WO2014021526A1 - 단맛이 증가된 신규 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 - Google Patents

단맛이 증가된 신규 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법 Download PDF

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공광훈
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중앙대학교 산학협력단
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a novel brazein multiple variant with increased sweetness and a method for preparing the same. [Background technology]
  • White sugar is one of the sugars, or more precisely, a simple carbohydrate called sucrose (sugar), a disaccharide, also called saccharose (chemical term for sugar).
  • sucrose sucrose
  • saccharose chemical term for sugar
  • sugar has been commonly used as a sweetener.
  • WHO World Health Organization
  • the World Health Organization (WHO) recently issued a recommendation to limit the use of sugar to the current 10%, and the US government has banned the sale of sugar-based foods and high-content beverages.
  • the National Obesity Countermeasure Committee was formed to announce a policy to label sugar risk warnings, and from 2010, food advertisements above the sugar standard will be regulated. Therefore, the emergence of new sweeteners that can replace sugar is required.
  • saccharin which is 500 times sweeter than sugar. Saccharin has the advantage of being excreted without being broken down in the body, but it has caused controversy that it is carcinogenic. Eventually, it was concluded that it is harmless to the human body, but it is not used much recently because of the disadvantage of using aftertaste.
  • U.S.A. discovered that sodium cyclonuclear sulfamate had a sweet taste. It was called cyclamate under the brand name and began to be used in the early 1950s, and won the world sweetener market in the I960s.
  • Monellin is a protein derived from the fruit of the vine plant, Serendipiti berry, which grows in the rain forests of Africa. It is 3,000 times sweeter than sugar. Extraction is also difficult.
  • the heat stability is low, the heat treatment during the food processing process loses the three-dimensional protein structure has a disadvantage that does not give a sweet taste.
  • research is being conducted to improve thermal stability using protein engineering techniques to overcome these disadvantages.
  • brazzein is a sweet protein first extracted from the fruit of Pentadipladra brazzeana Bail Ion of West Africa [Ming et al. , FEBS Letters, 355: 106-108, 1994]. Brazein has a sweet taste of about 500 to 2,000 times more than sucrose. Jin et al. , Chem. Senses. 28: 491-498, 2003]. There are two types, major type and minor type. The major type of plant-derived brazein has 54 amino acids, including pyrogkitamic acid residues at its amino terminus. On the other hand, minor types of brazein are 53 amino acids without pyroglutamic acid residues at the amino terminal sites.
  • Brazein is the smallest sweet protein, has a molecular weight of about 6.5 kDa, and is a monomer composed of one subunit. It consists of a single polypeptide (single polypeptide) and consists of one a-helix and two ⁇ -sheets. Brazein has eight cysteine residues to form four disulfide bonds in the molecule, resulting in very high thermal stability. In addition, the solubility and pH stability in water are very high [Gao et al. , Int. J. Biol, macromol. 24: 351-359, 1999].
  • brazein expressed by fusion with SNase produces an insoluble inclusion body, refolds it, and removes SNase and methionine by using cyanobromide (CNBr). Due to the separation and purification, it was technically difficult and difficult to commercialize by mass production. Accordingly, the present inventors have registered a patent for a polynucleotide containing Escherichia coli pelB signal sequence and brazein gene and a method for producing brazein using the same through prior studies (Korean Patent Registration No. 809100). have.
  • the present inventors have tried to develop a new type of brazein mutant protein with increased sweetness compared to the wild type brazein. As a result, the present inventors have found that the multivariate having the amino acid variation at four different sites of the wild type brazein at the same time. The present invention was completed successfully by experimentally confirming that this variant has a much higher sweetness than wild-type brazein and previously developed variants.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the brazein multiple variants.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.
  • Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with the recombinant vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the brazein multiple variants.
  • Another object of the present invention to provide a use of the brazein multiple variants for producing a sugar-enhancing food composition.
  • the present invention provides a brazein multiple variant having any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 22.
  • the brazine multiple variant of the present invention is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4 brazein tertiary variants H30R_E35D_E40K, H30R_E35D_E40A, H30R_E35D_E40D, H30R_E35D_E40R, amino acid in the fourth position (lysine) is a multiple variant in which the residues are substituted with aspartic acid, glutamic acid or arginine, respectively.
  • the brazein multiple variant protein of the present invention has an increased sweetness of about 2500 to 3500 times sweet compared to wild type brazein.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the brazein multiple variants.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleic acid molecules are naturally modified nucleotides, as well as modified sugar or base sites. Analogs are also included (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
  • the nucleic acid molecule has any one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 23 to SEQ ID NO: 34.
  • the invention provides a recombinant vector comprising (i) a promoter and (ii) said braze mutant coding nucleic acid molecule operably linked with said promoter.
  • the nucleic acid molecule encoding the brazein multiple variants in the recombinant vector may be linked to a nucleic acid molecule encoding the E. coli pelB signal sequence.
  • the E. coli pelB signal sequence of the cell membrane gap signal sequence of E. coli As a kind (Rietsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 130408-13053, 1996, Raina et al., Ann. Rev. Microbiol. 51: 179—202, 1997, Sone et al., J Biol. Chem. 272: 10349-10352, 1997), the synthesis of the Brazain multiple variant protein transfers to the cell membrane gap of Escherichia coli to induce accurate disulfide bonds, inhibits the formation of insoluble aggregates of the Brazein protein, and unnecessary Escherichia coli. Minimize the protein of origin to facilitate the purification process.
  • the pelB signal sequence is linked to have the same frame when translated into a protein on the 5 'top of a nucleic acid molecule encoding a brazein multiple variant of the present invention, and preferably has a DNA nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 35.
  • promoter refers to a DNA sequence that regulates the expression of a protein coding sequence or functional RNA.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter sequence, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, thereby Regulatory sequences will control the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequences.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter sequence, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites
  • Vectors in the present invention can be constructed through a variety of methods known in the art, specific methods for this are described in Sambrook et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), which is incorporated herein by reference.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed as a vector for cloning or expression, and can be constructed with prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter capable of promoting transcription for example, a ⁇ promoter, a trp promoter, a lac promoter, a T7 promoter, a tac promoter, etc.
  • E. coli is used as the host cell, the promoter and operator sites of the E.
  • coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984)) and the phage leftward promoter ( ⁇ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D ,, Ann. Rev. Genet., 14: 399—445 (1980)) can be used as regulatory sites.
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., a metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus e.g., adenovirus
  • Late promoters vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • vaccinia virus 7.5K promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • SV40 promoter vaccinia virus 7.5K promoter
  • cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.
  • the most preferred promoter in the vector of the invention is the E. coli pelB promoter.
  • Vectors of the present invention may include antibiotic resistance genes commonly used in the art as optional markers, and include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and Genes resistant to tetracycline include, but are not limited to.
  • the antibiotic resistance gene is operably linked with a promoter for its expression.
  • Vectors that can be used in the present invention include plasmids often used in the art (eg pSClOl, ColEl, pB 322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19, etc.), phage (eg gt4 ' ⁇ , ⁇ -Charon, ⁇ ⁇ , and M13) or viruses (eg SV40).
  • plasmids often used in the art (eg pSClOl, ColEl, pB 322, pUC8 / 9, pHC79, pGEX series, pET series and pUC19, etc.)
