JP2023535683A - 低減した糖の含有量を有する経口摂取用製品 - Google Patents
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Abstract
タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を、１：２，０００～１：８０，０００の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、食品などの経口摂取用の製品。
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り 令和２年７月６日 ウェブサイト 「ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｄｃｃ／？ｓｅｔ＝ＧＲＡＳＮｏｔｉｃｅｓ＆ｉｄ＝９１０＆ｓｏｒｔ＝ＧＲＮ＿Ｎｏ＆ｏｒｄｅｒ＝ＤＥＳＣ＆ｓｔａｒｔｒｏｗ＝１＆ｔｙｐｅ＝ｂａｓｉｃ＆ｓｅａｒｃｈ＝Ｎｏｍａｄ」及び「ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／１３９６０９／ｄｏｗｎｌｏａｄ」における公開
本発明は、タウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む、食品などの経口摂取用の製品に関する。製品において、糖の含有量は、甘味及び他の味質に対してほとんど作用することなく、低減することができる。さらに、本発明は、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物に関し、組成物は、少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む。甘味組成物として、又は経口摂取用の製品のカロリー含有量を低減するためのこのような組成物の使用が提供される。本発明はまた、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法及び経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップの辛味を低減する方法を提供する。
糖を含有する食品及び飲み物の過剰な摂取は、開発国並びに発展途上国における多くの人々にとって、増大する健康問題となっている。それから生じる健康問題は、よく知られており、肥満、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、並びに心血管疾患及びさらにＣｏｖｉｄ－１９などの感染性疾患に対する脆弱性の増大などの、健康問題及びそれに由来するリスクが挙げられる。
食品産業における近年の傾向は、生産者が、糖及び／又は高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の含有量を低減し、したがって、カロリー含有量を低減することを求める。しかしながら、製品の味質は、消費者による製品の認識性を傷つけることのないように、あまりに大きく変更されるべきではない。糖の含有量は、味覚、特に、甘味の知覚に対してばかりでなく、食感、粘度、及びかみ具合などの他の感覚刺激特性に対して、並びに微生物の攻撃に対する保存性に対して優生効果を有するため、製品の他の望ましい特性を傷つけることなく、糖を含有する製品、特に、糖の含有量が多い製品の糖の含有量を低減することは、容易な仕事ではない。
それゆえ、糖の含有量が低減されている、食品などの経口摂取用の製品及び組成物を提供することが、本発明の目的である。糖の含有量が低減されており、甘味、全体的な味及びあと味に関して、従来の製品と同じか、又は非常に似た味質を達成している、経口摂取用の製品及び組成物を提供することが、本発明の別の目的である。経口摂取用の製品のための甘味組成物、並びに甘味、全体的な味及びあと味のような味質をほとんど変えることなく、又は変えることなく、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法を提供することが、さらなる目的である。
それゆえ、糖の含有量が低減されている、食品などの経口摂取用の製品及び組成物を提供することが、本発明の目的である。糖の含有量が低減されており、甘味、全体的な味及びあと味に関して、従来の製品と同じか、又は非常に似た味質を達成している、経口摂取用の製品及び組成物を提供することが、本発明の別の目的である。経口摂取用の製品のための甘味組成物、並びに甘味、全体的な味及びあと味のような味質をほとんど変えることなく、又は変えることなく、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法を提供することが、さらなる目的である。
これらの目的は、以下によって達成される：
１）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、食品などの経口摂取用の製品。
２）製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチンである、経口摂取用の製品。
３）製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは、３～１０質量％、より好ましくは、４～８質量％の、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含む、項１又は２に記載の経口摂取用の製品。
４）前記少なくとも１つの糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない、項１～３のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
１）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、食品などの経口摂取用の製品。
２）製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチンである、経口摂取用の製品。
３）製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは、３～１０質量％、より好ましくは、４～８質量％の、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含む、項１又は２に記載の経口摂取用の製品。
４）前記少なくとも１つの糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない、項１～３のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
５）グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含有する高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、項１～４のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
６）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、項５に記載の経口摂取用の製品。
７）ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８％～７５％の溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する、項５又は６に記載の経口摂取用の製品。
６）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、項５に記載の経口摂取用の製品。
７）ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８％～７５％の溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する、項５又は６に記載の経口摂取用の製品。
８）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにグルコース及びフルクトースからなる群から選択される糖を含む、食品などの経口摂取用の製品であって、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、経口摂取用の製品。
９）高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される前記少なくとも１つの糖として含む、項１～８のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、経口摂取用の製品。
９）高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される前記少なくとも１つの糖として含む、項１～８のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
１０）飲み物、飲み物用粉末、飲料、清涼飲料、ヨーグルト、ジャム、マーマレード、シロップなどの飲料濃縮液、デザート、ケーキ、ビスケット、クッキー、チョコレート、キャンディー、菓子、砂糖菓子、チューインガム、カスタード、プディング、ゼリー、フィリングゼリー、ペストリー、パイ、あめ玉、加工食品、シリアル、焼成製品、又は医薬；ワイン若しくはビール又は他の発酵若しくは蒸留された飲み物、ポテトベースのスナック、朝食用シリアル、チューインガム、アイスクリーム、ココア及びチョコレート製品、ブレスミント、糖デコレーション又はアイシング、コーティング又はフィリング、上質なベーカリーの品物、食品添加物又は食卓用甘味料である、項１～９のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
１１）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物。
１１）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物。
１２）グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含有し、スクロースを含有しない、項１１に記載の組成物。
１３）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにグルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物。
１３）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにグルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物。
１４）組成物の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、組成物の総質量当たり３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチンを含有する、項１１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
１５）前記少なくとも１つのタウマチン及び前記少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
のタウマチン：糖の質量比で含有する、項１１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
１５）前記少なくとも１つのタウマチン及び前記少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
のタウマチン：糖の質量比で含有する、項１１～１４のいずれか１項に記載の組成物。
１６）組成物の総質量当たり１０～１００ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチン及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１つの糖を含む、項１１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
１７）組成物の総質量当たり３０～７０ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチン及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１つの糖を含む、項１１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
１８）前記経口摂取用の製品のためのさらなる成分を含み、前記成分が、クエン酸又はその塩、ビタミン、無機塩、微量元素、カフェイン、タウリン、ゲル化剤又は増粘剤、香味剤、及び保存剤からなる群から選択される１種又は複数の成分である、項１１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
１９）前記ビタミンが、アスコルビン酸若しくはその塩、ビタミンＢファミリーのビタミン、若しくはトコフェロール若しくはその誘導体から選択される１種若しくは複数であり；前記無機塩が、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩から選択され；並びに／又は前記微量元素が、亜鉛化合物、イオン化合物、若しくは銅化合物である、項１８に記載の組成物。
１７）組成物の総質量当たり３０～７０ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチン及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１つの糖を含む、項１１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
１８）前記経口摂取用の製品のためのさらなる成分を含み、前記成分が、クエン酸又はその塩、ビタミン、無機塩、微量元素、カフェイン、タウリン、ゲル化剤又は増粘剤、香味剤、及び保存剤からなる群から選択される１種又は複数の成分である、項１１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
１９）前記ビタミンが、アスコルビン酸若しくはその塩、ビタミンＢファミリーのビタミン、若しくはトコフェロール若しくはその誘導体から選択される１種若しくは複数であり；前記無機塩が、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩から選択され；並びに／又は前記微量元素が、亜鉛化合物、イオン化合物、若しくは銅化合物である、項１８に記載の組成物。
２０）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、項１３に記載の組成物。
２１）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８～７５質量の％溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する、項１３又は２０に記載の組成物。
２２）前記タウマチンが、タウマチンＩＩである、項１～２１のいずれか１項に記載の製品又は組成物。
２１）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８～７５質量の％溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する、項１３又は２０に記載の組成物。
２２）前記タウマチンが、タウマチンＩＩである、項１～２１のいずれか１項に記載の製品又は組成物。
２３）甘味組成物としての、項１１～２２のいずれか１項に定義される組成物の使用。
２４）経口摂取用の製品を調製するための、項１１～２２のいずれか１項に定義される組成物の使用。
２５）経口摂取用の製品のカロリー含有量を低減するための、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩ、好ましくは、タウマチンＩＩからなる群から選択されるタウマチンの使用。
２６）経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法であって、糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つであり、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
２４）経口摂取用の製品を調製するための、項１１～２２のいずれか１項に定義される組成物の使用。
２５）経口摂取用の製品のカロリー含有量を低減するための、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩ、好ましくは、タウマチンＩＩからなる群から選択されるタウマチンの使用。
２６）経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法であって、糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つであり、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
２７）スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖の含有量が、経口摂取用の製品において最大５０％低減され、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、項２６に記載の方法。
２８）経口摂取用の製品における糖の含有量を最大５０％低減する方法であって、糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つであり、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
２９）経口摂取用の製品において甘味料としてタウマチンを使用する方法であって、タウマチンを前記製品の前駆体に、製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍの範囲で加える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
２８）経口摂取用の製品における糖の含有量を最大５０％低減する方法であって、糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つであり、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
２９）経口摂取用の製品において甘味料としてタウマチンを使用する方法であって、タウマチンを前記製品の前駆体に、製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍの範囲で加える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
３０）経口摂取用の製品を製造する方法であって、項１１～２２のいずれか１項に記載の組成物を他の成分と混合して、前記製品を製造する工程を含む、方法。
３１）経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法であって、タウマチンを、前記ＨＦＣＳ含有製品のプレ製品に加える工程を含み、前記プレ製品が、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
３１）経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法であって、タウマチンを、前記ＨＦＣＳ含有製品のプレ製品に加える工程を含み、前記プレ製品が、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
３２）経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法であって、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換える工程を含み、得られた製品におけるＨＦＣＳの固形分の含有量が、得られた製品の総質量当たり４～８質量％、好ましくは、５～７質量％に低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
３３）経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法であって、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換える工程を含み、得られた製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量が、３０～５０％低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
３４）製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量を、得られた製品の総質量当たり４～８質量％、好ましくは、５～７質量％に低減し、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを加えることにより、経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減するためのタウマチンの使用であって、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、使用。
３５）高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）が、ＨＦＣＳ－５５である、項３１～３３のいずれか１項に記載の方法又は項３４に記載の使用。
３６）製品の総質量当たり５～７質量％のＨＦＣＳ固形物及び製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを含有する、経口摂取用の製品であって、ＨＦＣＳ固形物が、高フルクトースコーンシロップの固形分であり、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、経口摂取用の製品。
３３）経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法であって、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換える工程を含み、得られた製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量が、３０～５０％低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
３４）製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量を、得られた製品の総質量当たり４～８質量％、好ましくは、５～７質量％に低減し、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを加えることにより、経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減するためのタウマチンの使用であって、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、使用。
３５）高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）が、ＨＦＣＳ－５５である、項３１～３３のいずれか１項に記載の方法又は項３４に記載の使用。
３６）製品の総質量当たり５～７質量％のＨＦＣＳ固形物及び製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを含有する、経口摂取用の製品であって、ＨＦＣＳ固形物が、高フルクトースコーンシロップの固形分であり、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、経口摂取用の製品。
３７）前記タウマチンが、そのアミノ酸配列が配列番号５若しくは配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号５若しくは６のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列であるポリペプチドを含むタンパク質であり、前記タウマチンが、好ましくは、ニコチアナ種から抽出される、項１～３６のいずれか１項に記載の製品、組成物、使用又は方法。
３８）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択されるタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む、植物抽出物。
３８）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択されるタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む、植物抽出物。
３９）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、食品などの経口摂取用の製品。
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチンと前記糖の質量比で含む、食品などの経口摂取用の製品。
４０）製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは、３～１０質量％、より好ましくは、４～８質量％の、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含み；並びに／又は
製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチンである、項３９に記載の経口摂取用の製品。
４１）前記少なくとも１つの糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない、項３９又は４０に記載の経口摂取用の製品。
４２）グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含有する高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含み、好ましくは、ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、項３９～４１のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
４３）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８％～７５％の溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０％～７％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０％～７％のグルコースオリゴ糖を含有する、項４２に記載の経口摂取用の製品。
製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチンである、項３９に記載の経口摂取用の製品。
