GAATTC序列；

2)用NcoI与EcoRI酶对S100B基因编码序列和pET28a进行酶切反应，得酶切产物；

3)将上述步骤2)中酶切产物进行连接，得连接产物；

4)将上述步骤3)中的连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，在含卡那霉素的固体LB培养基中培养；

5)对上述步骤4)中的菌落进行筛选鉴定；

6)将鉴定为阳性(含pET28a-S100B重组质粒)的菌株进行扩大培养；

7)收集菌液，离心获得沉淀即为菌体；

8)提取收集菌体中的质粒即为含pET28a-S100B重组质粒表达载体。

实施例5：

重组质粒表达载体的应用

1、构建pET28a-S100B-D4K-hGH融合蛋白表达载体

1)合成D4K-hGHDNA序列，D4K序列上游添加EcoRI酶切割位点识别序列，即GAATTC序列，hGH序列下游添加HindIII酶切割位点识别序列，即AAGCTT序列。

D4K-hGH序列为序列表中SEQ ID NO:9所示。

2)用EcoRI与HindIII酶对pET28a-S100B和D4K-hGH进行酶切反应，得酶切产物；

3)将上述步骤2)中酶切产物进行连接，得连接产物；

5)对上述步骤4)中的菌落进行筛选鉴定；

6)将鉴定为阳性(含pET28a-S100B-D4K-hGH重组表达载体)的菌株进行扩大培养；

7)收集菌液，离心获得沉淀即为菌体；

8)提取收集菌体中的质粒即为含pET28a-S100B-D4K-hGH重组表达载体。

2、重组融合蛋白的表达

将经测序鉴定为阳性的重组表达载体转入BL21感受态细胞中，于含卡那霉素的液体LB培养基中37℃培养过夜。

重组表达的融合蛋白序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。

3、融合蛋白的分离纯化

离心收集菌体，用缓冲液(25mmol/LTris-HCl,pH7.5,100mmol/L NaCl)悬浮后，用超声破碎仪破碎细胞，细胞裂解液用15,000rpm的转速离心30min，离心后的上清液上DEAE-sephroseFF阴离子交换柱进行初步的分离，上样缓冲液是25mmol/LTris-HCl，pH7.5，100mmol/LNaCl，洗脱缓冲液是25mmol/LTris-HCl，pH7.5，1mol/LNaCl。

收集并混合在300-400ml此范围内洗脱的样品，直接加入5mmol/L的CaCl2，16℃放置约一小时后用0.22um孔径的水系滤器过滤。过滤后的样品上柱体积为20ml疏水层析柱(Hipreppheny,highsub)，平衡缓冲液是25mmol/LTris-HCl，pH7.5，洗脱缓冲液是25mmol/LTris-HCl，pH7.5，10mmol/LEGTA，洗脱两个柱体积后出现单一的峰，根据SDS-PAGE检测结果，纯度可达90％以上。

4、电泳

5、酶切纯化融合蛋白

酶切体系：20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5)

酶切温度：35－37摄氏度

酶切时间：16小时

加酶量：以融合蛋白4mg/U EK为基准。

实施例6：

1、一种pET28a-S100P质粒表达载体

一种pET28a-S100P质粒表达载体，其中多克隆位点区内包括S100P基因编码序列，S100P蛋白家族基因编码序列位于NcoI(还可以是其他限制性内切酶)限制性内切酶识别位点下游。

S100P序列为序列表中SEQ ID NO:11所示，其中上游划线“CCATGG”为NcoI限制性内切酶识别序列，下游下划线“GAATTC”为EcoRI限制性内切酶识别序列。

pET28a-S100P质粒表达载体的结构图谱如图7所示。

pET28a-S100P质粒表达载体的全序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。

2、质粒表达载体的制备

1)合成S100P序列，S100P基因编码序列上游添加NcoI酶切割位点识别序列，即CCATGG序列，S100P基因编码序列下游添加EcoRI酶切割位点识别序列，即GAATTC序列；

