KR20220050124A - 외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

VIP 유전자를 발현하는 미생물, 그 미생물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물, 키트, 및 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

외래 단백질을 발현하는 미생물, 및 그의 용도{Microorganism expressing heterologous protein, and use thereof}

VIP 유전자를 발현하는 미생물, 그 미생물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물, 키트, 및 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

혈관 작동성 장 펩티드(vasoactive intestinal peptide: VIP)는 장에서 혈관 작동성인 펩티드 호르몬이다. VIP는 글루카곤/세크레틴 수퍼패밀리, 클라스 II G 단백질-결합 수용체의 리간드에 속하는 28 아미노산 잔기를 갖는 펩티드이다.

미국특허 9,561,262는 VIP 및 항-고혈압제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 고혈압을 치료하는데 사용하기 위한 방법을 개시하고 있다.

종래 기술에 의하더라도 VIP 유전자를 발현하는 미생물 및 그를 염증성 장 질환을 치료하는데 사용하는 것에 대한 요구가 있다.

일 양상은 VIP를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 재조합 미생물을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물을 포함하는 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 미생물 및 TNF-알파 차단제를 포함하는 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다.

다른 양상은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 VIP를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 재조합 미생물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, 용어 "VIP" 또는 "VIP 단백질" 또는 "VIP 폴리펩티드"는 본원에 기술된 바와 같은 생물학적 활성 중 하나 이상을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 지칭한다. 사람에서, 사람 게놈 상의 염색체 6의 q25 영역은 길이가 170 아미노산인 세크레틴 패밀리 멤버를 코딩한다. 길이 170 아미노산의 이 멤버는 번역 후 잘려져 혈관 작동성 장 펩티드(VIP)를 형성한다. VIP 폴리펩티드의 활성 형태는 혈압을 낮추는 것, 혈관벽의 확장(vasodilation)을 증가시키는 것, 호흡기 계통 및 위장관 조직에서 평활근을 이완시키는 것(relax), Th1 반응의 감소뿐만 아니라 Th2의 촉진을 통하여 면역 반응을 감소시키는 것, 선천적 및 획득 면역반응을 조절하는 것, 또는 내장에서 전해질의 분비를 촉진하는 것의 기능을 한다. 또한, VIP는 신경전달 물질로서 중추 신경계에서 및 림프구와의 소통에서 활성적인 것이 밝혀졌다. VIP의 생물활성은 알려진 3가지 수용체를 통하여 전달된다: VIP₁R, VIP₂R, 및 PAC₁R. 이들 수용체들은 세포내 칼슘의 생산뿐만 아니라 cAMP 농축을 야기하는 것으로 알려져 있다. VIP와 같이 세크레틴에 대한 이들의 친화도는 서브타입과 리간드의 아미노산 서열에 따라 달라진다. 사람 천연 VIP는 혈류에서 약 2분의 반감기를 가지고 있어서, 짧은 반감기를 가지고 있다. 따라서, 본 명세서에 언급된 VIP는 천연 VIP의 기능을 흉내내는 변이체를 포함한다. 상기 변이체는 천연 VIP 보다 증가된 반감기를 갖고 천연 VIP에 비하여 동등 이상의 생물활성을 갖는 것을 포함한다.

본 발명의 VIP는 인간 VIP, 재조합 인간 VIP, 쥐 VIP 및/또는 재조합 마우스 VIP를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 상기 VIP는 서열번호 1의 아미노산 서열과 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열을 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 VIP는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 각각 갖는 것일 수 있다. 서열번호 2의 VIP는 사람 유래 천연 VIP이다. 서열번호 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열을 갖는 VIP는 사람 유래 천연 VIP 변이체 VIP1, VIP2, VIP3, VIP4, VIP5, VIP6, VIP7, 및 VIP8이다.