４１）前記少なくとも１つの糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない、項３９又は４０に記載の経口摂取用の製品。
４２）グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含有する高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含み、好ましくは、ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、項３９～４１のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
４３）ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８％～７５％の溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０％～７％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０％～７％のグルコースオリゴ糖を含有する、項４２に記載の経口摂取用の製品。
４４）飲み物、飲み物用粉末、飲料、清涼飲料、ヨーグルト、ジャム、マーマレード、シロップなどの飲料濃縮液、デザート、ケーキ、ビスケット、クッキー、チョコレート、キャンディー、菓子、砂糖菓子、チューインガム、カスタード、プディング、ゼリー、フィリングゼリー、ペストリー、パイ、あめ玉、加工食品、シリアル、焼成製品、又は医薬；ワイン若しくはビール又は他の発酵若しくは蒸留された飲み物、ポテトベースのスナック、朝食用シリアル、チューインガム、アイスクリーム、ココア及びチョコレート製品、ブレスミント、糖デコレーション若しくはアイシング、コーティング若しくはフィリング、上質なベーカリーの品物、食品添加物又は食卓用甘味料である、項３９～４３のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
４５）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含むか；又は
タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにグルコース及びフルクトースから選択される少なくとも１つの糖を含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物。
タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにグルコース及びフルクトースから選択される少なくとも１つの糖を含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物。
４６）組成物の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、組成物の総質量当たり３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチンを含有し；及び／又は
前記少なくとも１つのタウマチン及び前記少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
のタウマチン：糖の質量比で含有する、項４５に記載の組成物。
４７）組成物の総質量当たり１０～１００ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチン及び組成物の総質量当たり３０質量％～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の前記少なくとも１つの糖を含む、項４６に記載の組成物。
４８）前記経口摂取用の製品のためのさらなる成分を含み、前記成分が、クエン酸又はその塩、ビタミン、無機塩、微量元素、カフェイン、タウリン、ゲル化剤又は増粘剤、香味剤、及び保存剤からなる群から選択される１種又は複数の成分である、項４５～４７のいずれか１項に記載の組成物。
前記少なくとも１つのタウマチン及び前記少なくとも１つの糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
のタウマチン：糖の質量比で含有する、項４５に記載の組成物。
４７）組成物の総質量当たり１０～１００ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１つのタウマチン及び組成物の総質量当たり３０質量％～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の前記少なくとも１つの糖を含む、項４６に記載の組成物。
４８）前記経口摂取用の製品のためのさらなる成分を含み、前記成分が、クエン酸又はその塩、ビタミン、無機塩、微量元素、カフェイン、タウリン、ゲル化剤又は増粘剤、香味剤、及び保存剤からなる群から選択される１種又は複数の成分である、項４５～４７のいずれか１項に記載の組成物。
４９）甘味組成物としての、又は経口摂取用の製品を調製するための、項４５～４８のいずれか１項に定義される組成物の使用。
５０）経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法であって、糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択され、前記糖の一部を、最終製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
５１）経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法であって、タウマチンを、前記製品のプレ製品に加える工程を含み、前記プレ製品が、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
５２）前記タウマチンが、そのアミノ酸配列が配列番号５若しくは配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号５若しくは６のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列であるポリペプチドを含むタンパク質であり、前記タウマチンが、好ましくは、ニコチアナ種から抽出される、項３９～５１のいずれか１項に記載の製品、組成物、使用又は方法。
５３）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択されるタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を含み、タウマトコッカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ）植物の抽出物ではない、植物抽出物。
５０）経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法であって、糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択され、前記糖の一部を、最終製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
５１）経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法であって、タウマチンを、前記製品のプレ製品に加える工程を含み、前記プレ製品が、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
５２）前記タウマチンが、そのアミノ酸配列が配列番号５若しくは配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号５若しくは６のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列であるポリペプチドを含むタンパク質であり、前記タウマチンが、好ましくは、ニコチアナ種から抽出される、項３９～５１のいずれか１項に記載の製品、組成物、使用又は方法。
５３）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択されるタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を含み、タウマトコッカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ）植物の抽出物ではない、植物抽出物。
本発明の発明者らは、官能評価研究を行い、糖の最大６０％、好ましくは、最大５０％が、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択されるタウマチンによってもたらされる甘味によって置き換えられるとき、食品又は飲料などの経口摂取用の製品における糖の含有量は、味質の最小限の変化で、最大５０％、さらに最大６０％低減することができることを見出した。ここで、低減されるべき糖は、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される。さらに、本発明者らは、甘味を含む、味質の最小限の変化のみで、食品又は飲料などの経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法を同定した。
加えて、本発明は、＞９５質量％の純度を有するタウマチンＩ又はタウマチンＩＩを製造する方法を提供する。方法は、植物、例えば、ニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）におけるタウマチンＩ又はタウマチンＩＩの組み換え発現、続いて抽出及び精製を含む。この方法は、野生のカテンフェ（ｋａｔｅｍｆｅ）（タウマトコッカス・ダニエリ）植物の収穫と比較して、環境に優しいタウマチンの製造を提供する。方法は、発酵によって製造されるタウマチンと比較して、測定可能であり、コスト上有効である。結果として、方法は、産業上の適用のためのタウマチンの有効性を増大させ、高い安全性の供給を提供する。タウマチン製造におけるこれらの改善により、食品産業において高い効力の甘味料及び味覚変革物質としてのタウマチンの使用を可能にする。
本発明の糖
本発明の糖は、スクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される。これらの糖が、高い量で製品に存在する場合、これらの糖は、同時に、高いカロリー含有量を製品にもたらす経口摂取用の製品における主要な甘味糖である。甘味を製品にもたらすことができる他の化学化合物が存在する。甘味を本発明の製品にもたらすことができる、このような他の化合物の存在は、排除されない。本明細書において、「グルコース」という用語は、Ｄ－グルコースを指す。そうでなければ、グルコースは、限定されず、開鎖形態及び環状形態のグルコースを含む。環状形態は、α－Ｄ－グルコース又はβ－Ｄ－グルコースとして存在してもよい。グルコースの量又は含有量を決定するため、製品又は組成物におけるＤ－グルコースの全てのこれらの形態の量又は含有量が加えられる。グルコシドなどのより大きな分子の一部としてグルコース部分を含有する化合物は、本発明の意味ではグルコースではない。
本発明の糖は、スクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される。これらの糖が、高い量で製品に存在する場合、これらの糖は、同時に、高いカロリー含有量を製品にもたらす経口摂取用の製品における主要な甘味糖である。甘味を製品にもたらすことができる他の化学化合物が存在する。甘味を本発明の製品にもたらすことができる、このような他の化合物の存在は、排除されない。本明細書において、「グルコース」という用語は、Ｄ－グルコースを指す。そうでなければ、グルコースは、限定されず、開鎖形態及び環状形態のグルコースを含む。環状形態は、α－Ｄ－グルコース又はβ－Ｄ－グルコースとして存在してもよい。グルコースの量又は含有量を決定するため、製品又は組成物におけるＤ－グルコースの全てのこれらの形態の量又は含有量が加えられる。グルコシドなどのより大きな分子の一部としてグルコース部分を含有する化合物は、本発明の意味ではグルコースではない。
「フルクトース」という用語は、Ｄ－フルクトースを指す。そうでなければ、フルクトースは限定されず、開鎖形態及び環状形態のフルクトースを含む。環状形態では、それは、フルクトピラノース又はフルクトフラノースとして存在してもよい。環状形態は、α－又はβ－アノマー形態で存在してもよい。フルクトースの量又は含有量を決定するため、製品又は組成物におけるＤ－フルクトースの全てのこれらの形態の量又は含有量が加えられる。より大きな分子の一部としてフルクトース部分を含有する化合物は、本発明の意味ではフルクトースではない。
「スクロース」という用語は、α－Ｄ－グルコピラノシル－（１－２）－β－Ｄ－フルクトフラノシドを指す。
「スクロース」という用語は、α－Ｄ－グルコピラノシル－（１－２）－β－Ｄ－フルクトフラノシドを指す。
本発明における使用のため、糖は、スクロース、グルコース及び／又はフルクトースの純粋な化合物として利用されてもよく、本発明の製品、組成物、方法及び使用においてこのような形態で使用されてもよい。或いは、本発明の糖は、糖を含有する糖組成物の一部であってもよい。このような糖組成物の例は、サトウキビ又はテンサイなどの糖植物から単離されたか、又は処理された糖組成物又は抽出物である。糖組成物の別の例は、トウモロコシ、他の穀物、又はジャガイモなどの多量のデンプンを含有する植物から製造される組成物である。このような糖組成物は、デンプンを含有する植物の一部から得られたデンプンを加水分解して、グルコースを得る工程を含むプロセスによって、デンプン含有量が高い植物から製造することができる。好ましい糖組成物は、高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）である。ＨＦＣＳは、デンプンのグルコースへの酵素加水分解、続いて、グルコースからフルクトースへの異性体化によって、コーンスターチから得ることができる。デンプンの酵素加水分解は、アミラーゼ酵素を使用して行うことができる。グルコースのフルクトースへの異性体化は、酵素であるキシロース異性体化酵素を使用して行うことができる。例えば、フルクトースを分離し、分離されたフルクトースを異性体化プロセスの生成物に加えることにより、得られたグルコース－フルクトース混合物をさらに処理して、所望のフルクトース及びグルコース含有量のグルコース－フルクトース混合物を得てもよい。ＨＦＣＳは、フルクトース、グルコース、水、及び一部のグルコースオリゴ糖を含有する。ＨＦＣＳは、様々なフルクトース濃度で、例えば、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０として市販されており、数は、フルクトース含有量を乾燥組成物の質量％（すなわち、水を除去後の、ＨＦＣＳの固形分）で示す。したがって、フルクトースと異なり、ＨＦＣＳの他の成分は、上述の通り、大部分が、グルコース及び水であり、一部グルコースオリゴ糖である。好ましいＨＦＣＳは、ＨＦＣＳ－４２の固形分である、４２質量％のフルクトースを含有するＨＦＣＳ－４２である。別の好ましいＨＦＣＳは、ＨＦＣＳ－４２の固形分である、５５質量％のフルクトースを含有するＨＦＣＳ－５５である。
本発明において使用されるＨＦＣＳは、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８～７５質量％の溶解又は分散された固形物を含有してもよく、前記固形物は、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物は、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する。
本発明のタウマチン
本発明のタウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択され、タウマチンＩＩが好ましい。両方のタウマチンは、タンパク質であり、それらは、天然で生じるため、そのアミノ酸配列は、これらのタンパク質の成熟形態である２０７個のアミノ酸残基の長さを有する。タウマチンＩ及びタウマチンＩＩの天然の形態のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５及び配列番号６に示される。
本明細書において、「タウマチンＩ」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号５のアミノ酸配列又は配列番号５のアミノ酸配列において１～３個、好ましくは、１若しくは２個のアミノ酸（残基）置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列である、タンパク質を指す。好ましい実施形態では、タウマチンＩは、タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸配列である。
本発明のタウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択され、タウマチンＩＩが好ましい。両方のタウマチンは、タンパク質であり、それらは、天然で生じるため、そのアミノ酸配列は、これらのタンパク質の成熟形態である２０７個のアミノ酸残基の長さを有する。タウマチンＩ及びタウマチンＩＩの天然の形態のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５及び配列番号６に示される。
本明細書において、「タウマチンＩ」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号５のアミノ酸配列又は配列番号５のアミノ酸配列において１～３個、好ましくは、１若しくは２個のアミノ酸（残基）置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列である、タンパク質を指す。好ましい実施形態では、タウマチンＩは、タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、配列番号５のアミノ酸配列である。
「タウマチンＩＩ」という用語は、そのアミノ酸配列が配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６のアミノ酸配列において１～３個、好ましくは、１若しくは２個のアミノ酸（残基）置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列のアミノ酸配列である、タンパク質を指す。好ましい実施形態では、タウマチンＩＩは、タンパク質であり、そのアミノ酸配列は、配列番号６のアミノ酸配列である。
タウマチンが、本明細書において、アミノ酸置換、付加、挿入及び／又は欠失の数又は数値範囲によって定義される場合、これらのアミノ酸置換、付加、挿入及び／又は欠失は、組み合わされてもよいが、所定の数又は数値範囲は、全てのアミノ酸（残基）置換、付加、挿入及び欠失の合計を指す。アミノ酸置換、付加、挿入、及び欠失の中でも、アミノ酸置換、付加、及び欠失が、好ましく、置換及び付加が、より好ましく、付加が、最も好ましい。
「挿入」という用語は、参照配列のアミノ酸配列内の挿入、すなわち、Ｃ又はＮ末端における付加を除く、挿入に関する。「付加」という用語は、参照配列のアミノ酸配列のＣ又はＮ末端における負荷を意味する。欠失は、参照配列の末端又は内部アミノ酸残基の欠失であってもよい。「参照配列」という用語は、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を意味する。
タウマチンが、本明細書において、アミノ酸置換、付加、挿入及び／又は欠失の数又は数値範囲によって定義される場合、これらのアミノ酸置換、付加、挿入及び／又は欠失は、組み合わされてもよいが、所定の数又は数値範囲は、全てのアミノ酸（残基）置換、付加、挿入及び欠失の合計を指す。アミノ酸置換、付加、挿入、及び欠失の中でも、アミノ酸置換、付加、及び欠失が、好ましく、置換及び付加が、より好ましく、付加が、最も好ましい。
「挿入」という用語は、参照配列のアミノ酸配列内の挿入、すなわち、Ｃ又はＮ末端における付加を除く、挿入に関する。「付加」という用語は、参照配列のアミノ酸配列のＣ又はＮ末端における負荷を意味する。欠失は、参照配列の末端又は内部アミノ酸残基の欠失であってもよい。「参照配列」という用語は、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列を意味する。
タウマチンＩ及びタウマチンＩＩはそれぞれ、一般に、８個の分子内ジスルフィド結合を有する。したがって、参照配列に関して任意の置換又は欠失は、好ましくは、参照配列のシステイン残基の置換又は欠失ではなく、すなわち、好ましくは、置換又は欠失しているシステイン残基は存在しない。
配列番号５のタウマチンＩの好ましい置換は、Ｋ４６、Ｒ６３、Ｒ６７、Ｑ７６、及びＤ１１３の置換から選択される置換である。
配列番号５のタウマチンＩの好ましい置換は、Ｋ４６、Ｒ６３、Ｒ６７、Ｑ７６、及びＤ１１３の置換から選択される置換である。
配列番号５のＫ４６の好ましい置換は、Ｎ又はＲ、好ましくは、Ｎへの置換である。
配列番号５のＲ６３の好ましい置換は、Ｋ又はＳ、好ましくは、Ｓへの置換である。
配列番号５のＲ６７の好ましい置換は、Ｋ又はＨ、好ましくは、Ｋへの置換である。
配列番号５のＱ７６の好ましい置換は、Ｒ又はＫ、好ましくは、Ｒへの置換である。
配列番号５のＤ１１３の好ましい置換は、Ｎ、Ｅ又はＱ、好ましくは、Ｎへの置換である。
配列番号６のタウマチンＩＩの好ましい置換は、Ｎ４６、Ｓ６３、Ｋ６７、Ｒ７６、及びＮ１１３の置換から選択される置換である。
配列番号６のＮ４６の好ましい置換は、Ｋ又はＲ、好ましくは、Ｋへの置換である。
配列番号６のＳ６３の好ましい置換は、Ｋ又はＲ、好ましくは、Ｒへの置換である。
配列番号６のＫ６７の好ましい置換は、Ｒ又はＨ、好ましくは、Ｒへの置換である。
配列番号６のＲ７６の好ましい置換は、Ｑ又はＫ、好ましくは、Ｑへの置換である。
配列番号６のＮ１１３の好ましい置換は、Ｄ、Ｅ又はＱ、好ましくは、Ｄへの置換である。
２０種の天然のアミノ酸残基について一般的に公知の１文字コードが、上で使用される。
配列番号５のＲ６３の好ましい置換は、Ｋ又はＳ、好ましくは、Ｓへの置換である。
配列番号５のＲ６７の好ましい置換は、Ｋ又はＨ、好ましくは、Ｋへの置換である。
配列番号５のＱ７６の好ましい置換は、Ｒ又はＫ、好ましくは、Ｒへの置換である。
配列番号５のＤ１１３の好ましい置換は、Ｎ、Ｅ又はＱ、好ましくは、Ｎへの置換である。
配列番号６のタウマチンＩＩの好ましい置換は、Ｎ４６、Ｓ６３、Ｋ６７、Ｒ７６、及びＮ１１３の置換から選択される置換である。
配列番号６のＮ４６の好ましい置換は、Ｋ又はＲ、好ましくは、Ｋへの置換である。
配列番号６のＳ６３の好ましい置換は、Ｋ又はＲ、好ましくは、Ｒへの置換である。
配列番号６のＫ６７の好ましい置換は、Ｒ又はＨ、好ましくは、Ｒへの置換である。
配列番号６のＲ７６の好ましい置換は、Ｑ又はＫ、好ましくは、Ｑへの置換である。
配列番号６のＮ１１３の好ましい置換は、Ｄ、Ｅ又はＱ、好ましくは、Ｄへの置換である。
２０種の天然のアミノ酸残基について一般的に公知の１文字コードが、上で使用される。
タウマチンＩ及びＩＩは、単独又は組み合わせで使用されてもよい。タウマチンＩ及びＩＩが、組み合わせて使用される場合、本明細書に示される含有量は、タウマチンＩ及びＩＩの合計を指す。発明者らは、タウマチンＩＩが、長引くあと味がより少ないなどの、より良好な味の特徴を有することを見出したため、タウマチンＩＩは、本発明における使用に好ましい。したがって、本発明の製品及び組成物におけるタウマチンＩＩとタウマチンＩの質量比は、好ましくは、少なくとも２：１、より好ましくは、少なくとも４：１、なおより好ましくは、少なくとも９：１である。本発明の製品及び組成物におけるタウマチンＩＩとタウマチンＩの質量比が、１０：１以上である場合、製品又は組成物は、タウマチンＩを含有しないとみなされる。このような少量のタウマチンＩは、本発明の製品又は組成物におけるタウマチンの含有量を決定するのに考慮されない。
タウマチンＩ及びＩＩは、高い水溶性（＞２０％ｗ／ｖ）である。タウマチンを、水若しくは他の適当な食品に適合可能なビヒクルに溶解／希釈するか、又は食品若しくは飲み物に直接混合して、本発明の所望の効果を達成してもよい。
タウマチンＩ及びＩＩは、高い水溶性（＞２０％ｗ／ｖ）である。タウマチンを、水若しくは他の適当な食品に適合可能なビヒクルに溶解／希釈するか、又は食品若しくは飲み物に直接混合して、本発明の所望の効果を達成してもよい。
本発明において使用するためのタウマチンは、乾燥凍結乾燥粉末として、又は水などの溶液中で保存されてもよい。水又はストック溶液中のタウマチンの濃度は、タウマチンにおけるトリプトファン残基に起因した２８０ｎｍにおけるその吸光度を使用して測定されてもよい。２９４２０Ｍ-1ｃｍ-1の消衰係数は、タウマチンＩ及びＩＩについて両方使用され、１つの分子当たり３個のトリプトファン残基に基づく。１個の分子当たりトリプトファン残基の数が、変更される場合（例えば、アミノ酸の置換に起因する）、吸光度係数は調整される。
タウマチンは、西アフリカ森林のやぶにおいて成長する低木であるカテンフェ植物（タウマトコッカス・ダニエリ）の果実に存在する天然の甘いタンパク質である。果実、より具体的には、種衣は、異なるタウマチンタンパク質の混合物としてタウマチンを含有する。タウマチンタンパク質ファミリーのメンバーは、質量ベースでスクロースより２０００～３０００倍甘いであると報告され、公知の最も甘い天然の物質とみなされる。カテンフェ植物由来の天然のタウマチンは、何世紀もの間、西アフリカにおいて甘味料及び味覚変革物質として使用されてきた。分子レベルで、タウマチン分子における電荷の分布は、味覚受容体とのそれらの相互作用を仲介し得る。タウマチン分子と味覚受容体の間の相互作用の強さは、タウマチンの甘味の知覚の強度及び持続を説明し得る。
起源であるそれらの天然の植物において、タウマチンは、分泌されたタンパク質であり、切断可能なＮ末端の標的配列及びＣ末端の６個のアミノ酸の尾部を含有するプレプロタンパク質（２３５個のアミノ酸、２５．５ｋＤａ）として翻訳される。ウマチンＩ及びＩＩは、類似する特性、アミノ酸組成、甘味、分子量（両方が、約２２ｋＤａである）及び非常に類似するアミノ酸配列を有し、個のアミノ酸残基のみが異なる。それぞれの成熟タンパク質は、８個の分子内ジスルフィド結合を有する２０７個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖である。タウマチンＩのＸ線結晶解析により、タンパク質の骨格の特性が明らかになった。円二色性研究は、α－らせん体をほとんど示さないが、多くのβ－プリーツシート鎖及びベンドを示した。タウマチンの制限された構造が、甘味の感覚を誘発するのに必須であると考えられる。ジスルフィド架橋の熱変性又は切断は、甘味の喪失をもたらし得る。
タウマチンは、甘味の神経生理学的感覚を伝えるための、舌の味覚受容体と相互作用する。スクロースなどの糖又は他の甘味料が、唾液中に溶解し、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属する、ヘテロダイマーＴ１Ｒ２－Ｔ１Ｒ３受容体に結合するとき、自然な甘味の知覚が生じる。これらの受容体は、甘味を誘発する化合物との相互作用の際に活性化される、複数の結合部位を有する。受容体に対してリガンドが異なると、同じ受容体で異なる結合特性を示し、これにより、異なるタンパク質についての様々な甘味の知覚を導く。