  • phage eg gt4 ' ⁇ , ⁇ -Charon, ⁇ ⁇ , and M13
  • viruses eg SV40
  • the vector of the present invention is preferably a vector for prokaryotic cells and comprises a nucleic acid sequence that allows replication in prokaryotic host cells, in particular E. coli.
  • the vector of the present invention includes a replication origin of a bacteriophage such as the origin of replication of a bacterium of colEl or pl5A or fl origin.
  • the present invention provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner can be used in any host cell known in the art.
  • prokaryotic cells include E. coli JM109, E. coli BL21, and E. coli.
  • Bacillus genus strains such as RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Enterobacteria and strains such as Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons and various Pseudomonas species.
  • the host cell When the vector of the present invention is transformed into a eukaryotic cell, the host cell includes yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cell human cell (e.g. CH0 cell line (Chinese hamster ovary), W138, ⁇ , C0S-7, 293, HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines), plant cells and the like can be used.
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cell human cell e.g. CH0 cell line (Chinese hamster ovary)
  • W138 ⁇ , C0S-7, 293, HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines
  • plant cells and the like can be used.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell is performed by the CaC12 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)) when the host cell is a prokaryotic cell. , One method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 ( 1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • fine injection method Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)
  • calcium phosphate precipitation method Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)
  • Electroporation Neuroporation
  • liposome-mediated transfection Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)
  • DEAE- Dextran treatment Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)
  • gene balm Yamaang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)
  • the present invention provides a method for producing a brazein multiple variant comprising the steps of: (a) a host cell transformed with a recombinant vector expressing the brazein multiple variant described above Culturing; And (b) isolating brazein multiple variant proteins from the cultured host cell.
  • Host cells transformed with the vector expressing the brazein multiple variant of the present invention are cultured under suitable culture conditions using an appropriate medium capable of inducing the expression of the brazein multiple variant.
  • Media and culture conditions for host cell culture are known to those skilled in the art, and those skilled in the art can modify and use known media and culture conditions as appropriate for the present invention.
  • the host cell expressing the brazein multiple variant of the present invention is E. coli.
  • the brazein multiple variant is expressed by the nucleic acid expression control sequence in the expression vector.
  • the brazein multiple variant of the present invention comprises a pelB signal sequence
  • the brazein multiple variant protein is transferred to the cell membrane gap of Escherichia coli by the pelB signal sequence
  • E. coli signal peptidase The signal peptidase removes the pelB signal sequence.
  • Brazein multiple variants expressed in Escherichia coli are included in the cell membrane gap of Escherichia coli, and thus can be isolated using a known method for separating proteins from the cell membrane gap of Escherichia coli (Snyder et al., J. Bacteriology 177: 953963, 1995). Can be.
  • the cultured Escherichia coli were collected and then suspended in a 30 mM Tris-HCl (Tr i-HCl, pH 8) solution containing 20% sucrose, EDTACpH 8) solution and MgS0 4 . It can be carried out by a method of eluting the protein of the cell membrane gap of E. coli.
  • the method for separating the brazein multiple variant proteins of the present invention from the cell membrane gap protein of E. coli can be carried out through various separation and purification methods known in the art, for example, salting out (ammonium sulfate precipitation and sodium phosphate precipitation). , Solvent precipitation (protein fraction precipitation using acetone, ethanol and the like), dialysis, gel filtration, ion exchange chromatography, reverse phase column chromatography and affinity chromatography can be used alone or in combination.
  • brazein protein is heat stable
  • separation of the brazein multiple variant of the present invention can be carried out by heat treatment, for example, after heat-denatured proteins other than brazein by heating at 70-90 ° C. for 15-60 minutes. Only the brazein variant protein can be separated from the heat denatured protein by centrifugation at 18000 g for 30 minutes at 4 ° C.
  • brazein multiple variant protein of the present invention The characteristics of the brazein multiple variant protein of the present invention are summarized as follows.
  • the present invention provides a food composition for improving sugar content comprising the brazein multiple variants as an active ingredient.
  • the food composition of the present invention includes all forms such as functional foods, nutritional supplements, health foods and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art. For example, beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods (e.g. canned fruit, canned foods, jams, marmalade, etc.), fish, meat and processed foods (e.g. hams, sausage cornbeans, etc.) , Breads and noodles (e.g. udon, soba, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juices, various drinks, cookies, malts, dairy products (e.g. butter, cheese), edible vegetable oils, margarine, vegetable protein, retort Foods, frozen foods, and various seasonings (e.g., miso, soy sauce, sauce, etc.).
  • beverages including alcoholic beverages
  • fruits and processed foods e.g. canned fruit, canned foods, jams, marmalade, etc.
  • fish e.g. hams,
  • the food composition containing the brazein multiple variant of the present invention in the form of a food additive, it may be prepared and used in powder or concentrate form.
  • the brazein multiple variant of the present invention in the food composition of the present invention may be included in the content range of 0.01 to 10% by weight relative to the total composition weight.
  • the present invention provides the use of the brazein multiple variant for producing a food composition for enhancing the sugar content.
  • the present invention provides a novel Brazein multiple variant with increased sweetness, a nucleic acid molecule encoding the variant, a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule, a host cell transformed with the recombinant vector, a method for producing the variant, and the variant. It relates to a food composition for enhancing sugar content as an active ingredient.
  • Brazein multiple variants of the present invention may contain the same amount of Compared to sucrose (sugar), the sweetness is about 2 million times higher, and the increase in sweetness is much better than that of wild-type brazein and previously developed brazein variants.
  • the brazein variant of the present invention can be used in very small amounts to achieve the desired sweetness and can be used in place of other sweeteners, including sugar, in food.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing site-directed mutagenesis for producing brazein multiple variants of the present invention in Example 1 below.
  • Figure 2 shows the results of the SDS-PAGE analysis of the brazein multiple variant of the present invention purified without heat treatment in E. coli (16.5% Tris- tricine gel).
  • Lane M SDS-PAGE pulley peptide molecular weight marker; Lane 1 : wild type brazein (subtype); Lane 2: Brazein multiple variant K4D_H30R_E35D_E40A; Lane 3: Brazain multiple variant K4E_H30R_E35D_E40A; Lane 4: Brazein multiple variant K4R_H30R_E35D_E40A; Lane 5: Brazain multiple variant K4D_H30R_E35D_E40K; Lane 6 : Brazein multiple variant K4E_H30R_E35D_E40; Lane 7: Brazein multivariate K4R—H30R_E35D_E40K; Lane 8: Brazein multiple variant K4D_H30R_E35D_E40D; Lane 9: Brazein
  • Figure 3 is the result of the SDS-PAGE analysis of the brazein multiple variant of the present invention purified by heat treatment (16.5% Tris-tricine gel).
  • Lane M SDS-PAGE polypeptide molecular weight marker
  • Lane 1 wild type brazein (subtype)
  • Lane 2 Brazein multiple variant K4D_H30R_E35D_E40A
  • Lane 3 Brazain multiple variant K4E_H30R_E35D_E40A
  • Lane 4 Brazein multiple variant K4R_H30R_E35D_E40A
  • Lane 5 Brazein multi variant K4D_H30R_E35D_E40K
  • Lane 6 Brazein multi variant K4E_H30R_E35D_E40K
  • Lane 7 Brazein multi variant K4R_H30R_E35D_E40K
  • Lane 8 Brazein Multiple Variants K4D_H30R_E35D_E40D
  • Lane 9 Brazin multi variant K4E_H30R_
  • FIG. 4A-41 show the results of HPLC analysis of brazein multiple variants of the invention.
