CN110373338A - 酿酒酵母及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018062，分类命名为：Saccharomyces cerevisiae HEC‑YLK，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心。该菌株是发明人首次从传统酒曲中分离和诱变获得的，该菌株具有高产角鲨烯的特点。

Description

酿酒酵母及其用途

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及酿酒酵母、用途及生产角鲨烯的方法。

背景技术

角鲨烯(Squalene)是一种开链三萜类化合物。其化学名为：全反-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯。角鲨烯在工业、医药、化妆品领域有着广泛的用途。在工业上，角鲨烯可用于食品机械设备中润滑剂、杀虫剂、衣物护理剂等；在医药行业可用作药物载体、疫苗佐剂，也可用于提高人体的缺氧耐受能力；在化妆品领域，主要用作皮肤保湿剂、抗氧化剂。

角鲨烯的天然来源主要包括鱼油，植物油，微生物。其中在鱼油中，尤其是鲨鱼肝油中含量较高，这也是目前市场上提取角鲨烯的主要来源。但是随着海洋资源的大肆捕捞，导致了生态环境的破坏，从鲨鱼中大量提取角鲨烯的方法是不可持续的；而一些制药公司在采用角鲨烯做疫苗佐剂时需要避免动物源病原体的对产品的干扰，也不主张采用鲨鱼提取的角鲨烯。一些植物油中也含有角鲨烯，如橄榄油、大豆油、山茶油和米糠油。如橄榄油含有角鲨烯150～700mg/100g，米糠油含量为332mg/100g，目前国际上一些知名品牌的化妆品中所采用的角鲨烯原料就为橄榄油中提取。由于植物油中角鲨烯含量低，其使用成本较高。微生物也是角鲨烯的一个来源，如从微藻中提取《CN102787074B，罗盖特兄弟公司，生产角鲨烯的微藻新菌株》，另外，酵母也是被研究用于产角鲨烯的来源。酵母菌具有个体微小，结构简单，生长繁殖速度快，容易进行大规模发酵放大等特点。如赛诺菲申请了从发酵酵母中提取角鲨烯的方法《CN105431542A，从发酵的酵母的细胞悬浮液中生产角鲨烯和/或甾醇》；诺华《CN102257149B由超产酵母生产角鲨烯》中采用酿酒酵母生产的角鲨烯开发了一种制备水包油乳液佐剂的方法，用于疫苗中佐剂使用；中国科学院青岛生物能源与过程研究所，申请了《一种高产角鲨烯的类酵母菌及其应用，CN104560731A》的专利，从海洋中分离到了一株类酵母菌用于发酵生产角鲨烯。

酿酒酵母作为一种生物安全性良好的菌株，用于角鲨烯的生产具有很好的优势，然而，目前的酿酒酵母发酵产角鲨烯的含量都较低，生产成本较高。例如Bhattacharjee(P,B.,et al.,Studies on fermentative production of squalene.World Journal ofMicrobiology&Biotechnology,2001.17(8):p.811-816.)等以酿酒酵母和糖蜜中分离到的德氏孢圆酵母厌氧发酵生产角鲨烯，结果表明，酿酒酵母和德氏孢圆酵母中角鲨烯的产量分别为41.2μg/g和237.2μg/g干细胞。Mantzouridou等人通过对酿酒酵母BY4741和EGY48进行发酵条件的优化，结果角鲨烯最高产量也仅有1241μg/g和1155μg/g干细胞(Mantzouridou,F.,E.Naziri,and M.Z.Tsimidou,Squalene versus ergosterolformation using Saccharomyces cerevisiae:combined effect of oxygen supply,inoculum size,and fermentation time on yield and selectivity of thebioprocess.J Agric Food Chem,2009.57(14):p.6189-98.)。

因此，筛选角鲨烯生产能力强的酿酒酵母对于工业化生产微生物来源的角鲨烯具有重要意义。

发明内容

本申请是发明人基于对如下问题和事实的发现而提出的：

本申请的发明人从传统酒曲中分离的数十株酿酒酵母筛选出一株生长速度快且角鲨烯产量较高的菌株，经过APTP诱变后，成功筛选到一株角鲨烯产量提高的酿酒酵母突变体HEC-YLK。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，于2018年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018062，分类命名为：Saccharomyces cerevisiae HEC-YLK，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心。该菌株(在本申请中命名为HEC-YLK)是发明人首次从传统酒曲中分离和诱变获得的，该菌株具有高产角鲨烯的特点，例如，该菌株在普通YPD摇瓶培养基中进行72h发酵，其菌体中的角鲨烯含量即可达到2-3mg/g。