それらの甘味にも関わらず、タウマチンは、天然の供給源からの有効性が限定されるので、甘味料よりむしろ味覚変革物質として大抵使用されてきた。西アフリカ以外の他の地域におけるカテンフェ植物（タウマトコッカス・ダニエリ）を栽培する試みは失敗し、天然のタウマチンの果実からの抽出は、骨が折れる。結果として、タウマチンは、１ｋｇ当たり７，０００～１０，０００ドルもの高い販売価格となり、高価である。さらに、未生成物としての低い有効性及び低い供給の保障は、食品産業において巨大なスケールでの甘味料又は味覚変革物質としてのタウマチンの使用を制限する。加えて、天然のタウマチン調製物は、甘味、長引くあと味、及び甘草様のオフノートのゆっくりとした開始のような不所望な嗜好属性を有する、異なるタウマチンタンパク質の混合物であり、他の化合物である可能性もある。
これらの問題を解決するために、本発明は、オフノートを有さず、調節された組成、高い純度、及び再現可能な品質を有するタウマチンの提供を可能にする、カテンフェ植物以外の植物供給源由来のタウマチンを提供する。これは、順に、食品産業が、多量かつ、同時に、大きなスケールでさえ再現可能な味の、経口摂取用の製品を提供し、製造することを可能にする。植物からタウマチンを製造する方法が、以下でさらに記載される。
それらの甘味にも関わらず、タウマチンは、天然の供給源からの有効性が限定されるので、甘味料よりむしろ味覚変革物質として大抵使用されてきた。西アフリカ以外の他の地域におけるカテンフェ植物（タウマトコッカス・ダニエリ）を栽培する試みは失敗し、天然のタウマチンの果実からの抽出は、骨が折れる。結果として、タウマチンは、１ｋｇ当たり７，０００～１０，０００ドルもの高い販売価格となり、高価である。さらに、未生成物としての低い有効性及び低い供給の保障は、食品産業において巨大なスケールでの甘味料又は味覚変革物質としてのタウマチンの使用を制限する。加えて、天然のタウマチン調製物は、甘味、長引くあと味、及び甘草様のオフノートのゆっくりとした開始のような不所望な嗜好属性を有する、異なるタウマチンタンパク質の混合物であり、他の化合物である可能性もある。
これらの問題を解決するために、本発明は、オフノートを有さず、調節された組成、高い純度、及び再現可能な品質を有するタウマチンの提供を可能にする、カテンフェ植物以外の植物供給源由来のタウマチンを提供する。これは、順に、食品産業が、多量かつ、同時に、大きなスケールでさえ再現可能な味の、経口摂取用の製品を提供し、製造することを可能にする。植物からタウマチンを製造する方法が、以下でさらに記載される。
経口摂取用の製品
本発明による経口摂取用の製品は、ヒト又は他の動物により、好ましくは、ヒトにより、口を介した消費に適している、任意の製品、調製、又は組成物であってもよい。製品は、複数の成分（例えば、化学化合物）を含む。製品は、少なくとも２種の成分又は化学化合物、すなわち、糖及びタウマチンを含む。一般に、製品は、少なくとも５種、好ましくは、少なくとも１０種の成分を含む。多くの製品が、植物及び／若しくは動物又はその一部などの天然の供給源から作られるため、製品は、一般に、植物及び／又は動物からもたらされた多くの成分又は化学化合物を含有する。製品の１種又は複数の成分は、口の甘味受容体と相互作用し、甘味の知覚を引き起こす。一般に、製品の成分はまた、口の他の味覚受容体と相互作用し、他の感覚受容性の知覚を引き起こす。
本発明による経口摂取用の製品は、ヒト又は他の動物により、好ましくは、ヒトにより、口を介した消費に適している、任意の製品、調製、又は組成物であってもよい。製品は、複数の成分（例えば、化学化合物）を含む。製品は、少なくとも２種の成分又は化学化合物、すなわち、糖及びタウマチンを含む。一般に、製品は、少なくとも５種、好ましくは、少なくとも１０種の成分を含む。多くの製品が、植物及び／若しくは動物又はその一部などの天然の供給源から作られるため、製品は、一般に、植物及び／又は動物からもたらされた多くの成分又は化学化合物を含有する。製品の１種又は複数の成分は、口の甘味受容体と相互作用し、甘味の知覚を引き起こす。一般に、製品の成分はまた、口の他の味覚受容体と相互作用し、他の感覚受容性の知覚を引き起こす。
本発明の経口摂取用の製品は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択されるタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を含有する。製品／組成物は、前記タウマチン又は前記糖以外の甘味料をさらに含有してもよい。製品におけるタウマチンの含有量は、特定の製品について適当に選択され、製品の所望の味質に応じる。タウマチンの含有量は、一般に、製品の総質量当たり０．５ｐｐｍ～２０ｐｐｍ、好ましくは、１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、より好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲内である。製品の総質量は、経口摂取用に用意された状態の製品の総質量を指す。製品は、（ｉ）タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択されるタウマチン、好ましくは、タウマチンＩＩと、（ｉｉ）スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖の両方を含む。糖であるスクロース、グルコース、及びフルクトースのなかでも、製品は、これらの３種の糖のうち１種のみ、これらのうち２種の組み合わせだが、第３の糖を含まない組み合わせ、又はこれらの糖の全３種を含有してもよい。一実施形態では、製品は、スクロースを含有するが、グルコース及びフルクトースを含有しない。別の実施形態では、製品は、グルコース及びフルクトースを含有するが、スクロースを含有しない。さらなる実施形態では、製品は、スクロース、グルコース、及びフルクトースを含有する。
経口摂取用の製品は、製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは、３～１０質量％、より好ましくは、４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含む。好ましい実施形態では、前記少なくとも１種の糖は、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、前記製品は、スクロースを含有しない。製品が、スクロース（又は別の糖）を含有しないという特性は、製品が、０．５質量％未満のスクロース（又は他の糖）を含有することを意味する。
製品は、前記タウマチン（好ましくは、タウマチンＩＩ）及び前記糖を、タウマチン１ｐｐｍ当たり糖１：２，０００～１：８０，０００、すなわち、２，０００ｐｐｍ～８０，０００ｐｐｍのタウマチンと糖の質量比で含有してもよい。好ましくは、前記タウマチン及び前記糖は、
１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００、
最も好ましくは、１：１５，０００～１：３０，０００
のタウマチン：糖の質量比範囲で、製品に含有される。
製品は、前記タウマチン（好ましくは、タウマチンＩＩ）及び前記糖を、タウマチン１ｐｐｍ当たり糖１：２，０００～１：８０，０００、すなわち、２，０００ｐｐｍ～８０，０００ｐｐｍのタウマチンと糖の質量比で含有してもよい。好ましくは、前記タウマチン及び前記糖は、
１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
なおより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
なおより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００、
最も好ましくは、１：１５，０００～１：３０，０００
のタウマチン：糖の質量比範囲で、製品に含有される。
好ましい実施形態では、タウマチンは、タウマチンＩＩであり、タウマチンＩは、存在せず、上記の範囲は、タウマチンＩＩに関する。
タウマチンの糖に対するこれらの質量比範囲は、上で示された糖の含有量と組み合わせることができる。一実施形態では、タウマチン及び糖は、１：８，０００～１：４５，０００のタウマチンと糖の質量比で製品に含有され、製品は、製品の総質量に対して、３～１０質量％、好ましくは、４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を含有する。別の実施形態では、タウマチン及び糖は、１：１０，０００～１：３５，０００のタウマチンと糖の質量比で製品に含有され、製品は、製品の総質量に対して、３～１０質量％、好ましくは、４～８質量％の糖を含有する。さらなる実施形態では、タウマチン及び糖は、１：１５，０００～１：３０，０００のタウマチンと糖の質量比で製品に含有され、製品は、製品の総質量に対して、３～１０質量％、好ましくは、４～８質量％の糖を含有する。糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される（製品が、スクロースを含有しない）場合、これらの好ましい実施形態はまた、このような製品に関してもよい。糖がスクロースである（製品が、グルコース及びフルクトースを含有しない）場合、これらの好ましい実施形態はまた、このような製品に関してもよい。
タウマチンの糖に対するこれらの質量比範囲は、上で示された糖の含有量と組み合わせることができる。一実施形態では、タウマチン及び糖は、１：８，０００～１：４５，０００のタウマチンと糖の質量比で製品に含有され、製品は、製品の総質量に対して、３～１０質量％、好ましくは、４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を含有する。別の実施形態では、タウマチン及び糖は、１：１０，０００～１：３５，０００のタウマチンと糖の質量比で製品に含有され、製品は、製品の総質量に対して、３～１０質量％、好ましくは、４～８質量％の糖を含有する。さらなる実施形態では、タウマチン及び糖は、１：１５，０００～１：３０，０００のタウマチンと糖の質量比で製品に含有され、製品は、製品の総質量に対して、３～１０質量％、好ましくは、４～８質量％の糖を含有する。糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される（製品が、スクロースを含有しない）場合、これらの好ましい実施形態はまた、このような製品に関してもよい。糖がスクロースである（製品が、グルコース及びフルクトースを含有しない）場合、これらの好ましい実施形態はまた、このような製品に関してもよい。
タウマチンＩとタウマチンＩＩの両方が存在する場合、上で示された量（及びその範囲）は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩの合計を指す。一実施形態では、上で示された通り、本発明の製品及び組成物におけるタウマチンＩＩとタウマチンＩの質量比は、少なくとも２：１、より好ましくは、少なくとも４：１、なおより好ましくは、少なくとも９：１である。一実施形態では、タウマチンＩは存在するが、タウマチンＩＩは存在しない。別の実施形態では、タウマチンＩＩは存在するが、タウマチンＩは存在しない。好ましい実施形態では、発明者らにより見出された通り、タウマチンＩＩが、タウマチンＩと比較して、改善した味の特徴を有し、したがって、味の特徴を維持しながら、製品における糖の含有量を低減するのにより適しているため、製品は、タウマチンＩＩを含有するが、タウマチンＩを含有しない。「タウマチンＩが存在しない」という用語は、０．１ｐｐｍ未満のタウマチンＩが、前記製品に存在すること、又はタウマチンＩＩのタウマチンＩに対する比が、１０：１以上であることを意味する。「タウマチンＩＩが存在しない」という用語は、０．１ｐｐｍ未満のタウマチンＩＩが、前記製品に存在すること、又はタウマチンＩＩのタウマチンＩに対する比が、１：１０以下であることを意味する。
一実施形態では、製品は、グルコース及びフルクトースを含有する糖の組成物として高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含有する。このような糖は、スクロースを含有しない。製品が、ＨＦＣＳ由来以外の他の供給源由来のスクロースを含有する場合、このようなスクロースの含有量は、製品における糖の含有量を決定するとき、含まれる。経口摂取用の製品は、製品の総質量当たり５～７％のＨＦＣＳ固形物及び製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを含有してもよく、ＨＦＣＳ固形物は、高フルクトースコーンシロップの固形分であり、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される（上で示されたタウマチンに関する好ましい実施形態は、この実施形態と組み合わされてもよい）。
本発明による経口摂取用の製品は、経口摂取用に適した任意の製品、特に、甘味製品であってもよい。経口摂取用の製品は、一般に、経口摂取の用意ができている。例としては、飲み物（例えば、清涼飲料）、飲み物用粉末、飲料、清涼飲料、ヨーグルト、特に、フルーツヨーグルトなどの加糖ヨーグルト、ジャム、マーマレード、シロップなどの飲料濃縮液、デザート、ケーキ、ビスケット、クッキー、チョコレート、キャンディー、菓子、砂糖菓子、チューインガム、カスタード、プディング、ゼリー、フィリングゼリー、ペストリー、パイ、あめ玉、加工食品、シリアル、焼成製品、又は医薬である。されなる例としては、ワイン若しくはビール又は他の発酵若しくは蒸留された飲み物、ポテトベースのスナック、朝食用シリアル、チューインガム、アイスクリーム、ココア及びチョコレート製品、ブレスミント、糖デコレーション若しくはアイシング、コーティング若しくはフィリング、上質なベーカリーの品物、食品添加物又は食卓用甘味料である。発明の製品は、産業上のプロセスで製造された加工食品又は飲料だけでなく、手作りの食品又は飲料を含む。本発明はまた、タウマチンを含む、食卓用糖又は経口摂取用の製品用の成分として働くベーキング若しくは料理用の糖を提供する。さらなる例としては、経口投与用の薬物、特に、咳シロップ又は経口抗生物質溶液若くは懸濁液などの液体薬物である。好ましい実施形態では、本発明による経口摂取用の製品は、清涼飲料、例えば、コーラ又は他のレモネードである。
本発明の製品は、一般に、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を加糖されているが、タウマチンを含有しない、対応する、又は従来の製品と同等の甘味を有する。本発明の製品はまた、前記糖を加糖されているが、タウマチンを含有しない、従来の製品と比較して、低減したカロリー含有量を有する。製品は、タウマチンの代わりに、スクロース、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される糖を加糖された同じ製品／組成物と比較して、味覚試験において味の専門家集団によってスコア付けされたとき、甘味、あと味又は苦味、塩味、酸味若くは旨味のようなさらなる味の記録に関して、同等の味を有し得る。
本発明の製品は、上で記載されたタウマチン及び糖の含有量を有する本発明の製品を得るために、例えば、混合又は混ぜることによって、タウマチン及び／又は糖を製品の前駆体に取り込むことによって製造されてもよい。タウマチンは、製造プロセスの任意の時間で、製品の前駆体に混ぜられるか、又は混合されてもよい。製品の製造が、低温殺菌又は滅菌のための加熱工程を含む場合、タウマチンの変性を回避するために、加熱工程の後に、タウマチンを加えることが好ましくてもよい。タウマチンは、実施例で記載される通り、発現されてもよく、乾燥の凍結乾燥形態で保存されてもよい。製品の製造のため、公知の濃度のタウマチンのストック溶液は、水又は水溶液中で製造されてもよい。上で述べられた通り、水又はストック溶液中のタウマチンの濃度は、２８０ｎｍでのその吸光度を使用して測定されてもよい。タウマチンを、製品の前駆体にタウマチンストック溶液から加えて、所望のタウマチン濃度の製品を得てもよい。タウマチンストック溶液は、製品に望ましいタウマチンＩとタウマチンＩＩの比でタウマチンＩとタウマチンＩＩの両方を含有してもよい。好ましくは、タウマチンＩＩのみが使用され、ストック溶液は、この場合、タウマチンＩＩを含有するが、タウマチンＩを含有しない。タウマチンストックは、例えば、濾過により、製品の前駆体に加える前に無菌化されてもよい。
本発明の製品の甘味
本発明の製品の甘味は、４～１５、好ましくは、６～１３、より好ましくは、８～１２、最も好ましくは、９～１１の値内であってもよい。甘味は、味の専門家集団によって決定され、実施例に記載される通り、値９は、水９０ｇ中のスクロース１０ｇの溶液の甘味として定義され、値０は、水１００ｇ中のスクロース０ｇの溶液の甘味として定義される。
一実施形態では、百万分率（ｐｐｍ）でのタウマチンの含有量及び製品の総質量当たりの、スクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される糖の含有量は、関係性（Ｉ）：
甘味＝１．６２（＋／－０．４１）＋［０．７４（＋／－０．１９）×スクロース］＋［０．２５（＋／－０．０６３）×タウマチン］＋［０．１１（＋／－０．０２８）×スクロース×タウマチン］ （Ｉ）
（式中、「スクロース」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）のスクロースの含有量であるか、又はスクロース含有量と同程度に甘い、スクロース、グルコース及びフルクトースの合わせた含有量であり、「タウマチン」は、ｐｐｍでの、タウマチンＩ及びＩＩから選択されるタウマチンの含有量であり、「甘味」は、上で定義された通りである）に従う。特定の実施形態では、糖は、スクロースであり、「スクロース」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）での、スクロースの含有量である。
本発明の製品の甘味は、４～１５、好ましくは、６～１３、より好ましくは、８～１２、最も好ましくは、９～１１の値内であってもよい。甘味は、味の専門家集団によって決定され、実施例に記載される通り、値９は、水９０ｇ中のスクロース１０ｇの溶液の甘味として定義され、値０は、水１００ｇ中のスクロース０ｇの溶液の甘味として定義される。
一実施形態では、百万分率（ｐｐｍ）でのタウマチンの含有量及び製品の総質量当たりの、スクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される糖の含有量は、関係性（Ｉ）：
甘味＝１．６２（＋／－０．４１）＋［０．７４（＋／－０．１９）×スクロース］＋［０．２５（＋／－０．０６３）×タウマチン］＋［０．１１（＋／－０．０２８）×スクロース×タウマチン］ （Ｉ）
（式中、「スクロース」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）のスクロースの含有量であるか、又はスクロース含有量と同程度に甘い、スクロース、グルコース及びフルクトースの合わせた含有量であり、「タウマチン」は、ｐｐｍでの、タウマチンＩ及びＩＩから選択されるタウマチンの含有量であり、「甘味」は、上で定義された通りである）に従う。特定の実施形態では、糖は、スクロースであり、「スクロース」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）での、スクロースの含有量である。
別の実施形態では、共に、製品の総質量当たりの、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロースの含有量は、関係性（ＩＩ）：
甘味＝１．６２（＋／－０．４１）＋［０．７４（＋／－０．１９）×スクロース］＋［０．２５（＋／－０．０６３）×タウマチン］＋［０．１１（＋／－０．０２８）×スクロース×タウマチン］ （ＩＩ）
（式中、「スクロース」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）でのスクロースの含有量であり、「タウマチン」は、ｐｐｍでの、タウマチンＩ及びＩＩから選択されるタウマチンの含有量であり、「甘味」は、上で定義された通りである）に従う。
甘味＝１．６２（＋／－０．４１）＋［０．７４（＋／－０．１９）×スクロース］＋［０．２５（＋／－０．０６３）×タウマチン］＋［０．１１（＋／－０．０２８）×スクロース×タウマチン］ （ＩＩ）
（式中、「スクロース」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）でのスクロースの含有量であり、「タウマチン」は、ｐｐｍでの、タウマチンＩ及びＩＩから選択されるタウマチンの含有量であり、「甘味」は、上で定義された通りである）に従う。
別の実施形態では、製品は、ＨＦＣＳ－５５などのＨＦＣＳを含有し、共に製品の総質量当たりの、ｐｐｍでのタウマチンの含有量及びＨＦＣＳの含有量は、関係性（ＩＩＩ）：
甘味＝８．０７３（＋／－２．０２）＋［０．２０６（＋／－０．０５２）×ＨＦＣＳ－５５］＋［０．１４９（＋／－０．０３８）×タウマチン］＋［０．０１６（＋／－０．００４）×ＨＦＣＳ－５５×タウマチン］ （ＩＩＩ）
（式中、「ＨＦＣＳ－５５」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）でのＨＦＣＳ－５５固形物の質量であり、「タウマチン」は、ｐｐｍでのタウマチンＩ及びＩＩから選択されるタウマチンの含有量であり、「甘味」は、上で定義された通りである）に従う。
上記の関係性はまた、好ましくは、以下で記載される経口摂取用の製品を製造する方法などの、本発明の方法に適用する。
甘味＝８．０７３（＋／－２．０２）＋［０．２０６（＋／－０．０５２）×ＨＦＣＳ－５５］＋［０．１４９（＋／－０．０３８）×タウマチン］＋［０．０１６（＋／－０．００４）×ＨＦＣＳ－５５×タウマチン］ （ＩＩＩ）
（式中、「ＨＦＣＳ－５５」は、製品の総質量当たりの質量パーセント（％）でのＨＦＣＳ－５５固形物の質量であり、「タウマチン」は、ｐｐｍでのタウマチンＩ及びＩＩから選択されるタウマチンの含有量であり、「甘味」は、上で定義された通りである）に従う。
上記の関係性はまた、好ましくは、以下で記載される経口摂取用の製品を製造する方法などの、本発明の方法に適用する。
経口摂取用の製品を製造するための組成物
本発明の製品は、上で記載されたタウマチン及び糖の含有量を有する本発明の製品を得るために、例えば、混合又は混ぜることによって、本発明の組成物由来のタウマチン及び糖を製品の前駆体に取り込むことによって製造されてもよい。本発明の組成物（「甘味組成物」としても本明細書において言及される）は、本発明の経口摂取用の製品を製造するのに適している。組成物は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む。一実施形態では、糖は、スクロースであり、組成物は、グルコースもフルクトースも含有しない。代わりの実施形態では、糖は、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない。好ましい実施形態では、組成物は、タウマチン並びにグルコース及びフルクトースを含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む。ＨＦＣＳは、その一部をタウマチンに置き換えることによって低減され得る辛さのあと味を有するため、本発明は、ＨＦＣＳの含有量を低減するのに特に適している。
本発明の製品は、上で記載されたタウマチン及び糖の含有量を有する本発明の製品を得るために、例えば、混合又は混ぜることによって、本発明の組成物由来のタウマチン及び糖を製品の前駆体に取り込むことによって製造されてもよい。本発明の組成物（「甘味組成物」としても本明細書において言及される）は、本発明の経口摂取用の製品を製造するのに適している。組成物は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１つの糖を含む。一実施形態では、糖は、スクロースであり、組成物は、グルコースもフルクトースも含有しない。代わりの実施形態では、糖は、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない。好ましい実施形態では、組成物は、タウマチン並びにグルコース及びフルクトースを含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む。ＨＦＣＳは、その一部をタウマチンに置き換えることによって低減され得る辛さのあと味を有するため、本発明は、ＨＦＣＳの含有量を低減するのに特に適している。
甘味組成物は、一般に、製品に望ましいタウマチンＩとタウマチンＩＩの比を有し、好ましくは、それは、タウマチンＩＩを含有するが、タウマチンＩを含有しない。加えて、組成物は、スクロース、フルクトース及びグルコースの相対量並びに製品に望ましい、スクロース、フルクトース及びグルコースの相対量などの、タウマチンの糖に対する比を有してもよく、並びにタウマチンの糖に対する比は、組成物を製品の前駆体（「前駆体製品」としても言及される）に加えることによって、製品において得られる。したがって、甘味組成物により、本発明の製品の製造を可能になり、甘い低カロリーの製品が、単純な方法で製造することができる。
甘味組成物が、前駆体製品と混ぜられた際に、糖及びタウマチンの濃度で希釈されるため、組成物は、本発明の製品について上で与えられた含有量より、高いタウマチン及び糖の含有量を有する。
組成物は、組成物の総質量当たり１０～１５０ｐｐｍ、好ましくは、１５～１００ｐｐｍ、より好ましくは、２０～８０ｐｐｍ、最も好ましくは、３０～７０ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１種のタウマチンを含有してもよい。
或いは、又はさらに、組成物は、組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１種の糖を含有してもよい。
組成物は、組成物の総質量当たり１０～１５０ｐｐｍ、好ましくは、１５～１００ｐｐｍ、より好ましくは、２０～８０ｐｐｍ、最も好ましくは、３０～７０ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１種のタウマチンを含有してもよい。
或いは、又はさらに、組成物は、組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１種の糖を含有してもよい。
一実施形態では、組成物は、組成物の総質量当たり１０～１００ｐｐｍの範囲の少なくとも１種のタウマチン、及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９０質量％、なおより好ましくは、６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１種の糖を含む。
別の実施形態では、組成物は、組成物の総質量当たり３０～７０ｐｐｍの範囲の少なくとも１種のタウマチン、及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９質量０％、なおより好ましくは、６０～８０質量の範囲の前記少なくとも１種の糖を含む。
別の実施形態では、組成物は、組成物の総質量当たり３０～７０ｐｐｍの範囲の少なくとも１種のタウマチン、及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは、４０～９８質量％、より好ましくは、５０～９質量０％、なおより好ましくは、６０～８０質量の範囲の前記少なくとも１種の糖を含む。
