WO2021215717A1 - 혈관 작동성 장 펩티드를 발현하는 미생물, 및 그의 용도 - Google Patents

혈관 작동성 장 펩티드를 발현하는 미생물, 및 그의 용도 Download PDF

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lactobacillus
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최효정
노현진
박영하
정이레
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    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)

Definitions

  • the present disclosure relates to microorganisms expressing vasoactive intestinal peptide (VIP), and compositions for preventing or treating diseases causing damage to the gastrointestinal tract, including the microorganisms.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • VIP is a peptide hormone that is vasoactive in the intestine.
  • VIP is a peptide with 28 amino acid residues belonging to the ligands of the glucagon/secretin superfamily, class II G protein-coupled receptors.
  • Korean Patent Application Laid-Open No. 2014-0000620 discloses Lactobacillus and its irritable bowel syndrome (IBD) treatment use to increase VIP levels in the enteric nervous system. It is a strain screened in nature and is not a recombinant microorganism.
  • IBD irritable bowel syndrome
  • Cid-Open Patent No. 108753670 discloses a recombinant microorganism Lactococcus lactis NZ9000 that expresses VIP and is rich in selenium nanoparticles (SeNP) in cells. Since selenium is present in cells in the form of nanoparticles, this recombinant microorganism solves the problems of strong toxicity, low bioavailability, high environmental pollution, and high production cost of selenium when used as a selenium additive while simultaneously solving the problems of antibacterial peptide It is described that it can solve the problem of antibiotic residue by secreting phosphorus VIP. In addition, the pNZ8148 plasmid of the NICE® Lactococcus lactis expression system was used for VIP secretion expression.
  • An object of the present disclosure is to provide a recombinant Lactobacillus ( Lactobacillus ) genus microorganism expressing exogenous VIP.
  • Another object is to provide a recombinant lactic acid bacterium expressing exogenous VIP under a constitutive promoter.
  • Another object is to provide a composition for preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract in humans comprising the microorganism.
  • One aspect of the present disclosure is a promoter, and a foreign gene encoding a vasoactive intestinal peptide (VIP) operably linked to the promoter is introduced and a protease is inactivated (inactivated) recombinant As a microorganism, Lactobacillus ( Lactobacillus ) It provides a recombinant microorganism of the genus.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • Another aspect of the present disclosure is a recombinant microorganism into which a constitutive promoter and a foreign gene encoding a vasoactive intestinal peptide (VIP) operably linked to the promoter are introduced and the protease is inactivated, It provides a recombinant microorganism that is a lactic acid bacterium.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • Another aspect of the present disclosure is a recombinant microorganism into which a promoter and a foreign gene encoding a vasoactive intestinal peptide (VIP) operably linked to the promoter are introduced and the protease is inactivated, which is a lactic acid bacterium.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • VIP or “VIP protein” or “VIP polypeptide” refers to a biologically active polypeptide having one or more of the biological activities as described herein.
  • the q25 region of chromosome 6 on the human genome encodes a member of the secretin family that is 170 amino acids in length.
  • This member of 170 amino acids in length is post-translationally truncated to form a vasoactive intestinal peptide (VIP).
  • VIP polypeptide lowers blood pressure, increases vasodilation of blood vessel walls, relaxes smooth muscle in respiratory and gastrointestinal tissues, decreases Th1 response as well as immune response through promotion of Th2. It functions to reduce the blood flow, to modulate innate and acquired immune responses, or to promote the secretion of electrolytes in the intestine.
  • VIPs have been shown to be active as neurotransmitters in the central nervous system and in communication with lymphocytes.
  • VIP 1 R The bioactivity of VIP is transmitted through three known receptors: VIP 1 R, VIP 2 R, and PAC 1 R. These receptors are known to cause cAMP enrichment as well as the production of intracellular calcium. Like VIP, their affinity for secretins depends on the subtype and the amino acid sequence of the ligand. Human natural VIPs have a short half-life, with a half-life of about 2 minutes in the bloodstream.
  • VIPs referred to herein include variants that mimic the function of native VIPs.
  • the variants include those having an increased half-life than native VIP and equivalent or greater bioactivity compared to native VIP.
  • VIP includes, but is not limited to, human VIP, recombinant human VIP, murine VIP, and/or recombinant mouse VIP.
  • the VIP has 50% or more, 60% or more, 70% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 it could be
  • the VIP may have an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9, respectively.
  • VIP of SEQ ID NO: 1 is a human-derived natural VIP.
  • VIPs having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, and 9 are the human-derived native VIP variants VIP1, VIP2, VIP3, VIP4, VIP5, VIP6, VIP7, and VIP8.
  • the VIP polypeptides can be isolated from a variety of sources, such as human tissue or other sources, or prepared by recombinant or synthetic methods.
  • VIP polypeptide also includes variants of VIP polypeptides.
  • a VIP may be modified in such a way that it forms a chimeric molecule comprising the VIP fused to another heterologous polypeptide or amino acid sequence.
  • protease is a generic term for enzymes that degrade proteins, and may include any type known in the art without particular limitation.
  • auxotroph refers to a strain that cannot grow in a synthetic medium consisting only of inorganic salts and a carbon source and grows only by supplementing one or more nutrients, Any known kind may be included without particular limitation.
  • the microorganism according to an aspect of the present disclosure is a recombinant microorganism into which a promoter and a foreign gene encoding a vasoactive intestinal peptide (VIP) operably linked to the promoter are introduced, and the protease is inactivated. will be.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • the microorganism according to another aspect of the present disclosure is a recombinant microorganism into which a constitutive promoter and a foreign gene encoding a vasoactive intestinal peptide (VIP) operably linked to the promoter are introduced and the protease is inactivated, and lactic acid bacteria It is a recombinant microorganism that is
  • the lactic acid bacteria is Lactobacillus ( Lactobacillus ), Lactococcus ( Lactococcus ), Bifidobacteria ( Bifidobacteria ), Streptococcus ( Streptococcus ), Leuconostoc ( Leuconostoc ), Weissella ), or Pediococcus ( Pediococcus ), Pediococcus ( Pediococcus ) Caucus ( Enterococcus ) genus, particularly Lactobacillus ( Lactobacillus ), Lactococcus ( Lactococcus ) may be belonging to the genus, for example, Lactobacillus paracasei , Lactobacillus brevis , Lactobacillus plantarum or Lactococcus lactis may be one.
  • the microorganism of the genus Lactobacillus may be Lactobacillus paracasei , Lactobacillus brevis , or Lactobacillus plantarum .
  • it may be Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21 (KCTC 13422BP), or Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP).
  • the promoter may be a constitutive promoter.
  • the promoter may have transcription initiation efficiency in lactic acid bacteria equal to or greater than that of a conventional promoter, for example, the P11 promoter.
  • the promoter may also be an inducible promoter.
  • the inducible promoter may be, for example, a Nisin inducible promoter.
  • the promoter may be PR4 derived from Lactobacillus paracasei comprising the polynucleotide of SEQ ID NO: 10.
  • PR4 may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the microorganism according to the present disclosure is characterized in that a foreign gene encoding VIP is introduced.
  • the introduction may be by transformation, transduction, transfection or electroporation.
  • the introduced foreign gene may be integrated into the genome of the host cell or may exist without being integrated.
  • the foreign gene may be integrated into the genome of the host cell.
  • the microorganism according to the present disclosure is characterized in that the protease is inactivated.
  • the gene encoding the protease may be deleted (deleted). “Deletion” includes deletion of at least a portion, eg, all or part, of a gene.