在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的酿酒酵母在生产角鲨烯中的用途。本发明筛选到的高产角鲨烯诱变菌株，在未经任何基因工程改造的情况下，经过较短短周期发酵即可获得角鲨烯的高产，具有产业化应用潜力。

在本发明的第三发明，本发明提出了一种生产角鲨烯的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：在适于角鲨烯表达的条件下，培养权利要求1所述的酿酒酵母，以便获得含有所述角鲨烯的培养物。根据本发明实施例的方法，经过较短短周期发酵即可获得角鲨烯的高产。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述培养是在YPD培养基或无机盐培养基中进行的。

具体地，所述YPD培养基中含有20g/L葡萄糖，20g/L大豆蛋白胨，10g/L酵母浸粉；

具体地，所述无机盐培养基中含有30g/L葡萄糖，7g/L硫酸铵，2g/L酵母粉，2g/L蛋白胨，10g/L玉米浆，5g/L磷酸二氢钾，2g/L硫酸镁，1g/L硫酸锌，200mg/L维生素B1，200mg/L维生素B3，200mg/L维生素B6。

其中，前面的百分比表示质量体积比，如30g/L葡萄糖表示1L无机盐培养基中含有30g的葡萄糖。发明人通过实验发现，在上述YPD培养基或无机盐培养基中，所述酿酒酵母的生物量较高，代谢产物-角鲨烯的单位产量较高。

根据本发明的实施例，所述培养是在YPD培养基中进行发酵培养，所述发酵培养是在pH为5～6、培养体系的葡萄糖浓度为0.5～1.5g/L的条件下进行3～5天。酿酒酵母在上述条件下进行培养，代谢产物角鲨烯的单位含量显著提高，代谢产物角鲨烯的总产量显著提高。

根据本发明的具体实施例，所述培养是在YPD培养基中进行发酵培养，采用流加葡萄糖的方式补充碳源，所述培养体系中葡糖浓度控制在0.5～1.5g/L，采用氨水调节发酵体系pH，所述pH控制在5～6。

根据本发明的实施例，所述培养是在无机盐培养基中进行发酵培养，所述发酵培养是在pH为5～6、培养体系的乙醇浓度不高于3g/L的条件下进行3～5天。酿酒酵母在上述条件下进行培养，代谢产物角鲨烯的单位含量显著提高，代谢产物角鲨烯的总产量显著提高。

根据本发明的具体实施例，所述培养是在无机盐培养基中进行发酵培养，所述发酵开始后的40小时内，采用流加葡萄糖的方式补充碳源，所述发酵开始后的40小时后，采用流加乙醇的方式补充碳源，所述培养体系中乙醇浓度控制在不高于3g/L，所述发酵开始后的中期，采用氨水调节发酵体系pH，所述pH控制在5～6。

根据本发明的实施例，所述发酵处理前，进一步包括将所述酿酒酵母进行活化处理。进而可提高酿酒酵母的活力，进一步提高代谢产物角鲨烯的单位含量和总含量。

根据本发明的具体实施例，所述活化处理是通过如下方式进行的：将预先保存至-80℃的酿酒酵母接种至50ml YPD培养基中，在30℃，250rpm的条件下进行12h的一级活化处理，以便获得一级种子；将所述一级种子按照5％接种量转接至另一50ml YPD培养基中，在30℃，250rpm的条件下进行7h的二级活化处理，以便获得二级种子。

另外，根据本发明的实施例，所述生产角鲨烯的方法进一步包括：从获得的含有所述角鲨烯的培养物中分离和提取角鲨烯。分离和提取角鲨烯的方法不受特别限制，本领域技术人员可根据常规技术手段，依据实验室或工业生产的需求，进行选择。

附图说明

图1是根据本发明实施例的酿酒酵母的显微形态照片；

图2是根据本发明实施例的ARTP诱变对酵母的致死率考察结果；以及

图3是根据本发明实施例的HEC-YLK产角鲨烯的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明所要解决的技术问题是：目前报道的微生物发酵法产角鲨烯含量都很低，进行发酵生产角鲨烯的成本过高。若能得到高产角鲨烯的酵母菌株，则其将具产业化应用的前景。