本発明の組成物は、本発明の製品に導入されるべき他の成分をさらに含んでもよい。このような成分の例としては、クエン酸又はその塩、ビタミン、無機塩、微量元素、カフェイン、タウリン、ゲル化剤又は増粘剤、香味剤、及び保存剤からなる群から選択される１種又は複数の成分である。ビタミンは、アスコルビン酸若しくはその塩、ビタミンＢファミリーのビタミン、又はトコフェロール若しくはその誘導体から選択される１種又は複数であってもよく、前記無機塩は、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩から選択されてもよく、前記微量元素は、亜鉛化合物、鉄化合物、又は銅化合物であってもよい。
甘味組成物は、固体又は液体であってもよい。それが固体である場合、それは、乾燥（例えば、凍結乾燥）タウマチンとスクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される固体の糖の混合物であってもよい。乾燥甘味組成物は、上で示されるさらなる成分を任意選択で含有してもよい。或いは、甘味組成物は、液体であり、その成分とは別に、タウマチン、糖、及び任意選択のさらなる成分、液体分散剤又は溶媒を含有する。分散剤又は溶媒は、一般に、水である。
甘味組成物は、多量の糖を含有し、ゆえに、前駆体製品に加える前のその滅菌が、必ずしも必要であるわけではない。しかしながらまた、甘味組成物は、液体である場合、例えば、濾過により、低温殺菌又は滅菌されてもよい。
本発明の組成物は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩ、好ましくは、タウマチンＩＩから選択されるタウマチンを含む植物抽出物であってもよく、そしてそれに、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖が付加されていてもよい。
本発明の組成物は、本発明の製品用などの、甘味組成物として使用されてもよい。組成物はまた、他の材料を甘くするため使用されてもよい。組成物は、ケーキ若くはクッキーのベーキング又は料理用に使用されてもよい。組成物はまた、消費前に、食品又は飲料を甘くするための食卓用甘味料として使用されてもよい。さらに、本発明の組成物は、経口摂取用の製品のカロリー含有量を低減するため使用されてもよい。
甘味組成物は、多量の糖を含有し、ゆえに、前駆体製品に加える前のその滅菌が、必ずしも必要であるわけではない。しかしながらまた、甘味組成物は、液体である場合、例えば、濾過により、低温殺菌又は滅菌されてもよい。
本発明の組成物は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩ、好ましくは、タウマチンＩＩから選択されるタウマチンを含む植物抽出物であってもよく、そしてそれに、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖が付加されていてもよい。
本発明の組成物は、本発明の製品用などの、甘味組成物として使用されてもよい。組成物はまた、他の材料を甘くするため使用されてもよい。組成物は、ケーキ若くはクッキーのベーキング又は料理用に使用されてもよい。組成物はまた、消費前に、食品又は飲料を甘くするための食卓用甘味料として使用されてもよい。さらに、本発明の組成物は、経口摂取用の製品のカロリー含有量を低減するため使用されてもよい。
本発明の方法
本発明により、スクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される糖の一部を、タウマチンＩ及び／又はＩＩで置き換えることによって、従来の製品、特に、甘い製品の糖の含有量を低減することが可能になる。従来の製品の糖の含有量は、２０～６０％、好ましくは、３０～５０％、最も好ましくは、３５～４５％低減されてもよい。この範囲内で、製品の甘味は、本発明により十分に保つことができ、製品の味の特徴は、変化しないか、ほとんど変化しない。結果として、製品のカロリー含有量は、非常に低減され、味の特徴は、大部分維持することができる。上記の範囲未満では、カロリー含有量の低減は不十分であり得る。上記の範囲より上では、製品の味の特徴は、必要以上に変化し得、かみ具合、食感、弾力性、及び／又は保存などの他の製品特徴は、悪化し得る。低減した糖の含有量を有する製品の糖の含有量は、上で示した通りである。
本発明により、スクロース、グルコース、及びフルクトースから選択される糖の一部を、タウマチンＩ及び／又はＩＩで置き換えることによって、従来の製品、特に、甘い製品の糖の含有量を低減することが可能になる。従来の製品の糖の含有量は、２０～６０％、好ましくは、３０～５０％、最も好ましくは、３５～４５％低減されてもよい。この範囲内で、製品の甘味は、本発明により十分に保つことができ、製品の味の特徴は、変化しないか、ほとんど変化しない。結果として、製品のカロリー含有量は、非常に低減され、味の特徴は、大部分維持することができる。上記の範囲未満では、カロリー含有量の低減は不十分であり得る。上記の範囲より上では、製品の味の特徴は、必要以上に変化し得、かみ具合、食感、弾力性、及び／又は保存などの他の製品特徴は、悪化し得る。低減した糖の含有量を有する製品の糖の含有量は、上で示した通りである。
経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法において、方法は、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含んでもよく、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択され、好ましくは、それは、タウマチンＩＩであり、タウマチンＩを含有しない。
本発明は、経口摂取用の製品における糖の含有量を、最大６０％、好ましくは、上で示されたパーセンテージ範囲を低減する方法を提供し、糖は、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種であり、方法は、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明は、経口摂取用の製品における糖の含有量を、最大６０％、好ましくは、上で示されたパーセンテージ範囲を低減する方法を提供し、糖は、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種であり、方法は、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは、３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明は、経口摂取用の製品においてタウマチンを甘味料として使用する方法をさらに提供し、方法は、タウマチンを、前記製品のプレ製品に、製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍの範囲で加える工程を含み、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。好ましくは、本発明は、経口摂取用の製品においてタウマチンを甘味料として使用する方法を提供し、方法は、本発明の組成物（甘味組成物）を前駆体製品に加えて、製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍの範囲でタウマチンを含有する製品を製造する工程を含み、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明はまた、好ましくは、製品の甘さを維持しながら、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法を提供し、方法は、スクロース、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される糖の一部を、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンで置換する工程を含み、タウマチンの含有量及び糖の含有量は、上で示された関係性（ＩＩ）に従う。
好ましい実施形態では、糖は、スクロースであり、好ましくは、製品の甘味を維持しながら、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法は、糖スクロースの一部をタウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンの含有量及び糖の含有量は、上で示された関係性（ＩＩ）に従う。
別の実施形態では、糖は、ＨＦＣＳ、好ましくは、ＨＦＣＳ－５５であり、好ましくは、製品の甘味を維持しながら、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法は、ＨＦＣＳの一部をタウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンの含有量及び糖の含有量は、上で示された関係性（ＩＩＩ）に従う。
好ましい実施形態では、糖は、スクロースであり、好ましくは、製品の甘味を維持しながら、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法は、糖スクロースの一部をタウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンの含有量及び糖の含有量は、上で示された関係性（ＩＩ）に従う。
別の実施形態では、糖は、ＨＦＣＳ、好ましくは、ＨＦＣＳ－５５であり、好ましくは、製品の甘味を維持しながら、経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法は、ＨＦＣＳの一部をタウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンで置き換える工程を含み、タウマチンの含有量及び糖の含有量は、上で示された関係性（ＩＩＩ）に従う。
本発明はまた、本発明の甘味組成物を製品の他の成分又は前駆体製品と混合する工程を含む、経口摂取用の製品を製造する方法を提供する。得られた製品は、関係性（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）に関して、上で定義された甘味を有してもよい。本発明はまた、経口摂取用の製品においてタウマチンを甘味料として使用する方法を提供し、方法は、タウマチンを前駆体製品に、製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍの範囲で加える工程を含み、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明は、経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法をさらに提供し、方法は、タウマチンを前記製品のプレ製品に加える工程を含み、前記プレ製品は、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明は、経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法をさらに提供し、方法は、タウマチンを前記製品のプレ製品に加える工程を含み、前記プレ製品は、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明はまた、経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法を提供し、方法は、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換える工程を含む、得られた製品におけるＨＦＣＳの含有量は、得られた製品の総質量当たり５～７％低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法は、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換える工程を含み、得られた製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量は、３０～５０％低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法は、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換える工程を含み、得られた製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量は、３０～５０％低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
本発明は、製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量を、得られた製品の総質量当たり５～７％低減し、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを加えることにより、経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減するためのタウマチンの使用をさらに提供し、タウマチンは、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される。
上記の、ＨＦＣＳの辛味を低減する方法において、ＨＦＣＳは、好ましくは、ＨＦＣＳ－５５である。
上記の、ＨＦＣＳの辛味を低減する方法において、ＨＦＣＳは、好ましくは、ＨＦＣＳ－５５である。
タウマチンの製造
タウマチンは、Ｎａｔｕｒｅｘ、Ｂｅｎｅｏ Ｐａｌａｔｉｎｉｔ、Ｎａｔｅｘ、ＫＦ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ及び他の数社を含む、市販の供給源から入手可能である。製品Ｔａｌｉｎ（登録商標）は、Ｔａｔｅ＆Ｌｙｌｅ（ＵＫ）によって１９７０年代に市販され始め、７～１０％のスクロース溶液の甘味の１，６００～２，７００倍の未確認の甘味を有する。調製物は、日本において、ブランドＳａｎ Ｓｗｅｅｔ Ｔ－１００（登録商標）で販売された。市販のタウマチンは、例えば、純度についてのキャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動により、純度について分析されてもよい。例えば、それが、９５％未満のタウマチン（例えば、電気泳動バンドのクーマシー染色及びタウマチンバンドの強度を読むことによって決定される）を含有するため、純度が十分でない場合、それは、実施例に記載される方法によってさらに精製されてもよい。
本発明は、タウマチンの天然の供給源とは異なる植物においてタウマチンを製造する方法を提供する。本発明によるタウマチンは、植物発現系におけるタンパク質の発現の公知の方法によって製造されてもよい。タウマチンを製造するため、それをコードするヌクレオチド配列は、適当な植物宿主生物において発現されてもよい。一般に、タウマチンは、アポプラスト標的化配列、成熟タウマチンフラグメント、及び切断可能なＣ末端の尾部を含むタウマチンプレプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列から発現される。
タウマチンは、Ｎａｔｕｒｅｘ、Ｂｅｎｅｏ Ｐａｌａｔｉｎｉｔ、Ｎａｔｅｘ、ＫＦ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ及び他の数社を含む、市販の供給源から入手可能である。製品Ｔａｌｉｎ（登録商標）は、Ｔａｔｅ＆Ｌｙｌｅ（ＵＫ）によって１９７０年代に市販され始め、７～１０％のスクロース溶液の甘味の１，６００～２，７００倍の未確認の甘味を有する。調製物は、日本において、ブランドＳａｎ Ｓｗｅｅｔ Ｔ－１００（登録商標）で販売された。市販のタウマチンは、例えば、純度についてのキャピラリー電気泳動又はゲル電気泳動により、純度について分析されてもよい。例えば、それが、９５％未満のタウマチン（例えば、電気泳動バンドのクーマシー染色及びタウマチンバンドの強度を読むことによって決定される）を含有するため、純度が十分でない場合、それは、実施例に記載される方法によってさらに精製されてもよい。
本発明は、タウマチンの天然の供給源とは異なる植物においてタウマチンを製造する方法を提供する。本発明によるタウマチンは、植物発現系におけるタンパク質の発現の公知の方法によって製造されてもよい。タウマチンを製造するため、それをコードするヌクレオチド配列は、適当な植物宿主生物において発現されてもよい。一般に、タウマチンは、アポプラスト標的化配列、成熟タウマチンフラグメント、及び切断可能なＣ末端の尾部を含むタウマチンプレプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列から発現される。
タウマチンの発現に使用可能な植物発現系は、実施例に記載される。植物においてタウマチンのプレプロタンパク質をコードする目的のヌクレオチド配列の発現を達成する可能性のある方法は、プレプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する自己複製（ウイルス）レプリコンの使用である。プレプロタンパク質のコード配列は、植物又は発現宿主といて使用される特定の植物における発現に最適化されたコドンであってもよい。植物ウイルス発現系は、国際公開第２０１２０１９６６０号、国際公開第２００８０２８６６１号、国際公開第２００６００３０１８号、国際公開第２００５０７１０９０号、国際公開第２００５０４９８３９号、国際公開第２００６０１２９０６号、国際公開第０２１０１００６号、国際公開第２００７１３７７８８号又は国際公開第０２０６８６６４号などの、多くの刊行物において記載されており、さらに多くの刊行物が、これらの文書において引用されている。ＤＮＡ分子などの核酸分子を一過性発現のための植物又は植物の一部に導入するための様々な方法が公知である。アグロバクテリウムは、例えば、アグロインフィルトレーション又はアグロバクテリウム懸濁液を噴霧することによって、植物を核酸分子（ベクター）又は核酸コンストラクトで遺伝子導入するため使用され得る。参照のため、国際公開第２０１２０１９６６０号、国際公開第２０１４１８７５７１号、又は国際公開第２０１３１４９７２６号を参照されたい。
タウマチンの強い発現が望まれる実施形態では、プレプロタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸コンストラクトは、植物細胞において複製して、ウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードしてもよい。複製するために、ウイルスベクター及びレプリコンは、レプリコンから発現されるウイルスポリメラーゼなどの、植物細胞に存在する核酸ポリメラーゼにより認識され得る複製起点を含有してもよい。ＲＮＡウイルスベクター（「ＲＮＡレプリコン」として言及される）の場合、レプリコンは、ＤＮＡコンストラクトが、植物細胞の核に導入された後、植物細胞において活性なプロモーターの制御下でＤＮＡコンストラクトから転写されることによって形成され得る。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコンは、例えば、国際公開第００／１７３６５号及び国際公開第９９／２２００３号に記載されるＤＮＡコンストラクトにおいて、ウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２個の組み換え部位の間での組み換えによって形成され得る。レプリコンが、ＤＮＡコンストラクトによりコードされる場合、ＲＮＡレプリコンが好ましい。ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡ又はＲＮＡレプリコン）の使用は、何年にもわたり文献において広く記載されている。いくつかの例としては、以下の特許広報：国際公開第２００８０２８６６１号、国際公開第２００７１３７７８８号、国際公開第２００６００３０１８号、国際公開第２００５０７１０９０号、国際公開第２００５０４９８３９号、国際公開第０２０９７０８０号、国際公開第０２０８８３６９号、国際公開第０２０６８６６４号である。ＤＮＡウイルスベクターの例としては、ジェミニウイルスに基づくものである。本発明のため、植物ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクター又はレプリコン、特に、プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに基づくものが、好ましく使用され得る。したがって、ウイルスレプリコンは、プラス鎖１本鎖ＲＮＡレプリコンであってもよい。このようなウイルスベクターの例としては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、アブラナ感染性トバモウイルス（ｃｒ－ＴＭＶ）、及びポルテクスウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づくものである。「基づく」は、ウイルスベクターが、レプリカーゼ及び／又はこれらのウイルスの複製に関与する他のタンパク質などの複製システムを使用することを意味する。ポルテクスウイルスベースのウイルスベクター及び発現系は、欧州特許第２０６１８９０号又は国際公開第２００８／０２８６６１号に記載されている。
タウマチン又はそのプレプロタンパク質は、多細胞生物植物又はその一部、特に、高等植物又はその一部において発現されてもよい。単子葉と双子葉（作物）植物の両方を使用することができる。目的のタンパク質を発現させるために使用可能な一般的な植物としては、ニコチアナ・ベンサミアナ、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ホウレンソウ、ブラシカ・キャンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ブラシカ・ジュンセア（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、ビーツ（ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、クレソン、ルッコラ、カラシ、ストロベリー、ケノポディウム・カピターツム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、レタス、ヒマワリ、キュウリ、ハクサイ、キャベツ、ニンジン、ネギ、タマネギ、ダイコン、レタス、フィールドピー、カリフラワー、ブロッコリー、ゴボウ、カブ、トマト、ナス、カボチャ、スイカ、プリンスメロン、及びメロンが挙げられる。好ましい植物は、ホウレンソウ、チャード、ビートルート、ニンジン、テンサイ、ニコチアナ・タバカム、及びニコチアナ・ベンサミアナである。一実施形態では、ニコチアナ・タバカム（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）及びニコチアナ・ベンサミアナ（ニコチアナ・ベンサミアナ）などのニコチアナ種などのヒト又は動物の食物連鎖に通常入らない植物が使用される。本発明において、タウマチンは、タウマトコッカス・ダニエリにおいて発現しない。
一般に、目的のタンパク質としてのタウマチンは、植物又は植物の一部のアポプラストに標的化される。この目的のため、プレプロタンパク質は、一般に、Ｎ末端のプレ配列として、標的化ペプチドを含有する。
タウマチンを製造するプロセスにおいて、タウマチンは、第一の工程において、植物又は植物の細胞において発現される。次の工程において、タウマチンを発現している植物由来の発現したタウマチンを含有する植物材料が回収される。植物材料は、例えば、葉、根、塊茎、若しくは種であってもよいか、又は葉、根、塊茎、若しくは種の粉砕された、粉にされたか、若しくは細かく砕かれた生成物であってもよい。工程（ｉｉｉ）において、タウマチンは、水性バッファーを使用して、植物材料から抽出される。これは、植物材料が、ホモジナイズされ、不溶性の材料が、遠心分離又は濾過により除去され得ることを含んでもよい。タウマチンを含む溶解性成分を水性バッファーに抽出して、水性バッファー中のタウマチン溶液を製造する。タウマチンは、実施例に詳細に記載される通り、精製され、分析されてもよい。タウマチンは、水溶液として得られ、溶液中、好ましくは、凍結状態で保存されてもよい。好ましくは、タウマチンは、乾燥粉末形態で長期間安定的に保存することができるため、乾燥粉末形態に凍結乾燥される。
タウマチンを製造するプロセスにおいて、タウマチンは、第一の工程において、植物又は植物の細胞において発現される。次の工程において、タウマチンを発現している植物由来の発現したタウマチンを含有する植物材料が回収される。植物材料は、例えば、葉、根、塊茎、若しくは種であってもよいか、又は葉、根、塊茎、若しくは種の粉砕された、粉にされたか、若しくは細かく砕かれた生成物であってもよい。工程（ｉｉｉ）において、タウマチンは、水性バッファーを使用して、植物材料から抽出される。これは、植物材料が、ホモジナイズされ、不溶性の材料が、遠心分離又は濾過により除去され得ることを含んでもよい。タウマチンを含む溶解性成分を水性バッファーに抽出して、水性バッファー中のタウマチン溶液を製造する。タウマチンは、実施例に詳細に記載される通り、精製され、分析されてもよい。タウマチンは、水溶液として得られ、溶液中、好ましくは、凍結状態で保存されてもよい。好ましくは、タウマチンは、乾燥粉末形態で長期間安定的に保存することができるため、乾燥粉末形態に凍結乾燥される。
本発明は、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択されるタウマチン並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される糖を含む抽出物を提供し、前記植物は、好ましくは、タウマトコッカス・ダニエリではない。抽出物は、タウマチンを発現している植物由来のタウマチン、及び一般に、植物由来の他の成分を含有する。抽出物は、水溶液中にタウマチンを含有する液体であってもよい。水溶液は、バッファーなどのさらなる成分を含んでもよい。
製品及び組成物における糖及びタウマチンの定量
本発明の製品及び組成物を製造するため、並びに本発明の方法及び使用を実施するため、糖は、質量で定量することができ、糖の所望の量又は混合で製品又は組成物に加えることができる。タウマチンは、特に、乾燥の凍結乾燥形態で存在する場合、質量で定量されてもよい。水溶液において、タウマチンは、上及び実施例において記載された通り、２８０ｎｍでのそのｕｖ吸光度により定量されてもよい。
本発明の製品及び組成物を製造するため、並びに本発明の方法及び使用を実施するため、糖は、質量で定量することができ、糖の所望の量又は混合で製品又は組成物に加えることができる。タウマチンは、特に、乾燥の凍結乾燥形態で存在する場合、質量で定量されてもよい。水溶液において、タウマチンは、上及び実施例において記載された通り、２８０ｎｍでのそのｕｖ吸光度により定量されてもよい。
本発明の製品に存在する場合、タウマチンは、例えば、製品の試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続いて、ウエスタンブロッティングにより決定されてもよい。ウエスタンブロッティングについて、当該技術分野で一般に公知である、抗原としてタウマチンを使用したポリクローナル抗血清が使用されてもよい。ウエスタンブロッティングの較正のため、実施例に従い製造された純粋なタウマチンが、使用されてもよい。
食品などの、本発明の製品における糖の分析は、食品テクノロジーにおいて公知であり、例えば、書籍“Food Analysis” from S. Susanne Nielsen (editor), Fifth Edition 2017, Springer International Publishing, corrected publication 2019; DOI 10.1007/978-3-319-45776-5、特に、Chapter 19 “Carbohydrate Analysis”, pages 333-360を参照し、以下の開示は、その一部を抜粋する。
