CN108753670A - 多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法 - Google Patents

多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种多功能复合微生态制剂纳米硒‑重组表达血管活性肠肽‑乳酸乳球菌及制备方法，能够将毒性的亚硒酸钠转化为无毒的红色单质纳米硒，并将合成的纳米硒富集于细胞内的益生菌—乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000。本发明还公开了基于乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000制备多功能复合微生态制剂SeNPs‑rVIP‑L.lactis NZ9000的方法，解决了现有补硒添加剂毒性作用强、生物利用率低、易造成环境污染，以及现有生产技术流程复杂、周期长、成产成本高的问题以及抗生素残留、耐药性等问题。

Description

多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸 乳球菌及制备方法
技术领域
本发明属于生物工程和纳米材料制备技术领域，涉及一种多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法。
背景技术
饲用抗生素的过度使用衍生出药物残留和抗药性两大严峻的问题，因此减少甚至禁止抗生素的使用并寻找适宜的替代物已到了刻不容缓的地步。近年来，世界上许多国家已出台相应政策来控制抗生素的使用。但是由于养殖行业的迅猛发展，养殖密度加大，养殖动物病害发病的风险提高，急需可替代抗生素的新型绿色饲料添加剂产品。时至今日，绿色、安全且无残留的新型绿色饲料添加剂——益生菌微生态制剂，以其改善宿主肠道菌群平衡、促进消化吸收、增强免疫力等功效正在逐步跻身于促生长饲料添加剂的行列以替代抗生素的使用。随着饲用微生态制剂产品研发的深入，现代生物技术在提升微生态制剂的理论和应用研究方面发挥着重要作用。
动物源性抗菌肽无毒副作用、难以产生耐药性、无残留与无污染等，众多的优点，符合畜产品安全生产的需要，适合在饲料生产中使用，具有作为新一代饲料添加剂的潜质。本课题组前期研究表明，隶属于抗菌肽家族成员的神经免疫调节肽VIP(Vasoactiveintestinal peptide)具有开发为防病保健饲料添加剂的优势和潜力：(1)结构简单明确；(2)具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种生物学活性；(3)作为内源性胃肠道激素类抗菌肽，以较小的作用浓度(nmoL级)就能发挥较强的生物活性。VIP本身具有的特性使它具有开发为高效、安全的防病保健饲料添加剂的潜力和广阔的应用前景。然而，从组织中提取VIP成本高、获得率低、工序繁琐，化学合成价格相当昂贵，难以应用于生产。因此，探索建立了利用益生菌—乳酸乳球菌生物合成抗菌肽VIP的新技术，使之成为新兴饲料和饲料添加剂的途径更为现实，并显示出良好前景。
硒是人和动物必需的微量元素，与机体健康密切相关。然而，目前在实际生产中如畜禽饲料中主要以无机硒—亚硒酸钠为添加形式，其毒性作用强、生物利用率低而易造成环境污染。此外，无机硒的使用剂量难以掌握，幼龄动物对硒较为敏感，易导致中毒。因此，开发高效、绿色的饲料硒类生物制剂乃当务之急。纳米硒(SeNPs)是一种利用纳米技术制备而成的新型生物活性物质。纳米硒的粒度极细，易被动物胃肠道直接吸收充分利用，能更大限度的发挥其功能。纳米硒是已发现的急性毒性最低、环境污染较小的补硒制剂。纳米硒的众多特性和优点将使它具有广阔的开发应用前景。以益生菌为载体合成具有生物功能的纳米硒(SeNPs)是一种绿色、高效的生物学途径。
发明内容
要解决的技术问题
为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法，将益生菌、抗菌肽与纳米硒三者有机结合，建立了一种多功能复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactic NZ9000的制备方法。以解决现有抗生素使用中存在的问题以及现有的食品和饲料中硒添加剂存在毒性作用强、水溶性差、生物利用率低、环境污染大，以及现有生产制备技术流程复杂、生产成本高、存在不安全因素等问题。
技术方案