  • the peak seen at the about 9 minute position indicates the brazein protein and the peak at 2.5-3.5 minutes indicates the buffer.
  • Figure 4a is the HPLC analysis of the Brazain multivariate K4D_H30R_E35D_E40A
  • Figure 4b is the HPLC analysis of the Brazain multivariate K4E_H30R_E35D_E40A
  • Figure 4c HPLC analysis of the HPLC analysis of the multivariate KRKE variant of the variant VD40EKE of Figure 4D Results: HPLC analysis of 4e Brazain multivariate 4E_H30 _E35D_E40
  • Figure 4f is HPLC analysis of Brazain multivariate K4R_H30R_E35D_E40K
  • HPLC analysis of 4g Brazain multivariate 4D_H30R_E35D_E40D Figure 4H35E30ERVE HPLC analysis of FIG.
  • FIG. 4I HPLC analysis of Brazain multivariate K4R_H30RJ: 35D_E40D, HPLC analysis of 4j Brazain multivariate K4D_H30R_E35D_E40R, FIG. 4K is HPLC analysis of Brazain multivariate K4E_H30R_E35D_E40R, 41K_R4R40_30H30R .
  • the fourth amino acid lysine (K) residue in the amino acid sequence of the brazein tertiary variant (subtype basis) is mutated to aspartic acid, glutamic acid, and arginine, respectively.
  • Toc oligonucleotide primers were designed, and the designed primers were synthesized by Cosmo Genet ech (Seoul, Korea) (Table 1).
  • the oligonucleotide primers to be synthesized were designed to be less than 30 mer in length.
  • the base sequences of brazein are listed on both sides of the base to be converted, and two oligonucleotide primers designed to make one variant are complementary to each single strand of brazein.
  • the variant was prepared using the QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit of Stratagene.
  • PET-26b (+)-Brazezein H30R_E35D_E40K
  • pET-26b (+)-Br azze in H30R_E35D_E40A
  • pET- 26b (+)-Brazzein H30R_E35D_E40D
  • pET-26b (+)-Brazzein H30R_E35D_E40R
  • the template vector is a brazein tertiary variant H30R_E35D_E40K (SEQ ID NO: 1), H30R_E35D_E40A (SEQ ID NO: 2), H30R_E35D_E40D (SEQ ID NO: 3), wherein the 30th, 35th, and 40th amino acid is changed based on the brazein subtype amino acid sequence.
  • a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a H30R_E35D_E40R (SEQ ID NO: 4) protein.
  • the amplified product was confirmed by 1.0% agarose gel electrophoresis.
  • the identified product was treated with Dpnl restriction enzyme at 37 ° C. for 1 hour and then transformed into E. coli DH5a (see FIG. 1).
  • Transformants were selected by transforming DH5a in LB-agar plates containing 30 // g / of kanamycin for 12 hours. Selected colonies were cultured to separate DNA from them.
  • Genes identified as variants by sequencing were transformed into E. coli BL21 star (DE3) and used for mass expression. All three variants were successfully prepared and purified by the same method as recombinant brazein expressed in the pET-26b (+)-brazzein (Met-) gene.
  • Variant vector pET—brazzein which contains a Braunan multiple variant gene comprising a mutated nucleotide sequence obtained by PCR, was purified from the transformed E. coli DH5a to confirm the gene sequence. Gene sequences were analyzed by Cosmo Genetech Co., Ltd. Example 2 Expression and Purification of Brazein Multiple Variants
  • PET-Brazzein variant / BL21 star (DE3) prepared in Example 1 was stored in -70 ° C by making a 20% glycerol stock (glycerol stock) of the liquid culture sample for long-term storage.
  • glycerol stock glycerol stock
  • 1L LB medium containing 30 ⁇ kanamycin was cultured for at least 8 hours without addition of IPTG (isopropyl-i3-D-thiogalactopyranoside) as an expression inducing agent. Induced.
  • Mass-expressed cultures were collected for 10 minutes at 4 ° C, 8,000 g using a frozen centrifuge, and then stored at -2CTC until used for purification. 2. Purification of Variant Proteins
  • brazeinol per 1 L of culture was obtained and quantified by BCA assay.
  • brazein variant protein Quantitative determination of brazein variant protein was performed according to the BCA assay (Pierce Chemical Co, Rockford IL, USA) method, after preparing a standard curve using BSA (bovine serum albumin) and wild-type brazein at 562 nm as a standard protein, Used to measure protein concentration. After reacting Bio-Rad's protein quantitative reagent with the purified brazein variant at 60 ° C for 30 minutes, 562 The absorbance was measured at nm to determine the concentration of the protein.
  • BSA bovine serum albumin
  • Tris-tricine gel was used to make 16.5% gel according to the Schagger and von Jagow (1987) method. The gels were electrophoresed and stained using coomassie brilliant blue R-250, and protein and purity were confirmed by layered bleaching.
  • the molecular weight standard protein used was Bio-rad's Polypeptide SDS-PAGE Melocular Weight Standards, which included Triosephosphate isomerase (26.6 kDa), Myoglobin (17 kDa), a -Lactalbumin (14.4 kDa), and Aprotinin (6.5 kDa). Used. SDS-PAGE revealed a pure brazein variant protein band with about 6.5 kDa (see FIGS. 2 and 3). 5. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analysis
  • HPLC analysis was performed to confirm whether the purified brazein variant was active.
  • the HPLC Giga was used as Gilson's 305 system, and the column for HPLC analysis was C18 5micron 150 X 4.6 column, the detection wavelength was 210 nm, the column temperature was room temperature, and the minute flow rate was 0.5 A solvent as the mobile phase solvent.
  • % TFA-distilled water, 0.05% TFA-acetonitrile using a solvent B was analyzed by the concentration gradient conditions. As a result of HPLC analysis, it was confirmed that eluted with one large peak in about 9 components (see FIGS. 4A to 41).
  • Example 3 Determination of Activity of Brazein Multiple Variants
  • brazein is a protein, not sugar, sweetness cannot be measured using a sugar meter. Therefore, activity was measured using human taste. Since the threshold value for the first sweet taste is different for each person, activity was measured by comparing the concentration of sugar solution, brazein solution and sweet taste for the first time.
  • the test subjects consisted of 10 men and 10 women trained in advance. First, the standard sugar solution was tasted one by one, and the concentration of sweetness was first checked. Brazein was dissolved in distilled water (10.0 mg / mL).
  • the activity was measured as follows. Subjects were informed of the date and time of the test prior to the activity measurement to taste in the best condition, and drinking and eating the food immediately before the test were prohibited the day before the test. The subjects marched into the prepared bottled water and tasted the samples according to the concentration of each type sequentially from low to high concentrations. The resulting data were discarded with suspicious values by the Q test, minimized the standard deviation, and obtained from the mean.