2)用NcoI与EcoRI酶对S100P序列和pET28a进行酶切反应,得酶切产物；

3)将上述步骤2)中的酶切产物进行连接；

5)对上述步骤4)中的菌落进行筛选鉴定；

6)将鉴定为阳性(含pET28a-S100P重组质粒)的菌株进行扩大培养；

7)收集菌液，离心获得沉淀即为菌体；

8)提取收集菌体中的质粒即为含pET28a-S100P重组质粒表达载体。

序列表

<110> 北京中科唯新生物医学研究所有限公司

<120> 用于纯化蛋白的表达载体

<130> ZW17014-I

<141> 2017-12-30

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

catatgggct ctgagctgga gacggcgatg gagaccctca tcaacgtgtt ccacgcccac 60

tcgggcaaag agggggacaa gtacaagctg agcaagaagg agctgaaaga gctgctgcag 120

acggagctct ctggcttcct ggatgcccag aaggatgtgg atgctgtgga caaggtgatg 180

aaggagctag acgagaatgg agacggggag gtggacttcc aggagtatgt ggtgcttgtg 240

gctgctctca cagtggcctg taacaatttc ttctgggaga acagtgaatt c 291

<210> 2

<211> 5687

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcact gttctcccag aagaaattgt tacaggccac tgtgagagca 240

gccacaagca ccacatactc ctggaagtcc acctccccgt ctccattctc gtctagctcc 300

ttcatcacct tgtccacagc atccacatcc ttctgggcat ccaggaagcc agagagctcc 360

gtctgcagca gctctttcag ctccttcttg ctcagcttgt acttgtcccc ctctttgccc 420

gagtgggcgt ggaacacgtt gatgagggtc tccatcgccg tctccagctc agagcccata 480

tgtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag aggggaattg ttatccgctc 540

acaattcccc tatagtgagt cgtattaatt tcgcgggatc gagatcgatc tcgatcctct 600

acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata 660

tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt 720

tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc 780

atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc 840

taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gagatcccgg acaccatcga atggcgcaaa 900

acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 960

aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 1020

cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 1080

atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 1140

ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 1200

gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 1260

agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 1320

ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 1380

aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 1440

tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 1500

atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 1560

cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 1620

gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 1680

atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 1740

ctgcgcgttg gtgcggacat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 1800

tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 1860

gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 1920

tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 1980

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 2040

gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccgggatctc gaccgatgcc 2100

cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 2160

cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 2220

ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 2280

ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 2340

tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc ccacgggtgc gcatgatcgt 2400

gctcctgtcg ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga 2460

atcaccgata cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc 2520

aacaacatga atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc 2580

gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 2640

acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg 2700

ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc 2760

atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa 2820

cagaaatccc ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat 2880

ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc 2940

ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag 3000

ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 3060

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 3120

gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 3180

tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatatgcggt 3240

gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 3300

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 3360

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 3420

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 3480

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 3540

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 3600

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 3660

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gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 4020

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cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 4140

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 4200

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 4260

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 4320

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 4380

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 4440

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gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 4560

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gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 4740

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 4800

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ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 5160

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 5220

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tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga 5340

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aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc 5520

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<210> 3

<211> 603

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

gaattcgacg acgacgacaa attcccgacc atcccgctga gtcgactttt tgacaacgct 60

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gcctatatcc caaaggaaca gaagtattca ttcctgcaga acccccagac ctccctctgt 180

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ctaaaggacc tagaggaagg catccaaacg ctgatgggga ggctggaaga tggcagcccc 420

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gacgcactac tcaagaacta cgggctgctc tactgcttca ggaaggacat ggacaaggtc 540

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ctt 603

<210> 4

<211> 292

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val Phe

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His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Lys Lys

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Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala

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Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys Glu Leu Asp Glu

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Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Val Val Leu Val Ala

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Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe Trp Glu Asn Ser Glu Phe

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Asp Asp Asp Asp Lys Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp

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Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr

115 120 125

Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser

130 135 140

Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro

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Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu

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Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln

180 185 190

Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp

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Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr

210 215 220

Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe

225 230 235 240

Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala

245 250 255

Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp

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Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly

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Ser Cys Gly Phe

290

<210> 5

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

gaattcgaaa acctgtactt ccagggattc ccgaccatcc cgctgagtcg actttttgac 60

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ctctgtttct cagagtctat tccgacaccc tccaacaggg aggaaacaca acagaaatcc 240

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tagctcgag 609

<210> 6

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val Phe

1 5 10 15

His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala

35 40 45

Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys Glu Leu Asp Glu

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Val Val Leu Val Ala

65 70 75 80

Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe Trp Glu Asn Ser Glu Asn

85 90 95

Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Asp Asp Asp Lys Phe Pro Thr Ile Pro Leu

100 105 110

Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln

115 120 125

Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys

130 135 140

Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe

145 150 155 160

Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys

165 170 175

Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp

180 185 190

Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val

195 200 205

Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu

210 215 220

Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg

225 230 235 240

Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser

245 250 255

His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe

260 265 270

Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys

275 280 285

Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe

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<212> DNA

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ccatggatgt ctgagctgga gaaggccatg gtggccctca tcgacgtttt ccaccaatat 60