一种多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌，其特征在于：命名为：SeNPs-rVIP-Lactococcus lactis NZ9000，缩写为：SeNPs-rVIP-L.lactisNZ9000；生物表达为：益生菌L.lactis NZ9000能够将毒性的亚硒酸钠转化为无毒的红色单质纳米硒SeNPs，并将纳米硒富集于菌体内；胞外含有重组分泌表达的抗菌肽VIP，胞内富集纳米硒SeNPs的乳酸乳球菌微生态制剂。
所述纳米硒富集在L.lactis NZ9000菌体细胞内，且纳米硒的粒径为50nm-180nm。
一种所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1、抗菌肽VIP的重组分泌表达载体的构建：
设计VIP基因序列：引入信号肽序列SPusp45，His标签和限制性内切酶识别位点；所述内切酶为Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ；
构建抗菌肽VIP的重组分泌表达载体：将抗菌肽VIP基因及载体pNZ8148分别进行双酶切，然后将酶切后的质粒pNZ8148和VIP基因进行连接，以将目的基因构建到表达载体上，获得VIP的重组表达质粒rVIP-pNZ8148后转化至MC1061感受态细胞；
构建步骤：使用双酶切连接法构建重组分泌表达载体时，按外源基因与质粒摩尔数比为3:1的比例进行混合，反应体系为10μL，16℃过夜，转化至MC1061感受态细胞：过程为：将制备好的MC1061感受态细胞迅速置于冰水浴中；将10μL连接体系加入到感受态细胞中，冰浴20min；42℃水浴脉冲30s，快速移至冰水浴中放置3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、200±10rpm摇床培养45min；取部分菌液涂布于LB平板；37℃倒置培养12-16h；所述LB平板是上含34μg/ml氯霉素；
所述MC1061感受态细胞的制备：挑取1个单克隆，加入5mL SOB培养基，37℃、200±10rpm培养至指数生长后期；取2mL菌液加入100mL SOB培养基中，于18℃、200rpm培养至OD600nm＝0.55，置于冰上10min；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全除去水滴，加入1/3体积的预冷工作液，用移液枪悬浮菌液；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全吸去水滴；加入1/12体积工作液，悬浮菌体；逐渐加入DMSO并混匀，冰上放置10min；分装进入1.5ml无菌离心管中，液氮放置1h后进行后续转化；所述DMSO的加入量为：0.3ml/50mL菌液；
步骤2、抗菌肽VIP的富硒诱导表达：
将重组质粒rVIP-pNZ8148电转至L.lactis NZ9000感受态细胞，得到VIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000重组菌，具体电转方法如下：将重组质粒rVIP-pNZ8148与L.lactis NZ9000的感受态细胞混合，冰浴5min；将混合物转入无菌预冷的2mm电转化杯中；于2.0kV、186Ω下电击；之后加入1ml冰预冷的含有3％甘油、5％蔗糖、20mM氯化镁及2mM氯化钙的M17培养基中30℃静置培养2h；取100μL菌液涂布于含有10μg/mL氯霉素的M17琼脂培养基上，30℃培养48h；重组菌接种至20mL的M17培养基于30℃静置培养过夜，加入亚硒酸钠Na2SeO3培养11～13h；取部分培养液按照4％的比例分别接种于50mL新鲜的M17培养基中，于30℃静置培养，当吸光度OD600nm达到0.4左右时，向培养基中加入诱导剂nisin诱导2.5h；诱导表达结束后，将整个发酵液冷冻干燥，即为该微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactisNZ9000；所述加入亚硒酸钠Na2SeO3的终浓度200μg/mL；所述加入诱导剂nisin的终浓度100ng/mL；
步骤3、重组表达抗菌肽VIP分离纯化：