  • the gene encoding the protease is replaced with a foreign gene encoding a vasoactive intestinal peptide (VIP) operably linked to a promoter, whereby the introduction of the foreign VIP gene and the deletion of the protease gene can be implemented simultaneously.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • Replacement includes replacement of at least a portion, eg, all or part, of a gene.
  • protase may include any type known in the art without particular limitation.
  • HtrA and/or PepN may be HtrA.
  • the htrA gene may be an L. brevis htrA gene, particularly SEQ ID NO: 14.
  • the pepN gene may be an L. brevis pepN gene, particularly SEQ ID NO: 15.
  • the clpP gene may be L.
  • brevis It may be a clpP gene, particularly SEQ ID NO: 16.
  • the lon gene may be an L. brevis lon gene, particularly SEQ ID NO: 17.
  • the protease is not expressed and thus the foreign VIP protein is prevented from being degraded. , can increase the yield or productivity of the VIP protein According to one embodiment, when HtrA is not expressed, the productivity of the VIP protein can be greatly increased.
  • the recombinant microorganism may further include a signal sequence operably linked between the promoter and the foreign gene.
  • a signal sequence operably linked between the promoter and the foreign gene.
  • the signal sequence may encode SP4 (SEQ ID NO: 12) derived from Lactobacillus paracasei.
  • SP4 may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO:13.
  • the microorganism may be to secrete VIP out of the cell.
  • the recombinant microorganism may be an auxotroph.
  • the auxotroph is, for example, one or more genes selected from the group consisting of Riboflavin biosynthesis protein gene (ribB), Thymidylate synthase gene (thyA) and Glutamine--fructose-6-phosphate aminotransferase gene (glmS), for example, ribB and / or thyA, for example, ribB may be deleted, but there is no particular limitation.
  • the ribB may be L. brevis ribB, in particular of SEQ ID NO: 18.
  • thyA may be L. brevis thyA, particularly of SEQ ID NO: 19.
  • the glmS may be L.
  • deletion includes deletion of at least a portion, eg, all or part, of a gene.
  • compositions for use in preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract comprising the above-mentioned microorganism.
  • the disease may be one that causes inflammation of the gastrointestinal tract.
  • the disease may be at least one selected from the group consisting of inflammatory bowel disease (IBD), and colitis.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • colitis may be ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • the composition may include a pharmaceutically or food acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the pharmaceutically or food acceptable carrier may be any standard such as a phosphate buffered saline solution, a 5% aqueous solution of dextrose and an emulsion (eg, oil/water or water/oil emulsion).
  • emulsion eg, oil/water or water/oil emulsion
  • excipients include adjuvants, binders, fillers, diluents, disintegrants, emulsifiers, wetting agents, lubricants, glidants, sweetening agents, flavoring and coloring agents.
  • the preferred pharmaceutical or food carrier depends on the intended mode of administration of the active agent.
  • Typical modes of administration include enteral (eg, oral) administration.
  • the composition may be in unit dosage form.
  • the composition may have an oral dosage form.
  • the composition may be a food or pharmaceutical composition.
  • the composition may include a dried product of the microorganism.
  • the composition may include a medium for the microorganism.
  • pharmaceutically acceptable or acceptable for food refers to substantially not causing adverse reactions when administered to a subject.
  • the side effect may be toxic, allergic, or an immune response.
  • kits for use in preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract comprising the above recombinant microorganism and a drug for treating other gastrointestinal damaging diseases.
  • the recombinant microorganism is as described above.
  • the recombinant microorganism may be in the form of the composition described above.
  • the kit may include instructions for using recombinant microorganisms and drugs for treating other diseases of the gastrointestinal tract to prevent or treat diseases that cause damage to the gastrointestinal tract.
  • the drug for treating other diseases that damage the gastrointestinal tract includes any drug that treats diseases that damage the gastrointestinal tract, for example, inflammatory bowel disease.
  • Drugs for treating diseases of the gastrointestinal tract may include the following drugs:
  • methotrexate methotrexate, cyclophosphamide, MX-68, atiprimod dihydrochloride, BMS-188667, CKD-461, rimexolone, cyclosporine, tacrolimus, gusperimus, azathiopurine, antilymphocyte stimulating factor, freeze-dukin sulfonated normal immunoglobulin, erythropoietin, colony, etc.
  • TNF-alpha-receptor IgG-Fc fusion protein etanercept
  • infliximab adalimumab
  • certolizumab pegol certolizumab pegol
  • golimumab golimumab
  • PASSTNF- ⁇ soluble TNF- ⁇ receptor
  • TNF- ⁇ binding protein anti-TNF- ⁇ antibody
  • CDP571 CDP571 and the like.
  • natalizumab vedolizumab, AJM300, TRK-170, E-6007, etc.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • benzbromarone allopurinol, sodium aurothiomalate, hyaluronate sodium, sodium salicylate, salicylic acid, atropine, scopolamine, levorphanol, oxymorphone or its salts, etc.
  • salicylic acid derivatives eg celecoxib, aspirin
  • etoricoxib etoricoxib
  • valdecoxib etoricoxib
  • diclofenac sodium indomethacin
  • loxoprofen etc.
  • the description of the microorganism is also applicable to the composition.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating a disease causing damage to the gastrointestinal tract, comprising administering to the subject an amount of the microorganism that is effective for preventing or treating the disease causing damage to the gastrointestinal tract.
  • the method may further comprise administering to the subject an amount of a TNF-alpha blocker effective to prevent or treat a disease causing damage to the gastrointestinal tract.
  • the step of administering the TNF-alpha blocking agent to the subject may be performed simultaneously with, before, or after the step of administering the microorganism to the subject.
  • the TNF-alpha blocking agent may be administered by the same or different route as the route to which the microorganism is administered.
  • the TNF-alpha blocking agent may be administered orally or parenterally.
  • the parenteral may be an injection such as vascular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.
  • the TNF-alpha blocking agent may be administered intraperitoneally, and the microorganism may be administered orally.
  • the TNF-alpha blocking agent may be administered intraperitoneally after the microorganism is orally administered.
  • the TNF-alpha blocking agent may be administered in an amount of 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 40 mg, 10 mg to 50 mg, or 20 mg to 50 mg per one administration.
  • the disease may cause inflammation of the gastrointestinal tract.
  • the diseases include inflammatory intestinal disease, autoimmune disease, damage to the gastrointestinal tract by radiation or graft versus host disease (GVHD), inflammatory bowel disease : IBD), and colitis including chronic colitis may be at least one selected from the group consisting of.
  • the inflammatory bowel disease may be ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • the "administering or administration” refers to administering the microorganism to a physiological system (individual or in vivo, in vitro, or ex vivo cells, tissues and organs), a composition comprising the microorganism, or a therapeutic agent. Indicates the act of giving therapeutic treatment. Accordingly, in the method, the microorganism may be in the form of the composition described above.
  • An acceptable route of administration to the human body may be oral, or mucosal (eg, intestinal mucosa, oral mucosa or Bucal).
  • the administration may be administered in combination with an additional therapeutic agent.
  • the combination administration includes either simultaneous or sequential order.
  • treatment refers to prophylactic treatment or therapeutic treatment.
  • treatment refers to administration of a microorganism or composition to an individual for therapeutic or prophylactic purposes.
  • a “therapeutic” treatment is a treatment administered to a subject exhibiting pathological signs or symptoms to reduce or eliminate the signs or symptoms. Signs or symptoms may be biochemical, cellular, histological, functional or physical, subjective or objective.