食品などの、本発明の製品における糖の分析は、食品テクノロジーにおいて公知であり、例えば、書籍“Food Analysis” from S. Susanne Nielsen (editor), Fifth Edition 2017, Springer International Publishing, corrected publication 2019; DOI 10.1007/978-3-319-45776-5、特に、Chapter 19 “Carbohydrate Analysis”, pages 333-360を参照し、以下の開示は、その一部を抜粋する。
飲み物を除く多くの食品について、乾燥は、一定質量に達するまで、試料調製における第一の工程であってもよい。次いで、乾燥材料は、細かい粉末に粉砕され、続いて、脂質及び他の脂質溶解性物質が抽出されてもよい。次いで、乾燥した脂質を含まない試料を、沈殿した炭酸カルシウムの存在下で、熱８０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いて抽出して、いずれかの酸性を中和してもよい（ＡＯＡＣ Ｍｅｔｈｏｄ ９２２．０２、９２５．０５）。大部分の炭水化物、特に、低分子量のものは、８０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解性である。ポリマー並びにほぼ全ての多糖及びタンパク質は、熱８０％エタノールに溶解性であり、これにより、存在する任意のモノ－（グルコース、フルクトース）、ジ－（スクロース、ラクトース、マルトース）、トリ－（ラフィノース）、テトラ－（スタキオース）、又は他のオリゴ糖（例えば、マルトデキストリン）のむしろ特異的な抽出が可能になる。
抽出及び精製後の食品試料におけるスクロース、グルコース及びフルクトースの含有量は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、クロマトグラフィーで決定することができる。ＨＰＬＣは、ピーク組込みを介した標準的かつ定量的分析との比較を介して定性的分析をもたらす。ＨＰＬＣ分析は、迅速であり、広範な試料濃度を許容することができ、高い程度の精度及び正確性をもたらす。ＨＰＬＣは、単糖とオリゴ糖の複雑な混合物を測定することができる。食品及び他の炭水化物を決定するためのＨＰＬＣの使用は、例えば、Montero CM, Dodero MCR, Sanchez DAG, Barroso CG (2004): Analysis of low molecular weight carbohydrates in foods and beverages: A review; Chromatographia 59:15において包括的に概説されている。ＨＰＬＣ分析のための試料調製は、文献、例えば、Peris-Tortajada M (2012): HPLC determination of carbohydrates in foods (Chapter 7) In: Nollet LM, Toldra F (eds): Food analysis by HPLC, 3rd edn. CRC Press, Boca Ratonに記載されている。ＨＰＬＣによる炭水化物の分離は、陰イオン交換カラム（ＡＥ－ＨＰＬＣ）により行うことができる。炭水化物は、非常に弱い酸であり、一般に、１２～１４の範囲のｐＫa値を有する。それゆえ、高いｐＨの溶液は、炭水化物のヒドロキシル基の一部をイオン化し、これにより、陰イオン交換樹脂を含むカラムでの糖の分離が可能になる。炭水化物のヒドロキシル基及びアルデヒド基の酸化によるパルス電気化学的検出器（ＥＣＤ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた使用に適している。したがって、ＥＣＤに連結したＡＥ－ＨＰＬＣにより、多くの食品成分及び製品における炭水化物の調査を可能にする。
抽出後の食品飲料における炭水化物及び糖を測定するための別の可能性は、酵素的方法である。これらの方法は、決定される炭水化物について高い特異性を有し、分析される飲料の高い純度を必要とせず、非常に低い検出限界を有し、高価な装置を必要とせず、容易に自動化される。しかしながら、酵素的方法は、定量のための分光光度測定により、正確な測定のため、清澄な溶液を必要とする。したがって、例えば、Ｃａｒｒｅｚ処理による、分析前の抽出物の精製が推奨される。スクロース、グルコース及びフルクトースの特異的な決定のための酵素的方法は、キットとして開発されており、いくつかの製造元から市販されている。これらのキットは、分析に必須の酵素及び試薬を含有し、正しい結果を生じるために必要である詳細な指示を提供する。これらの因子は、信頼できる結果を得るために測定中に考慮されることを必要とする。
酵素アッセイは、単糖を定量するのに特に適している。二糖は、基礎をなす単糖成分に加水分解されてもよい。例えば、グルコース及びフルクトースは、その酵素決定のためのキットを用いて直接定量することができる。他方、スクロースは、スクロース決定のプロセスにおいて、グルコース及びフルクトースに酵素で加水分解される必要があり得る。スクロースは、加水分解されたスクロースから放出されたグルコースとして定量されてもよい。スクロースを測定するよう設計されたキットを使用し、スクロース定量に必須の全ての工程は、製造元のプロトコールに便利に含まれる。
酵素試験：グルコース酸化酵素／ペルオキシダーゼ／色素方法（ＧＯＰＯＤ方法）又はＮＡＤＰＨ－方法のため２つの広く使用される原理が存在する。ＧＯＰＯＤ方法において、グルコース酸化酵素は、分子酵素を使用して、グルコースをＤ－グルコノ－１，５－ラクトン（グルコノ－デルタ－ラクトン）及び過酸化水素に酸化する。ペルオキシダーゼ及び無色のロイコ色素の添加後、ペルオキシダーゼは、過酸化水素を使用して、ロイコ色素を着色した化合物に酸化し、次いで、分光光度法で測定される。ＮＡＤＰＨ－方法は、ヘキソキナーゼを使用して、ＡＴＰを使用してグルコースをグルコース６－ホスフェート（Ｇ６Ｐ）にリン酸化する。反応混合物はまた、一般に、グルコース６－ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）及びＮＡＤＰ＋を含有する。Ｇ６ＰＤＨは、形成されたＮＡＤＰＨの量が、元々存在するＤ－グルコースの量に等しくなるように、Ｇ６ＰのＤ－グルコネート６－ホスフェートへの酸化及びＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの還元を触媒する。形成されたＮＡＤＰＨの量は、ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定されてもよい。スクロースをグルコース及びフルクトースに加水分解するインベルターゼを加えることで、ＧＯＰＯＤ法とＮＡＤＰＨ法の両方が、試料中のスクロースの量を定量することができる。両方の方法は、スクロース加水分解から放出されたグルコースとしてスクロースを測定してもよい。
実施例１：タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ配列
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質は、タウマトコッカス・ダニエリ由来の天然のタウマチン混合物の最もよくある形態である。これらの２つのタンパク質を、本発明者らの植物ウイルスベースの発現系を使用して発現させた。タウマトコッカスにおいて、両方のタンパク質を、切断可能なＮ末端のアポプラスト標的配列及びＣ末端の６個のアミノ酸の尾部を含有するプレプロタンパク質として翻訳させる。
タウマチン－Ｉプレプロタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ４４５６７．１；配列番号１）は、配列番号２のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６５６９０．１）によりコードされる（図１）。タウマチン－ＩＩプレプロタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９５．１、配列番号３）は、配列番号４のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０１２０９．１）によりコードされる（図２）。
タウマチン－Ｉとタウマチン－ＩＩプレタンパク質の両方が、２３５個のアミノ酸からなる。両方のプレプロタンパク質は、切断可能なＮ末端のアポプラスト標的配列（アミノ酸１～２２）、成熟タンパク質フラグメント（アミノ酸２３～２２９）、及び切断可能なＣ末端の６個のアミノ酸の尾部（アミノ酸２３０～２３５）からなる（図１及び２）。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質は、タウマトコッカス・ダニエリ由来の天然のタウマチン混合物の最もよくある形態である。これらの２つのタンパク質を、本発明者らの植物ウイルスベースの発現系を使用して発現させた。タウマトコッカスにおいて、両方のタンパク質を、切断可能なＮ末端のアポプラスト標的配列及びＣ末端の６個のアミノ酸の尾部を含有するプレプロタンパク質として翻訳させる。
タウマチン－Ｉプレプロタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ４４５６７．１；配列番号１）は、配列番号２のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６５６９０．１）によりコードされる（図１）。タウマチン－ＩＩプレプロタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９５．１、配列番号３）は、配列番号４のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０１２０９．１）によりコードされる（図２）。
タウマチン－Ｉとタウマチン－ＩＩプレタンパク質の両方が、２３５個のアミノ酸からなる。両方のプレプロタンパク質は、切断可能なＮ末端のアポプラスト標的配列（アミノ酸１～２２）、成熟タンパク質フラグメント（アミノ酸２３～２２９）、及び切断可能なＣ末端の６個のアミノ酸の尾部（アミノ酸２３０～２３５）からなる（図１及び２）。
タウマチン－Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ８３９６４．１；配列番号５）とタウマチン－ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９５．１；配列番号６）の両方の成熟タンパク質は、２０７個のアミノ酸からなる。配列番号７（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５５０９８．１）は、成熟タンパク質に対応するタウマチン－Ｉプレプロタンパク質コード配列のフラグメントである。同様に、配列番号８（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０１２０９．１）は、成熟タンパク質をコードするタウマチン－ＩＩプレプロタンパク質コード配列のフラグメントである。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩプレプロタンパク質は、９８．３０％の同一性（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、標準設定）を有し、５個のアミノ酸のみが異なる（図３）。タウマチン－Ｉプレプロタンパク質とタウマチン－ＩＩプレプロタンパク質の両方は、同一の切断可能なＮ末端のプレ配列及びＣ末端の尾部を有し、５個の不一致のアミノ酸全てが、成熟タンパク質に位置する（図３及び４）。成熟タンパク質は、９８．０７％の同一性（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、標準設定）を有する。
インタクトなジスルフィド結合を有するタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの計算した分子量は、それぞれ、２２１８８．８Ｄａ及び２２２７１．９Ｄａである。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩプレプロタンパク質は、９８．３０％の同一性（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、標準設定）を有し、５個のアミノ酸のみが異なる（図３）。タウマチン－Ｉプレプロタンパク質とタウマチン－ＩＩプレプロタンパク質の両方は、同一の切断可能なＮ末端のプレ配列及びＣ末端の尾部を有し、５個の不一致のアミノ酸全てが、成熟タンパク質に位置する（図３及び４）。成熟タンパク質は、９８．０７％の同一性（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、標準設定）を有する。
インタクトなジスルフィド結合を有するタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの計算した分子量は、それぞれ、２２１８８．８Ｄａ及び２２２７１．９Ｄａである。
実施例２：プラスミドコンストラクト
アルファ－アミラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５６３３６．１）のオリゼ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＲＡｍｙ３Ａ遺伝子由来のＮ末端のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－Ｉ（配列番号７）、続いて停止コドン（融合配列について配列番号９）のコード配列をコードするヌクレオチド配列の転写融合物を、国際公開第２０１２／０１９６６０号の特許に記載されるＴＭＶベースの構築ウイルスベクターｐＮＭＤ０３５に挿入した。得られたプラスミドコンストラクトｐＮＭＤ４０５０２を、図５に示す。配列番号１１は、ｐＮＭＤ４０５０２ベクターのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。このコンストラクトを、アグロバクテリウム介在性送達を使用した、タウマチン－Ｉタンパク質の一過性発現のため使用した。
同様に、アルファ－アミラーゼのオリゼ・サティバＲＡｍｙ３Ａ遺伝子由来のＮ末端のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－ＩＩ（配列番号８）、続いて停止コドン（融合配列について配列番号１０）のコード配列をコードする配列の翻訳融合物を、ｐＮＭＤ０３５プラスミドに挿入して、ｐＩＣＨ９５３９７コンストラクトを得た（図５）。配列番号１２は、ｐＩＣＨ９５３９７ベクターのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。このコンストラクトを、アグロバクテリウム介在性送達を使用した、タウマチン－ＩＩタンパク質の一過性発現のため使用した。
アルファ－アミラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５６３３６．１）のオリゼ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＲＡｍｙ３Ａ遺伝子由来のＮ末端のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－Ｉ（配列番号７）、続いて停止コドン（融合配列について配列番号９）のコード配列をコードするヌクレオチド配列の転写融合物を、国際公開第２０１２／０１９６６０号の特許に記載されるＴＭＶベースの構築ウイルスベクターｐＮＭＤ０３５に挿入した。得られたプラスミドコンストラクトｐＮＭＤ４０５０２を、図５に示す。配列番号１１は、ｐＮＭＤ４０５０２ベクターのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。このコンストラクトを、アグロバクテリウム介在性送達を使用した、タウマチン－Ｉタンパク質の一過性発現のため使用した。
同様に、アルファ－アミラーゼのオリゼ・サティバＲＡｍｙ３Ａ遺伝子由来のＮ末端のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－ＩＩ（配列番号８）、続いて停止コドン（融合配列について配列番号１０）のコード配列をコードする配列の翻訳融合物を、ｐＮＭＤ０３５プラスミドに挿入して、ｐＩＣＨ９５３９７コンストラクトを得た（図５）。配列番号１２は、ｐＩＣＨ９５３９７ベクターのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。このコンストラクトを、アグロバクテリウム介在性送達を使用した、タウマチン－ＩＩタンパク質の一過性発現のため使用した。
エタノール誘導性タウマチン発現のための二重誘導性ウイルスベクターを、ＥＰ３０９７７８３ Ａ１として公開された欧州特許出願において詳細に記載されたＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． ２０１１；国際公開第２０１１／１５４１４７号）を使用して作製した。ｐＮＭＤ４０５２３コンストラクト（図６Ａ）は、ライスアルファ－アミラーゼ３Ａ由来のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－Ｉ（融合配列について配列番号９）をコードする配列の翻訳融合物の挿入物を含有していた。配列番号１３は、ｐＮＭＤ４０５２３コンストラクトのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。
ｐＮＭＤ３８０６１コンストラクト（図６Ｂ）は、ライスアルファ－アミラーゼ３Ａ由来のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－ＩＩ（融合配列について配列番号１０）のコード配列をコードする配列の翻訳融合物の挿入物を含有していた。配列番号１３は、ｐＮＭＤ３８０６１コンストラクトのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。
ｐＮＭＤ４０５２３及びｐＮＭＤ３８０６１コンストラクトを、ニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム植物の安定的な転写のため使用した。
ｐＮＭＤ３８０６１コンストラクト（図６Ｂ）は、ライスアルファ－アミラーゼ３Ａ由来のアポプラスト標的配列及び成熟タウマチン－ＩＩ（融合配列について配列番号１０）のコード配列をコードする配列の翻訳融合物の挿入物を含有していた。配列番号１３は、ｐＮＭＤ３８０６１コンストラクトのＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列である。
ｐＮＭＤ４０５２３及びｐＮＭＤ３８０６１コンストラクトを、ニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム植物の安定的な転写のため使用した。
実施例３：ＴＭＶベースのウイルスベクターを有するニコチアナ・ベンサミアナにおけるタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの一過性発現
ニコチアナ・ベンサミアナ植物を、温室（それぞれ、１９～２３℃及び１７～２０℃の日中の気温及び夜間の気温であり、１２時間明るく、３５～７０％の湿度）において成長させた。６週齢の植物を、アグロバクテリウムの接種に使用した。
選択したタウマチンレプリコンを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）種菌を、葉の気孔（孔）を介して、温室で成長し、質を試験した宿主植物に適用した。植物全体の接種を、植物の葉を種菌の懸濁液に浸した後の真空仲介性浸透（Marillonnet et al. 2005）、又は界面活性剤と混合した種菌を植物の葉にスプレーする手法（Hahn et al. 2015）を介して行った。いずれかの方法を介して、アグロバクテリウムを、植物に効率的に内部移行させ、浸透移行性分布を得た。
ニコチアナ・ベンサミアナ植物を、温室（それぞれ、１９～２３℃及び１７～２０℃の日中の気温及び夜間の気温であり、１２時間明るく、３５～７０％の湿度）において成長させた。６週齢の植物を、アグロバクテリウムの接種に使用した。
選択したタウマチンレプリコンを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）種菌を、葉の気孔（孔）を介して、温室で成長し、質を試験した宿主植物に適用した。植物全体の接種を、植物の葉を種菌の懸濁液に浸した後の真空仲介性浸透（Marillonnet et al. 2005）、又は界面活性剤と混合した種菌を植物の葉にスプレーする手法（Hahn et al. 2015）を介して行った。いずれかの方法を介して、アグロバクテリウムを、植物に効率的に内部移行させ、浸透移行性分布を得た。
真空浸透のため、プラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＩＣＦ３２０細胞を、５０ｍｇ／ｍｌリファンピシン及び５０ｍｇ／ｍｌカナマイシン（バイナリーベクターの選択）を含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地３００ｍｌに接種し、密集するまで成長させた。密集したアグロバクテリウムの一晩培養物を、アグロバクテリウム接種溶液（１０ｍＭ ２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．５、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4）を用いて、ＯＤ６００＝１．３～１．５（約１．２×１０9ｃｆｕ／ｍＬ）に調整した。元々の培養物と比べて１０-2倍の濃度を得るために、細菌培養物を、同じ溶液を用いてさらに希釈した。浸透溶液を含有するビーカーを、植物の気中部分を溶液に浸しながら、真空チャンバー（直径３０ｃｍ）に入れた。真空を、０．１５～０．２ｂａｒの範囲の圧力を有するＶａｃｕｕｍ Ｐｕｍｐ ＭＥ ８ ＮＴ（ｖａｃｕｕｂｒａｎｄ（登録商標）、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２×１５秒間適用した。浸透させた植物を、標準条件下の温室に戻した。気中植物材料の回収を、浸透の７日後（ｄｐｉ）に行った。
噴霧トランスフェクションのため、密集したアグロバクテリウムの一晩培養物を、アグロバクテリウム接種溶液を用いて、ＯＤ６００＝１．３又は１．５に調整し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７（Ｋｕｒｔ Ｏｂｅｒｍｅｉｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ． ＫＧ、Ｂａｄ Ｂｅｒｌｅｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した同じ溶液を用いてさらに希釈して、１０-2倍の濃度を得て、接種を、ハンドスプレー（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ＋ＣＯ．ＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。噴霧した植物を、標準条件下の温室に戻した。気中植物材料の回収を、噴霧の１０～１２日後（ｄｐｉ）に行った。
実施例４：安定なトランスジェニックニコチアナ・ベンサミアナ植物におけるタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩのエタノール誘導性発現
エタノール誘導性タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ発現のため、本発明者らは、二重誘導性ＴＭＶベースのウイルスベクターのゲノム挿入物を含有する安定なトランスジェニックニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム植物を作製した（アプローチは、Werner et al. 2011に記載されている）。
タウマチン－Ｉ発現のためのコンストラクトｐＮＭＤ４０５２３を、アグロバクテリウム仲介性葉ディスク形質転換及び若干改変した標準的なプロトコール（Horsch et al. 1895; Werner et al. 2011）を使用したカナマイシン含有培地上での選択を用いて、ニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム「Ｓａｍｓｕｎ」植物に形質転換した。タウマチン－ＩＩ発現のためのコンストラクトｐＮＭＤ３８０６１を、同じアプローチを使用して、ニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム「Ｓａｍｓｕｎ」並びに「Ｂｕｒｌｅｙ Ｂ５」植物に形質転換した。再生した植物を温室に移し、エタノール誘導の際のタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ発現について試験した。
エタノール誘導性タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ発現のため、本発明者らは、二重誘導性ＴＭＶベースのウイルスベクターのゲノム挿入物を含有する安定なトランスジェニックニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム植物を作製した（アプローチは、Werner et al. 2011に記載されている）。
タウマチン－Ｉ発現のためのコンストラクトｐＮＭＤ４０５２３を、アグロバクテリウム仲介性葉ディスク形質転換及び若干改変した標準的なプロトコール（Horsch et al. 1895; Werner et al. 2011）を使用したカナマイシン含有培地上での選択を用いて、ニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム「Ｓａｍｓｕｎ」植物に形質転換した。タウマチン－ＩＩ発現のためのコンストラクトｐＮＭＤ３８０６１を、同じアプローチを使用して、ニコチアナ・ベンサミアナ及びニコチアナ・タバカム「Ｓａｍｓｕｎ」並びに「Ｂｕｒｌｅｙ Ｂ５」植物に形質転換した。再生した植物を温室に移し、エタノール誘導の際のタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ発現について試験した。
実施例５：タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの精製
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの精製のため、若干改変した同じ手法を使用した。タウマチン精製プロセスのフロー図を、図７に示す。