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

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tccatgactt tgtccacaac ctcctgctct ttgatttcct ctaagaaatg ggaaagctca 360

ttgttgatga gctccttcag ttcggatttc ttcagcttgt gcttgtctcc ctcccttcca 420

gaatattggt ggaaaacgtc gatgagggcc accatggcct tctccagctc agacatccat 480

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tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 3720

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 3780

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cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga 4380

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ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc 4920

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gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 5220

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accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5340

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cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 5460

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

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atgctccgcg cccatcgtct gcaccagctg gcctttgaca cctaccagga gtttgaagaa 120

gcctatatcc caaaggaaca gaagtattca ttcctgcaga acccccagac ctccctctgt 180

ttctcagagt ctattccgac accctccaac agggaggaaa cacaacagaa atccaaccta 240

gagctgctcc gcatctccct gctgctcatc cagtcgtggc tggagcccgt gcagttcctc 300

aggagtgtct tcgccaacag cctggtgtac ggcgcctctg acagcaacgt ctatgacctc 360

ctaaaggacc tagaggaagg catccaaacg ctgatgggga ggctggaaga tggcagcccc 420

cggactgggc agatcttcaa gcagacctac agcaagttcg acacaaactc acacaacgat 480

gacgcactac tcaagaacta cgggctgctc tactgcttca ggaaggacat ggacaaggtc 540

gagacattcc tgcgcatcgt gcagtgccgc tctgtggagg gcagctgtgg cttctagaag 600

ctt 603

<210> 10

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Ser Glu Leu Glu Lys Ala Met Val Ala Leu Ile Asp Val Phe His

1 5 10 15

Gln Tyr Ser Gly Arg Glu Gly Asp Lys His Lys Leu Lys Lys Ser Glu

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Leu Lys Glu Leu Ile Asn Asn Glu Leu Ser His Phe Leu Glu Glu Ile

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Lys Glu Gln Glu Val Val Asp Lys Val Met Glu Thr Leu Asp Asn Asp

50 55 60

Gly Asp Gly Glu Cys Asp Phe Gln Glu Phe Met Ala Phe Val Ala Met

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Asp Asp Lys Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala

100 105 110

Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln

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Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu

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Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro

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Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg

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Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu

180 185 190

Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn

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Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met

210 215 220

Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln

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Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu

245 250 255

Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val

260 265 270

Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys

275 280 285

Gly Phe

290

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

ccatggatga cggaactaga gacagccatg ggcatgatca tagacgtctt ttcccgatat 60

tcgggcagcg agggcagcac gcagaccctg accaaggggg agctcaaggt gctgatggag 120

aaggagctac caggcttcct gcagagtgga aaagacaagg atgccgtgga taaattgctc 180

aaggacctgg acgccaatgg agatgcccag gtggacttca gtgagttcat agtgttcgtg 240

gctgcaatca cgtctgcctg tcacaagtac tttgagaagg caggactcaa atgagaattc 300

<210> 12

<211> 5559

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattctca tttgagtcct gccttctcaa agtacttgtg acaggcagac 240