  • a “prophylactic” treatment is a treatment administered to a subject that does not show signs of a disease or only shows early signs of a disease in order to reduce the risk of developing a pathology.
  • the microorganisms or compositions described herein can be provided as a prophylactic treatment to reduce the likelihood of developing a pathology, or to minimize the severity of the pathology if it does occur.
  • terapéuticaally effective amount refers to an amount sufficient to carry out the stated purpose.
  • An effective amount can be determined empirically. The effective amount may be determined, for example, depending on the extent to which the microorganism secretes VIP into the extracellular space. For example, for a person having a body weight of 60 kg, it may be the number of the microorganisms capable of secreting 0.01 to 300 mg, or 0.5 to 100 mg of VIP per day.
  • the subject may be a mammal.
  • the mammal may be a human, horse, pig, cow, dog, cat, monkey, chimpanzee, sheep, or goat.
  • microorganism and/or composition is also applicable to the method.
  • the recombinant microorganism according to the present disclosure can not only produce and secrete VIP with higher productivity, but also exhibit high environmental safety, thereby more effectively preventing or treating diseases that cause damage to the gastrointestinal tract.
  • FIG. 1a and 1b are schematic diagrams showing a genetically engineered site of a recombinant microorganism according to an embodiment.
  • Figures 2a and 2b is a view confirming the production of a recombinant microorganism with improved VIP productivity according to an embodiment.
  • Figures 3a and 3b is a view showing that the VIP productivity of the recombinant microorganism according to one embodiment is improved.
  • 4a and 4b are views confirming the production of recombinant microorganisms with improved environmental safety according to an embodiment.
  • 5A and 5B are views showing that the environmental safety of recombinant microorganisms according to an embodiment is improved.
  • FIG. 6 is a view showing that a recombinant microorganism according to an embodiment exhibits an IBD therapeutic effect in an animal model.
  • Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP)
  • KCTC 13423BP a homologous recombination genetic engineering method commonly used in lactic acid bacteria
  • D-Ala-D-Ala ligase as a broad host-range counterselection marker in vancomycin resistant lactic acid
  • a recombinant microorganism expressing exogenous VIP was prepared.
  • FIGS. 1a and 1b schematically show the genetically engineered site of the microorganism according to this example.
  • Figure 1a shows the process of replacing the protease gene (htrA or pepN) with the VIP gene to improve VIP productivity.
  • a signal peptide that helps to secrete back and forth of VIP and a tag for detection were included in one cassette.
  • the protase gene is L. brevis htrA (SEQ ID NO: 14) or L. brevis pepN (SEQ ID NO: 15).
  • Figure 1b shows the process of forming a auxotroph to promote environmental safety, a method of removing some regions of the target gene.
  • the target gene is L. brevis ribB (SEQ ID NO: 18).
  • 1A and 1B has the following meaning: P: Promoter, SP: Signal Peptide, UTR: Untranslated Region, VIP: Vasoactive Intestinal Peptide), A: L. brevis ribB, B: L. brevis htrA or L. brevis pepN.
  • FIGS. 2A and 2B are schematic diagrams (left) showing the replacement of the protase genes htrA (FIG. 2A) and pepN (FIG. 2B) by the VIP expression cassette, respectively, and the size of the bands generated by recombinant microorganisms therefrom is a gel image (right) showing that ⁇ has changed as intended.
  • FIGS. 2A and 2B it was confirmed that recombinant microorganisms were generated in which the protase genes htrA and pepN were replaced with VIP expression cassettes, respectively.
  • the band size of the PCR product was 1.5 kb in the wild type, and when the htrA region was replaced with the VIP expression cassette, the band size was 920 bp.
  • the wild-type PCR product had a band size of 2 kB, and when the pepN region was replaced with a VIP expression cassette, the band size was 1.3 kb.
  • each abbreviation is as defined in Example 1, and WT in the gel image means wild type.
  • Example 3 Evaluation of VIP productivity of recombinant microorganisms
  • Example 1 In order to confirm whether the VIP productivity of the recombinant microorganism was improved, evaluation was performed to confirm the VIP expression level of the strains prepared in Example 1.
  • the stock of the prepared strain was streaked on an MRS plate and cultured for 3 days at 37°C. Here, single colonies were picked and cultured with shaking at 37°C in MRS liquid medium for 24 hours. This was inoculated to 25ml MRS so that OD 600 became 0.1, and then cultured with shaking at 37°C for 16 hours. 10ml of the strain culture medium was extracted and centrifuged at 4000rpm for 10 minutes, and only the supernatant was extracted, 1ml of TCA (Tricholoacetic acid) was added, and treated at 4°C for 30 minutes or more.
  • TCA Tricholoacetic acid
  • FIG. 3a is a graph showing a gel image (left) showing VIP expressed from a recombinant strain in which htrA and/or ribB is deleted and quantifying the expression level of VIP (right).
  • 3b is a graph showing the expression level of VIP expressed from a recombinant strain in which pepN is deleted.
  • the protase gene of L. brevis was deleted, the expression level of VIP, an effective substance, was increased.
  • the expression level of the target substance, VIP was increased three-fold or more compared to that in which other genes were deleted.
  • FIGS. 4A and 4B are schematic diagrams (left) of a recombinant microorganism in which rib and thyA are deleted, respectively, and a gel image (right) showing that the size of the band was changed as intended by the generation of the recombinant microorganism therefrom.
  • FIGS. 4A and 4B each abbreviation is as defined in Example 1, and WT in the gel image means wild type.
  • FIGS. 4A and 4B it was confirmed that recombinant microorganisms in which ribB and thyA were deleted were generated.
  • the band size of the PCR product was 1.0 kb in the wild type, and when the ribB region was deleted, the band size was 500 bp.
  • the wild type was 250 bp, and no band was observed in the strain in which ribB was deleted.
  • the band size of the PCR product was 700 bp in the wild type, and when a part of the thyA region was deleted, the band size was 500 bp.
  • a growth test was performed to determine the growth pattern of the strain prepared in Example 1.
  • the stock of the prepared strain was streaked on an MRS plate and cultured for 3 days at 37°C. Here, single colonies were picked and cultured in MRS broth at 37° C. for 24 hours with shaking (230 rpm).
  • 1 ml of the culture medium was extracted and centrifuged at 13000 rpm for 1 minute.
  • the OD 600 was measured and inoculated to 25ml of a minimal medium for lactic acid bacteria called SDM (Semi-defined media), which is an environment in which growth can be inhibited, so that the OD 600 becomes 0.0025. It was cultured for 40 hours under shaking culture (230 rpm) conditions at 37° C., and the values measured for OD 600 at 15, 17, 20, 22, 24, and 40 hours after inoculation are shown as graphs.
  • FIGS. 5A and 5B are graphs showing the growth patterns of ribB-deleted recombinant lactic acid bacteria (FIG. 5A) and thyA-deleted recombinant lactic acid bacteria (FIG. 5B).
  • WT means wild type. It was confirmed from Figures 5a and 5b that the auxotrophic lactic acid bacteria cause growth inhibition in nutrient-deficient medium conditions.
  • Example 6 In vivo efficacy: IBD animal model experiment
  • the transgenic strain was orally administered to a DSS (dextran sulfate sodium)-induced mouse intestinal inflammation model, and then the survival rate or DAI (disease activity index) score was checked.
  • DSS extran sulfate sodium
  • DAI disease activity index
  • the culture supernatant was removed by centrifugation at 4000rpm for 10 minutes, and the recovered strain was suspended in 1x PBS so that it could be administered at 1x10 9 cfu per animal once.