为此，本申请的发明人从传统酒曲中分离的数十株酿酒酵母筛选出一株生长速度快且角鲨烯产量较高的菌株，经过APTP诱变后，筛选到一株角鲨烯产量提高的突变体HEC-YLK。为了以较快速度筛选出正向突变的菌株，本申请的发明人采用了角鲨烯环氧化酶抑制辅助筛选的方法进行筛选。因而，本发明提供一种快速筛选高产角鲨烯酿酒酵母突变体的方法。进一步，提供一株经过诱变得到的高产角鲨烯酿酒酵母。

根据本发明的实施例，本发明包含了下述内容：

1、一株高产角鲨烯的酿酒酵母，该酵母为采用ARTP诱变得到的一株高产突变体HEC-YLK已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2018062，保藏日期为2018年1月29日。该菌株在普通YPD摇瓶培养基中进行72h发酵，其干菌体中的角鲨烯含量即可达到2-3mg/g。

2、筛选角鲨烯高产突变体菌株的方法。将诱变后的细胞在YPD培养基中预培养12h后，涂布在含0.5mg/L抗真菌剂特比萘芬(terbinafine)的YPD固体平板上，筛选生长速度相对较快的菌落用于进一步的摇瓶发酵，并分别测定各发酵菌株中角鲨烯的含量，筛选出角鲨烯产量最高的菌株。

3、高密度发酵突变体菌株生产角鲨烯的方法。将筛选出的高产酵母菌株采用在液体培养基中高密度发酵，采用分阶段补不同碳源的方式促进角鲨烯的形成。在发酵前期采用葡萄糖作为基础料碳源和补料用碳源，待发酵30-40小时后改用乙醇作为碳源进行补料发酵至发酵结束。

本发明的效果：

本发明筛选到的高产角鲨烯诱变菌株，在未经任何基因工程改造的情况下，经过较短短周期发酵即可获得角鲨烯的高产，具有产业化应用潜力。

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1酒曲中酵母的分离及角鲨烯含量测定

样品采集：2015年12月份，分别在湖南永州、山东郓城、云南嵩明和广东乳源四个地方的乡下集市上购买了农家酒曲，带回实验室冰箱4℃暂存。

1)分离纯化：将上述四个酒曲样品，分别取1g加入到10ml无菌生理盐水中，混匀，在YPD平板上划线分离，于30℃静置培养48h，挑选出表面光滑、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘都很均一的单菌落，分别再进行YPD平板二次划线分离，于30℃静置培养48h。挑选分离后单菌落形态一致的平板，镜检初步确认为酵母，选取其中生长良好的单菌落划线扩培，一部分用于保存菌种，一部分用于摇瓶发酵检测角鲨烯含量。

2)摇瓶发酵：将上述分离纯化的菌种接种到含有5ml YPD液体培养基的PA瓶中，30℃，220rpm进行培养过夜。再按照5‰的接种量转接新鲜的YPD摇瓶中，30℃，220rpm连续培养3天。第三天取样测菌体的OD值。

3)角鲨烯含量测定：

由于角鲨烯是脂溶性物质，结合在细胞膜系统上，因此需要先将细胞破壁，用于角鲨烯的提取。流程如下：取发酵后培养物1mL到5ml离心管中，离心去上清收集菌体；然后加入1ml的3M浓度盐酸，在沸水浴中处理3min，破坏酵母细胞壁；将处理过后的细胞在冰水浴中冷却1min，离心去上清，并用纯水水洗2遍去除残余的盐酸；最后加入1ml丙酮，上下震荡萃取其中的角鲨烯。

与此同时，相同的1ml培养物离心、纯水洗涤1遍后80℃烘干至恒重。

HPLC检测：采用Welch-XB-C30(4.6*250mm)色谱柱，210nm，甲基叔丁基醚：乙腈＝5：95，等度洗脱。采用外标法计算提取物中角鲨烯的总量。菌体中角鲨烯含量计算：1ml培养物角鲨烯总量/1ml细胞干重。

将来自四个不同地方酒曲的酵母菌株分别YPD摇瓶考察10个单菌落，比较菌体生长速度和角鲨烯产量，选择产量最高的一株X8(来自山东郓城，摇瓶产量1.22mg/g干菌体)，作为后期诱变筛选的出发菌株。