본원에서 사용된 상기 VIP 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 공급원과 같은 다양한 공급원으로부터 단리되거나 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 용어 "VIP 폴리펩티드"는 또한 VIP 폴리펩티드의 변이체를 포함한다. 본 발명의 VIP는 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 VIP를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.

상기 미생물은 VIP의 발현을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 VIP를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 카피 수를 증가시키는 것은 외래 유전자의 미생물로 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 도입은 형질전환, 형질도입, 형질감염 또는 전기천공에 의한 것일 수 있다. 도입된 상기 외래 유전자는 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 통합되지 않고 존재하는 것일 수 있다.

상기 미생물은 VIP를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 조절하는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터, 또는 신호 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 유산균에서 전사 개시 효율이 종래의 프로모터 예를 들면, P11 프로모터와 같거나 그보다 큰 것일 수 있다. 상기 프로모터는 또한 유도성 프로모터일 수 있다. 상기 유도성 프로모터는 예컨대, 니신 유도성 프로모터(Nisin inducible promoter)일 수 있다. 상기 프로모터는 Lactobacillus paracasei 유래의 PR4(서열번호 10)일 수 있다. 상기 신호 폴리펩티드는 외래 단백질 유전자와 인 프레임으로 연결되는 경우, 세포 외로 분비시키는 능력이 종래의 신호 폴리펩티드, 예를 들면, USP45 신호 폴리펩티드보다 큰 것일 수 있다. 상기 신호 폴리펩티드는 Lactobacillus paracasei 유래의 SP4(서열번호 11)의 것일 수 있다. 상기 미생물은 VIP를 세포 외로 분비시키는 것일 수 있다.

상기 미생물은 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 상기 그람 양성 박테리아는 유산균일 수 있다. 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 와이셀라(Weissella), 페디오코커스(Pediococcus), 또는 엔테로코커스(Enterococcus) 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 유산균은 Lactobacillus paracasei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum 또는 Lactococcus lactis인 것일 수 있다. 상기 유산균은 Lactobacillus plantarum LMT1-9 (KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21 (KCTC 13422BP), 또는 Lactobacillus brevis LMT1-46 (KCTC 13423BP)일 수 있다.

다른 양상은 상기한 미생물을 포함하는 위장관(gastrointestinal tract)의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것일 수 있다. 상기 질환은 염증성 장질환(IBD), 및 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)인 것일 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 염수 용액(phosphate buffered saline solution), 덱스트로스의 5 % 수용액 및 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼)과 같은 임의의 표준 약제학적 또는 식품적 담체를 의미한다. 부형제의 비제한적인 예는 보조제, 결합제, 충전제, 희석제, 붕해제, 유화제, 습윤제, 윤활제, 활택제, 감미제, 향료 및 착색제를 포함한다. 바람직한 약학적 또는 식품적 담체는 활성제의 의도된 투여 방식에 의존한다. 전형적인 투여 방식은 장내 (예를 들어, 경구) 투여를 포함한다. 상기 조성물은 단일 투여 제형(unit dosage form)일 수 있다. 상기 조성물은 경구 투여 제형을 가질 수 있다. 상기 조성물은 식품 또는 의약 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 상기 미생물의 건조물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 상기 미생물의 배지를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, "약학적으로 또는 식품적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable or acceptable for food)"은 개체에 투여되었을 때 부작용(adverse reactions)을 실질적으로 일으키지 않는 것을 나타낸다. 상기 부작용은 독성, 알레르기, 또는 면역반응일 수 있다.

다른 양상은 상기한 재조합 미생물 및 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물을 포함하는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 재조합 미생물은 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 상기 키트는 재조합 미생물 및 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물을 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하도록 지시하는 지침서를 포함할 수 있다.