  • the strain administration was performed once a day, for a total of 16 days.
  • the treatment efficacy experiment was started by setting the first strain administration day to Day-9, and from Day 0 to Day 5, 2% DSS was treated with a negative number in all groups except for the PBS group, and euthanasia was performed on Day 8.
  • the DAI score was calculated by checking the weight loss, hair bristles, the degree of movement of the animals and the presence of diarrhea every 2 days.

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Abstract

VIP 유전자를 발현하는 재조합 미생물, 및 그 미생물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

Description

혈관 작동성 장 펩티드를 발현하는 미생물, 및 그의 용도
본 개시는 혈관 작동성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide: VIP)를 발현하는 미생물, 및 이를 포함하는 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.
VIP는 장에서 혈관 작동성인 펩티드 호르몬이다. VIP는 글루카곤/세크레틴 수퍼패밀리, 클라스 II G 단백질-결합 수용체의 리간드에 속하는 28 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이다.
한국공개특허 제2014-0000620호는 장신경계(enteric nervous system)에서 VIP 수준을 증가시키는 락토바실러스 및 그의 과민성 대장증후군(IBD) 치료 용도를 개시하고 있다. 이것은 자연에서 스크리닝된 균주로서 재조합 미생물이 아니다.
중국공개특허 제108753670호는 VIP를 발현하고 셀레늄 나노입자(SeNP)가 세포 내에 풍부한 재조합 미생물 Lactococcus lactis NZ9000을 개시한다. 이 재조합 미생물은 셀레늄이 나노입자의 형태로 세포 내에 존재하므로 셀레늄 첨가제로 사용되는 경우, 셀레늄의 강한 독성, 낮은 생체이용율, 높은 환경오염 유발성, 및 높은 생산 원가의 문제를 해결하는 동시에, 항균 펩티드인 VIP를 분비하므로 항생제 잔류 문제를 해결할 수 있다고 기재되어 있다. 또한, VIP 분비 발현을 위하여 NICE® Lactococcus lactis 발현 시스템의 pNZ8148 플라스미드를 이용하였다.
외래 VIP를 발현하는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 재조합 미생물, 구성적 프로모터(constitutive promoter) 하에 외래 VIP를 발현하는 재조합 유산균, 및 이러한 미생물을 사람에서 IBD와 같은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기 위해 사용하는 것은 알려진 바 없다.
본 개시의 목적은 외래 VIP를 발현하는 재조합 락토바실러스(Lactobacillus) 속 미생물을 제공하는 것이다.
다른 목적은 구성적 프로모터 하에 외래 VIP를 발현하는 재조합 유산균을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 상기 미생물을 포함하는 사람에서 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시의 일 양상은 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고(introduced) 프로테이즈(protease)가 불활성화되어 있는(inactivated) 재조합 미생물로서, 락토바실러스(Lactobacillus) 속인 것인 재조합 미생물을 제공한다.
본 개시의 다른 양상은 구성적 프로모터(constitutive promoter), 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고 프로테이즈가 불활성화되어 있는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물을 제공한다.
본 개시의 또 다른 양상은 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고 프로테이즈가 불활성화되어 있는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물을 포함하는, 사람에서 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.
이하 상세히 설명한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "VIP" 또는 "VIP 단백질" 또는 "VIP 폴리펩티드"는 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 활성 중 하나 이상을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 지칭한다.
사람에서, 사람 게놈 상의 염색체 6의 q25 영역은 길이가 170 아미노산인 세크레틴 패밀리 멤버를 코딩한다. 길이 170 아미노산의 이 멤버는 번역 후 잘려져 혈관 작동성 장 펩티드(VIP)를 형성한다. VIP 폴리펩티드의 활성 형태는 혈압을 낮추는 것, 혈관벽의 확장(vasodilation)을 증가시키는 것, 호흡기 계통 및 위장관 조직에서 평활근을 이완시키는 것(relax), Th1 반응의 감소뿐만 아니라 Th2의 촉진을 통하여 면역 반응을 감소시키는 것, 선천적 및 획득 면역 반응을 조절하는 것, 또는 내장에서 전해질의 분비를 촉진하는 것의 기능을 한다. 또한, VIP는 신경전달 물질로서 중추 신경계에서 및 림프구와의 소통에서 활성적인 것이 밝혀졌다. VIP의 생물활성은 알려진 3가지 수용체를 통하여 전달된다: VIP1R, VIP2R, 및 PAC1R. 이들 수용체들은 세포내 칼슘의 생산뿐만 아니라 cAMP 농축을 야기하는 것으로 알려져 있다. VIP와 같이 세크레틴에 대한 이들의 친화도는 서브타입과 리간드의 아미노산 서열에 따라 달라진다. 사람 천연 VIP는 혈류에서 약 2분의 반감기를 가지고 있어서, 짧은 반감기를 가지고 있다.
본 명세서에 언급된 VIP는 천연 VIP의 기능을 흉내내는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 천연 VIP 보다 증가된 반감기를 갖고 천연 VIP에 비하여 동등 이상의 생물활성을 갖는 것을 포함한다.
본 명세서에서, VIP는 인간 VIP, 재조합 인간 VIP, 쥐 VIP 및/또는 재조합 마우스 VIP를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 VIP는 서열번호 1의 아미노산 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 VIP는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. 서열번호 1의 VIP는 사람 유래 천연 VIP이다. 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 갖는 VIP는 사람 유래 천연 VIP 변이체 VIP1, VIP2, VIP3, VIP4, VIP5, VIP6, VIP7, 및 VIP8이다.
본원에서 사용된 상기 VIP 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "VIP 폴리펩티드"는 또한 VIP 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본원에서, VIP는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 VIP를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "프로테이즈"는 단백질을 분해하는 효소를 총칭하는 것으로서, 당업계에 알려져 있는 어떠한 종류도 특별한 제한 없이 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "영양요구주(auxotroph)”는 무기염류와 탄소원으로만 이루어진 합성배지로는 증식할 수 없고 1종 또는 그 이상의 영양소를 보충하여 비로소 생육하는 균주를 지칭하는 것으로, 당업계에 알려져 있는 어떠한 종류도 특별한 제한 없이 포함할 수 있다.
본 개시의 일 양상에 따른 미생물은 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고 프로테이즈가 불활성화되어 있는 재조합 미생물로서, 락토바실러스 속인 것이다.
본 개시의 다른 양상에 따른 미생물은 구성적 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고 프로테이즈가 불활성화되어 있는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물이다
상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 특히 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus) 속에 속하는 것일 수 있으며, 예를 들어, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum 또는 Lactococcus lactis인 것일 수 있다.
상기 락토바실러스 속 미생물은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, 또는 Lactobacillus plantarum인 것일 수 있다. 예를 들어 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21 (KCTC 13422BP), 또는 Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP)일 수 있다.
상기 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 상기 프로모터는 유산균에서 전사 개시 효율이 종래의 프로모터 예를 들면, P11 프로모터와 같거나 그보다 큰 것일 수 있다. 상기 프로모터는 또한 유도성 프로모터(inducible promoter)일 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 예컨대, 니신 유도성 프로모터(Nisin inducible promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 Lactobacillus paracasei 유래의 PR4일 수 있다. PR4는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 개시에 따른 미생물은 VIP를 코딩하는 외래 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 도입은 형질전환, 형질도입, 형질감염 또는 전기천공에 의한 것일 수 있다. 도입된 상기 외래 유전자는 숙주 세포의 게놈에 통합되거나(integrated) 통합되지 않고 존재하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 외래 유전자는 숙주 세포의 게놈에 통합된 것일 수 있다.