植物材料最大３．５ｋｇを、Ｆｒｕｉｔ Ｓｈｒｅｄｄｅｒ「Ｆｒｕｉｔ Ｓｈａｒｋ １．６」（ＶＡＲＥＳ Ｍｎｉｃｈｏｖｉｃｅ ａ．ｓ．、Ｍｎｉｃｈｏｖｉｃｅ、Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）を使用して、ホモジナイズした。ホモジネートを、抽出バッファー１容量とさらに混合した。タウマチン－Ｉの場合、抽出バッファーは、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ６からなっていた。タウマチン－ＩＩの場合、次の組成の抽出バッファーを使用した：２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ６．５。希釈したホモジネートを、Ｔｏｍａｔｏ Ｐｒｅｓｓ（９００６Ｎ、Ｒｅｂｅｒ、Ｌｕｚｚａｒａ Ｉｔａｌｙ）に通して、固形物を除去した。この手法の結果として、グリーンジュース（ＧＪ）を集め、さらに処理した。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの精製のため、若干改変した同じ手法を使用した。タウマチン精製プロセスのフロー図を、図７に示す。
植物材料最大３．５ｋｇを、Ｆｒｕｉｔ Ｓｈｒｅｄｄｅｒ「Ｆｒｕｉｔ Ｓｈａｒｋ １．６」（ＶＡＲＥＳ Ｍｎｉｃｈｏｖｉｃｅ ａ．ｓ．、Ｍｎｉｃｈｏｖｉｃｅ、Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）を使用して、ホモジナイズした。ホモジネートを、抽出バッファー１容量とさらに混合した。タウマチン－Ｉの場合、抽出バッファーは、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ６からなっていた。タウマチン－ＩＩの場合、次の組成の抽出バッファーを使用した：２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ６．５。希釈したホモジネートを、Ｔｏｍａｔｏ Ｐｒｅｓｓ（９００６Ｎ、Ｒｅｂｅｒ、Ｌｕｚｚａｒａ Ｉｔａｌｙ）に通して、固形物を除去した。この手法の結果として、グリーンジュース（ＧＪ）を集め、さらに処理した。
グリーンジュースを、乾燥オーブンにおいて、６５℃で約３時間さらにインキュベーとした（およそ４８℃の温度に達するまで、抽出の温度を、温度計を使用して測定した）。インキュベーション後、グリーンジュースを、結果的に、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ及びＦｉｌｔｅｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｐｕｌｃｉｎｏ １０～２０×１０、Ｒｏｖｅｒ Ｐｏｍｐｅ、Ｉｔａｌｙ）を使用して４５μｍの孔サイズの三重フィルターを通して濾過した。得られた清澄化した濾液（ＣＦ）の伝導性を測定し、脱イオン水を使用して、約３ｍＳ／ｃｍに合わせて、タンパク質を効率的に結合させた。
希釈したＣＦを、Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｐｕｌｃｉｎｏ １０～２０×１０、Ｒｏｖｅｒ Ｐｏｍｐｅ、Ｉｔａｌｙ）を使用して０．２５μｍの孔サイズの三重フィルターを通してさらに濾過した。この工程により、清澄化した抽出物を得て、これを、クロマトグラフィーカラム（Ｃｏｌｕｍｎ Ｌｏａｄ、ＣＬ）の充填に使用した。
希釈したＣＦを、Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｐｕｌｃｉｎｏ １０～２０×１０、Ｒｏｖｅｒ Ｐｏｍｐｅ、Ｉｔａｌｙ）を使用して０．２５μｍの孔サイズの三重フィルターを通してさらに濾過した。この工程により、清澄化した抽出物を得て、これを、クロマトグラフィーカラム（Ｃｏｌｕｍｎ Ｌｏａｄ、ＣＬ）の充填に使用した。
タウマチンのクロマトグラフィー精製を、ＡＫＴＡ（商標）理論的システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、強力なカチオン交換（ＣＩＥＸ）樹脂ＣａｐｔｏＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。精製のため、カラム容積２５０ｍｌ及び流速１２～１４ｍｌ／分を使用した。試料充填前に、カラムを、５カラム容積の２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ６．５を用いて平衡化した。試料充填後、カラムを、５カラム容積の平衡バッファーを用いて洗浄した。タウマチンを、２０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．３及び４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５カラム容積の溶出バッファーを用いた溶出工程を使用して回収した。
９０％のバッファー交換を達成するまで、溶出液（Ｅ）を、Ｍｉｎｉｍａｔｅ（商標）ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒ、ＵＳＡ）を使用した５ｋＤａ Ｍｉｎｉｍａｔｅ（商標）Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｐｓｕｌｅを有するＵＦ／ＤＦを使用して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に対するバッファー交換の対象にした。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光の決定によって測定した。適切な量の脱塩したタウマチンを、－８０℃で凍結し、使用まで凍結乾燥させた２５ｍｌのガラスバイアルに分注した。
精製工程のためのタンパク質試料を、図８及び９に示す通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。
９０％のバッファー交換を達成するまで、溶出液（Ｅ）を、Ｍｉｎｉｍａｔｅ（商標）ＴＦＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒ、ＵＳＡ）を使用した５ｋＤａ Ｍｉｎｉｍａｔｅ（商標）Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｐｓｕｌｅを有するＵＦ／ＤＦを使用して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水に対するバッファー交換の対象にした。タンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光の決定によって測定した。適切な量の脱塩したタウマチンを、－８０℃で凍結し、使用まで凍結乾燥させた２５ｍｌのガラスバイアルに分注した。
精製工程のためのタンパク質試料を、図８及び９に示す通り、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分析した。
実施例６：タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの品質管理：タンパク質の純度
単離したタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質の純度を、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）により分析した。
チップ上でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８０ Ｋｉｔ（サイズ分類範囲：５～８０ｋＤａ）及び２１００ Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Kuschel et al. 2002）と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ；Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。全ての試薬及びチップを、製造元の指示に従い調製した。
単離したタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質の純度を、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）により分析した。
チップ上でのキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８０ Ｋｉｔ（サイズ分類範囲：５～８０ｋＤａ）及び２１００ Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Kuschel et al. 2002）と組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ；Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。全ての試薬及びチップを、製造元の指示に従い調製した。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ試料を含有する凍結乾燥バッファーを、水を用いて、１ｍｌ当たりタンパク質１ｍｇの濃度に再構成した。それぞれのタウマチン試料４μｌ及び還元試料バッファー２μｌを混合し、９５℃で５分間インキュベーとした。水８４μｌをそれぞれのタウマチンバッファー混合物に加えた後、それぞれの試料６μｌを、２種のＢＳＡ標準タンパク質試料（還元及び非還元）並びにタンパク質８０ラダーと一緒にチップに充填した。チップの実行結果を、ゲル様画像として電気泳動図及び表形式で示す。電気泳動図のピークベースライン調整及びピーク組込みを自動で行い、必要に応じて、ピークベースラインの手動調整を、ケースバイケースを基本に行った。
図１０は、タウマチン－ＩＩ純度のＧＣＥ分析のゲル画像を示す。分析を、標準としてＢＳＡ、及びタンパク質８０ラダーを使用して２連で行った。タンパク質を、非還元条件及び還元条件下で分離した。図１１は、タウマチン－Ｉ（Ａ）及びタウマチン－ＩＩ（Ｂ）純度のＧＣＥ分析についての対応する電気泳動図を示す。タンパク質の純度を、凍結乾燥タンパク質試料の再懸濁の際に得たトータルの可溶性タンパク質のパーセンテージとして示す。それは、両方のタンパク質について９７％～９８％の範囲にあることを見出した。
水溶液中の精製したタウマチン－Ｉ又はタウマチン－ＩＩの濃度を、Ｌａｍｂｅｒｔ－Ｂｅｅｒ法則を使用して、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）に基づき決定した。Ａ２８０を、ＢｉｏＴｅｋ（商標）Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴＸ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ及びＴａｋｅ３（商標）Ｍｕｌｔｉ－Ｖｏｌｕｍｅ Ｐｌａｔｅ（ＢｉｏＴｅｋ Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｂａｄ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｈａｌｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。０．１％ｗ／ｖ（＝１ｇ／ｌ）溶液の消衰係数及び吸光を、ＵＲＬ https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparamを介してアクセスしたＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ＥｘＰＡＳｙ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌ）を使用して計算した。両方について、タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの消衰係数を、同じになるようコンピューター処理した：２９４２０Ｍ－１ ｃｍ－１（非還元形態）。水中の０．１％ｗ／ｖ溶液の吸光値は、若干異なっていた：タウマチン－Ｉについて１．３２５及びタウマチン－ＩＩについて１．３２０（両方が、非還元形態）。
実施例７：タウマチン－ＩＩ品質管理：タンパク質の完全性
精製の際にタウマチン－ＩＩの完全性を確認するために、再構成した凍結乾燥タンパク質を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析により分析した。バッチ番号５、番号６及び番号７を、分析のため使用した。それぞれのバッチについて、タウマチン－ＩＩの分子量を決定し、Ｎ並びにＣ末端の配列を検証した。
タンパク質末端の配列の検証には、供給源の減衰（ＩＳＤ）と呼ばれる特定の質量分析技術の使用を必要とした。この技術は、イオン化中に非常に上昇したレーザーエネルギーにより生じる、Ｎ末端（ａ及びｃ型）並びにＣ末端（ｙ及びｚ型）フラグメントイオンを使用する。これらのフラグメントイオンを使用して、タンパク質の末端のアミノ酸配列を導き出すことができる。ＩＳＤは、標的化していない技術であり、ゆえに、生じるフラグメントの種類（Ｃ及びＮ末端、Ｎ又はＣ末端のみ）並びにそれらが生じる効率に影響する可能性はない。２種の異なる化合物が、試料内に存在する場合、次いで、両方のフラグメントイオンを通常観察する。ＩＳＤスペクトルは、Ｎ及びＣ末端の最初のアミノ酸をカバーしない。ゆえに、それらは、それぞれのアミノ酸並びに可能性のある改変の正確な場所の同定／確認を可能にしない。この課題を解決するためにＴ３配列決定と呼ばれる技術の使用が必要である。Ｔ３アプローチは、ＬＩＦＴによる選択したＩＳＤフラグメントの分析に基づく。ＩＳＤフラグメントイオンを、イオン供給源内で生成させるため、それらは、質量分析器内でさらに断片化することができる。質量分析器内に位置するＬＩＦＴ単位は、この挙動を使用する。ＬＩＦＴは、ＩＳＤフラグメントイオンを特異的に選択し、そのフラグメントスペクトルを取得し、これが、通常、最初のアミノ酸及びそれらの改変の同定を可能にする。
精製の際にタウマチン－ＩＩの完全性を確認するために、再構成した凍結乾燥タンパク質を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析により分析した。バッチ番号５、番号６及び番号７を、分析のため使用した。それぞれのバッチについて、タウマチン－ＩＩの分子量を決定し、Ｎ並びにＣ末端の配列を検証した。
タンパク質末端の配列の検証には、供給源の減衰（ＩＳＤ）と呼ばれる特定の質量分析技術の使用を必要とした。この技術は、イオン化中に非常に上昇したレーザーエネルギーにより生じる、Ｎ末端（ａ及びｃ型）並びにＣ末端（ｙ及びｚ型）フラグメントイオンを使用する。これらのフラグメントイオンを使用して、タンパク質の末端のアミノ酸配列を導き出すことができる。ＩＳＤは、標的化していない技術であり、ゆえに、生じるフラグメントの種類（Ｃ及びＮ末端、Ｎ又はＣ末端のみ）並びにそれらが生じる効率に影響する可能性はない。２種の異なる化合物が、試料内に存在する場合、次いで、両方のフラグメントイオンを通常観察する。ＩＳＤスペクトルは、Ｎ及びＣ末端の最初のアミノ酸をカバーしない。ゆえに、それらは、それぞれのアミノ酸並びに可能性のある改変の正確な場所の同定／確認を可能にしない。この課題を解決するためにＴ３配列決定と呼ばれる技術の使用が必要である。Ｔ３アプローチは、ＬＩＦＴによる選択したＩＳＤフラグメントの分析に基づく。ＩＳＤフラグメントイオンを、イオン供給源内で生成させるため、それらは、質量分析器内でさらに断片化することができる。質量分析器内に位置するＬＩＦＴ単位は、この挙動を使用する。ＬＩＦＴは、ＩＳＤフラグメントイオンを特異的に選択し、そのフラグメントスペクトルを取得し、これが、通常、最初のアミノ酸及びそれらの改変の同定を可能にする。
未変性タウマチン－ＩＩは、８個のジスルフィド結合を含有する。３個のバッチにおけるこれらのジスルフィド結合の存在を調べるために、それぞれの試料を２個の部分に分けた：一方を、ＭＡＬＤＩ標的（非還元試料）に直接適用し、他方を、５０℃で３０分間、１０ｍＭ ＤＴＴで処理した（還元試料）。両方の種類の試料を、ＭＡＬＤＩマトリックスＳ－ＤＨＢ（２．５－ジヒドロキシ安息香酸と２－ヒドロキシ－５－メトキシ安息香酸の混合物）及びＤＨＡＰ（２，５－ジヒドロキシアセトフェノン）を用いて、ＭＡＬＤＩ基盤スチール標的上で再結晶した。
質量スペクトルを、線形（分子質量の決定）並びに反射モード（ＩＳＤ分析）において、正の極性を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得した。分析物含有マトリックスの照射を、パルス速度１ｋＨｚ、パルスエネルギー５００μＪ及び放出波長３５５ｎｍに設定したＮｄ：ＹＡＧレーザー（Ｓｍａｒｔ ｂｅａｍ－ ＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって達成した。スペクトルを、少なくとも１００００ショット（１試料スポット当たり）の蓄積により、ｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ（バージョン３．４、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して記録した。レーザーエネルギーを、ＭＳ実験の域値より若干上に設定し、ＩＳＤ分析のため非常に上昇した値に設定した。スペクトル処理を、ＴｏｐＨａｔアルゴリズムを用いたベースラインの減算を適用し、Ｓａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いてスムージングし、ＳＮＡＰを用いてピークを検出することによって、ｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ（バージョン３．４、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計を、標準ペプチドと公知の質量のタンパク質のセット（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＩ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｉ及びＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の質量シグナルを使用して較正した。較正に利用したスペクトルを、試料分析のため使用したのと同じレーザーエネルギーを用いて取得した。
分子量を決定し、タンパク質末端の完全性を評価し、ジスルフィド結合の存在についての情報を明らかにするために、タウマチン－ＩＩの３個のバッチ全てを、ＭＡＬＤｌ－ＴＯＦ（／ＴＯＦ）質量分により分析した。
それぞれの試料について、分子量を、非還元状態及び還元状態のタウマチン－ＩＩについて決定した。得られた質量の値は、通常、５Ｄａ未満の偏差で、理論質量と良好な相関を示した。
非還元型タウマチン－ＩＩと還元型タウマチン－ＩＩの実験で決定した質量の比較により、８．０Ｄａ～１８．９Ｄａの質量差が明らかになった。これらの差は、非還元型タウマチン－ＩＩにおけるジスルフィド結合の存在を示す。
ｌＳＤ分析及びＴ３配列決定の結果により、両方のタンパク質末端が未変化であり、配列の変動又は改変は存在しないことを確認した（表１）。
それぞれの試料について、分子量を、非還元状態及び還元状態のタウマチン－ＩＩについて決定した。得られた質量の値は、通常、５Ｄａ未満の偏差で、理論質量と良好な相関を示した。
非還元型タウマチン－ＩＩと還元型タウマチン－ＩＩの実験で決定した質量の比較により、８．０Ｄａ～１８．９Ｄａの質量差が明らかになった。これらの差は、非還元型タウマチン－ＩＩにおけるジスルフィド結合の存在を示す。
ｌＳＤ分析及びＴ３配列決定の結果により、両方のタンパク質末端が未変化であり、配列の変動又は改変は存在しないことを確認した（表１）。
図１２は、確認したアミノ酸残基についての概要を提供する。一緒に取得したＩＳＤ及びＴ３配列決定データにより、３個の試験したバッチ全てにおけるタウマチン－ＩＩタンパク質の完全性、Ｎ末端のアポプラスト標的化プレ配列の正しい切断、Ｎ末端とＣ末端の両方の完全性及び８個のジスルフィド結合の存在を確認した。
実施例８：精製したタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの安定性
精製したニコチアナ・ベンサミアナが産生したタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質粉末の安定性を、４℃及び室温（約２２℃）での保存中に評価した。安定性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８０試薬キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動）により決定した。分析のため、様々な時間点で採取した不連続のバッチにおいて産生された、保存した精製したタウマチンタンパク質粉末１ミリグラム（１ｍｇ）を、水１ｍｌに溶解した。室温で保存したタウマチンＩＩの発生上のバッチ由来の試料の典型的な電気泳動図を、図１３に示す。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩのパーセント純度を、２種の温度での保存の様々な時間で採取した、不連続で産生されたバッチの分析（２連の複製実験の平均）から決定し、タンパク質の安定性（分解による低減した純度）と呼んだ。タウマチン－ＩＩについての結果の編集を、表２に示す。
精製したニコチアナ・ベンサミアナが産生したタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質粉末の安定性を、４℃及び室温（約２２℃）での保存中に評価した。安定性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ及びＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ ８０試薬キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＣＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動）により決定した。分析のため、様々な時間点で採取した不連続のバッチにおいて産生された、保存した精製したタウマチンタンパク質粉末１ミリグラム（１ｍｇ）を、水１ｍｌに溶解した。室温で保存したタウマチンＩＩの発生上のバッチ由来の試料の典型的な電気泳動図を、図１３に示す。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩのパーセント純度を、２種の温度での保存の様々な時間で採取した、不連続で産生されたバッチの分析（２連の複製実験の平均）から決定し、タンパク質の安定性（分解による低減した純度）と呼んだ。タウマチン－ＩＩについての結果の編集を、表２に示す。
乾燥タンパク質粉末を、長期間にわたり保存したとき、タウマチンタンパク質純度（総タンパク質のパーセントとしてのタウマチンタンパク質）を維持した。タウマチン－ＩＩの試料のいずれも、４℃又は室温（約２２℃）のいずれかでの保存の際に、分解断片化又は凝集を示さなかった。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩは、示した条件下での保存中安定であった。表２に示したパーセント純度の値は、２個の複製分析の平均である。例えば、４℃で保存したとき、タウマチン－ＩＩは、１２カ月間安定であることを見出し、これは、その保存期間にわたり３％未満の純度の減少であった。タウマチン－ＩＩの一部のバッチはまた、室温で、最大１１カ月間安定であった。一般に、冷所保存（４℃～１０℃）が、より高い安定性をもたらすと予想され、ゆえに、より長い製品の保存を可能にする。
タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩは、示した条件下での保存中安定であった。表２に示したパーセント純度の値は、２個の複製分析の平均である。例えば、４℃で保存したとき、タウマチン－ＩＩは、１２カ月間安定であることを見出し、これは、その保存期間にわたり３％未満の純度の減少であった。タウマチン－ＩＩの一部のバッチはまた、室温で、最大１１カ月間安定であった。一般に、冷所保存（４℃～１０℃）が、より高い安定性をもたらすと予想され、ゆえに、より長い製品の保存を可能にする。
実施例９：タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩの品質管理：残渣アルカロイドの含有量
タウマチンタンパク質をニコチアナ・ベンサミアナにおいて発現させたため、最終製品における残渣アルカロイド、特に、ニコチン及びアナバシンは、精製中に許容されるレベルまで低減されるべきである。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によるニコチンの決定を行ったＳｉｓｓｏｎ及びＳｅｖｅｒｓｏｎ（１９９０）によると、ニコチアナ・ベンサミアナの緑色の葉は、総アルカロイドの乾燥質量１ｇ当たり平均１５．８ｍｇを含有し、その大部分が、ニコチン（９０．４％）及びアナバシン（８．４％）である。したがって、本発明者らの研究において、本発明者らは、湿った葉（９０％の水分）において、新鮮な植物材料の質量１ｇ当たり約ニコチン１．５ｍｇであることを見出すと仮定した。ＨＰＬＣ－ＭＳによるニコチン及びアナバシン（ニコチアナにおける最も顕著なピリジンアルカロイド）の実際の測定は、公開されたもの（Stephan et al. 2017）と同じ範囲の量を示した。それにもかかわらず、本発明者らの研究において、本発明者らは、ニコチンの含有量が、公開された値より約１０倍低いことを示すことができた：新鮮質量１ｇ当たり１２３，６６７±５９，１８１ｎｇ。同じことが、アナバシンの含有量の分析において当てはまる：新鮮質量１ｇ当たり１４，１３３±２，５９０ｎｇ。Ｓｉｓｓｏｎ及びＳｅｖｅｒｓｏｎ（１９９０）によると、ニコチンの９．３％が、ニコチアナ・ベンサミアナの葉に存在する。アルカロイド濃度のこの差は、おそらく、実験条件（例えば、植物の成長又は抽出条件）の差に起因する。
タウマチンタンパク質をニコチアナ・ベンサミアナにおいて発現させたため、最終製品における残渣アルカロイド、特に、ニコチン及びアナバシンは、精製中に許容されるレベルまで低減されるべきである。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によるニコチンの決定を行ったＳｉｓｓｏｎ及びＳｅｖｅｒｓｏｎ（１９９０）によると、ニコチアナ・ベンサミアナの緑色の葉は、総アルカロイドの乾燥質量１ｇ当たり平均１５．８ｍｇを含有し、その大部分が、ニコチン（９０．４％）及びアナバシン（８．４％）である。したがって、本発明者らの研究において、本発明者らは、湿った葉（９０％の水分）において、新鮮な植物材料の質量１ｇ当たり約ニコチン１．５ｍｇであることを見出すと仮定した。ＨＰＬＣ－ＭＳによるニコチン及びアナバシン（ニコチアナにおける最も顕著なピリジンアルカロイド）の実際の測定は、公開されたもの（Stephan et al. 2017）と同じ範囲の量を示した。それにもかかわらず、本発明者らの研究において、本発明者らは、ニコチンの含有量が、公開された値より約１０倍低いことを示すことができた：新鮮質量１ｇ当たり１２３，６６７±５９，１８１ｎｇ。同じことが、アナバシンの含有量の分析において当てはまる：新鮮質量１ｇ当たり１４，１３３±２，５９０ｎｇ。Ｓｉｓｓｏｎ及びＳｅｖｅｒｓｏｎ（１９９０）によると、ニコチンの９．３％が、ニコチアナ・ベンサミアナの葉に存在する。アルカロイド濃度のこの差は、おそらく、実験条件（例えば、植物の成長又は抽出条件）の差に起因する。
アルカロイドの含有量を、Stephan et al. 2017に記載される通り、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により決定した。方法は、約２０ｎｇ／ｍＬ（２０ｐｐｂ）のＬＬＯＱ及び２０～１，５００ｎｇ／ｍＬ（２０～１，５００ｐｐｂ）の直線性を有する。