实施例2菌种的鉴定

将实施例1中保存的已分离菌种进一步做形态学鉴定和分子生物学鉴定，步骤如下：

外观形态鉴定：将保存的X8菌种在YPD平板培养基上划线分离单菌落，观察菌落形态为球形突起，表面光滑、不透明、奶油状；有酒香味；进一步将菌落进行活体镜检，方法为取少量无菌水滴在载玻片上，然后取少量菌体与无菌水混匀，再加上盖玻片，直接进行观察，油镜下可以看到卵形细胞，直径5-10μm，部分有典型的酵母芽体。具体形态见附图1，结合上述外观表型及最初筛选来源，可初步确定得到此菌株为酿酒酵母。

分子鉴定：以X8菌株基因组为模板，采用真菌rDNA鉴定通用引物ITS1(SEQ ID NO：1)和ITS4(SEQ ID NO：2)，Takara公司primeSTAR酶进行核糖体DNA区段的PCR扩增，经过测序得到，得到如SEQ ID NO：3所示序列，该序列在NCBI比对，结果显示为酿酒酵母。

TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID NO:1)。

TCCTCCGCTTATTGATATGC(SEQ ID NO：2)。

TTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTT(SEQ ID NO：3)。

实施例3酿酒酵母的ARTP诱变筛选

以角鲨烯产量最高的X8酿酒酵母为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变系统ARTP-M进行诱变。

首先进行诱变条件的考察：先将X8菌种制备成菌悬液，然后取10μL涂布诱变仪配套的载片，共涂16个，然后分别进行ARTP诱变处理0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s和70s,每个处理时间设两个平行，再将诱变处理的载样片放进1mL生理盐水中振荡洗脱菌体，最后用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布YPD平板进行菌落计数。统计致死率结果见附图2。由图可知在诱变处理40s条件下菌株的致死率在95％左右，50s及以上的处理时间则基本致死率在100％，所以确定最佳诱变处理时间为40s。将初筛的X8菌株进行菌悬液制备，取10uL涂布诱变处理载样片，采用40s ARTP诱变处理，处理完立即用生理盐水将载样片上的菌体洗脱制成诱变菌株母液。

高产角鲨烯突变菌株的平板筛选：特比萘芬是一种真菌抑制剂，它可抑制真菌的角鲨烯环氧化酶，该酶是真菌细胞膜中麦角固醇合成中的关键酶之一，故本药可干扰麦角固醇的生物合成，使真菌细胞内角鲨烯的过度堆积和麦角固醇的合成受阻。将诱变后的菌涂于含特比萘芬的平板上，能生长或者生长较快的菌可能是1)角鲨烯环氧化酶发生了突变的菌株；2)或者是细胞角鲨烯合成途径增强的菌株，即使抑制剂存在，由于相对较高的底物浓度，部分未被抑制的角鲨烯环氧化酶仍然可以合成充足的下游代谢产物，以及麦角固醇，保证细胞的正常生长。

将诱变后的菌株母液在YPD培养基中预培养12h后，涂布在含0.5mg/L抗真菌剂特比萘芬(terbinafine)的YPD固体平板上，大部分细胞由于真菌抑制剂的存在，细胞不能生长。筛选生长速度相对较快的菌落50株用于进一步分别测定各发酵菌株中角鲨烯的含量，筛选出角鲨烯产量最高的菌株。

将上述获得的50株菌分别在YPD液体培养基里活化过夜，然后按1％接种至装有50mlYPD培养基的三角瓶中，30℃，250rpm培养72h。然后收集酵母细胞，破碎，萃取得到角鲨烯，按照实施例1的角鲨烯含量测定方法进行细胞中角鲨烯含量测定，其中菌体中的角鲨烯含量最高的菌株角鲨烯含量为2.27mg/g，将该菌株命名为HEC-YLK。HEC-YLK产角鲨烯HPLC图谱如图3所示。

实施例4YPD补料发酵罐实验

将-80℃保存的HEC-YLK甘油种子接种至50ml YPD培养基中，30℃，250rpm培养12h活化，获得一级种子；再按5％接种量转接至新的50ml YPD培养基中按上述条件培养7h后，获得二级种子；接着向装有3LYPD发酵培养基的5L发酵罐中接入已活化的二级种子。发酵过程中，采用流加葡萄糖补充碳源，采用氨水将pH控制在5-6之间，补料过程控制残糖在1g/L左右，发酵3天，最终生物量(OD600)达到143OD，角鲨烯产量155mg/L，酵母细胞中角鲨烯含量达到3.26mg/g；