  • K4D_H30R_E35D_E40D, K4E_H30R_E35D_E40D, K4R_H30R_E35D_E40D, K4D_H30R_E35D_E40R, K4E_H30R_E35D_E40R, K4R_H30R_E35D_E40R were compared to sucrose by weight compared to each of two million times, 2, 000, 000 times i 2, 900, 000 times, 1500, 000-fold, 1, 70 coming from 000-fold, 2,000,000 times, 1,300, 000 times, 1,250, 000 times, 1,700, 000 times, 1,800, 000 times, 1,800, 000 times, 2,000, 000 times sweetness was shown (see Table 3).
  • Table 3 shows the relative activity of the variants relative to the activity of wild type brazein (100%). Brazain Multiple Variants K4D_H30R_E35D_E40A, K4E_H30R_E35D_E40A, K4R_H30R_E35D_E40A,
  • K4D_H30R_E35D_E40R, K4E_H30R_E35D_E40R and K4R_H30R_E35D_E40R are 2, 500 times, 2, 500 times, 3, 570 times, 1,920 times, 2,080 times, 2,500 times, 1,670 times, respectively. 1,560, 2, 080, 2, 270, 2, 270, 2, 500 times sweet. [Table 3]

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Abstract

본 발명은 단맛이 증가된 신규한 브라제인 다중 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 변이체를 생산하는 방법 및 상기 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 동일한 양의 수크로오스(설탕)과 비교하여 약 2백만배 이상 단맛이 높으며, 야생형의 브라제인 및 종래 개발된 브라제인 변이체와 비교하여도 단맛의 증가가 월등히 우수하다. 따라서, 본 발명의 브라제인 변이체는 매우 적은 양을 사용하여 원하는 단맛을 낼 수 있으며, 식품에서 설탕을 비롯한 다른 감미제를 대체하여 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
단맛이 증가된 신규 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법
【기술 분야】
본 발명은 단맛이 증가된 신규 브라제인 다중 변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 【배경 기술】
백색 설탕 (정백당)은 당류의 하나로， 더욱 정확히 말하면 수크로오스 (sucrose, 설탕)라는 간단한 탄수화물의 하나로 사카로오스 (saccharose, 설탕의 화학적 용어)라고도 하는 이당류이다. 오랜 기간 동안 설탕은 감미료로서 흔하게 사용되어 왔다. 하지만 설탕의 유해성 문제로 최근 세계보건기구 (WHO)에서는 설탕 사용을 현재의 10%로 제한하자는 권고안을 제시 였으며, 미국의 주 정부에서는 설탕 주성분 식품 및 고함유 음료 판매를 전면 금지시켰다. 또한, 한국의 경우， 국가비만대책위원회를 구성하여 설탕 위험 경고문구 표기 방침 발표하였으며， 2010년 이후부터 설탕 기준치 이상 식품 광고 규제를 실시할 예정이다. 따라서， 설탕을 대체할 수 있는 새로운 감미료의 등장이 요구 되고 있다. 1879 년 미국의 아이라 렘슨과 독일의 콘스탄틴 팔베르크는 설탕보다 5 백배 단맛을 내는 사카린 (saccharin)을 발견하였다. 사카린은 체내에서 분해되지 않고 배설되는 장점을 가졌으나 발암성 물질이라는 논란을 불러일으켰다. 결국 인체에 무해하다고 결론이 났지만, 뒷맛이 쓰다는 단점 때문에 최근에는 많이 사용되지 않는다. 1937 년 미국 일리노이대에서 사이클로핵실설파민산 나트륨이 단맛을 내는 것을 발견하였다. 상품명으로 사이클라메이트 (cyclamate)로 불리면서 1950 년 초부터 사용이 시작돼, I960 년대 세계 감미료 시장을 석권 했다. 그러나, 발암성 물질로 판명되면서 우리나라에서는 1970 년대부터 사용이 전면 금지되었다. 최근에 가장 널리 사용되는 인공 감미료는 1965 년 제임스 쉬레터에 의해 발견된 아스파탐 (aspartame)이다. 아스파탐은설탕 보다 약 180-200 배 정도 높은 당도를 가지고 있다. 현재 시관되는 대다수의 다이어트 음료에는 아스파탐이 포함되어 있는데, 체내에 들어가면 대사과정 중 페닐알라닌을 생성한다. 따라서， 페닐알라닌을 분해하는 특정 효소 (phenylalanine hydroxylase)가 선천적으로 결핍된 페닐케톤뇨증 환자들은 이용할 수 없다는 단점을 지닌다.
이 같은 인공 감미료뿐만 아니라 천연 감미료를 개발하기 위한 연구도 계속되어 왔으며， 그 결과로서, 허브로 분류되고 있는 국화과의 다년생 식물 (Stevia rabaudiana)의 잎에는 스테비오사이드 (stevioside)라는 물질이 존재한다. 파라과이와 브라질의 국경 지대 원주민들은 이 물질을 4 백년 이상 감미료로 사용했다. 우리나라의 소주에 첨가되기도 하는데, 설탕 보다 200배 단맛을 갖고 있다. 한편， 최근에는 열대 과일에서 추출한 감미 단백질에 대한 관심이 증대하고 있는데， 타우마틴 (Thaumatin)은 서아프리카에서 기적의 과일이라고 불리는 다년생 식물 (Thaumatococcus daniellii)의 과실 중에 포함되어 있는 단백질로서， 설탕 보다 2,000 - 3,000 배나 단맛을 나타낸다. 모넬린 (Monellin)은 아프리카의 다우림 지대에 생육하는 세렌디퍼티 베리 (Serendipiti berry)라고 하는 넝쿨상 식물의 열매로부터 얻어지는 단백질로 설탕 보다 무려 3，000 배가 달다, 그러나, 재배가 쉽지 않으며 열매로부터의 추출도 어렵다. 더욱이 열 안정성이 낮아서 식품 가공 과정에서 열처리를 하면 삼차원적인 단백질 구조를 잃어버려 단맛을 내지 못하는 단점을 갖고 있다. 현재에는 이런 단점을 극복하기 위해서 단백질 공학 기술을 이용하여 열 안정성을 증진시키는 연구가 진행되고 있다.
한편， 브라제인 (brazzein)은 서아프리카의 펜타디플란드라 브라제나 바이론 (Pentadipladra brazzeana Bail Ion)의 열매에서 처음 추출된 감미 단백질이다 [Ming et al. , FEBS Letters, 355： 106-108, 1994] . 브라제인은 수크로오스 (sucrose)와 비교했을 때 약 500 배 내지 2,000 배 이상의 단 맛을 나타내몌 Jin et al. , Chem. Senses. 28： 491-498, 2003] , 주 (major) 타입과부 (minor) 타입의 2가지 형태가 있다. 식물에서 추출한 브라제인의 대부분인 주 (major) 타입은 아미노 말단 부위에 피로글루탐산 (pyrogkitamic acid) 잔기를 포함하여 54 개의 아미노산을 가진다. 반면， 부 (minor) 타입의 브라제인은 아미노 말단 부위의 피로글루탐산 잔기 없이 53 개의 아미노산 잔기만을 가지며 주 (major) 타입의 브라제인에 비해 약 2 배 정도 강한 단 맛을 보인다 [Assadi-Porter et al. , Arch.. Biochem. Biophys. 376： 259-265, 2000] . 브라제인은 감미 단백질 중 가장 작은 크기로 약 6.5 kDa 의 분자량을 갖고 있으며， 1 개의 서브유닛 (subunit)으로 구성된 단량체 (monomer)이다. 단일 폴리 펩티드 (single polypept ide)로 이루어져 있으며 1 개의 a-나선 (helix)과 2 개의 β-병풍구조 (sheet)로 구성된다. 브라제인은 8 개의 시스테인 (cysteine) 잔기를 가져 분자 내에 4 개의 이황화 결합 (disulfide bond)을 형성하고 있어 열 안정성이 매우 높다. 또한， 물에 대한 용해도 및 pH 안정성이 매우 높다 [Gao et al . , Int. J. Biol, macromol . 24： 351-359, 1999] .