또한, 본 개시에 따른 미생물은 프로테이즈가 불활성화되어 있는 것을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 프로테이즈를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는(deleted) 것일 수 있다. "결실"은 유전자의 적어도 일부, 예를 들어 전체 또는 일부가 결실된 것을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 프로테이즈를 코딩하는 유전자가 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자로 대체(replaced)됨으로써, 외래 VIP 유전자 도입 및 프로테이즈 유전자 결실을 동시에 구현할 수 있다. ”대체”는 유전자의 적어도 일부, 예를 들어 전체 또는 일부가 대체된 것을 포함한다.
본 명세서에 있어서, "프로테이즈"는 당업계에 알려져 있는 어떠한 종류도 특별한 제한 없이 포함할 수 있다. 예를 들어, HtrA(high temperature requirement A), PepN(Aminopeptidase N), ClpP((Caseinolytic pretease P) 및 Lon(Lon protease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상, 예를 들어, HtrA 및/또는 PepN, 예를 들어 HtrA일 수 있다. htrA 유전자는 L. brevis htrA 유전자, 특히 서열번호 14의 것일 수 있다. pepN 유전자는 L. brevis pepN 유전자, 특히 서열번호 15의 것일 수 있다. clpP 유전자는 L. brevis clpP 유전자, 특히 서열번호 16의 것일 수 있다. lon 유전자는 L. brevis lon 유전자, 특히 서열번호 17의 것일 수 있다. 이러한 미생물에서는, 프로테이즈가 발현되지 않아 외래 VIP 단백질이 분해되는 것을 방지함으로써, VIP 단백질의 수율 또는 생산성을 증가시킬 수 있다. 일 구현예에 따르면, HtrA가 발현되지 않는 경우 VIP 단백질의 생산성을 크게 증가시킬 수 있다.
상기 재조합 미생물은 상기 프로모터와 상기 외래 유전자 사이에 작동가능하게 연결되어 있는 신호 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 신호 서열은 외래 단백질 유전자와 인 프레임으로 연결되는 경우, 세포 외로 분비시키는 능력이 종래의 신호 서열, 예를 들면, USP45 신호 서열보다 큰 것일 수 있다. 상기 신호 서열은 Lactobacillus paracasei 유래의 SP4(서열번호 12)를 코딩하는 것일 수 있다. 예를 들어, SP4는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 미생물은 VIP를 세포 외로 분비시키는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 재조합 미생물은 영양요구주(auxotroph)일 수 있다. 영양요구주는 예를 들어, ribB(Riboflavin biosynthesis protein gene), thyA(Thymidylate synthase gene) 및 glmS(Glutamine--fructose-6-phosphate aminotransferase gene)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자, 예를 들어 ribB 및/또는 thyA, 예를 들어 ribB가 결실된 것일 수 있으나, 특별한 제한이 있는 것은 아니다. ribB는 L. brevis ribB, 특히 서열번호 18의 것일 수 있다. thyA는 L. brevis thyA, 특히 서열번호 19의 것일 수 있다. glmS는 L. brevis glmS, 특히 서열번호 20의 것일 수 있다. 이 경우, 재조합 미생물의 성장 및 생존을 제어함으로써 환경안전성을 증진시킬 수 있다. "결실"은 유전자의 적어도 일부, 예를 들어 전체 또는 일부가 결실된 것을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기한 미생물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것일 수 있다. 상기 질환은 염증성 장질환(IBD), 및 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)인 것일 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 염수 용액(phosphate buffered saline solution), 덱스트로스의 5% 수용액 및 에멀젼(예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼)과 같은 임의의 표준 약제학적 또는 식품적 담체를 의미한다. 부형제의 비제한적인 예는 보조제, 결합제, 충전제, 희석제, 붕해제, 유화제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 감미제, 향료 및 착색제를 포함한다. 바람직한 약학적 또는 식품적 담체는 활성제의 의도된 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여 방식은 장내(예를 들어, 경구) 투여를 포함한다. 상기 조성물은 단일 투여 제형(unit dosage form)일 수 있다. 상기 조성물은 경구 투여 제형을 가질 수 있다. 상기 조성물은 식품 또는 의약 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 상기 미생물의 건조물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상기 미생물의 배지를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "약학적으로 또는 식품적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable or acceptable for food)"은 개체에 투여되었을 때 부작용(adverse reactions)을 실질적으로 일으키지 않는 것을 나타낸다. 상기 부작용은 독성, 알레르기, 또는 면역반응일 수 있다.
다른 양상은 상기한 재조합 미생물 및 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 재조합 미생물은 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 상기 키트는 재조합 미생물 및 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물을 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하도록 지시하는 지침서를 포함할 수 있다.
상기 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물은 위장관의 손상 질환, 예를 들면 염증성 장 질환을 치료하는 약물이면 어느 것이나 포함된다. 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물은 하기 약물을 포함할 수 있다:
(i) 스테로이드성 항염증제
dexamethasone, hexestrol, methimazole, betamethasone, triamcinolone, triamcinolone acetonide, fluocinonide, fluocinolone acetonide, predonisolone, methylpredonisolone, cortisone acetate, hydrocortisone, fluorometholone, beclomethasone dipropionate, estriol, paramethasone acetate, fludrocortisone acetate, clobetasol propionate, diflorasone acetate, dexamethasone propionate, difluprednate, betamethasone dipropionate, budesonide, diflucortolone valerate, amcinonide, halcinonide, mometasone furoate, hydrocortisone butyrate propionate, flumetasone pivalate, clobetasone butyrate, dexametasone acetate 등.
(ii) 5-아미노살리실산
sulfasalazine, mesalazine, olsalazine, balsalazide 등.
(iii) 면역조절제(immunomodulator) 또는 면역 억제제(immunosuppressant)
methotrexate, cyclophosphamide, MX-68, atiprimod dihydrochloride, BMS-188667, CKD-461, rimexolone, cyclosporine, tacrolimus, gusperimus, azathiopurine, antilymphocyte serum, freeze-dried sulfonated normal immunoglobulin, erythropoietin, colony stimulating factor, interleukin, interferon 등.
(iv) JAK 저해제
tofacitinib, ruxolitinib 등.
(v) TNF 저해제
재조합 TNF-알파-수용체 IgG-Fc 융합 단백질(etanercept), infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, PASSTNF-α, soluble TNF-α receptor, TNF-α binding protein, anti-TNF-α antibody, CDP571 등.
(vi) 인테그린 저해제
natalizumab, vedolizumab, AJM300, TRK-170, E-6007 등.
(vii) 인터류킨-12/23 저해제
ustekinumab, briakinumab (anti-interleukin-12/23 antibody) 등.
(viii) 비-스테로이드성 항염증제(NSAID)
(a) 고전적 NSAID
alcofenac, aceclofenac, sulindac, tolmetin, etodolac, fenoprofen, thiaprofenic acid, meclofenamic acid, meloxicam, tenoxicam, lornoxicam, nabumeton, acetaminophen, phenacetin, ethenzamide, sulpyrine, antipyrine, migrenin, aspirin, mefenamic acid, flufenamic acid, diclofenac sodium, ketophenylbutazone, loxoprofen sodium, phenylbutazone, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, oxaprozin, flurbiprofen, fenbufen, pranoprofen, floctafenine, piroxicam, tenoxicam, epirizole, tiaramide hydrochloride, zaltoprofen, gabexate mesylate, camostat mesylate, ulinastatin, colchicine, probenecid, sulfinpyrazone, bucolome, benzbromarone, allopurinol, sodium aurothiomalate, hyaluronate sodium, sodium salicylate, salicylic acid, atropine, scopolamine, levorphanol, oxymorphone 또는 그의 염 등.