表３は、タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ分析の結果の概要であり、精製したタンパク質粉末のニコチン及びアナバシンのアルカロイド含有量を示す。タウマチン－Ｉについて、精製したタンパク質の１個のバッチを分析した。タウマチン－ＩＩの場合、３個の独立したタンパク質バッチを分析した。これらのバッチは、不連続で作製した。それぞれ、タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質１ｍｇ当たり残渣ニコチン約６ｎｇ及び１３～１５ｎｇを検出した。残渣アナバシンレベルは、両方のタンパク質について０．３４～３．８４の範囲であった。
本発明者らのデータにより、本発明者らが使用するタンパク質精製が、アルカロイドを安全なレベルまで効率的に低減することを明らかにする。
表３は、タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩ分析の結果の概要であり、精製したタンパク質粉末のニコチン及びアナバシンのアルカロイド含有量を示す。タウマチン－Ｉについて、精製したタンパク質の１個のバッチを分析した。タウマチン－ＩＩの場合、３個の独立したタンパク質バッチを分析した。これらのバッチは、不連続で作製した。それぞれ、タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩタンパク質１ｍｇ当たり残渣ニコチン約６ｎｇ及び１３～１５ｎｇを検出した。残渣アナバシンレベルは、両方のタンパク質について０．３４～３．８４の範囲であった。
本発明者らのデータにより、本発明者らが使用するタンパク質精製が、アルカロイドを安全なレベルまで効率的に低減することを明らかにする。
タウマチン－ＩＩについて得た結果により示した通り、最も一般的なアルカロイドであるニコチン及びアナバシンについて、バッチ間で高い再現性及び一貫性がある。
実施例１０：知覚研究：タウマチン－ＩＩの検出域値
この研究の目標は、本発明者らの植物ウイルスベースの発現系を使用して産生したタウマチン－ＩＩについての検出の域値（タウマチンの存在）及び甘味（甘味）の域値を決定することであった。検出域値は、ブランク対照（「何かを認識する」）と比較して異なるため、それを検出し得る媒体における物質の最低濃度である。認識域値は、甘いと認識することができる（「甘味を認識する」）媒体における物質の最低濃度である（Lawless and Heymann, 2010）。この研究を、Ｈａｌｌｅ（Ｓａａｌｅ）、ＧｅｒｍａｎｙのＮｏｍａｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ研究施設にて行った。
この研究の目標は、本発明者らの植物ウイルスベースの発現系を使用して産生したタウマチン－ＩＩについての検出の域値（タウマチンの存在）及び甘味（甘味）の域値を決定することであった。検出域値は、ブランク対照（「何かを認識する」）と比較して異なるため、それを検出し得る媒体における物質の最低濃度である。認識域値は、甘いと認識することができる（「甘味を認識する」）媒体における物質の最低濃度である（Lawless and Heymann, 2010）。この研究を、Ｈａｌｌｅ（Ｓａａｌｅ）、ＧｅｒｍａｎｙのＮｏｍａｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ研究施設にて行った。
研究設計
この評価を、ＡＳＴＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ）の標準実行Ｅ６７９－０４（Ｒｅａｐｐｒｏｖｅｄ ２０１１）に従い、Ｆｏｒｃｅｄ－Ｃｈｏｉｃｅ Ａｓｃｅｎｄｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｉｍｉｔｓを使用して行った。対象材料は、ニコチアナ・ベンサミアナにおいて発現し、実施例５に記載した通り精製したタウマチン－ＩＩからなっていた。
タウマチン－ＩＩの溶液を、０．０１～３ｐｐｍの範囲の濃度で調製した。これらの溶液を、１：１．８希釈工程で分析し、検出域値（タウマチンの存在）及び甘味の域値の決定のため、１０種の異なる希釈の評価を得た。全ての溶液及び希釈液は、水の質に起因した可能性のある味の違いを防ぐために、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を使用した。同じ水をブランク（対照）として使用した。
この評価を、ＡＳＴＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ）の標準実行Ｅ６７９－０４（Ｒｅａｐｐｒｏｖｅｄ ２０１１）に従い、Ｆｏｒｃｅｄ－Ｃｈｏｉｃｅ Ａｓｃｅｎｄｉｎｇ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｌｉｍｉｔｓを使用して行った。対象材料は、ニコチアナ・ベンサミアナにおいて発現し、実施例５に記載した通り精製したタウマチン－ＩＩからなっていた。
タウマチン－ＩＩの溶液を、０．０１～３ｐｐｍの範囲の濃度で調製した。これらの溶液を、１：１．８希釈工程で分析し、検出域値（タウマチンの存在）及び甘味の域値の決定のため、１０種の異なる希釈の評価を得た。全ての溶液及び希釈液は、水の質に起因した可能性のある味の違いを防ぐために、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を使用した。同じ水をブランク（対照）として使用した。
清潔な市販の使い捨てプラスチックビーカー（０．２Ｌ）を使用し、試験した全ての溶液にわたり同一であった。ビーカーを、３桁の無作為な盲検コードで印し、それぞれの濃度について、無作為な順序で実験者により水又は試験試料で満たした。試験後、試料をカップに排出した。試料間で、回答者は、洗浄のため最大６０秒間、非発泡のミネラルウォーターで口をゆすいだ。必要に応じて、ウォータービスケットの試料採取により、口由来のフレーバーを取り除き、続いて上の通り、洗浄した。
計１９人の参加者／回答者が、本研究に参加した。ストック溶液は、０．０１５１ｐｐｍ（０．６７９ｎＭ）～３ｐｐｍ（１３４．６ｎＭ）のタウマチン－ＩＩの濃度範囲であった。本研究に含まれるストックスクロース溶液はなかった。それぞれのセットを試験した（３個のビーカー）後、回答者は、それぞれのセットの３個のビーカーの間で認識した差を評価しながら、スコアシートをうめた。バックグラウンド対照及び試料溶液を、それぞれの試料について記述エントリーの機会と共に、指示（０＝差なし、１＝何かを感じる、２＝明確な甘味を検出した）に従い記録した。結果を分析して、タウマチン－ＩＩ検出及びタウマチン－ＩＩ甘味域値濃度を決定した。
計１９人の参加者／回答者が、本研究に参加した。ストック溶液は、０．０１５１ｐｐｍ（０．６７９ｎＭ）～３ｐｐｍ（１３４．６ｎＭ）のタウマチン－ＩＩの濃度範囲であった。本研究に含まれるストックスクロース溶液はなかった。それぞれのセットを試験した（３個のビーカー）後、回答者は、それぞれのセットの３個のビーカーの間で認識した差を評価しながら、スコアシートをうめた。バックグラウンド対照及び試料溶液を、それぞれの試料について記述エントリーの機会と共に、指示（０＝差なし、１＝何かを感じる、２＝明確な甘味を検出した）に従い記録した。結果を分析して、タウマチン－ＩＩ検出及びタウマチン－ＩＩ甘味域値濃度を決定した。
タウマチン－ＩＩを用いた結果
本研究のタウマチン－ＩＩ検出域値部分の結果を、表４に示す。分析は、タウマチン－ＩＩについての低い認識域値、すなわち、２６ｎＭ又は０．５９ｐｐｍ；（ｎ＝１８）を示す。
タウマチン－ＩＩ甘味検出域値の結果を、表５に示す。１人の回答者によって確立した最低の個々の検出域値は、１．６４ｎＭであった。回答者（ｎ＝１６）の結果のまとめにより、既に公開された５０ｎＭ（１．２ｐｐｍ）（Masuda et al. 2018）と比較して、タウマチン－ＩＩについての甘味の検出について、より低い濃度、すなわち、３７ｎＭ（０．８３ｐｐｍ）を明らかにした。
域値濃度の決定における差を、タンパク質のより高い純度により、又は味の評価に影響し得る、塩を含有するバッファーではなく、水に対してタウマチン－ＩＩを透析したという事実により説明することができる。
本研究のタウマチン－ＩＩ検出域値部分の結果を、表４に示す。分析は、タウマチン－ＩＩについての低い認識域値、すなわち、２６ｎＭ又は０．５９ｐｐｍ；（ｎ＝１８）を示す。
タウマチン－ＩＩ甘味検出域値の結果を、表５に示す。１人の回答者によって確立した最低の個々の検出域値は、１．６４ｎＭであった。回答者（ｎ＝１６）の結果のまとめにより、既に公開された５０ｎＭ（１．２ｐｐｍ）（Masuda et al. 2018）と比較して、タウマチン－ＩＩについての甘味の検出について、より低い濃度、すなわち、３７ｎＭ（０．８３ｐｐｍ）を明らかにした。
域値濃度の決定における差を、タンパク質のより高い純度により、又は味の評価に影響し得る、塩を含有するバッファーではなく、水に対してタウマチン－ＩＩを透析したという事実により説明することができる。
実施例１１：スクロースのタウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩでの置き換え
本研究は、２個の目的を有していた。第一の目的は、対照（１０％スクロース溶液）と類似の知覚特性（甘味及び甘味のあと味）を有するタウマチン－Ｉ溶液の定式を同定することであった。第二の目的は、対照（１０％スクロース溶液）と類似の知覚特性（甘味及び甘味のあと味）を有するタウマチン－ＩＩ溶液の定式を同定することであった。研究を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、ＧＡ、ＵＳＡにて行った。
本研究は、２個の目的を有していた。第一の目的は、対照（１０％スクロース溶液）と類似の知覚特性（甘味及び甘味のあと味）を有するタウマチン－Ｉ溶液の定式を同定することであった。第二の目的は、対照（１０％スクロース溶液）と類似の知覚特性（甘味及び甘味のあと味）を有するタウマチン－ＩＩ溶液の定式を同定することであった。研究を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、ＧＡ、ＵＳＡにて行った。
研究設計
対照技術に由来する違いを組み合わせたハイブリッドの記述的方法及び特性強度評価を使用した。６人の訓練した回答者により、評価を行った。０．５ずつ増加する、０～１５ポイントのスケールを使用した。実験前、甘味対照（１０％スクロース）についての強度評価を行った。スクロースと異なり、タウマチンの甘味は、よりゆっくりと構築され、５秒後に最大になった。それゆえ、全ての特性を、試料を口の中に５秒間保持した後に評価した。甘味のあと味の傾向を評価するために、回答者は、２分間２０秒毎にあと味を評価した。タイミングを、パネルリーダーが調節した。試験を５回繰り返した。
対照技術に由来する違いを組み合わせたハイブリッドの記述的方法及び特性強度評価を使用した。６人の訓練した回答者により、評価を行った。０．５ずつ増加する、０～１５ポイントのスケールを使用した。実験前、甘味対照（１０％スクロース）についての強度評価を行った。スクロースと異なり、タウマチンの甘味は、よりゆっくりと構築され、５秒後に最大になった。それゆえ、全ての特性を、試料を口の中に５秒間保持した後に評価した。甘味のあと味の傾向を評価するために、回答者は、２分間２０秒毎にあと味を評価した。タイミングを、パネルリーダーが調節した。試験を５回繰り返した。
結果
１．タウマチン－Ｉ。
１．１甘味。対照溶液（１０％スクロース）の甘味の強度は、９．０であった。６％スクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－Ｉを含む試料は、対照と類似の甘味の強度を有していた（表６）。５％のスクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－Ｉのみが、対照より弱い甘味の強度を有していた。
１．タウマチン－Ｉ。
１．１甘味。対照溶液（１０％スクロース）の甘味の強度は、９．０であった。６％スクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－Ｉを含む試料は、対照と類似の甘味の強度を有していた（表６）。５％のスクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－Ｉのみが、対照より弱い甘味の強度を有していた。
１．２．甘味のあと味。スクロースと比較して、タウマチン－Ｉ試料は、より長引く甘味のあと味を有していた。対照溶液（１０％糖）の甘味のあと味の強度は、２０、４０、６０、８０、１００、及び１２０秒で、それぞれ、６、３、２、１、１、及び０．５であった。６％糖＋３．５ｐｐｍタウマチン－Ｉを含む試料は、対照と類似の甘味の強度を有していたが、甘味のあと味について異なるパターンを示した（より長引く）（図１４）。タウマチン－Ｉを含有した全ての試料は、全ての時間ポイント（２０秒～１２０秒）で対照より比較的高い甘味のあと味の強度を有していた。５％スクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－Ｉを含む試料は、対照（１０％スクロース）と近い甘味のあと味のパターンを有していた。
２．タウマチン－ＩＩ。
２．１甘味。対照溶液（１０％スクロース）の甘味の強度は、９．０であった。５％スクロース＋５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、対照と類似の甘味の強度を有していた（表７）。５％スクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、対照より低い甘味の強度を有する唯一であった。２種の試料（７％スクロース＋７ｐｐｍタウマチンＩＩ、及び７％スクロース＋９ｐｐｍタウマチンＩＩ）の甘味の強度は、１５より上であるとわかり、これは、使用したスケールで最大値であった。
２．１甘味。対照溶液（１０％スクロース）の甘味の強度は、９．０であった。５％スクロース＋５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、対照と類似の甘味の強度を有していた（表７）。５％スクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、対照より低い甘味の強度を有する唯一であった。２種の試料（７％スクロース＋７ｐｐｍタウマチンＩＩ、及び７％スクロース＋９ｐｐｍタウマチンＩＩ）の甘味の強度は、１５より上であるとわかり、これは、使用したスケールで最大値であった。
２．２甘味のあと味。スクロースと比較して、タウマチン－ＩＩ試料は、より長引く甘味のあと味を有していた。対照溶液（１０％スクロース）についての甘味のあと味の強度は、２０、４０、６０、８０、１００、及び１２０秒で、それぞれ、６、３、２、１、１、及び０．５であった。５％スクロース＋５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを含む試料は、対照と類似の甘味強度を有していたが、それは、甘味のあと味について異なるパターンを示した（より長引く）（図１５）。タウマチン－ＩＩを含有する全ての試料は、全ての時間ポイント（２０秒～１２０秒）で対照より比較的高い甘味のあと味の強度を有していた。５％スクロース＋３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、対照と比較した場合、より低い初期の甘味強度を有し（７．９±０．１０対９．０）、それにも関わらず、それらの甘味のあと味のパターンは、非常に類似していた（図１５）。
３．タウマチン－Ｉのタウマチン－ＩＩに対する甘味の比較。一般に、タウマチン－Ｉ及びタウマチン－ＩＩは、図１６に示す通り、甘味が非常に類似していた。タウマチン－ＩＩを、マウスコーティングにより特徴づけ、タウマチン－Ｉより持続する長引くあと味を有していた。同時に、タウマチン－Ｉを、いくつかの人工的、化学的、及び渋み特性により特徴づけた。タウマチン－Ｉは、タウマチン－ＩＩより少ないマウスコーティングを有し、あと味に関して、タウマチン－ＩＩ溶液より早く消失した。
観察したタウマチン－Ｉの望ましくない嗜好属性（人工的、化学的、及び渋み特性）を考慮すると、タウマチン－ＩＩは、タウマチン－Ｉより好ましい。
観察したタウマチン－Ｉの望ましくない嗜好属性（人工的、化学的、及び渋み特性）を考慮すると、タウマチン－ＩＩは、タウマチン－Ｉより好ましい。
４．糖のタウマチン－ＩＩを用いた回帰式。スクロース及びタウマチン－ＩＩを含有する試料についての甘味のデータに基づき、ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ． Ｃａｒｙ、ＮＣ）における一般化線形モデルを使用して、線形回帰モデルに合わせた（Little et al. 2002）。得られた回帰式により、標的化した甘味を達成するための、それぞれ、一定量のスクロース又はタウマチン－ＩＩと共に使用すべき、タウマチン－ＩＩ又はスクロースの量の決定が可能になる。
次の回帰式を得た：
甘味＝１．６２＋０．７４×スクロース＋０．２５×タウマチン－ＩＩ＋０．１１×スクロース×タウマチン－ＩＩ
次の回帰式を得た：
甘味＝１．６２＋０．７４×スクロース＋０．２５×タウマチン－ＩＩ＋０．１１×スクロース×タウマチン－ＩＩ
「スクロース」は、質量％の糖スクロースの含有量である。「タウマチン－ＩＩ」は、ｐｐｍ（質量）のタウマチン－ＩＩの含有量である。
溶液の標的化した甘味が、９（１０％スクロースの甘味）である場合、
９＝１．６２＋０．７４×スクロース＋０．２５×タウマチン－ＩＩ＋０．１１×スクロース×タウマチン－ＩＩ
０．７４×スクロース＋０．２５×タウマチン－ＩＩ＋０．１１×スクロース×タウマチン－ＩＩ＝７．３８
一方は、他方を決定するために、糖又はタウマチン－ＩＩのいずれかを一定に維持しなければならない。
表８は、１０％スクロース溶液の甘味と等しい甘味を得るために、ある特定量のスクロースと混合しなければならないタウマチン－ＩＩの量を示す。
溶液の標的化した甘味が、９（１０％スクロースの甘味）である場合、
９＝１．６２＋０．７４×スクロース＋０．２５×タウマチン－ＩＩ＋０．１１×スクロース×タウマチン－ＩＩ
０．７４×スクロース＋０．２５×タウマチン－ＩＩ＋０．１１×スクロース×タウマチン－ＩＩ＝７．３８
一方は、他方を決定するために、糖又はタウマチン－ＩＩのいずれかを一定に維持しなければならない。
表８は、１０％スクロース溶液の甘味と等しい甘味を得るために、ある特定量のスクロースと混合しなければならないタウマチン－ＩＩの量を示す。
実施例１２：ＨＦＣＳのタウマチン－ＩＩでの置き換え
高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）は、コーンスターチから作製した甘味料である。ＨＦＣＳ－５５は、２３％（ｗ／ｗ）の水及び７７％（ｗ／ｗ）の固形物を含有する。固形物は、順に、５５％（ｗ／ｗ）のフルクトース、４１～４２％（ｗ／ｗ）のグルコース及び３～４％（ｗ／ｗ）のグルコースオリゴ糖からなる。ＨＦＣＳ－５５は、食品及び飲み物においてスクロースと容易に置き換えることができるように、スクロースと同じ相対的な甘味を有するように戦略的に設計された（Ｗｈｉｔｅ、２０１４）。
本研究の目的は、対照（水中の１０％スクロース溶液と相関するＨＦＣＳ－５５溶液）と等しいか、又は類似の知覚特性（甘味及び甘味のあと味）を有する、水中のタウマチン－ＩＩ濃度を同定することであった。研究を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、ＧＡ、ＵＳＡにて行った。
高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）は、コーンスターチから作製した甘味料である。ＨＦＣＳ－５５は、２３％（ｗ／ｗ）の水及び７７％（ｗ／ｗ）の固形物を含有する。固形物は、順に、５５％（ｗ／ｗ）のフルクトース、４１～４２％（ｗ／ｗ）のグルコース及び３～４％（ｗ／ｗ）のグルコースオリゴ糖からなる。ＨＦＣＳ－５５は、食品及び飲み物においてスクロースと容易に置き換えることができるように、スクロースと同じ相対的な甘味を有するように戦略的に設計された（Ｗｈｉｔｅ、２０１４）。
本研究の目的は、対照（水中の１０％スクロース溶液と相関するＨＦＣＳ－５５溶液）と等しいか、又は類似の知覚特性（甘味及び甘味のあと味）を有する、水中のタウマチン－ＩＩ濃度を同定することであった。研究を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｇｒｉｆｆｉｎ、ＧＡ、ＵＳＡにて行った。
研究設計
対照技術に由来する違いを組み合わせたハイブリッドの記述的方法及び特性強度評価を使用した。６人の訓練した回答者により、評価を行った。実施例１１に記載した通り決定した、甘味対照についての強度評価（１０％スクロース溶液について甘味９）を使用した。１０％スクロース溶液（１０°ブリックス）、水中の０．１３ｇ／ｍｌ ＨＦＣＳ－５５又は１０％（ｗ／ｗ）ＨＦＣＳ－５５固形物の溶液に関してＨＦＣＳ－５５の均等な甘味を確立し、本研究において使用した。ブリックスの程度（記号°ブリックス）は、水溶液のスクロースの含有量である。１°ブリックスは、溶液１００グラム中のスクロース１グラムであり、質量パーセンテージとしての溶液の強度を表す。１°ブリックスは、溶液１００グラム中のＨＦＣＳ－５５の固形分の１グラムである。
甘味の対照と比較して、試料の強度評価を決定した。０．５ずつ増加する、０～１５ポイントのスケールを使用した。スクロースと異なり、タウマチンの甘味は、よりゆっくりと構築され、５秒後に最大になった。それゆえ、甘味を、試料を口の中に５秒間保持した後に評価した。甘味のあと味の傾向を評価するために、回答者は、２分間２０秒毎にあと味を評価した。オフフィールの辛さを、ＨＦＣＳを有する試料で、回答者は認識した。辛さのあと味を評価するために、回答者は、吐き出した２０秒後のあと味を評価した。評価後の試料の辛さを取り除くために、口蓋洗浄法（クラッカー、０．２％塩水及び必要に応じて、合間に歯ブラシの使用を伴う通常の水）を使用した。タイミングを、パネルリーダーが調節した。試験を５回繰り返した。
対照技術に由来する違いを組み合わせたハイブリッドの記述的方法及び特性強度評価を使用した。６人の訓練した回答者により、評価を行った。実施例１１に記載した通り決定した、甘味対照についての強度評価（１０％スクロース溶液について甘味９）を使用した。１０％スクロース溶液（１０°ブリックス）、水中の０．１３ｇ／ｍｌ ＨＦＣＳ－５５又は１０％（ｗ／ｗ）ＨＦＣＳ－５５固形物の溶液に関してＨＦＣＳ－５５の均等な甘味を確立し、本研究において使用した。ブリックスの程度（記号°ブリックス）は、水溶液のスクロースの含有量である。１°ブリックスは、溶液１００グラム中のスクロース１グラムであり、質量パーセンテージとしての溶液の強度を表す。１°ブリックスは、溶液１００グラム中のＨＦＣＳ－５５の固形分の１グラムである。
甘味の対照と比較して、試料の強度評価を決定した。０．５ずつ増加する、０～１５ポイントのスケールを使用した。スクロースと異なり、タウマチンの甘味は、よりゆっくりと構築され、５秒後に最大になった。それゆえ、甘味を、試料を口の中に５秒間保持した後に評価した。甘味のあと味の傾向を評価するために、回答者は、２分間２０秒毎にあと味を評価した。オフフィールの辛さを、ＨＦＣＳを有する試料で、回答者は認識した。辛さのあと味を評価するために、回答者は、吐き出した２０秒後のあと味を評価した。評価後の試料の辛さを取り除くために、口蓋洗浄法（クラッカー、０．２％塩水及び必要に応じて、合間に歯ブラシの使用を伴う通常の水）を使用した。タイミングを、パネルリーダーが調節した。試験を５回繰り返した。
結果
１．甘味。対照溶液（１０％スクロース）の甘味の強度は、９．０であった。全ての試料は、甘味対照と比較して、有意により高い甘味スコア（Ｐ＜０．０５）を有していた（表９）。１０％スクロース溶液（１０°ブリックス、０．１３ｇ／ｍｌ ＨＦＣＳ－５５）に均等なＨＦＣＳ－５５溶液は、１０．２の甘味を有していた。３０％と４０％ＨＦＣＳの減少した試料の両方について、２ｐｐｍ及び３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、ＨＦＣＳ溶液と類似の甘味強度を有していた。５０％ＨＦＣＳの低減で、５ｐｐｍタウマチンＩＩを有する試料は、ＨＦＣＳ溶液と最も類似する甘味を示した。
１．甘味。対照溶液（１０％スクロース）の甘味の強度は、９．０であった。全ての試料は、甘味対照と比較して、有意により高い甘味スコア（Ｐ＜０．０５）を有していた（表９）。１０％スクロース溶液（１０°ブリックス、０．１３ｇ／ｍｌ ＨＦＣＳ－５５）に均等なＨＦＣＳ－５５溶液は、１０．２の甘味を有していた。３０％と４０％ＨＦＣＳの減少した試料の両方について、２ｐｐｍ及び３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを有する試料は、ＨＦＣＳ溶液と類似の甘味強度を有していた。５０％ＨＦＣＳの低減で、５ｐｐｍタウマチンＩＩを有する試料は、ＨＦＣＳ溶液と最も類似する甘味を示した。
２．ＨＦＣＳのタウマチン－ＩＩを用いた回帰式。ＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ． Ｃａｒｙ、ＮＣ）における一般化線形モデルを使用して、線形回帰モデルに合わせた（Little et al. 2002）。得られた回帰式により、標的化した甘味を達成するための、それぞれ、一定量のＨＦＣＳ又はタウマチン－ＩＩと共に使用すべき、タウマチン－ＩＩ又はＨＦＣＳの量の決定が可能になる。
次の回帰式を得た：
甘味＝８．０７３＋０．２０６×ＨＦＣＳ＋０．１４９×タウマチン－ＩＩ＋０．０１６×ＨＦＣＳ×タウマチン－ＩＩ
この式において、「ＨＦＣＳ」は、ｗ／ｗ又は°ブリックスのＨＦＣＳの％固形分のＨＦＣＳの濃度であり、「タウマチン－ＩＩ」は、ｐｐｍのタウマチン－ＩＩの濃度である。
次の回帰式を得た：
甘味＝８．０７３＋０．２０６×ＨＦＣＳ＋０．１４９×タウマチン－ＩＩ＋０．０１６×ＨＦＣＳ×タウマチン－ＩＩ
この式において、「ＨＦＣＳ」は、ｗ／ｗ又は°ブリックスのＨＦＣＳの％固形分のＨＦＣＳの濃度であり、「タウマチン－ＩＩ」は、ｐｐｍのタウマチン－ＩＩの濃度である。
溶液の標的化した甘味が、１０°ブリックスである場合、
１０＝８．０７３＋０．２０６×ＨＦＣＳ＋０．１４９×タウマチン－ＩＩ＋０．０１６×ＨＦＣＳ×タウマチン－ＩＩ
を、一定のＨＦＣＳ又はタウマチン－ＩＩのいずれかと共に使用して、他方を決定する。
表１０に、１０°ブリックスＨＦＣＳ溶液の甘味と等しい甘味を得るために、一定量のＨＦＣＳと混合するべきタウマチン－ＩＩの量を示す。
１０＝８．０７３＋０．２０６×ＨＦＣＳ＋０．１４９×タウマチン－ＩＩ＋０．０１６×ＨＦＣＳ×タウマチン－ＩＩ
を、一定のＨＦＣＳ又はタウマチン－ＩＩのいずれかと共に使用して、他方を決定する。
表１０に、１０°ブリックスＨＦＣＳ溶液の甘味と等しい甘味を得るために、一定量のＨＦＣＳと混合するべきタウマチン－ＩＩの量を示す。
３．甘味のあと味。スクロース対照と比較して、タウマチン試料は、より長引く甘味のあと味を有していた。対照溶液（１０％スクロース）の甘味のあと味強度は、２０、４０、６０、８０、１００、及び１２０秒で、それぞれ、６、３、２、１、１、及び０．５であった。ＨＦＣＳ溶液の甘味のあと味の値は、２０、４０、６０、８０、１００、及び１２０秒で、それぞれ、７．２、３．７、２．６、１．３、０．８、及び０．６であった。ＨＦＣＳのあと味は、８０秒までスクロース対照より高かった。タウマチン試料を有する減少したＨＦＣＳの全てが、類似の傾向の甘味のあと味を示した（表１１；図１７）。