미국 특허 제 6,274,707호 및 아사디 포터 등 (Assadi-Porter et al . Arch.. Biochem. Biophys. [0006] 376： 259-265, 2000)은 상기와 같은 브라제인을 대장균을 이용한 유전공학적 방법으로 재조합 브라제인을 생산하는 방법을 기술하고 있는데, 브라제인을 암호화하고 있는 유전자를 합성하여 이를 SNase 를 포함하고 있는 재조합 백터에 삽입하여 새로운 형질전환 백터를 생성한 후， 이를 다시 대장균에 도입하여 최종 SNase 와 연결된 융합 단백질을 발현， 정제하는 방법이 개시되어 있다. 그러나ᅳ SNase 와 융합되어 발현된 브라제인은 불용성 웅집체 (Inclusion body)를 생성하며 이를 다시 리폴딩 (refolding) 시키고 시아노브로마이드 (cyanobromide, CNBr)을 이용하여 SNase 와 메티오닌 (Met)을 제거하는 방법으로 분리， 정제하기 때문에 기술적으로 복잡하고 어려워 대량 생산에 의한 상업화가 곤란한 단점이 있었다. 이에, 본 발명자들은 기존 연구의 단점을 해결하고자 선행연구를 통해 대장균 pelB 신호서열 및 브라제인 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 브라제인의 제조방법을 특허 등록 (한국특허등록 제 809100 호)한 바 있다. 또한， 본 발명자는 열 안정성이 높고， 우수한 단맛을 나타내는 천연 감미료를 찾기 위해 브라제인을 구성하고 있는 아미노산 중 구조에 영향 주지 않을 것이라 예상되는 특정 위치의 아미노산의 변이체 및 다중 변이체의 제조방법올 특허출원 (한국특허출원 제 2007-0117013호， 제 2008-0019008호, 제 2010-0016660호 및 국제특허출원 PCT/KR2009/04855호)한 바 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 종래의 야생형 브라제인과 비교하여 단맛이 증가되어 있는 새로운 형태의 브라제인 변이체 단백질을 개발하기 위해 연구 노력한 결과， 야생형 브라제인의 4 가지의 다른 부위에서의 아미노산 변이를 동시에 갖는 다중변이체를 성공적으로 제조하였으며， 이 변이체가 야생형 브라제인 및 종전에 개발된 변이체에 비해 훨씬 높은 단맛을 가진다는 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 단맛이 증가된 브라제인 다중 변이체를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 브라제인 다중 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 당도 증진용 식품 조성물을 제조하기 위한 상기 브라제인 다중 변이체의 용도를 제공하는 데에 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 11 내지 서열번호 22로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 브라제인 다중 변이체를 제공한다.
본 발명의 브라제인 다중 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2， 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열올 가지는 브라제인 3차 변이체 H30R_E35D_E40K, H30R_E35D_E40A , H30R_E35D_E40D , H30R_E35D_E40R 에서， 4번째 위치의 아미노산인 라이신 (lysine) 잔기가 각각 아스파르트산 (aspartic acid) , 글루탐산 (glutamic acid) 또는 아르기닌 (arginine)으로 치환된 다중 변이체이다.
하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 브라제인 다중 변이체 단백질은 야생형 브라제인에 비해 약 2500배 내지 3500배 단맛이 증가되어 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자" 는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며， 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라， 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980)； Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면， 상기 핵산 분자는 서열번호 23 내지 서열번호 34로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 프로모터 및 (ii) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 브라제인 다증 변이체 코딩 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터를 제공한다。
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 재조합 백터에서 상기 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 대장균 pelB 신호서열을 코딩하는 핵산분자에 연결될 수 있다.
상기 대장균 pelB 신호서열은 대장균의 세포막 간극 신호서열의 일종으로 (Rietsch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93： 130408-13053, 1996, Raina et al. , Ann. Rev. Microbiol. 51： 179—202， 1997, Sone et al., J. Biol. Chem. 272： 10349-10352, 1997) , 브라제인 다중 변이체 단백질이 합성되면 대장균의 세포막 간극으로 이동시켜 정확한 이황화 결합을 유도하게 하고， 브라제인 단백질의 불용성 응집체 형성을 억제하며, 불필요한 대장균 유래의 단백질을 최소로 하여 정제과정을 용이하게 하는 작용을 한다.
상기 pelB 신호서열은 본 발명의 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자의 5' 상단에 단백질로의 번역시 동일한 프레임을 가지도록 연결되며， 바람직하게는 서열번호 35의 DNA 핵산 염기서열을 갖는다.
상기 용어 "프로모터" 는 단백질 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA서열을 의미한다.
상기 용어 "작동가능하게 연결된 (operatively linked)" 은 핵산 발현 조절 서열 (예컨대 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며， 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및 /또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에서의 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며 , 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며， 이 문헌은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 재조합 백터는 클로닝 또는 발현을 위한 백터로사 구축될 수 있으며, 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 백터가 발현 백터이고， 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대， ρίλ프로모터, trp 프로모터， lac 프로모터， T7 프로모터， tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다, 숙주 세포로서 대장균 (E. coli)가 이용되는 경우, 대장균 (E. coli) 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C. , J. Bacteriol. , 158： 1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (ρΙ 프로모터， Herskowitz, I. and Hagen, D,, Ann. Rev. Genet., 14:399— 445 (1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 백터가 발현 백터이고， 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터， 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며， 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 백터에서 가장 바람직한 프로모터는 대장균 (E. coli) pelB 프로모터이다.
본 발명의 백터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린， 겐타마이신， 카베니실린, 클로람페니콜 스트렙토마이신, 카나마이신， 게네티신， 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있으며， 이에 한정되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자는 이의 발현을 위한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 백터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSClOl , ColEl, pB 322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈， pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: gt4 ' λΒ, λ -Charon, λ Δζΐ 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 백터는 바람직하게는 원핵세포용 백터이며， 원핵 숙주세포， 특히 대장균 (E. coli)에서 복제가 가능하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 따라서， 본 발명의 백터는 colEl 또는 pl5A의 박테리아의 복제 원점 또는 fl origin과 같은 박테리오파아지의 복제 원점을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며， 원핵세포로서는 예컨대， E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 백터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서， 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 사람 세포 (예컨대， CH0 세포주 (Chinese hamster ovary) , W138, ΒΗΚ, C0S-7, 293, HepG2, 3Τ3, RIN 및 MDCK세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaC12 방법 (Cohen, S.N. et al. , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973))， 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D. , J. Mol. Biol. , 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al .， Nucleic. Acids Res., 16：6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R. , Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al . , Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMB0 J., 1:841(1982)), 리포좀 -매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. , 5:1188-1190(1985))， 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 백터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법을 제공한다: (a) 상술된 브라제인 다중 변이체를 발현하는 재조합 백터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주 세포로부터 브라제인 다중 변이체 단백질을 분리하는 단계 .