(b) 시클로옥시게나제 저해제 (COX-1 선택적 저해제, COX-2 선택적 저해제 등)
살리실산 유도체 (예, celecoxib, aspirin), etoricoxib, valdecoxib, diclofenac sodium, indomethacin, loxoprofen 등.
(c) 니트릭옥시드-방출 NSAID (nitric oxide-releasing NSAID).
상기 미생물에 대한 기재사항은 상기 조성물에 대해서도 적용 가능하다.
다른 양상은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료학적 유효한 양의 상기 미생물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기에 유효한 양의 TNF-알파 차단제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제를 개체에게 투여하는 단계는 상기 미생물을 개체에게 투여하는 단계와 동시, 전, 또는 후에 수행하는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 상기 미생물이 투여되는 경로와 동일 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 TNF-알파 차단제는 경구 또는 비경구로 투여되는 것일 수 있다. 상기 비경구는 혈관 주사, 복강, 또는 피하 주사와 같은 주사일 수 있다. 예를 들면, 상기 TNF-알파 차단제는 복강 내로 투여되고, 상기 미생물은 경구로 투여되는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 상기 미생물이 경구로 투여된 후, 복강 내로 투여되는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 1회 투여 당 5mg 내지 100mg, 5mg 내지 50mg, 5mg 내지 40mg, 10mg 내지 50mg, 또는 20mg 내지 50mg의 양으로 투여되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것일 수 있다. 상기 질환은 염증성 내장 질환(inflammatory intestinal disease), 자가면역질환(autoimmune disease), 방사선(radiation)에 의한 위장관의 손상 또는 이식편대숙주 질환(graft versus host disease: GVHD), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease: IBD), 및 만성 대장염을 포함한 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 상기 "투여(administering 또는 administration)"는 상기 미생물을 생리적 시스템(개체 또는 인 비보, 인 비트로, 또는 엑스 비보 세포, 조직 및 기관)에 상기 미생물, 그를 포함하는 조성물, 또는 치료적 처치(therapeutic treatment)를 주는 행위를 나타낸다. 따라서, 상기 방법에서, 상기 미생물은 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 사람 몸에 투여하는 수용가능한 경로(route)는 입, 또는 점막(예, 장내 점막, 경구 점막 또는 부칼)일 수 있다. 상기 투여는 추가의 치료적 작용제(therapeutic agent)와 조합으로 투여될 수 있다. 상기 조합 투여는 동시 및 연속 중 어느 순서도 포함한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "치료(treatment)"는 예방적 치료(prophylactic treatment) 또는 치료적 치료(therapeutic treatment)를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, "치료"는 치료 또는 예방 목적을 위해 미생물 또는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 나타낸다.
"치료적(therapeutic)" 치료는 징후(signs) 또는 증상(symptoms)을 감소시키거나 제거하기 위한 병리학적 징후 또는 증상을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포성, 조직학적, 기능적 또는 물리적, 주관적 또는 객관적일 수 있다.
"예방적(prophylactic)" 치료는 병리(pathology) 발생 위험을 줄이기 위해 질병의 징후를 나타내지 않거나 질병의 초기 징후만을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다. 본 명세서 기재된 미생물 또는 조성물은 병리 발생의 가능성(likelihood)을 줄이거나, 발생되었다면 상기 병리의 심각성을 최소화하기 위하여 예방적 치료로서 제공될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "치료적 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양을 나타낸다. 유효한 양은 실험적으로 결정될 수 있다. 유효한 양은 예를 들면, 상기 미생물이 VIP를 세포 외로 분비하는 정도에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 60kg 체중을 갖는 사람에 대하여, 1일 0.01 내지 300 mg, 또는 0.5 내지 100 mg의 VIP를 분비할 수 있는 상기 미생물의 수일 수 있다. 예를 들면, 개체에 대하여 개체 당 1회 투여당 1x105 내지 1x1013cfu, 1x106 내지 1x1013cfu, 1x107 내지 1x1013cfu, 1x107 내지 1x1012cfu, 1x107 내지 1x1011cfu, 1x107 내지 1x1010cfu, 1x108 내지 1x1011cfu, 1x108 내지 1x1010cfu, 2.5x108 내지 7.5x109cfu, 5.0x108 내지 5.0x109cfu, 7.5x108 내지 2.5x109cfu, 또는 약 1x109cfu로 투여되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 양, 또는 염소일 수 있다.
상기 미생물 및/또는 조성물에 대한 기재사항은 상기 방법에 대해서도 적용 가능하다.
본 개시에 따른 재조합 미생물은 VIP를 보다 높은 생산성으로 생산 및 분비할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 환경안전성을 나타내어, 위장관의 손상을 야기하는 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1a 및 1b는 일 구현예에 따른 재조합 미생물의 유전자 조작부위를 보여주는 모식도이다.
도 2a 및 2b는 일 구현예에 따른 VIP 생산성이 향상된 재조합 미생물의 생성을 확인한 도면이다.
도 3a 및 3b는 일 구현예에 따른 재조합 미생물의 VIP 생산성이 향상되었음을 보여주는 도면이다.
도 4a 및 4b는 일 구현예에 따른 환경안전성이 증진된 재조합 미생물의 생성을 확인한 도면이다.
도 5a 및 5b는 일 구현예에 따른 재조합 미생물의 환경안전성이 증진되었음을 보여주는 도면이다.
도 6은 일 구현예에 따른 재조합 미생물이 동물모델에서 IBD 치료효과를 나타냄을 보여주는 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 미생물의 제작
Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC 13423BP)을 이용하여, 유산균에서 일반적으로 사용되는 상동 재조합 유전자 조작 방법(Zhang et al., D-Ala-D-Ala ligase as a broad host-range counterselection marker in vancomycin resistant lactic acid bacteria, J. Bacteriol., 2018)에 따라, 외래 VIP를 발현하는 재조합 미생물을 제작하였다.
도 1a 및 도 1b에 본 실시예에 따른 미생물의 유전자 조작부위를 모식적으로 나타내었다. 도 1a는 VIP 생산성 향상을 위해 프로테이즈 유전자(htrA 또는 pepN)를 VIP 유전자로 대체하는 과정을 보여준다. VIP의 앞뒤로 분비를 도와주는 신호 펩티드와 검출을 위한 택을 하나의 카세트로 포함시켰다. 프로테이즈 유전자는 L. brevis htrA(서열번호 14) 또는 L. brevis pepN(서열번호 15)이다. 도 1b는 환경안전성 증진을 위해 영양요구주를 형성하는 과정을 보여주는 것으로, 목표 유전자의 일부 지역을 제거하는 방식이다. 목표 유전자는 L. brevis ribB이다(서열번호 18). 도 1a 및 도 1b에서 각각의 약어는 다음의 의미를 갖는다: P: 프로모터(Promoter), SP: 신호펩티드(Signal Peptide), UTR: 비번역 부위(Untranslated Region), VIP: 혈관작동성펩티드(Vasoactive Intestinal Peptide), A: L. brevis ribB, B: L. brevis htrA 또는 L. brevis pepN.