상기 다른 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물은 위장관의 손상 질환, 예를 들면 염증성 장 질환을 치료하는 약물이면 어느 것이나 포함된다. 위장관의 손상 질환을 치료하는 약물은 하기 약물을 포함할 수 있다.:

(i) 스테로이드성 항 염증제

dexamethasone, hexestrol, methimazole, betamethasone, triamcinolone, triamcinolone acetonide, fluocinonide, fluocinolone acetonide, predonisolone, methylpredonisolone, cortisone acetate, hydrocortisone, fluorometholone, beclomethasone dipropionate, estriol, paramethasone acetate, fludrocortisone acetate, clobetasol propionate, diflorasone acetate, dexamethasone propionate, difluprednate, betamethasone dipropionate, budesonide, diflucortolone valerate, amcinonide, halcinonide, mometasone furoate, hydrocortisone butyrate propionate, flumetasone pivalate, clobetasone butyrate, dexametasone acetate 등.

(ii) 5-아미노살리실산

sulfasalazine, mesalazine, olsalazine, balsalazide 등.

(iii) 면역조절제(immunomodulator) 또는 면역 억제제(immunosuppressant)

methotrexate, cyclophosphamide, MX-68, atiprimod dihydrochloride, BMS-188667, CKD-461, rimexolone, cyclosporine, tacrolimus, gusperimus, azathiopurine, antilymphocyte serum, freeze-dried sulfonated normal immunoglobulin, erythropoietin, colony stimulating factor, interleukin, interferon 등.

(iv) JAK 저해제

tofacitinib, ruxolitinib 등.

(v) TNF 저해제

재조합 TNF-알파-수용체 IgG-Fc 융합 단백질(etanercept), infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, golimumab, PASSTNF-α, soluble TNF-α receptor, TNF-α binding protein, anti-TNF-α antibody, CDP571 등.

(vi) 인테그린 저해제

natalizumab, vedolizumab, AJM300, TRK-170, E-6007 등.

(vii) 인터류킨-12/23 저해제

ustekinumab, briakinumab (anti-interleukin-12/23 antibody) 등.

(viii) 비-스테로이드성 항염증제(NSAID)

(a) 고전적 NSAID

alcofenac, aceclofenac, sulindac, tolmetin, etodolac, fenoprofen, thiaprofenic acid, meclofenamic acid, meloxicam, tenoxicam, lornoxicam, nabumeton, acetaminophen, phenacetin, ethenzamide, sulpyrine, antipyrine, migrenin, aspirin, mefenamic acid, flufenamic acid, diclofenac sodium, ketophenylbutazone, loxoprofen sodium, phenylbutazone, indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, oxaprozin, flurbiprofen, fenbufen, pranoprofen, floctafenine, piroxicam, tenoxicam, epirizole, tiaramide hydrochloride, zaltoprofen, gabexate mesylate, camostat mesylate, ulinastatin, colchicine, probenecid, sulfinpyrazone, bucolome, benzbromarone, allopurinol, sodium aurothiomalate, hyaluronate sodium, sodium salicylate, salicylic acid, atropine, scopolamine, levorphanol, oxymorphone 또는 그의 염 등.

(b) 시클로옥시게나제 저해제 (COX-1 선택적 저해제, COX-2 선택적 저해제 등)

살리실산 유도체 (예, celecoxib, aspirin), etoricoxib, valdecoxib, diclofenac sodium, indomethacin, loxoprofen 등.

(c) 니트릭옥시드-방출 NSAID (nitric oxide-releasing NSAIDs).