gtgattgcag ccacgaacac tatgaactca ctgaagtcca cctgggcatc tccattggcg 300

tccaggtcct tgagcaattt atccacggca tccttgtctt ttccactctg caggaagcct 360

ggtagctcct tctccatcag caccttgagc tcccccttgg tcagggtctg cgtgctgccc 420

tcgctgcccg aatatcggga aaagacgtct atgatcatgc ccatggctgt ctctagttcc 480

gtcatccatg gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt 540

tatccgctca caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat 600

cctctacgcc ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc 660

ctatatcgcc gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc 720

ttgtttcggc gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc 780

cttgcatgca ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg 840

cttcctaatg caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc 900

gcaaaacctt tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga 960

atgtgaaacc agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg 1020

tttcccgcgt ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag 1080

cggcgatggc ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac 1140

agtcgttgct gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg 1200

tcgcggcgat taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag 1260

aacgaagcgg cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca 1320

gtgggctgat cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct 1380

gcactaatgt tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta 1440

ttttctccca tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc 1500

agcaaatcgc gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg 1560

gctggcataa atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact 1620

ggagtgccat gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca 1680

ctgcgatgct ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt 1740

ccgggctgcg cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct 1800

catgttatat cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca 1860

gcgtggaccg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc 1920

ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc 1980

gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc 2040

agtgagcgca acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg 2100

atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 2160

gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 2220

ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg 2280

cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc 2340

aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg 2400

atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag 2460

aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc 2520

tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag 2580

tcagcgccct gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt 2640

ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg 2700

tcccgccgca tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt 2760

tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc 2820

atgaacagaa atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt 2880

aacatggccc gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg 2940

gacgcggatg aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac 3000

cgcagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 3060

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 3120

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga 3180

gtgtatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat 3240

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc 3300

ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 3360

ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 3420

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 3480

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 3540

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 3600

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 3660

gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 3720

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 3780

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 3840

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 3900

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 3960

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 4020

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 4080

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa 4140

caataaaact gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac 4200

gggaaacgtc ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 4260

ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga 4320

agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 4380

cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc 4440

attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag 4500

cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 4560

tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 4620

tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 4680

ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt 4740

tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 4800

ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 4860

accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 4920

ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 4980

tgctcgatga gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag 5040

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta 5100

aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac 5160

caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg 5220

agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa 5280

gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt 5340

tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt 5400

agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga 5460

gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc 5520

gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5559

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

gaaaacctgt acttccaggg a 21

Claims

1.一种表达载体在纯化蛋白中的应用，所述表达载体包括S100蛋白家族基因编码序列以及其他载体元件，所述S100蛋白家族基因编码序列位于能够正常表达的区域，其特征在于，包括如下步骤：

a) 使用所述表达载体构建S100蛋白与待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体;

b) 所述重组融合蛋白的表达:得到表达细胞;

c) 所述重组融合蛋白的分离纯化:收集所述表达细胞，破碎所述表达细胞，离心并收集含所述重组融合蛋白的上清液,所述上清液进行阴离子交换柱初步分离,经过上样、洗脱并收集混合在300至400毫升范围内的洗脱液样品,向所述洗脱液样品中加入氯化钙(CaCl₂),上疏水层析柱，得到所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白；

d) 电泳鉴定;

e) 酶切纯化所述疏水层析柱纯化后的融合蛋白，得到待纯化蛋白。

2.根据权利要求1所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于：所述其他载体元件包括多克隆位点、筛选标记、操纵子、启动子以及终止子，所述多克隆位点区内包括所述S100蛋白家族基因编码序列。

3.根据权利要求1所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于：所述表达载体是原核表达载体或真核表达载体。

4.根据权利要求1至3任一所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于：所述S100蛋白家族基因编码序列为S100A蛋白家族基因编码序列、S100B蛋白家族基因编码序列、S100C蛋白家族基因编码序列、S100D蛋白家族基因编码序列、S100E蛋白家族基因编码序列、S100F蛋白家族基因编码序列、S100P蛋白家族基因编码序列、S100G蛋白家族基因编码序列、S100L蛋白家族基因编码序列或S100Z蛋白家族基因编码序列。

5.根据权利要求4所述的表达载体在纯化蛋白中的应用, 其特征在于:所述S100A蛋白家族基因编码序列为S100A1、S100A2、S100A3、S100A4、S100A5、S100A6、S100A7、S100A8、S100A9、S100A10、S100A11、S100A12、S100A13、S100A14、S100A15或S100A16。

6.根据权利要求1至3、5中任一所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于，满足下列中的一项或几项：

所述步骤a)中选择载体pET32a-S100构建所述待纯化蛋白的重组融合蛋白表达载体，鉴定所述重组融合蛋白的基因序列,获得阳性的重组表达载体；和/或

所述步骤c)中，所述上清液上DEAE-琼脂糖凝胶FF(DEAE-sephrose FF)阴离子交换柱进行初步的分离,所述上样的缓冲液是25 毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为 7.5，100毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，所述洗脱的缓冲液是25 毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，pH为 7.5，1摩尔/升氯化钠(NaCl)；向所述样品中加入5毫摩尔/升氯化钙(CaCl₂),水系滤器过滤,过滤后的所述样品上疏水层析柱，加入所述上疏水层析柱的平衡缓冲液三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，所述上疏水层析柱的洗脱缓冲液是三羟甲基氨基甲烷-盐酸 (Tris-HCl)和乙二醇双-2-氨基乙基醚-四乙酸(EGTA)。

7.根据权利要求4所述的表达载体在纯化蛋白中的应用，其特征在于，满足下列中的一项或几项：