诱导表达后的培养液于4℃、12000±1000rpm离心5min后，收集上清液A，并用20mmol/L的PBS清洗菌体，于4℃、12000±1000rpm离心5min，重复清洗1～2次；然后向菌体中加入溶菌酶，充分混匀后于37℃水浴孵育1h，反应过程颠倒混匀数次，离心后收取上清液B；将上清液A与B充分混合后经His-Trap HP亲和层析进行分离、纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，再经脱盐柱Sephadex G25脱盐后可得到纯化的重组表达抗菌肽VIP；所述PBS的pH7.0；所述溶菌酶终浓度为10mg/mL。
所述微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000中纳米硒含量的测定及其表征：采用原子吸收光谱—火焰分光光度计法测定纳米硒微球中硒含量。准确称取标准品溶液，以不含硒的溶液为空白对照，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。准确称取一定量样品，加入混酸HClO4+HNO3，硝化过夜至样品清澈透明，转移至容量瓶中。根据样品吸光度，从标准曲线中计算相应的硒的含量。并将富集有SeNPs的L.lactis NZ9000用PBS清洗后进行预包埋处理，1％饿酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察菌体内纳米粒的分布和粒径大小；所述混酸添加体积和比例为：HClO4∶HNO3＝1∶4，总体积为10ml。
所述抗菌肽VIP的重组表达水平用猪VIP ELISA试剂盒进行检测。
有益效果
本发明提出的一种多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌及制备方法，益生菌——乳酸乳球菌L.lactis NZ9000本身具有改善宿主肠道健康、促进生长、降低腹泻及免疫调节等作用。其次，细菌具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点，且利用微生物转化硒不受季节和气候的影响，生产周期短、无污染，是一种更为简便、经济、绿色、环保的制备技术。且基于乳酸乳球菌L.lactis NZ9000生物合成的纳米硒具有功效众多、急性毒性最低、环境污染较小、生物利用率高等优点。因此，本发明将益生菌、抗菌肽与纳米硒三者有机结合，制备的一种多功能复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactic NZ9000，其既具有乳酸菌的益生性，又可发挥抗菌肽和硒的生物学功能，并且直接以活菌制剂的形式进行饲喂，可以简化生产流程，降低生产成本，同时也降低了饲料中直接添加亚硒酸钠(Na2SeO3)所带来的负面效应，该产品将具有广阔的应用前景和很好的经济效益。
附图说明
图1.复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000的冻干粉；
图2.是富集有纳米硒的乳酸乳球菌L.lactic NZ9000的透射电镜(TEM)；
图3.复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000的抗菌活性；
图4.复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000的抗氧化活性。
具体实施方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
本发明提供了一种能将剧毒的亚硒酸钠生物转化为无毒的红色单质纳米硒，并将其富集于菌体内，同时胞外分泌表达抗菌肽VIP的工程菌rVIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000。
本发明所采用的技术方案是，利用L.lactic NZ9000胞外分泌表达抗菌肽VIP，并生物合成细胞内纳米硒，以制备复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactic NZ9000的方法，按照以下步骤实施：
步骤1、抗菌肽VIP的重组分泌表达载体的构建及鉴定：