실시예 2: 재조합 미생물의 생성 확인
재조합 미생물이 의도한 바와 같이 생성되었는지 확인하기 위해 PCR을 진행하였다. MRS 플레이트에서 37℃, 16시간 동안 정치배양된 유산균 콜로니를 사용하였다. 증류수 100㎕이 담긴 튜브에 싱글 콜로니를 피킹하여 현탁시켰다. 이를 비드-비팅(bead-beating)한 뒤, 98℃에서 10분간 가열하여 DNA 주형으로 사용하였다. DNA 주형 1㎕, 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕, DNA 중합효소 믹스 25㎕을 섞어 PCR용 혼합액을 만들었다. PCR 조건은 1사이클 당 (a) 변성 단계, 98℃에서 10초; (b) 어닐링 단계, 55℃에서 15초; 및 (c) 연장 단계, 72℃에서 10초로 구성된 40 사이클의 증폭 단계 및 72℃에서 2분으로 구성된 최종 연장 단계로 실시하였다. 사용 프라이머는 조작할 유전자 부위의 ORF 바깥 영역으로 디자인되었으며, 서열은 아래 표 1에 기술하였다.
명칭 서열 서열번호
1-46 pepN icF AGC AAC CTT TGA CCT AGC 21
1-46 pepN icR AAT TCC ATA TCA CCA CCC AC 22
pepN orf cF CCC GAT GGC CTT ACA AC 23
pepN orf cR GGA ACG GCT GTC CAT TAG 24
1-46 htrA insert cF CTA AAT GAG GAG GGT TCG CG 25
1-46 htrA insert cR AAG CTG GCG CTT TCA TTC C 26
1-46 htrA ORF cF ACC TCT AAC GTC AAC GTC 27
1-46 htrA ORF cR AGT TCC CAG GGT TAA TCG 28
그 결과를 도 2a 및 2b에 각각 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 2a 및 2b는 프로테이즈 유전자 htrA(도 2a) 및 pepN(도 2b)이 각각 VIP 발현 카세트로의 대체되는 것을 보여주는 모식도(좌측)와 이로부터 재조합 미생물이 생성되어 밴드의 크기가 의도한 대로 변화했음을 나타내는 겔 이미지(우측)이다. 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 프로테이즈 유전자 htrA 및 pepN이 각각 VIP 발현 카세트로 대체된 재조합 미생물이 생성되었음을 확인하였다. htrA의 경우 야생형은 PCR 생성물의 밴드 크기가 1.5kb로 나타났고, htrA 지역이 VIP 발현 카세트로 대체되면 밴드의 크키가 920bp로 나타났다. pepN의 경우 야생형은 PCR 생성물의 밴드 크기가 2kB로 나타났고, pepN 지역이 VIP 발현 카세트로 대체되면 밴드의 크기가 1.3kb로 나타났다. 도 2a 및 2b의 모식도에서, 각각의 약어는 실시예 1에 정의된 바와 같으며, 겔 이미지의 WT는 야생형(wild type)을 의미한다.
실시예 3: 재조합 미생물의 VIP 생산성 평가
재조합 미생물의 VIP 생산성이 향상되었는지 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제작한 균주들의 VIP 발현량 확인을 위한 평가를 진행하였다. 제작된 균주의 스탁을 MRS 플레이트에 스트리킹하여 37℃에서 3일 동안 정치배양 하였다. 여기서 싱글 콜로니를 골라 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 동안 진탕배양하였다. 이를 25ml MRS에 OD600이 0.1이 되도록 접종한 뒤, 37℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 균주 배양액 10ml을 추출하여 4000rpm, 10분 동안 원심분리하였고, 상등액만을 추출하여 TCA(Tricholoacetic acid)를 1ml 첨가하고, 4℃에서 30분 이상 처리하였다. 이를 10000rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 상등액을 제거한 뒤 4℃에 보관된 아세톤 1ml을 이용하여 펠렛을 현탁하였다. 13000rpm에서 10분 동안 원심분리 하였고, 상등액을 제거한 뒤, 아세톤 0.5ml을 첨가하여 펠렛을 현탁하였다. 이를 다시 13000rpm에서 10분 동안 원심분리하였고, 60℃에서 5분간 드라이과정을 거쳤다. 샘플 버퍼(환원 버퍼)를 첨가하고 펠렛을 잘 섞어 98℃에서 10분간 처리하였다. 이를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 진행하였다. 웨스턴 블랏팅의 결과를 바탕으로 ImageJ 라는 프로그램을 이용하여 동일 크기의 영역에 따라 측정되는 밴드의 세기를 정량화하였다.
그 결과를 도 3a 및 3b에 각각 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 3a는 htrA 및/또는 ribB가 결실된 재조합 균주를 생성하고 이로부터 발현된 VIP를 보여주는 겔 이미지(좌측)와 VIP의 발현량을 정량화하여 보여주는 그래프이다(우측). 도 3b는 pepN이 결실된 재조합 균주로부터 발현된 VIP의 발현량을 보여주는 그래프이다. 도 3a 및 3b로부터 확인할 수 있는 바와 같이, L. brevis의 프로테이즈 유전자를 결실시켰을 경우, 효능물질인 VIP의 발현량이 증가하였다. 특히, htrA를 결실시켰을 경우, 다른 유전자를 결실시킨 것에 비해 타겟 물질인 VIP의 발현량이 3배 이상 증가하였다.
실시예 4: 영양요구주의 생성 확인
영양요구주가 의도한 바와 같이 생성되었는지 확인하기 위해 PCR을 진행하였다. MRS 플레이트에서 37℃, 16시간 동안 정치배양된 유산균 콜로니를 사용하였다. 증류수 100㎕이 담긴 튜브에 싱글 콜로니를 피킹하여 현탁시켰다. 이를 비드-비팅(bead-beating)한 뒤, 98℃에서 10분간 가열하여 DNA 주형으로 사용하였다. DNA 주형 1㎕, 정방향 프라이머 1㎕, 역방향 프라이머 1㎕, DNA 중합효소 믹스 25㎕을 섞어 PCR용 혼합액을 만들었다. PCR 조건은 1사이클 당 (a) 변성 단계, 98℃에서 10초; (b) 어닐링 단계, 55℃에서 15초; 및 (c) 연장 단계, 72℃에서 10초로 구성된 40 사이클의 증폭 단계 및 72℃에서 2분으로 구성된 최종 연장 단계로 실시하였다. 사용 프라이머는 조작할 유전자 부위의 ORF 안쪽 및 바깥 영역으로 디자인되었으며, 서열은 아래 표 2에 기술하였다.
명칭 서열 서열번호
1-46 ribB orf cF TAA CCG CAG TGA CTG AC 29
1-46 ribB orf cR AGC TGA TAC ATC AAA GGT C 30
1-46 ribB icF AGC ATT GTG TTA TCA GC 31
1-46 ribB icR GCA GCA TTG GTA GCA AC 32
LbthyA-UP-cF3 GTG TGG CAA GGT GGC AAA GCC A 33
LbthyA-DN-cR1 CCG ATC TAC AGG CCC AAC TCG ATG A 34
그 결과를 도 4a 및 4b에 각각 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 4a 및 4b는 각각 rib 및 thyA가 결실된 재조합 미생물의 제작 모식도(좌측) 및 이로부터 재조합 미생물이 생성되어 밴드의 크기가 의도한 대로 변화했음을 나타내는 겔 이미지(우측)이다. 도 4a 및 4b에서, 각각의 약어는 실시예 1에 정의된 바와 같으며, 겔 이미지의 WT는 야생형(wild type)을 의미한다. 도 4a 및 4b에 나타난 바와 같이, 각각 ribB 및 thyA가 결실된 재조합 미생물이 생성되었음을 확인하였다. ribB의 경우 야생형은 PCR 생성물의 밴드 크기가 1.0kb로 나타났고, ribB 지역이 결실되면 밴드의 크키가 500bp로 나타났다. ribB 지역 내부에 결합하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 경우 야생형이 250bp로 나타났고, ribB가 결실된 균주에서는 밴드가 관찰되지 않았다. thyA의 경우 야생형은 PCR 생성물의 밴드 크기가 700bp로 나타났고, thyA지역 일부가 결실되면 밴드의 크기가 500bp로 나타났다.