본 발명의 브라제인 다중 변이체를 발현하는 백터로 형질전환된 숙주세포를 브라제인 다중 변이체의 발현을 유도할 수 있는 적절한 배지를 사용하여 적합한 배양 조건 하에서 배양한다. 숙주세포 배양을 위한 배지 및 배양 조건은 당업자에게 공지되어 있으며， 당업자는 공지된 배지 및 배양 조건을 본 발명에 적합하게 변형하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면， 본 발명의 브라제인 다중 변이체를 발현하는 숙주 세포는 대장균 (E. coli)이다. 상기 숙주 세포로서 대장균이 배양되는 동안, 발현백터 내의 핵산 발현 조절 서열에 의해 브라제인 다중 변이체가 발현된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면， 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 pelB 신호서열올 포함하며， 브라제인 다중 변이체 단백질은 pelB 신호서열에 의해 대장균의 세포막 간극으로 이동하게 되고， 대장균의 시그널 펩티다제 (signal peptidase)에 의해 pelB신호서열이 제거된다.
대장균에서 발현된 브라제인 다중 변이체는 대장균의 세포막 간극에 포함되어 있으므로， 대장균의 세포막 간극에서 단백질을 분리하는 공지의 방법 (Snyder et al. , J. Bacteriology 177： 953963, 1995)을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 배양된 대장균을 집균한 뒤， 20% 수크로오스 (Sucrose)가 포함된 30 mM 트리스 -염산 (Tr i-HCl， pH 8) 용액으로 현탁하고, EDTACpH 8) 용액 및 MgS04를 이용하여 대장균의 세포막 간극의 단백질을 용출시키는 방법에 의해 수행될 수 있다.
대장균의 세포막 간극 단백질로부터 본 발명의 브라제인 다중 변이체 단백질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며， 예를 들어， 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤， 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)， 투석， 겔 여과， 이온 교환 크로마토그래피， 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합을 사용할 수 있다.
브라제인 단백질은 열에 안정하므로 본 발명의 브라제인 다중 변이체의 분리는 열처리를 하여 수행될 수 있으며， 예컨대, 70 ― 90°C에서 15 - 60분간 가열하여 브라제인을 제외한 다른 단백질을 열 변성시킨 뒤 4°C에서 18000 g에서 30분간 원심분리를 통하여 열 변성된 단백질로부터 브라제인 변이체 단백질만을 분리할 수 있다.
본 발명의 브라제인 다중 변이체 단백질의 특성을 정리하면 다음과 같다,
( i ) 분자량: 6304 - 6389 Da
(ii) 높은 열 안정성 및 내산성
(iii) 높은 수용성
(iv) 수크로오스 대비 단맛 증가도: 1,250,000 - 2, 800, 000배
( V ) 야생형 브라제인 부타입 대비 단맛 증가도: 1,500 - 3, 570배 즉， 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 야생형 브라제인 부타입 단백질에 비해 단맛이 1,500 - 3， 570배와 같이 큰 정도로 향상되었다.
이와 같은 단맛의 증가 정도는 종래 본 발명자들이 개발한 브라제인 변이체 (한국특허출원 제 2007-0117013호， 제 2008-0019008호， 제 2010- 0016660호)와 비교하여도 훨씬 증가된 수치이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면， 본 발명은 상기 브라제인 다중 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 ( functional food) , 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 음료 (알콜성 음료 포함)， 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림， 병조림， 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동， 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙， 각종 드링크， 쿠키， 엿， 유제품 (예: 버터, 치이즈 등)， 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품， 넁동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등을 포함한다.
본 발명의 브라제인 다중 변이체를 함유하는 식품 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 전체 조성물 중량에 대해 0.01 - 10중량 %의 함유량 범위로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 당도 증진용 식품 조성물을 제조하기 위한 상기 브라제인 다중 변이체의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명은 단맛이 증가된 신규한 브라제인 다중 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터 상기 재조합 백터로 형질전환된 숙주 세포， 상기 변이체를 생산하는 방법 및 상기 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 브라제인 다중 변이체는 동일한 양의 수크로오스 (설탕)과 비교하여 약 2 백만배 이상 단맛이 높으며， 야생형의 브라제인 및 종래 개발된 브라제인 변이체와 비교하여도 단맛의 증가가 월등히 우수하다. 따라서， 본 발명의 브라제인 변이체는 매우 적은 양을 사용하여 원하는 단맛을 낼 수 있으며， 식품에서 설탕을 비롯한 다른 감미제를 대체하여 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 하기 실시예 1 에서의 본 발명의 브라제인 다중 변이체를 제조하기 위한 부위 특이적 변이법 (site-directed mutagenesis)을 모식적으로 보여주는 도면이다.
도 2 는 대장균 (E. coli)에서 열처리 없이 정제한 본 발명의 브라제인 다중 변이체를 SDS-PAGE 분석을 실시한 결과이다 (16.5% Tris- tricine gel). Lane M ： SDS-PAGE 풀리펩타이드 분자량 마커; Lane 1 ： 야생형 브라제인 (부타입); Lane 2 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40A; Lane 3 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40A; Lane 4: 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40A； Lane 5 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40K; Lane 6 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40 ; Lane 7 ： 브라제인 다증 변이체 K4R— H30R_E35D_E40K; Lane 8 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40D； Lane 9 ： 브라제인 다증 변이체 K4E_H30R_E35D_E40D; Lane 10 ： 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40D; Lane 11 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D— E40R； Lane 12 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40R； Lane 13 ： 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40R.