다른 양상은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료학적 유효한 양의 상기 미생물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하기에 유효한 양의 TNF-알파 차단제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제를 개체에게 투여하는 단계는 상기 미생물을 개체에게 투여하는 단계와 동시, 전, 또는 후에 수행하는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 상기 미생물이 투여되는 경로와 동일 또는 다른 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 TNF-알파 차단제는 경구 또는 비경구로 투여되는 것일 수 있다. 상기 비경구는 혈관 주사, 복강, 또는 피하 주사와 같은 주사일 수 있다. 예를 들면, 상기 TNF-알파 차단제는 복강 내로 투여되고, 상기 미생물은 경구로 투여되는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 상기 미생물이 경구로 투여된 후, 복강 내로 투여되는 것일 수 있다. 상기 TNF-알파 차단제는 1회 투여 당 5mg 내지 100mg, 5mg 내지 50mg, 5mg 내지 40mg, 10mg 내지 50mg, 또는 20mg 내지 50mg의 양으로 투여되는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 질환은 위장관 염증을 야기하는 것일 수 있다. 상기 질환은 염증성 내장 질환(inflammatory intestinal disease), 자가면역 질환(autoimmune disease), 방사선(radiation)에 의한 위장관의 손상 또는 이식편 대 숙주 질환(graft versus host disease: GVHD), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease: IBD), 및 만성 대장염을 포함한 대장염(colitis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 "투여(administering 또는 administration)"는 상기 미생물을 생리적 시스템(개체 또는 인 비보, 인 비트로, 또는 엑스 비보 세포, 조직 및 기관)에 상기 미생물, 그를 포함하는 조성물, 또는 치료적 처치(therapeutic treatment)를 주는 행위를 나타낸다. 따라서, 상기 방법에서, 상기 미생물은 상기한 조성물의 형태일 수 있다. 사람 몸에 투여하는 수용가능한 경로(route)는 입, 또는 점막(예, 장내 점막, 경구 점막 또는 부칼)일 수 있다. 상기 투여는 추가의 치료적 작용제(therapeutic agent)와 조합으로 투여될 수 있다. 상기 조합 투여는 동시 및 연속 중 어느 순서도 포함한다.

본 명세서에 있어서, 용어 "치료(treatment)"는 예방적 치료(prophylatic treatment) 또는 치료적 치료(therapeutic treatment)를 나타낸다. 특정 실시 양태에서, "치료"는 치료 또는 예방 목적을 위해 미생물 또는 조성물을 개체에게 투여하는 것을 나타낸다.

"치료적(therapeutic)" 치료는 징후(signs) 또는 증상(symptoms)을 감소시키거나 제거하기 위한 병리학적 징후 또는 증상을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포성, 조직학적, 기능적 또는 물리적, 주관적 또는 객관적일 수 있다.

"예방적(prophylactic)" 치료는 병리(pathology) 발생 위험을 줄이기 위해 질병의 징후를 나타내지 않거나 질병의 초기 징후만을 나타내는 개체에게 투여하는 치료이다. 본 명세서 기재된 미생물 또는 조성물은 병리 발생의 가능성(likelihood)을 줄이거나, 발생되었다면 상기 병리의 심각성을 최소화하기 위하여 예방적 치료로서 제공될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "치료적 유효한 양(therapeutically effective amount)"은 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양을 나타낸다. 유효한 양은 실험적으로 결정될 수 있다. 유효한 양은 예를 들면, 상기 미생물이 VIP를 세포 외로 분비하는 정도에 따라 결정될 수 있다. 예를 들면, 60kg 체중을 갖는 사람에 대하여, 1일 0.01 내지 300 mg, 또는 0.5 내지 100 mg의 VIP를 분비할 수 있는 상기 미생물의 수일 수 있다. 예를 들면, 개체에 대하여 개체 당 1회 투여당 1x10⁷ 내지 1x10¹¹cfu, 1x10⁷ 내지 1x10¹⁰cfu, 1x10⁸ 내지 1x10¹¹cfu, 1x10⁸ 내지 1x10¹⁰cfu, 2.5x10⁸ 내지 7.5x10⁹cfu, 5.0x10⁸ 내지 5.0x10⁹cfu, 7.5x10⁸ 내지 2.5x10⁹cfu, 또는 약 1x10⁹cfu로 투여되는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 말, 돼지, 소, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 양, 또는 염소일 수 있다. 상기 개체는 사람이 아닌 포유동물일 수 있다.