실시예 5: 영양요구주의 환경안전성 평가
실시예 1에서 제작한 균주의 생장 패턴을 알아보기 위해 생장 시험을 진행하였다. 제작된 균주의 스탁을 MRS 플레이트에 스트리킹하여 37℃에서 3일 동안 정치배양하였다. 여기서 싱글 콜로니를 골라 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 동안 진탕배양하였다(230rpm). 배양액 1ml을 추출하여 13000rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 1x PBS 용액 1ml로 세포 펠렛을 현탁시킨 뒤, OD600을 측정하여 생장이 저해될 수 있는 환경인 SDM(Semi-defined media)이라는 유산균용 최소배지 25ml에 OD600이 0.0025가 되도록 접종하였다. 37℃에서 진탕배양(230rpm) 조건에서 40시간 동안 배양했으며, 접종 후 15, 17, 20, 22, 24, 40시간 시점에서 OD600을 측정한 값을 그래프로 나타내었다.
그 결과를 도 5a 및 5b에 각각 나타내었다. 보다 구체적으로, 도 5a 및 5b는 ribB가 결실된 재조합 유산균(도 5a) 및 thyA가 결실된 재조합 유산균(도 5b)의 생장 패턴을 나타내는 그래프이다. 도 5a 및 5b에서, WT는 야생형(wild type)을 의미한다. 도 5a 및 5b로부터 영양요구성 유산균이 영양소 부족 배지 조건에서 생장저해를 일으키고 있음을 확인하였다.
실시예 6: In vivo 효능: IBD 동물모델 실험
형질전환 균주 유래 VIP 단백질 치료효능을 평가하기 위하여, 형질전환 균주를 DSS(dextran sulfate sodium)로 유도된 마우스 장염증 모델에 경구 투여한 후 생존률 또는 DAI(disease activity index) 점수를 확인하였다. 5ml의 MRS 배지에서 하루 동안 1차 배양한 후, 배양한 균주를 50ml의 MRS 배지에 OD600이 0.1이 되도록 접종하였다. 16-18시간 뒤 배양액의 OD600이 4-5가 되면 총 투여 마우스 개체 수와 급여횟수에 맞춰 균주를 회수하였다. 4000rpm에서 10분간 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 회수된 균주는 마리당 1회 1x109 cfu로 투여할 수 있도록 1x PBS에 부유시켰다. 균주 투여는 1일 1회, 총 16일간 시행되었다.
최초 균주 투여일을 Day-9일로 설정하여 치료효능 실험이 시작되었으며, Day 0부터 Day 5에 2% DSS가 PBS군을 제외한 모든 군에 음수로 처리되었고 Day 8에 안락사하였다. DSS 처리 후 2일 간격으로 체중감소, 털의 곤두섬, 동물의 움직임 정도, 설사여부를 체크하여 DAI 점수를 산정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 생산성 향상 및 환경안전성 증진을 수행한 균주가 IBD 동물모델 실험에서 대조군들에 비해 우수한 효능을 나타냄을 확인하였다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13421BP
수탁일자 : 20171212
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13422BP
수탁일자 : 20171212
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13423BP
수탁일자 : 20171212
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Figure PCTKR2021004479-appb-I000002
Figure PCTKR2021004479-appb-I000003

Claims (15)

  1. 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고(introduced) 프로테이즈(protease)가 불활성화되어 있는(inactivated) 재조합 미생물로서, 락토바실러스(Lactobacillus) 속인 것인 재조합 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 또는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)인 것인 미생물.
  3. 구성적 프로모터(constitutive promoter), 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고 프로테이즈가 불활성화되어 있는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 또는 락토코커스(Lactococcus) 속인 것인 미생물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 또는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)인 것인 미생물.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터와 상기 외래 유전자 사이에 작동가능하게 연결되어 있는 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 미생물.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 프로테이즈를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는(deleted) 미생물.
  8. 청구항 7에 있어서, 프로테이즈를 코딩하는 유전자가 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자로 대체된(replaced) 미생물.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 프로테이즈가 HtrA, PepN, ClpP 및 Lon으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것인 미생물.
  10. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 영양요구주(auxotroph)인 미생물.
  11. 청구항 10에 있어서, ribB, thyA 및 glmS로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자가 결실된 미생물.
  12. 프로모터, 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 혈관작동성 장 펩티드(VIP)를 코딩하는 외래 유전자가 도입되고 프로테이즈가 불활성화되어 있는 재조합 미생물로서, 유산균인 것인 재조합 미생물을 포함하는, 사람에서 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것인 조성물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 질환은 염증성 장질환(IBD), 및 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)인 것인 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024096123A1 (ja) * 2022-11-04 2024-05-10 株式会社バイオパレット 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006262724A (ja) * 2005-03-22 2006-10-05 Kobe Univ タンパク質高発現乳酸菌
KR20120062777A (ko) * 2009-08-14 2012-06-14 파세비오 파마수티컬스 인코포레이티드 변형된 혈관활성 장 펩티드
KR20140000620A (ko) 2010-05-28 2014-01-03 꽁빠니 자베 다노느 장신경계의 개선을 위한 프로바이오틱 균주의 용도
KR20150095717A (ko) * 2012-12-18 2015-08-21 꽁빠니 자베 다노느 비피도박테리움 아니말리스 아종 아니말리스 균주
CN108753670A (zh) 2018-05-28 2018-11-06 西北工业大学 多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法
KR101992345B1 (ko) * 2017-12-29 2019-09-27 (주)메디톡스 프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101910808B1 (ko) * 2016-11-28 2018-10-24 주식회사 쎌바이오텍 유산균 유래 p8 단백질 및 이의 항암 용도

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006262724A (ja) * 2005-03-22 2006-10-05 Kobe Univ タンパク質高発現乳酸菌
KR20120062777A (ko) * 2009-08-14 2012-06-14 파세비오 파마수티컬스 인코포레이티드 변형된 혈관활성 장 펩티드
KR20140000620A (ko) 2010-05-28 2014-01-03 꽁빠니 자베 다노느 장신경계의 개선을 위한 프로바이오틱 균주의 용도
KR20150095717A (ko) * 2012-12-18 2015-08-21 꽁빠니 자베 다노느 비피도박테리움 아니말리스 아종 아니말리스 균주
KR101992345B1 (ko) * 2017-12-29 2019-09-27 (주)메디톡스 프로모터 폴리뉴클레오티드, 신호 폴리펩티드 및 그의 용도
CN108753670A (zh) 2018-05-28 2018-11-06 西北工业大学 多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP4144847A4
ZHANG ET AL.: "D-Ala-D-Ala ligase as a broad host-range counterselection marker in vancomycin resistant lactic acid bacteria", J. BACTERIOL., 2018

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024096123A1 (ja) * 2022-11-04 2024-05-10 株式会社バイオパレット 遺伝子が改変された微生物およびその生産方法

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