在本发明中，抗菌肽VIP的重组表达采用乳酸球菌表达系统。pNZ8148质粒本身不是分泌型表达质粒，为实现VIP的分泌表达，在设计VIP基因序列时，引入信号肽序列SPusp45，将带有His标签和限制性内切酶(Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ)识别位点的抗菌肽VIP基因及载体pNZ8148分别进行双酶切，然后将酶切后的质粒pNZ8148和VIP基因进行连接，以将目的基因构建到表达载体上，获得VIP的重组表达质粒rVIP-pNZ8148。使用双酶切连接法构建重组分泌表达载体时，按外源基因与质粒摩尔数比为3:1的比例进行混合，反应体系为10μL，16℃过夜，转化至制备好的MC1061感受态细胞。
MC1061感受态细胞制备方法如下：从平板上挑取1个单克隆，加入5ml SOB培养基，37℃、200±10rpm培养至指数生长后期；取2ml菌液加入100ml SOB培养基中，于18℃、200rpm培养至OD600nm＝0.55，置于冰上10min；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全除去水滴，加入1/3体积的预冷工作液，用移液枪悬浮菌液；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全吸去水滴；加入1/12体积工作液，悬浮菌体。渐加入DMSO(0.3ml/50ml菌液)并混匀，冰上放置10min；分装进入1.5mlEP管中，液氮放置1h后进行后续转化。
rVIP-pNZ8148转化至MC1061感受态细胞的方法如下：将制备好的MC1061感受态细胞迅速置于冰水浴中；将10μL连接体系加入到感受态细胞中，冰浴20min；42℃水浴脉冲30s，快速移至冰水浴中放置3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、200±10rpm摇床培养45min；取部分菌液涂布于LB平板(含34μg/ml氯霉素)；37℃倒置培养12-16h。
重组表达质粒的鉴定：挑取在LB固定培养基上(含34μg/ml氯霉素)上长出的单克隆，接种到LB液体培养基(含34μg/ml氯霉素)中，37℃、200±10rpm摇床培养过夜后，抽提纯化质粒，然后经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切及DNA测序鉴定以证明抗菌肽VIP的表达载体构建成功；
步骤2、抗菌肽VIP的富硒诱导表达：
将重组质粒rVIP-pNZ8148电转至L.lactis NZ9000感受态细胞，得到rVIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000重组菌，具体电转方法如下：将pNZ8148空质粒(作为空白对照)及鉴定正确的重组质粒rVIP-pNZ8148分别与L.lactis NZ9000的感受态细胞混合，冰浴5min；将混合物转入无菌预冷的2mm电转化杯中；于2.0kV、186Ω下，立即电击；之后迅速加入1ml冰预冷的含有3％甘油、5％蔗糖、20mM氯化镁及2mM氯化钙的M17培养基中30℃静置培养2h；取100μL菌液涂布于含有10μg/mL氯霉素的M17琼脂培养基上，30℃培养48h。重组菌接种至20mL的M17培养基于30℃静置培养过夜，加入亚硒酸钠Na2SeO3(终浓度200μg/mL)培养12h左右，同时以L.lactis NZ9000和转化有空质粒pNZ8148的L.lactis NZ9000为对照。取部分培养液按照4％的比例分别接种于50mL新鲜的M17培养基中，于30℃静置培养，当吸光度OD600nm达到0.4左右时，向培养基中加入诱导剂nisin(终浓度100ng/mL)分泌诱导0,2，4,6，8h。
步骤3、重组表达抗菌肽VIP的分离、纯化
将诱导表达后的培养液于4℃、12000±1000rpm离心5min后，收集上清液A，并用20mmol/L PBS(pH7.0)清洗菌体，于4℃、12000±100rpm离心5min，重复清洗1～2次；然后向菌体中加入溶菌酶(终浓度为10mg/mL，溶于10mMTris-HCl)，充分混匀后于37℃水浴孵育1h,反应过程颠倒混匀数次，离心后收取上清液B；将上清液A与B充分混合后经His-Trap HP亲和层析进行分离、纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，再经脱盐柱Sephadex G25脱盐后可得到纯化的重组表达抗菌肽VIP。
步骤4、重组表达VIP的表达水平检测：
抗菌肽VIP的重组表达水平用猪VIP ELISA试剂盒进行检测。
步骤5、微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000中纳米硒含量的测定及其表征