도 3 은 열처리하여 정제한 본 발명의 브라제인 다중 변이체를 SDS- PAGE 분석을 실시한 결과이다 (16.5% Tris-tricine gel). Lane M: SDS- PAGE 폴리펩타이드 분자량 마커; Lane 1 ： 야생형 브라제인 (부타입); Lane 2 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40A； Lane 3 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40A; Lane 4 ： 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40A; Lane 5 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40K； Lane 6 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40K； Lane 7 ： 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40K; Lane 8 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40D; Lane 9 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40D； Lane 10 ： 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40D； Lane 11 ： 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40R; Lane 12 ： 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40R; Lane 13 ： 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40R . 도 4a 내지 도 41 는 본 발명의 브라제인 다중 변이체의 HPLC 분석 결과를 보여준다. 약 9 분 위치에서 보여지는 피크는 브라제인 단백질을 지시하고 2.5 - 3.5 분에서의 피크는 완층액 (buffer)를 지시한다. 도 4a는 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40A 의 HPLC 분석결과이며, 도 4b 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40A 의 HPLC 분석결과이며， 도 4c 브라제인 다중 변이체 4R_H30R_E35D_E40A 의 HPLC 분석결과이며' 도 4d 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40K 의 HPLC 분석결과이며， 4e 브라제인 다중 변이체 4E_H30 _E35D_E40 의 HPLC 분석결과이며， 도 4f 는 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40K 의 HPLC 분석결과이며， 4g 브라제인 다중 변이체 4D_H30R_E35D_E40D 의 HPLC 분석결과이며, 도 4h 는 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40D 의 HPLC 분석결과이며, 도 4i
Figure imgf000013_0001
브라제인 다중 변이체 K4R_H30RJ:35D_E40D 의 HPLC 분석결과이며， 4j 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40R 의 HPLC 분석결과이며, 도 4k 는 브라제인 다중 변이체 K4E_H30R_E35D_E40R 의 HPLC 분석결과이며， 41 브라제인 다중 변이체 K4R_H30R_E35D_E40R의 HPLC 분석결과이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 실시예를 통하여 본 발명올 더욱 상세히 설명하고자 한다, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실시예 1: 브라제인 다증 변이체의 제조
1. 프라이머 설계
부위 특이적 변이법 (site-directed mutagenesis)을 사용하여 브라제인 3차 변이체 (부타입 기준)의 아미노산 서열에서 4 번째 아미노산인 라이신 (lysine, K) 잔기를, 각각 아스파르트산 (aspart ic acid), 글루탐산 (glutamic acid), 아르기닌 (arginine)으로 변이시키도톡 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하였고， 설계한 프라이머는 (주) Cosmo Genet ech (Seoul , Korea)에 의뢰하여 합성하였다 (표 1). 변이체에 변환시켜야 할 염기들의 효율을 높이기 위해 합성할 을리고뉴클레오타이드 프라이머는 길이가 30 mer 이하가 되도록 디자인하였다. 변환시키고자 하는 염기를 중심으로 양 옆에 브라제인의 염기서열를 나열하였으며 하나의 변이체를 만들기 위해 설계한 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 브라제인의 각 단일 가닥과 서로 상보적이 되도록 하였다.
【표 1】
Figure imgf000014_0001
2. 변이체의 제작
변이체 제작을 위해 치환시키고자 하는 아미노산의 DNA 서열을 포함하는 프라이머를 합성한 후， 변이체의 작성은 Stratagene의 QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit를 이용하였다. 브라제인 변이체 제작에 있어서는 발현 및 정제 과정이 단순한 pET-26b(+)- Brazzein(H30R_E35D_E40K) , pET-26b ( + ) -Br azze i n ( H30R_E35D_E40A ) , pET- 26b(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40D), pET-26b(+)-Brazzein(H30R_E35D_E40R) 백터를 주형 (template)으로 사용하였다. 상기 주형 백터는 브라제인 부타입 아미노산 서열 기준으로 30번째， 35번째， 및 40번째 아미노산이 변이된 브라제인 3차 변이체 H30R_E35D_E40K (서열번호 1)， H30R_E35D_E40A (서열번호 2)， H30R_E35D_E40D(서열번호 3)，
H30R_E35D_E40R (서열번호 4) 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 백터이다.
먼저 주형 DNA 핵산 분자 10 ng, 각각 최종농도 0.2 mM의 dNTP 흔합물, 125 ng의 변이된 염기가 포함된 합성 프라이머， 10X 반응 버퍼 5 μί, PfuTurbo DNA 중합효소 (2.5 \/≠) 1 ^를 포함하는 총 부피 50 ^의 반웅액을 제조한 후, 중합효소연쇄반웅 (PCR)을 행하였다. PCR 반웅 조건은 먼저 95°C에서 30초 동안 열변성 (denaturing)한 후 55°C에서 1분 동안 서넁 복원 (annealing)하였다. 그런 후 중합효소에 의한 유전자의 합성은 68°C에서 15분 동안 실시하였다. 이 조건을 1 사이클 (cycle)로 하고, 이 사이클을 반복하여 16사이클 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1.0% 아가로스 (agarose) 겔 전기영동에 의해 증폭된 생성물을 확인하였다. 확인된 생성물은 37°C에서 1 시간 동안 Dpnl제한효소로 처리한 후, 대장균 (E. coli) DH5a에 형질전환시켰다 (도 1 참조). 형질전환된 DH5a는 30 //g/ 의 카나마이신 (kanamycin)이 함유된 LB-한천 플레이트에서 12시간 배양하여 형질전환체를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양하여 이로부터 DNA를 분리하였다. 염기서열 분석을 통해 변이체로 확인된 유전자는 대장균 BL21 star(DE3)에 형질전환시켜 대량발현에 이용하였다. 3개 변이체 모두 성공적으로 제조되었으며, pET-26b(+)-brazzein (Met-) 유전자에서 발현된 재조합 브라제인과 동일한 방법에 의하여 정제하였다.
브라제인 3차 변이체 H30R_E35D_E40K, H30 35D_E40A ,
H30R_E35D_E40D, 및 H30R_E35D_E40R을 기반으로 상기 방법을 통해 제조한 4번째 라이신 아미노산의 아스파르트산， 글루탐산, 또는 아르기닌으로의 치환 변이체는 아래 표 2에 정리하여 나타내었다. 【표 2】
Figure imgf000016_0001
3. DNA 염기 서열 분석
PCR에 의해 얻어진 변이된 염기서열을 포함하는 브라제안 다중 변이체 유전자를 포함하는 변이체 백터 pET— Brazzein을 형질전환된 대장균 DH5a로부터 정제하여 유전자 염기 서열을 확인하였다. 유전자 염기서열은 (주) Cosmo Genetech에 의뢰하여 분석하였다. 실시예 2 ： 브라제인 다중 변이체의 발현 및 정제
1. 변이체의 대량 발현 상기 실시예 1에서 제작한 pET-Brazzein 변이체 /BL21 star(DE3)는 장기 보관을 위해 액체 배양한 샘플을 20% 글리세를 스탁 (glycerol stock) 상태로 만들어 -70°C에 넁동 보관하였다. pET-Brazzein 변이체 /BL21 star(DE3) 대량 발현을 위해 30 ^의 카나마이신이 포함된 1L LB 배지에 발현유도제인 IPTG(isopropyl-i3-D-thiogalactopyranoside)의 첨가 없이 8 시간 이상을 배양하여 대량발현을 유도하였다. 대량 발현된 배양액은 냉동원심분리기를 이용하여 4°C, 8,000g에서 10분간 집균한 뒤, 정제에 사용하기 전까지 -2CTC에서 넁동 보관하였다. 2. 변이체 단백질의 정제
넁동 보관된 균체를 20 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 8.0)를 이용하여 덩어리가 생기지 않게 잘 풀어준 다음 초음파 파쇄기를 이용하여, 보통의 대장균 파쇄 조건인 4°C, 30-40 watts, 진폭 (amplitude) 8%의 조건으로 15 분간 세포막을 파괴하였다. 세포 파쇄 후 30,000 g, 4°C에서 20분간 원심 분리하여 단백질과 다른 세포 불순물들을 분리하였다. 브라제인 변이체 단백질의 정제는 이전의 연구방법에 기술한 방법을 이용하였다 (Lee et al., 2010). 단백질 발현과정에서 봉입체 (inclusion body)를 생성하여 대부분 불용성 분획에서 얻을 수 있었다. 얻어진 불용성 분획을 가용화 버퍼 (solubilization buffer)로 가용화 한 후 24 시간 재접힘 (refolding) 시킴으로써 활성을 갖는 가용화 된 브라제인을 얻을 수 있었다。 이를 24 시간 동안 3차 증류수에 투석하였다. 마지막으로 85 t에서 30분간 가열하고 원심분리를 통해 순수한 브라제인을 얻을 수 있었다. 배양액 1L 당 약 6 mg의 정제된 브라제인올 얻을 수 있었으며 BCA assay를 통해 정량하였다.