实施例5无机盐补料发酵实验

将-80℃保存的HEC-YLK甘油种子接种至50ml YPD培养基中，30℃，250rpm培养12h活化，获得一级种子；再按5％接种量转接至新的50ml YPD培养基中按上述条件培养7h后，获得二级种子；接着向装有3L无机盐发酵培养基(葡萄糖30g/L，硫酸铵7g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锌1g/L，维生素B1 200mg/L，维生素B3 200mg/L，维生素B6 200mg/L)的5L发酵罐中接入已活化的二级种子。发酵过程中，前期采用葡萄糖作为基础料碳源和补料用碳源，待发酵40小时后改用乙醇作为碳源进行补料，发酵罐中乙醇浓度控制在3g/L以下，中途采用氨水将pH控制在5-6之间，发酵3天，最终生物量(OD600)达到255OD，角鲨烯产量458mg/L，酵母细胞中角鲨烯含量达到5.97mg/g。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞东阳光药物研发有限公司

<120> 酿酒酵母及其用途

<130> PIDC4190118

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 真菌rDNA鉴定通用引物ITS1序列

<400> 1

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<210> 2

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<212> DNA

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<223> 真菌rDNA鉴定通用引物ITS4序列

<400> 2

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<211> 572

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 酿酒酵母rDNA序列

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ttgttttggc aagagcatga gagcttttac tgggcaagaa gacaagagat ggagagtcca 60

gccgggcctg cgcttaagtg cgcggtcttg ctaggcttgt aagtttcttt cttgctattc 120

caaacggtga gagatttctg tgcttttgtt ataggacaat taaaaccgtt tcaatacaac 180

acactgtgga gttttcatat ctttgcaact ttttctttgg gcattcgagc aatcggggcc 240

cagaggtaac aaacacaaac aattttattt attcattaaa tttttgtcaa aaacaagaat 300

tttcgtaact ggaaatttta aaatattaaa aactttcaac aacggatctc ttggttctcg 360

catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata cgtaatgtga attgcagaat tccgtgaatc 420

atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca gggggcatgc ctgtttgagc 480

gtcatttcct tctcaaacat tctgtttggt agtgagtgat actctttgga gttaacttga 540

aattgctggc cttttcattg gatgtttttt tt 572

Claims (9)

1.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2018年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018062。

2.权利要求1所述的酿酒酵母在生产角鲨烯中的用途。

3.一种生产角鲨烯的方法，其特征在于，包括：

在适于角鲨烯表达的条件下，培养权利要求1所述的酿酒酵母，以便获得含有所述角鲨烯的培养物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养是在YPD培养基或无机盐培养基中进行的，

任选地，所述YPD培养基中含有20g/L葡萄糖，20g/L大豆蛋白胨，10g/L酵母浸粉；

任选地，所述无机盐培养基中含有30g/L葡萄糖，7g/L硫酸铵，2g/L酵母粉，2g/L蛋白胨，10g/L玉米浆，5g/L磷酸二氢钾，2g/L硫酸镁，1g/L硫酸锌，200mg/L维生素B1，200mg/L维生素B3，200mg/L维生素B6。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养是在YPD培养基中进行发酵培养，所述发酵培养是在pH为5～6、培养体系的葡萄糖浓度为0.5～1.5g/L的条件下进行3～5天。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用流加葡萄糖的方式补充碳源，所述培养体系中葡糖浓度控制在0.5～1.5g/L，采用氨水调节发酵体系pH，所述pH控制在5～6。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养是在无机盐培养基中进行发酵培养，所述发酵培养是在pH为5～6、培养体系的乙醇浓度不高于3g/L的条件下进行3～5天。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵开始后的40小时内，采用流加葡萄糖的方式补充碳源，所述发酵开始后的40小时后，采用流加乙醇的方式补充碳源，所述培养体系中乙醇浓度控制在不高于3g/L，所述发酵开始后的中期，采用氨水调节发酵体系pH，所述pH控制在5～6。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵处理前，进一步包括将所述酿酒酵母进行活化处理；

任选地，所述活化处理是通过如下方式进行的：

将预先保存至-80℃的酿酒酵母接种至50ml YPD培养基中，在30℃，250rpm的条件下进行12h的一级活化处理，以便获得一级种子；

将所述一级种子按照5％接种量转接至另一50ml YPD培养基中，在30℃，250rpm的条件下进行7h的二级活化处理，以便获得二级种子。