采用原子吸收光谱—火焰分光光度计法测定纳米硒微球中硒含量。准确称取标准品溶液，以不含硒的溶液为空白对照，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。准确称取一定量样品，加入混酸HClO4+HNO3(1：4)10ml，硝化过夜至样品清澈透明，转移至容量瓶中。根据样品吸光度，从标准曲线中计算相应的硒的含量。并将富集有SeNPs的L.lactisNZ9000用PBS清洗后进行预包埋处理，1％饿酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察菌体内纳米粒的分布和粒径大小。
本发明提供由所述乳酸乳球菌L.lactis NZ9000制备的微生态制剂，其特征在于，纳米硒富集在L.lactis NZ9000菌体细胞内，且所述的纳米硒的粒径为50nm-180nm。
本发明提供由所述乳酸乳球菌L.lactis NZ9000制备的微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000，其特征在于，含有具有抗菌活性的抗菌肽VIP。
本发明提供由所述乳酸乳球菌L.lactis NZ9000制备的微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000，其特征在于，所述的微生态制剂具有较强的抗菌活性和抗氧化活性。
实施例：
分泌型重组表达抗菌肽VIP的质粒的构建方法
(1)抗菌肽VIP基因序列的设计及优化：
采用乳酸乳球菌表达系统，由于pNZ8148质粒本身不是分泌型表达质粒，为实现抗菌肽VIP在乳酸乳球菌中的分泌表达，在设计VIP基因序列时，引入信号肽序列SPusp45，为方便抗菌肽后续的分离纯化，在抗菌肽核苷酸序列中加入His标签识别序列(HHHHH)；使用KpnI和NcoI限制性内切酶构建重组质粒，在基因两端分别设计了与pNZ8148序列中KpnI和NcoI酶切位点相同的序列，新设计的重组抗菌肽VIP核苷酸序列为200bp。
此外，为了在乳酸乳球菌L.lactic NZ9000中高效表达，以不改变氨基酸序列为前提，对密码子进行优化，以提高其表达能力。
优化前后的重组抗菌肽VIP基因序列如下：
优化前：
GAATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGCTGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTT TACGCTCATCACCATCACCATCACTCGGATGCAGTCTTCACTGACAACTACACCCGCCTTCGCAAACAAATGGCTGTCAAGAAGTACTTGAACTCCATTCTAAATTAATGA
优化后：
GTATGAAAAAGAAAATTATTTCAGCTATTTTAATGTCAACAGTTATTTTATCAGCTGCTGCTCCATTATCAGGTGTT TATGCTCATCATCATCACCATCATTCAGATGCTGTTTTTACAGATAATTATACACGTTTACGTAAACAAATGGCTGTTAAAAAATATTTAAATTCAATTTTAAATTAATGA
上述序列中：方框显示分别为Nco I和Kpn I酶切位点，黑色斜体加粗部分为信号肽SPusp45序列，斜体部分为His标签序列，黑色加粗部分为VIP基因序列。
(2)抗菌肽VIP的重组分泌型表达质粒的构建及鉴定
将优化后的带有信号肽和His标签的VIP基因合成到pUC57载体上，然后将抗菌肽VIP基因及载体pNZ8148分别进行双酶切(Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ)，酶切后的质粒pNZ8148和VIP基因进行连接，以将目的基因构建到表达载体上，获得VIP的重组表达质粒rVIP-pNZ8148。使用双酶切连接法构建重组分泌表达载体时，按外源基因与质粒摩尔数比为3:1的比例进行混合，反应体系为10μL，16℃过夜，转化至制备好的MC1061感受态细胞，具体方法如下：将制备好的MC1061感受态细胞迅速置于冰水浴中；将10μL连接体系加入到感受态细胞中，冰浴20min；42℃水浴脉冲30s，快速移至冰水浴中放置3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、200±10rpm摇床培养45min；取部分菌液涂布于LB平板(含34μg/ml氯霉素)；37℃倒置培养12-16h。挑取在LB固定培养基上(含34μg/ml氯霉素)上长出的单克隆，接种到LB液体培养基(含34μg/ml氯霉素)中，37℃、200±10rpm摇床培养过夜后，抽提纯化质粒，然后经Nco Ⅰ和KpnⅠ双酶切及DNA测序鉴定以证明抗菌肽VIP的表达载体构建成功。
rVIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000工程菌的富硒诱导表达
将重组质粒rVIP-pNZ8148电转至L.lactis NZ9000感受态细胞，得到rVIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000重组菌，具体电转方法如下：将pNZ8148空质粒(作为空白对照)及鉴定正确的重组质粒rVIP-pNZ8148分别与L.lactis NZ9000的感受态细胞混合，冰浴5min；将混合物转入无菌预冷的2mm电转化杯中；于2.0kV、186Ω下，立即电击；之后迅速加入1ml冰预冷的含有3％甘油、5％蔗糖、20mM氯化镁及2mM氯化钙的M17培养基中30℃静置培养2h；取100μL菌液涂布于含有10μg/mL氯霉素的M17琼脂培养基上，30℃培养48h。重组菌接种至20mL的M17培养基于30℃静置培养过夜，加入亚硒酸钠Na2SeO3(终浓度200μg/mL)培养12h左右，同时以L.lactis NZ9000和转化有空质粒pNZ8148的L.lactis NZ9000为对照。取部分培养液按照4％的比例分别接种于50mL新鲜的M17培养基中，于30℃静置培养，当吸光度OD600nm达到0.4左右时，向培养基中加入诱导剂nisin(终浓度100ng/mL)诱导2.5h。诱导表达结束后，将整个发酵液冷冻干燥，如附图1所示，即为该微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactisNZ9000。
抗菌肽VIP的分离、纯化及鉴定
将诱导表达后的培养液于4℃、12000±1000rpm离心5min后，收集上清液A，并用20mmol/L PBS(pH7.0)清洗菌体，于4℃、12000±1000rpm离心5min，重复清洗1～2次；然后向菌体中加入溶菌酶(终浓度为10mg/mL)，充分混匀后于37℃水浴孵育1h,反应过程颠倒混匀数次，离心后收取上清液B；将上清液A与B充分混合后经His-Trap HP亲和层析进行分离、纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，再经脱盐柱Sephadex G25脱盐后可得到纯化的重组表达抗菌肽VIP。发酵液中重组VIP的表达水平用猪VIP ELISA试剂盒进行检测。
微生态制剂中纳米硒含量的测定及表征
采用原子吸收光谱—火焰分光光度计法测定纳米硒微球中硒含量。准确称取标准品溶液，以不含硒的溶液为空白对照，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。准确称取一定量样品，加入混酸HClO4+HNO3(1：4)10ml，硝化过夜至样品清澈透明，转移至容量瓶中。根据样品吸光度，从标准曲线中计算相应的硒的含量。并将富集有SeNPs的L.lactisNZ9000用PBS清洗后进行预包埋处理，1％饿酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察菌体内纳米粒的分布和粒径大小，结果如附图1所示，乳酸乳球菌L.lactis NZ9000将亚硒酸钠还原生成粒径大小为50-180nm的纳米硒。
重组表达的VIP的抗菌活性测定
将产肠毒素的大肠杆菌K88划线接种于MH固体培养基，37℃过夜培养；挑取单克隆菌落，接种于5mL MH液体培养基，37℃培养18h；取50μL培养液转接到5mL MH液体培养基中，37℃250rpm培养至OD600nm为0.6；将上述菌液稀释1000倍，使细菌数在1×105-5×105CFUs/mL，将稀释好的菌液加到96孔培养板中，每孔100μL，再加入100μL用培养基倍比稀释的VIP溶液，空白对照组为100μL菌液和100μL不含抗菌肽的培养基，阴性对照组为200μL的MH培养基；阳性对照组为相同浓度人工合成VIP溶液；将96孔培养板置于湿盒中，37℃静置培养过夜；取出96孔培养板用多功能酶标仪于630nm处测定吸光度值。如附图3所示，说明微生态制剂中含有的抗菌肽VIP具有较强的抗菌活性。