일 양상에 따른 재조합 미생물은 VIP를 생산 및 분비할 수 있다.

다른 양상에 따른 조성물 또는 키트는 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한 용도로 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 위장관의 손상을 야기하는 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 의하면, 위장관의 손상을 야기하는 질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 pMT447 벡터의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 pMT447 벡터로 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46 균주의 배양 상등액에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. plantarum LMT1-9 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 4는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. paracasei LMT1-21 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 5는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. brevis LMT1-46 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 6은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다.
도 7은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 조직병리학적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 에타너셉트(etanercept) (Enbrel, 한국화이자제약)의 병용 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다.
도 9는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다.
도 10은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 조직병리학적 결과로 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: VIP 유전자를 발현하는 유산균 세포 및 그의 IBD 치료 효과

본 실시예에서는 VIP 유전자를 유산균 세포에 도입하고, 상기 유전자가 발현되어 그 산물이 세포 외로 분비되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 VIP 유전자로 형질전환된 유산균 세포가 IBD 치료에 효과가 있는지를 개체에 경구로 투여하고, 그 증상 개선을 확인하였다. VIP는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 사람 VIP 변이체를 사용하였다. 상기 VIP 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 사람의 천연 VIP에서 4개 아미노산 잔기가 치환된 것으로서, 사람 혈류에서 증가된 반감기를 갖는 것이다.

1. VIP 유전자를 포함하는 벡터 제작

서열번호 14의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 VIP 유전자는 마크로젠사(한국)에서 DNA를 합성하여 사용하였다. 합성된 VIP 유전자 절편과 유산균(Lactic Acid Bacteria: LAB)-대장균 셔틀 벡터 pMT54-PR4-SP4(서열번호 13)를 각각 SalI 및 XhoI 제한효소의 존재하에서 접촉시켜 절단하였다. 반응액 중 절단된 유전자 단편 및 벡터를 gel purification kit(GeneAll 사)를 이용하여 정제한 후, 절단된 유전자 단편 및 벡터를 알칼리 포스파타제의 존재하에서 인큐베이션하여 탈인산화하여, 탈인산화된 절단된 VIP 유전자 단편 및 절단된 pMT54-PR4-SP4 벡터를 얻었다.

이렇게 준비한 벡터 DNA 1ul 및 VIP 유전자 DNA 3ul와 T4 DNA 리가제(Takara) 0.5ul, 완충용액 1ul 및 증류수 5.5ul를 테스트 튜브 중에서 혼합하여 총 부피를 10ul로 한 후 16℃에서 12시간 인큐베이션하여 VIP 유전자 DNA과 벡터 단편을 연결하여, VIP 유전자를 포함하는 벡터를 얻었다. 이 벡터를 삼브룩 등의 방법 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn, 1989)을 사용하여 대장균 Top10 컴페턴트 균주(TOP10 Competent Cells)에 형질전환시켰다.

형질전환된 대장균을 클로람페니콜 10ug/ml이 포함된 LB(Luria-Bertani)-아가 함유 플레이트에 도말하고 인큐베이션하였다. 그 결과, 형성된 콜로니를 선발하고 배양하고 그 배양물로부터 상기 벡터를 분리하였다. 이 벡터를 pMT447이라고 명명하였다. pMT447 벡터는 VIP 유전자가 PR4 프로모터와 SP4의 신호 펩티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 따라서, pMT447 벡터에 의하여 형질전환된 세포는 VIP 유전자를 높은 효율로 발현시키고, 세포 외로 분비한다.