４．辛さ。ＨＦＣＳを含有する溶液で、オフフィールの辛さを示した。ＨＦＣＳ溶液の辛さは、４であった。タウマチン－ＩＩ溶液を添加した減少したＨＦＣＳの全てが、ＨＦＣＳ溶液より低い辛さレベルを示した（表１２）。３０％ＨＦＣＳの減少した試料について、試料の辛さは、タウマチン－ＩＩのレベルが高いほど増大した。ＨＦＣＳが４０％及び５０％減少した試料に対して示した、タウマチンレベルの辛さに対する効果はなかった。
結論
１０％スクロース溶液（１０°ブリックス）に均等であるＨＦＣＳ－５５の濃度は、０．１３ｇ／ｍＬ ＨＦＣＳ５５であった。この溶液は、対照溶液より１．２ポイント甘かった（０～１５ポイントのスケールで甘味９）。スクロース溶液と異なり、ＨＦＣＳ溶液は、４のオフフィール（舌の辛さ）を有していた。
ＨＦＣＳ試料は、スクロース試料（２ｐｐｍタウマチン－ＩＩ）より多くのタウマチン－ＩＩ（３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩ）を必要とし、これは、３０～４０％の減少を伴った。しかしながら、５０％の減少で、均等な甘味の強度に必要なタウマチン－ＩＩの量は、ＨＦＣＳとスクロース試料の両方について類似していた。３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを加えたとき、ＨＦＣＳを有する試料の甘味の増大は、スクロース試料より大きかった。しかしながら、５ｐｐｍ又は７ｐｐｍタウマチン－ＩＩを加えると、甘味の強度の増大は、スクロースを有する試料についてより大きかった。
辛さは、ＨＦＣＳ溶液で示した特有のオフフィールであった。ＨＦＣＳの量が減少するため、辛さのレベルもまた減少する。タウマチン－ＩＩをそのＨＦＣＳが減少した試料に加えると、試料の辛さは増大するが、ＨＦＣＳ対照より低かった。
１０％スクロース溶液（１０°ブリックス）に均等であるＨＦＣＳ－５５の濃度は、０．１３ｇ／ｍＬ ＨＦＣＳ５５であった。この溶液は、対照溶液より１．２ポイント甘かった（０～１５ポイントのスケールで甘味９）。スクロース溶液と異なり、ＨＦＣＳ溶液は、４のオフフィール（舌の辛さ）を有していた。
ＨＦＣＳ試料は、スクロース試料（２ｐｐｍタウマチン－ＩＩ）より多くのタウマチン－ＩＩ（３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩ）を必要とし、これは、３０～４０％の減少を伴った。しかしながら、５０％の減少で、均等な甘味の強度に必要なタウマチン－ＩＩの量は、ＨＦＣＳとスクロース試料の両方について類似していた。３．５ｐｐｍタウマチン－ＩＩを加えたとき、ＨＦＣＳを有する試料の甘味の増大は、スクロース試料より大きかった。しかしながら、５ｐｐｍ又は７ｐｐｍタウマチン－ＩＩを加えると、甘味の強度の増大は、スクロースを有する試料についてより大きかった。
辛さは、ＨＦＣＳ溶液で示した特有のオフフィールであった。ＨＦＣＳの量が減少するため、辛さのレベルもまた減少する。タウマチン－ＩＩをそのＨＦＣＳが減少した試料に加えると、試料の辛さは増大するが、ＨＦＣＳ対照より低かった。
実施例１３：減少した炭水化物含有量を有する甘いフルーツレモネードの調製
甘い清涼飲料は、典型的には、約１０％の糖又は均等な量のＨＦＣＳを含有する。平均で、１００％の果汁はまた、約１０％の糖を含有する。
１０％スクロースを含有するが、５０％の減少したスクロース含有量を有する清涼飲料と同じ甘味を有するフルーツレモネード１リットルを調製するために、濾過した１００％のフルーツジュース１００ｍｌ、クエン酸１．５ｇ、糖４０ｇ、タウマチン－ＩＩ４．６ｍｇを一緒に混合し、ミネラルウォーターを用いて１リットルの体積に調製してもよい。様々な果物からの果汁を、単独又は混合物：オレンジ、マンダリン、リンゴ、ナシ、チェリー、キイチゴ、クランベリー、クラフサグリ、プラムなどで使用することができる。任意選択で、レモネードを、圧縮二酸化炭素を注入することによって、炭酸化することができる。
甘い清涼飲料は、典型的には、約１０％の糖又は均等な量のＨＦＣＳを含有する。平均で、１００％の果汁はまた、約１０％の糖を含有する。
１０％スクロースを含有するが、５０％の減少したスクロース含有量を有する清涼飲料と同じ甘味を有するフルーツレモネード１リットルを調製するために、濾過した１００％のフルーツジュース１００ｍｌ、クエン酸１．５ｇ、糖４０ｇ、タウマチン－ＩＩ４．６ｍｇを一緒に混合し、ミネラルウォーターを用いて１リットルの体積に調製してもよい。様々な果物からの果汁を、単独又は混合物：オレンジ、マンダリン、リンゴ、ナシ、チェリー、キイチゴ、クランベリー、クラフサグリ、プラムなどで使用することができる。任意選択で、レモネードを、圧縮二酸化炭素を注入することによって、炭酸化することができる。
１０％（ｗ／ｖ）ＨＦＣＳ－５５を含有するが、５０％の減少したＨＦＣＳ－５５含有量を有する清涼飲料と同じ甘味を有するフルーツレモネード１リットルを調製するために、濾過した１００％のフルーツジュース１００ｍｌ、クエン酸１．５ｇ、ＨＦＣＳ－５５ ４０ｇ、タウマチン－ＩＩ３．９ｍｇを一緒に混合し、ミネラルウォーターを用いて１リットルの体積に調製してもよい。様々な果物からの果汁を、単独又は混合物：オレンジ、マンダリン、リンゴ、ナシ、チェリー、キイチゴ、クランベリー、クラフサグリ、プラムなどで使用することができる。任意選択で、レモネードを、圧縮二酸化炭素を注入することによって、炭酸化することができる。
参考文献
ヌクレオチド及びアミノ酸配列
配列番号１ タウマトコッカス・ダニエリプレプロタウマチン－Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ４４５６７．１）のアミノ酸配列
配列番号１ タウマトコッカス・ダニエリプレプロタウマチン－Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＦ４４５６７．１）のアミノ酸配列
配列番号２ プレプロタウマチン－Ｉ、完全ｃｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ２６５６９０．１）のタウマトコッカス・ダニエリｍＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号３ タウマトコッカス・ダニエリプレプロタウマチン－ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９５．１）のアミノ酸配列
配列番号４ プレプロタウマチン－ＩＩ、完全ｃｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０１２０９．１）のタウマトコッカス・ダニエリｍＲＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５ タウマトコッカス・ダニエリタウマチン－Ｉ成熟タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＬ８３９６４．１）のアミノ酸配列
配列番号６ タウマトコッカス・ダニエリタウマチン－ＩＩ成熟タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ９３０９５．１）のアミノ酸配列
配列番号７ プレプロタウマチン－Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３５５０９８．１）のタウマトコッカス・ダニエリｍＲＮＡの成熟タンパク質をコードするフラグメントのヌクレオチド配列
配列番号８ プレプロタウマチン－ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０１２０９．１）のタウマトコッカス・ダニエリｍＲＮＡの成熟タンパク質をコードするフラグメントのヌクレオチド配列
配列番号９ アルファ－アミラーゼ及び成熟タウマチン－Ｉのオリゼ・サティバＲＡｍｙ３Ａ遺伝子由来のＮ末端のアポプラスト標的配列の翻訳融合物のヌクレオチド配列
配列番号１０ アルファ－アミラーゼ及び成熟タウマチン－ＩＩのオリゼ・サティバＲＡｍｙ３Ａ遺伝子由来のＮ末端のアポプラスト標的配列の翻訳融合物のヌクレオチド配列
配列番号１１ ｐＮＭＤ４０５０２のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
配列を、配列表に提供する。
配列番号１２ ｐＩＣＨ９５３９７のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
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配列番号１３ ｐＮＭＤ４０５２３のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
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配列番号１４ ｐＮＭＤ３８０６１のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
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配列番号１２ ｐＩＣＨ９５３９７のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
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配列番号１３ ｐＮＭＤ４０５２３のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
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配列番号１４ ｐＮＭＤ３８０６１のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列
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本特許出願は、２０２０年７月１６日に出願された欧州特許出願第２０１８６３２３．０号の優先権を主張し、その全体が、明細書、全ての請求項、配列表、及び図面を含み、ここで参照により取り込まれる。
Claims (43)
- タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチン、並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
さらにより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
さらにより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチン：前記糖の質量比で含む、食品等の経口摂取用の製品。 - 製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは３～１０質量％、より好ましくは４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含み；並びに／又は
製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンである、
請求項１に記載の経口摂取用の製品。 - 製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは３～１０質量％、より好ましくは、４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含み；かつ
製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンである、
請求項１に記載の経口摂取用の製品。 - タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチン、並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を、１：１０，０００～１：３５，０００の前記タウマチンと前記糖の質量比で含み、
製品の総質量に対して、４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖、並びに
製品の総質量当たり３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンをさらに含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンである、食品等の経口摂取用の製品。 - 製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチン、並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１つのタウマチンである、経口摂取用の製品。
- 製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは３～１０質量％、より好ましくは４～８質量％のスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含む、請求項１又は５に記載の経口摂取用の製品。
- 前記少なくとも１種の糖が、グルコース及びフルクトースからなる群から選択され、スクロースを含有しない、請求項１～６のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
- グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を含有する高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
- ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、請求項８に記載の経口摂取用の製品。
- ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８％～７５％の溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する、請求項８又は９に記載の経口摂取用の製品。 - タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチン、並びにグルコース及びフルクトースからなる群から選択される糖を含み、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
さらにより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
さらにより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
の前記タウマチン：前記糖の質量比で含む、食品等の経口摂取用の製品。 - 製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは３～１０質量％、より好ましくは４～８質量％のグルコース及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含み；並びに／又は
製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンである、請求項１１に記載の経口摂取用の製品。 - 製品の総質量に対して、２～１２質量％、好ましくは３～１０質量％、より好ましくは４～８質量％のグルコース及びフルクトースからなる群から選択される前記糖を含み；かつ
製品の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンである、請求項１１に記載の経口摂取用の製品。 - グルコース及びフルクトースからなる群から選択される前記少なくとも１種の糖として高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
- 飲み物、飲み物用粉末、飲料、清涼飲料、ヨーグルト、ジャム、マーマレード、シロップ等の飲料濃縮液、デザート、ケーキ、ビスケット、クッキー、チョコレート、キャンディー、菓子、砂糖菓子、チューインガム、カスタード、プディング、ゼリー、フィリングゼリー、ペストリー、パイ、あめ玉、加工食品、シリアル、焼成製品、又は医薬；ワイン若しくはビール又は他の発酵若しくは蒸留された飲み物、ポテトベースのスナック、朝食用シリアル、チューインガム、アイスクリーム、ココア及びチョコレート製品、ブレスミント、糖デコレーション若しくはアイシング、コーティング若しくはフィリング、上質なベーカリーの品物、食品添加物又は食卓用甘味料である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の経口摂取用の製品。
- 経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物であって、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチン、並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を含む、組成物。
- グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を含有し、スクロースを含有しない、請求項１６に記載の組成物。
- 経口摂取用の製品を製造するのに適した組成物であって、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のタウマチンと、グルコース及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を含む高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）とを含む、組成物。
- 組成物の総質量当たり１～１３ｐｐｍ、好ましくは、組成物の総質量当たり３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１種のタウマチンを含有する、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記少なくとも１種のタウマチン及び前記少なくとも１種の糖を、
１：２，０００～１：８０，０００、
好ましくは、１：４，０００～１：６５，０００、
より好ましくは、１：６，０００～１：５５，０００、
さらにより好ましくは、１：８，０００～１：４５，０００、
さらにより好ましくは、１：１０，０００～１：３５，０００
のタウマチン：糖の質量比で含有する、請求項１６～１９のいずれか１項に記載の組成物。 - 組成物の総質量当たり１０～１００ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１種のタウマチン、及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは４０～９８質量％、より好ましくは５０～９０質量％、さらにより好ましくは６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１種の糖を含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の組成物。
- 組成物の総質量当たり３０～７０ｐｐｍの範囲の前記少なくとも１種のタウマチン、及び組成物の総質量当たり３０～９９．９質量％、好ましくは４０～９８質量％、より好ましくは５０～９０質量％、さらにより好ましくは６０～８０質量％の範囲の前記少なくとも１種の糖を含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記経口摂取用の製品のためのさらなる成分を含み、前記成分が、クエン酸又はその塩、ビタミン、無機塩、微量元素、カフェイン、タウリン、ゲル化剤又は増粘剤、香味剤、及び保存剤からなる群から選択される１種又は複数の成分である、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ビタミンが、アスコルビン酸若しくはその塩、ビタミンＢファミリーのビタミン、若しくはトコフェロール若しくはその誘導体から選択される１種若しくは複数であり；前記無機塩が、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、及びカルシウム塩から選択され；並びに／又は前記微量元素が、亜鉛化合物、鉄化合物、若しくは銅化合物である、請求項２３に記載の組成物。
- ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳ－４２、ＨＦＣＳ－５５、ＨＦＣＳ－６５、ＨＦＣＳ－７０又はＨＦＣＳ－９０である、請求項１８に記載の組成物。
- ＨＦＣＳが、ＨＦＣＳの総質量当たり２２～２５質量％の水及び７８～７５質量％の溶解又は分散された固形物を含有し、
前記固形物が、固形物の総質量当たり１５～９２質量％のフルクトース、８～８５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有し、好ましくは、前記固形物が、固形物の総質量当たり４０～６５質量％のフルクトース、３０～５５質量％のグルコース、及び０～７質量％のグルコースオリゴ糖を含有する、請求項１８又は２５に記載の組成物。 - 前記タウマチンが、タウマチンＩＩである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の製品又は組成物。
- 甘味組成物としての、請求項１６～２７のいずれか１項において定義される組成物の使用。
- 経口摂取用の製品を調製するための、請求項１６～２７のいずれか１項において定義される組成物の使用。
- 経口摂取用の製品のカロリー含有量を低減するための、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択されるタウマチン、好ましくは、タウマチンＩＩの使用。
- 経口摂取用の製品における糖の含有量を低減する方法であって、前記糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種であり、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えることを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
- スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖の含有量が、経口摂取用の製品において最大５０％低減され、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えることを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
- 経口摂取用の製品における糖の含有量を最大５０％低減する方法であって、前記糖が、スクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種であり、前記糖の一部を、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍ、好ましくは３ｐｐｍ～７ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えることを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
- 経口摂取用の製品における甘味料としてタウマチンを使用する方法であって、前記製品の前駆体に、タウマチンを前記製品の総質量当たり１ｐｐｍ～１３ｐｐｍの範囲で加えることを含み、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
- 経口摂取用の製品を製造する方法であって、請求項１６～２７のいずれか１項に記載の組成物を他の成分と混合して、前記製品を製造することを含む、方法。
- 経口摂取用のＨＦＣＳ含有製品の辛味を低減する方法であって、タウマチンを前記ＨＦＣＳ含有製品のプレ製品に加えることを含み、前記プレ製品が、低減した含有量のＨＦＣＳを有し、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
- 経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法であって、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換えることを含み、得られた製品におけるＨＦＣＳの固形分の含有量が、得られた製品の総質量当たり４～８質量％、好ましくは５～７質量％に低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
- 経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減する方法であって、ＨＦＣＳの一部をタウマチンで置き換えることを含み、得られた製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量が、３０～５０％低減され、得られた製品の総質量当たり２ｐｐｍ～３．５ｐｐｍの範囲のタウマチンで置き換えられ、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、方法。
- 製品におけるＨＦＣＳ固形物の含有量を、得られた製品の総質量当たり４～８質量％、好ましくは５～７質量％に低減し、得られた製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを加えることにより、経口摂取用の製品における高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）の辛味を低減するためのタウマチンの使用であって、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、使用。
- 高フルクトースコーンシロップ（ＨＦＣＳ）が、ＨＦＣＳ－５５である、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法又は請求項３９に記載の使用。
- 製品の総質量当たり５～７質量％のＨＦＣＳ固形物及び製品の総質量当たり１ｐｐｍ～４．５ｐｐｍの範囲のタウマチンを含有する、経口摂取用の製品であって、ＨＦＣＳ固形物が、高フルクトースコーンシロップの固形分であり、タウマチンが、タウマチンＩ及びタウマチンＩＩからなる群から選択される、経口摂取用の製品。
- 前記タウマチンが、そのアミノ酸配列が配列番号５若しくは配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号５若しくは配列番号６のアミノ酸配列における１～３個のアミノ酸置換、付加、欠失、及び／若しくは挿入を有するアミノ酸配列であるポリペプチドを含むタンパク質であり、前記タウマチンが、好ましくは、ニコチアナ種から抽出される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の製品、組成物、使用又は方法。
- タウマチンＩ及びタウマチンＩＩから選択されるタウマチン、並びにスクロース、グルコース、及びフルクトースからなる群から選択される少なくとも１種の糖を含む植物抽出物であって、好ましくは、タウマトコッカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌｌｉｉ）植物の抽出物ではない、抽出物。
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