实施例6：富集纳米硒的乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的抗氧化活性
通过建立500μM H2O2诱导的猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞氧化损伤模型，研究了本发明制备的微生态制剂的抗氧化活性。将处于对数生长期的IPEC-J2细胞与富集纳米硒的乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(硒含量为4μg/mL)共培养8h后，将细胞暴露于含有500μM H2O2的无血清培养基中，继续培养12h后，用Hoechst 33342染色试剂盒进行活细胞染色，用Annexin V-FITC PI染色试剂盒检测细胞凋亡情况。细胞培养液中丙二醛(MDA)的水平和总的超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性用相应的试剂盒检测。结果如附图4所示，富集纳米硒的乳酸乳球菌L.lactis NZ9000显著抑制了H2O2诱导的IPEC-J2细胞凋亡，发挥了有效的抗氧化作用。
本发明将益生菌(乳酸乳球菌)、必需微量元素硒与抗菌肽—VIP三者有机结合，利用乳酸乳球菌表达系统高效重组表达饲料用抗菌肽—VIP，同时利用乳酸乳球菌L.lactis NZ9000对亚硒酸钠进行生物学转化而合成生物纳米硒(SeNPs)，自行设计建立了一种多功能复合微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000的制备方法，并对其抗菌和抗氧化活性进行了评价。通过对构建的工程菌rVIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000进行富硒诱导表达，然后喷雾干燥可直接制备成富含纳米硒和抗菌活性成分的饲料添加剂，亦或将发酵后富硒菌体经分离纯化出纳米硒微球，并制备成粉剂、液体等抗氧化制剂，发酵液中的重组表达的VIP经分离纯化，可制备成抗菌剂。基于L.lactis NZ9000通过生物工程制备的新型具有抗菌、抗氧化活性的微生态制剂可作为畜禽饲料添加剂用于疾病的预防和治疗。该发明解决了目前抗生素使用中存在的药物残留、耐药性等问题以及现有补硒添加剂毒性作用强、生物利用率低、易造成环境污染，以及现有生产技术流程复杂、周期长、成产成本高的问题。

Claims (5)

1.一种多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌，其特征在于：命名为：SeNPs-rVIP-Lactococcus lactis NZ9000，缩写为：SeNPs-rVIP-L.lactisNZ9000；生物表达为：益生菌L.lactis NZ9000能够将毒性的亚硒酸钠转化为无毒的红色单质纳米硒SeNPs，并将纳米硒富集于菌体内；胞外含有重组分泌表达的抗菌肽VIP，胞内富集纳米硒SeNPs的乳酸乳球菌微生态制剂。
2.根据权利要求1所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌，其特征在于：所述纳米硒富集在L.lactis NZ9000菌体细胞内，且纳米硒的粒径为50nm-180nm。
3.一种权利要求1或2所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1、抗菌肽VIP的重组分泌表达载体的构建：
设计VIP基因序列：引入信号肽序列SPusp45，His标签和限制性内切酶识别位点；所述内切酶为NcoⅠ和KpnⅠ；
构建抗菌肽VIP的重组分泌表达载体：将抗菌肽VIP基因及载体pNZ8148分别进行双酶切，然后将酶切后的质粒pNZ8148和VIP基因进行连接，以将目的基因构建到表达载体上，获得VIP的重组表达质粒rVIP-pNZ8148后转化至MC1061感受态细胞；
构建步骤：使用双酶切连接法构建重组分泌表达载体时，按外源基因与质粒摩尔数比为3:1的比例进行混合，反应体系为10μL，16℃过夜，转化至MC1061感受态细胞：过程为：将制备好的MC1061感受态细胞迅速置于冰水浴中；将10μL连接体系加入到感受态细胞中，冰浴20min；42℃水浴脉冲30s，快速移至冰水浴中放置3min，加入1mL LB液体培养基，37℃、200±10rpm摇床培养45min；取部分菌液涂布于LB平板；37℃倒置培养12-16h；所述LB平板是上含34μg/ml氯霉素；