도 1은 pMT447 벡터의 구성을 나타낸 도면이다. 도 1에서, promoter는 서열번호 10의 PR4 프로모터 서열이며, SP는 서열번호 11의 SP4 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 12)을 나타내고, VIP는 서열번호 1의 사람 VIP 변이체를 코딩하는 유전자(서열번호 14)를 나타낸다. HA 및 6xHis는 사람 인플루엔자 헤마글루티닌(human influenza hemagglutinin) 태그와 6개 히스티딘을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로서, 단백질의 검출, 분리, 및 정제를 위한 것이다. E.coli ori, Rep, 및 CM는 각각 대장균 복제 원점, 유산균 복제원점(replication origin), 및 클로람페니콜 내성 마커 유전자를 나타낸다.

2. 재조합 벡터를 유산균 세포에 도입

1절에서 제작된 재조합 벡터 pMT447 벡터를 Lactobacillus plantarum LMT1-9(KCTC 13421BP), Lactobacillus paracasei LMT1-21(KCTC 13422BP), 및 Lactobacillus brevis LMT1-46(KCTC 13423BP)에 각각 도입하고, VIP 단백질이 분비되는지를 확인하였다.

상기 각 균주를 50mL의 MRS 배지(Difco Co., USA) 함유 플라스크 중에서 OD₆₀₀이 0.5가 될 때까지 배양한 후 4℃, 7,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 25mL 냉 EPS(ice-cold electroporation solution)(1mM K₂HPO₄, 1mM KH₂PO₄, pH 7.4, 1mM MgCl₂, 및 0.5 M 수크로스 함유)로 2회 세척하였다. MRS는 De Man, Rogosa 및 Sharpe agar 배지라고도 한다.

세척 후 1ml 냉 EPS에 세포를 재현탁하고 전기천공법에 사용될 컴피턴트 세포를 제조하고 -80℃저온 냉동고(deep freezer)에 보관하였다. 컴피턴트 세포 40μl와 각 벡터 DNA (1μg/μl) 1μl를 큐벳에 넣고 5분 동안 얼음에 방치하였다. 25μF, 8kV/cm, 400 ohms 조건에서 전기펄스를 준 후, 즉시 1ml MRS 액체 배지에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양된 세포를 10μg/ml 클로람페니콜이 포함된 MRS 배지('MRS-CM'이라고도 함)에 도말하고 48시간 동안 37℃에서 배양하였다.

이렇게 얻어진 pMT447 벡터가 도입된 각 균주를 MRS 액체 배지에서 37℃, 16시간 동안 정치 배양하였다. 배양물을 MRS 액체 배지에 3(v/v)%가 되도록 접종한 후 8시간 동안 동일한 온도에서 정치 배양하였다. 배양물 1ml를 7,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 취하였다. 상등액 1ml에 트리클로로아세트산 100μl를 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 정치하여, 배양 성분을 농축하였다. 반응물을 4℃, 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 1ml 찬 아세톤으로 1회 세척하고, 상온에서 10분 동안 말린 후 Tris-HCl 버퍼(pH 8.8) 100μl로 용출하였다.

용출액에 4x 로딩 버퍼(Thermo), 및 10x 환원제(Thermo)를 첨가한 후 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하였다. 상기 겔을 Trans blot semi-dry cell (biorad)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막에 전달하여, 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 구체적으로, 상기 막을 1% 탈지우유(skim milk) 함유 TBST 버퍼로 1시간 동안 차단하고 항-HA 항체(Santa cruz)를 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후 TBST로 5분씩 3번 세척 후 ECL로 검출하였다. pMT447 벡터에서, VIP 유전자는 그의 3' 말단 측에 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA) 유전자와 작동가능하게 연결되어 있어서, HA 태그된 상태로 발현된다.

도 2는 pMT447 벡터로 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46 균주의 배양 상등액에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도면이다. 도 2에서, 2, 3, 및 4 레인은 pMT447 벡터로 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46을 각각 나타내고, 1 레인은 표준 단백질 래더를 나타낸다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 형질전환 균주는 hVIP 변이체를 효과적으로 분비하였다.