3. 변이체 단백질의 정량
브라제인 변이체 단백질의 정량은 BCA assay (Pierce Chemical Co, Rockford IL, USA) 방법에 따라 측정하였으며, 562 nm에서 BSA(bovine serum albumin)과 야생형 브라제인을 표준단백질로 사용하여 표준 곡선을 작성한 뒤， 단백질 농도를 측정하는데 이용하였다. Bio-Rad사의 단백질 정량 시약과 정제된 브라제인 변이체를 60°C에서 30분간 반응시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질의 농도를 결정하였다.
4. 변이체 단백질의 전기영동 분석
단백질의 순도를 측정하기 위해 SDS-PAGE분석을 실시하였다, Tris- tricine 겔은 Schagger and von Jagow(1987) 방법에 따라 16.5%의 겔을 만들어 사용하였다. 전기영동이 끝난 겔은 coomassie brilliant blue R- 250을 사용하여 염색하였고， 층분한 탈색을 통해 단백질와 순도를 확인하였다. 이 때 사용한 분자량 표준 단백질은 Triosephosphate isomerase(26.6 kDa) , Myoglobin(17 kDa) , a -Lactalbumin(14.4 kDa) , Aprotinin(6.5 kDa)을 포함하고 있는 Bio-rad사의 Polypeptide SDS-PAGE Mel ocular Weight Standards를 사용하였다. SDS-PAGE 결과 약 6.5 kDa을 갖는 순수한 브라제인 변이체 단백질 밴드를 확인할 수 있었다 (도 2 및 도 3 참조). 5. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석
정제한 브라제인 변이체가 활성형인지를 확인하기 위하여 HPLC 분석을 행하였다. HPLC 기가는 Gilson사의 305 system을 사용하였으며， HPLC 분석을 위한 컬럼은 C18 5micron 150 X 4.6 컬럼을 사용하였고, 검출파장은 210 nm, 컬럼온도는 상온， 분당유속은 0.5 이동상 용매로는 A용매로 0.05 % TFA - 증류수， B 용매로 0.05 % TFA - 아세토니트릴을 사용하여 농도구배조건으로 분석하였다. HPLC 분석 결과, 약 9 분대에 하나의 큰 피크 (peak)로 용출됨을 확인하였다 (도 4a내지 도 41 참조). 실시예 3: 브라제인 다중 변이체의 활성 측정
브라제인은 당이 아닌 단백질이기 때문에 당도계를 이용하여 단맛을 측정할 수 없다. 따라서 사람의 미각을 이용하여 활성을 측정하였다. 사람마다 단맛을 처음 느끼게 되는 역치의 값 (threshold value)은 다르기 때문에 설탕용액과 브라제인 용액와 단맛을 처음 느끼는 농도를 비교하여 활성을 측정하였다. 피실험자는 사전에 훈련된 남성 10명， 여성 10명으로 구성하였다. 먼저 표준 설탕용액을 차례로 맛을 보고， 처음으로 단맛을 느끼는 농도를 체크하였다, 브라제인은 증류수에 (10.0 mg/mL) 녹여 희석하여 1-20 ng/mL이 되게 범위를 정하였으며 용액의 단맛을 보고 역치 값으로 느끼는 단계의 농도를 체크하여 설탕과 브라제인 야생형 및 브라제인 변이체와의 단맛의 상대 활성을 측정하였다. 구체적으로 활성 측정은 다음과 같이 진행하였다. 활성 측정 전 미리 피실험자에게 테스트 시행 날짜 및 시간을 공고하여 최상의 컨디션에서 맛을 보게끔 하였으며 테스트 전날 음주 및 테스트 직전 음식 섭취를 금하였다. 피실험자는 준비 된 생수로 입안을 행군 후 각 종류별 농도에 따른 샘플을 ΙΟΟμ Ι씩 저농도에서 고농도 별로 순차적으로 맛을 보았다. 결과 데이터는 Q 테스트 통해 의심스러운 값은 버리고 표준편차를 최소화하였으며 평균을 통해 데이터를 얻었다,
3차 변이체를 기반으로 감미 효과 증대 위해 변이시킨 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40A, K4E_H30R_E35D_E40A , K4R_H30R_E35D_E40A , K4D_H30R_E35D_E40K, 4E_H30R_E35D_E40K , 4R_H30R_E35D_E40K ,
K4D_H30R_E35D_E40D, K4E_H30R_E35D_E40D , K4R_H30R_E35D_E40D , K4D_H30R_E35D_E40R, K4E_H30R_E35D_E40R, K4R_H30R_E35D_E40R은 질량 대비 각각 수크로오스에 비해 각각 2 ,000,000배， 2, 000 ,000배ᅵ 2, 900 ,000배， 1,500， 000배， 1， 70으 000배， 2 ,000 ,000배, 1,300, 000배， 1,250, 000배， 1,700, 000배, 1,800, 000배, 1,800， 000배， 2, 000， 000배 단맛을 나타내었다 (표 3 참조). 표 3에는 야생형 브라제인의 활성 (100%) 대비 변이체의 상대 활성을 나타내었다. 본 발명의 브라제인 다중 변이체 K4D_H30R_E35D_E40A, K4E_H30R_E35D_E40A , K4R_H30R_E35D_E40A ,
K4D_H30R_E35D_E40K, K4E_H30R_E35D_E40K , K4R_H30R_E35D_E40K,
K4D_H30R_E35D_E40D, 4E_H30R_E35D_E40D , K4R_H30R_E35D_E40D ,
K4D_H30R_E35D_E40R, K4E_H30R_E35D_E40R , K4R_H30R_E35D_E40R은 질량 대비 각각 야생형 브라제인에 비해 각각 2, 500배， 2, 500배， 3， 570배， 1，920배， 2 ,080배， 2 ,500배, 1，670배， 1,560배, 2, 080배， 2, 270배， 2， 270배， 2， 500배 단맛을 나타내었다. 【표 3]
Figure imgf000020_0001
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참조문헌
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Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
서열번호 11 내지 서열번호 22로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산서열을 가지는 브라제인 다중 변이체.
【청구항 2】
상기 제 1 항의 브라제인 다중 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
【청구항 3】
(i) 프로모터 및 (ii) 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 상기 제 2 항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 백터 .
【청구항 4】
상기 제 3 항의 재조합 백터로 형질전환된 숙주 세포.
【청구항 5]
다음의 단계를 포함하는 브라제인 다중 변이체를 생산하는 방법: (a) 상기 제 4 항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 숙주세포로부터 브라제인 다중 변이체 단백질을 분리하는 단계 .
[청구항 6】
상기 제 1 항의 브라제인 다중 변이체를 유효성분으로 포함하는 당도 증진용 식품 조성물.
[청구항 7】
당도 증진용 식품 조성물을 제조하기 위한 상기 제 1 항 브라제인 다중 변이체의 용도.
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