所述MC1061感受态细胞的制备：挑取1个单克隆，加入5mL SOB培养基，37℃、200±10rpm培养至指数生长后期；取2mL菌液加入100mL SOB培养基中，于18℃、200rpm培养至OD600nm＝0.55，置于冰上10min；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全除去水滴，加入1/3体积的预冷工作液，用移液枪悬浮菌液；在4℃条件下2500±100g离心10min，收集菌体，弃上清，完全吸去水滴；加入1/12体积工作液，悬浮菌体；逐渐加入DMSO并混匀，冰上放置10min；分装进入1.5ml无菌离心管中，液氮放置1h后进行后续转化；所述DMSO的加入量为：0.3ml/50mL菌液；
步骤2、抗菌肽VIP的富硒诱导表达：
将重组质粒rVIP-pNZ8148电转至L.lactis NZ9000感受态细胞，得到VIP-pNZ8148/L.lactis NZ9000重组菌，具体电转方法如下：将重组质粒rVIP-pNZ8148与L.lactisNZ9000的感受态细胞混合，冰浴5min；将混合物转入无菌预冷的2mm电转化杯中；于2.0kV、186Ω下电击；之后加入1ml冰预冷的含有3％甘油、5％蔗糖、20mM氯化镁及2mM氯化钙的M17培养基中30℃静置培养2h；取100μL菌液涂布于含有10μg/mL氯霉素的M17琼脂培养基上，30℃培养48h；重组菌接种至20mL的M17培养基于30℃静置培养过夜，加入亚硒酸钠Na2SeO3培养11～13h；取部分培养液按照4％的比例分别接种于50mL新鲜的M17培养基中，于30℃静置培养，当吸光度OD600nm达到0.4左右时，向培养基中加入诱导剂nisin诱导2.5h；诱导表达结束后，将整个发酵液冷冻干燥，即为该微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000；所述加入亚硒酸钠Na2SeO3的终浓度200μg/mL；所述加入诱导剂nisin的终浓度100ng/mL；
步骤3、重组表达抗菌肽VIP分离纯化：
诱导表达后的培养液于4℃、12000±1000rpm离心5min后，收集上清液A，并用20mmol/L的PBS清洗菌体，于4℃、12000±1000rpm离心5min，重复清洗1～2次；然后向菌体中加入溶菌酶，充分混匀后于37℃水浴孵育1h，反应过程颠倒混匀数次，离心后收取上清液B；将上清液A与B充分混合后经His-Trap HP亲和层析进行分离、纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，再经脱盐柱Sephadex G25脱盐后可得到纯化的重组表达抗菌肽VIP；所述PBS的pH7.0；所述溶菌酶终浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求3所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述微生态制剂SeNPs-rVIP-L.lactis NZ9000中纳米硒含量的测定及其表征：采用原子吸收光谱—火焰分光光度计法测定纳米硒微球中硒含量。准确称取标准品溶液，以不含硒的溶液为空白对照，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。准确称取一定量样品，加入混酸HClO4+HNO3，硝化过夜至样品清澈透明，转移至容量瓶中。根据样品吸光度，从标准曲线中计算相应的硒的含量。并将富集有SeNPs的L.lactis NZ9000用PBS清洗后进行预包埋处理，1％饿酸固定，酒精梯度脱水，包埋剂处理，70℃加热，切片染色后，在透射电镜下观察菌体内纳米粒的分布和粒径大小；所述混酸添加体积和比例为：HClO4∶HNO3＝1∶4，总体积为10ml。
5.根据权利要求3所述多功能复合微生态制剂纳米硒-重组表达血管活性肠肽-乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽VIP的重组表达水平用猪VIP ELISA试剂盒进行检测。
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