3. VIP를 분비하는 유산균의 DSS 유도된 모델에서 IBD에 대한 효능

2절에 기술된 상기 형질전환된 L. plantarum LMT1-9, L. paracasei LMT1-21, 및 L. brevis LMT1-46을 덱스트란 술페이트 소듐염(Dextran Sulfate Sodium Salt: DSS)으로 유도된 생쥐 장염(colitis) 모델에 경구 투여한 후, 생쥐의 생존율과 질병활성 지수(disease activity index: DAI) 점수를 확인하여, 상기 균주에 의한 장 염증 치료 효과를 평가하였다.

(1) 재조합 미생물 단독 투여

구체적으로, 상기 형질전환된 균주를 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 10ml MRS 배지 함유 플라스크에서 24시간 37℃에서 1차 정치 배양하였다. 다음날, 배양된 균주를 300 내지 600ml의 MRS CM 배지에 OD₆₀₀이 0.01이 되도록 접종하고, 1차 배양과 동일한 조건에서 2차 배양하였다. 약 16 내지 18 시간 후 배양물의 OD₆₀₀이 2 내지 3이 되면 배양물을 7,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 세포를 마리당 1회 1x10⁹cfu로 투여할 수 있도록 1xPBS에 부유시켰다. 이 세포 함유 PBS 용액을 개체에 경구 투여(마리당 1 회 1x10⁹cfu) 및 음수 투여를 병행하여 1일 1회, 총 16일 동안 수행하였다.

먼저, 실험동물로는 8 내지 10주령 수컷 Balb/c mice (20 내지 25g, 각군 10마리)(ORIENTBIO 사)가 사용되었다. 최초 균주 투여일을 Day-7일로 설정하고, DSS는 멸균 수 중에 2(v/v)%로 희석하여 0일부터 6일에 음수로서 PBS군을 제외한 모든 군에 공급하였다. 마우스는 자의적으로 음수를 섭취하나 일반적으로 하루에 6ml 이내를 섭취한다. 9일에 마우스를 희생시켰다.

DSS 투여한 후 2일 간격으로 마우스 생존율을 확인하였고, 체중, 털의 곤두섬, 동물의 움직임 정도, 및 설사 여부를 검사하여 DAI 점수를 산정하였다.

질환 활성지수(Disease activity index: DAI) 점수 부여(scoring)는 Ameho, Gut 1997; 41:487~493와 Wallace, Gastroenterology 1989; 96: 29~36을 참고하였다. 그 결과를 도 3 내지 도 6에 나타내었다.

도 3은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. plantarum LMT1-9 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 3에서 1-9 VIP는 L. plantarum LMT1-9에 pMT447이 형질전환된 균주를 나타낸다. 1-9 vector는 L. plantarum LMT1-9에 대조군 벡터 (VIP 유전자가 없는 모벡터)가 형질전환된 균주를 나타낸다.

도 4는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. paracasei LMT1-21 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 4에서 1-21 VIP는 L. paracasei LMT1-21에 pMT447이 형질전환된 균주를 나타낸다. 1-21 vector는 L. paracasei LMT1-21에 대조군 벡터 (VIP 유전자가 없는 모벡터)가 형질전환된 균주를 나타낸다.

도 5는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 L. brevis LMT1-46 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 5에서 1-46 VIP는 L. brevis LMT1-46에 pMT447이 형질전환된 균주를 나타낸다. 1-46 vector는 L. brevis LMT1-46에 대조군 벡터(VIP 유전자가 없는 모벡터)가 형질전환된 균주를 나타낸다.

도 3 내지 5에서, CyA는 cyclosporinA의 약자로 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. PBS는 균을 처리하지 않고 DSS만 처리한 대조군 그룹이다. Normal은 균과 DSS 어떤 것도 처리하지 않은 그룹을 나타낸다.

도 6은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다. 각각의 균주 및 화학물질에 대한 설명은 위에 언급되었으며 DAI AUC는 8일차까지 DAI SCORE의 곡선하 면적(area under the curve)을 나타낸다.

도 3 내지 6에 나타낸 바와 같이, VIP를 발현시키도록 형질전환된 Lactobacillus 균주는 DSS로 유도한 장염증 모델에서 치료 효과가 있었다.

도 7은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 형질전환 균주 유래 VIP의 치료효능을 조직병리학적으로 나타낸 도면이다. 도 7에서, Normal, PBS, LMT1-9 vector, LMT1-9 VIP, LMT1-46 vector, LMT1-46 VIP, LMT1-21 vector, 및 LMT1-21 VIP는 도 1 내지 6에서 설명한 바와 같다.

도 7에 나타낸 바와 같이, DSS로 유도한 장염증 마우스 모델에서 현미경을 통하여 대장의 조직병리학적 검사를 수행하였는바, VIP를 발현하는 Lactobacillus 균주를 투여한 마우스는 대조군에 비하여 치료 효능이 있는 것이 확인되었다.

구체적으로, 도 7에 나타낸 바와 같이, DSS로 유도한 장염증 마우스 모델에서 현미경을 통하여 대장의 조직병리학적 검사를 수행하였는바, 단핵 세포의 침윤, 점막 손상 등이 DSS 군에서 가장 심각하게 나타났으며, LMT 1-9 vector, LMT 1-21 vector, 및 LMT 1-46 vector 투여군은 병증에 대한 큰 개선 효과를 보이지 못했다. 반면, LMT 1-9 VIP, 1-21 VIP, LMT1-46 VIP 투여군에서는 조직학적 손상 및 염증성 침윤의 병변이 감소되는 경향을 나타냈다. 이는 VIP를 발현하는 Lactobacillus 균주가 DSS로 유도된 염증성 장 질환 마우스 모델에 있어서 염증 완화 및 보호 효능이 있는 것으로 볼 수 있다.

(2) 재조합 미생물 및 TNF-알파 차단제의 병용 투여 효과

도 8은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 에타너셉트(etanercept) (Enbrel, 한국화이자제약)의 병용 치료효능을 DAI 스코어로 나타낸 도면이다. 도 8에서, Normal은 어떤 것도 처리하지 않은 그룹이다. PBS는 DSS만 처리 한 그룹이다. Enbrel은 DSS와 엔브렐을 처리한 그룹이다. 1-46 VIP는 DSS로 유도한 마우스에 L. brevis LMT1-46에 pMT447이 형질전환된 균주를 급여한 그룹이다. 1-46 VIP + enbrel은 DSS 유도한 마우스에 L. brevis LMT1-46에 pMT447이 형질전환된 균주와 엔브렐을 함께 처리한 그룹이다.

도 8은 아래와 같은 과정에 의하여 얻어진 결과이다. 형질전환 균주 유래 VIP 단백질 치료효능을 평가하기 위하여, 형질전환 균주를 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에 경구 투여시킨 후 생존율 또는 DAI 점수를 확인하였다. 형질전환 균주를 10ug/ml 클로람페니콜이 포함된 10ml의 MRS 배지에서 하루 동안 1차 배양한 후, 배양한 균주를 300 내지 600ml의 MRS CM 배지에 OD600이 0.01이 되도록 접종하였다. 16 내지 18시간 뒤 배양액의 OD600이 2 내지 3이 되면 총 투여 마우스 개체 수와 급여횟수에 맞춰 균주를 회수하였다. 7,000rpm에서 10분간 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 회수된 균주는 마리당 1회 1x10⁹cfu로 투여할 수 있도록 1x PBS에 부유시켰다. 균주 투여는 1일 1회, 총 16일간 시행되었다.

최초 균주 투여일을 Day-7일로 설정하여 치료효능 실험이 시작되었으며, DSS는 멸균 수 중에 2(v/v)%로 희석하여 0일부터 6일에 음수로서 PBS군을 제외한 모든 군에 공급하였다. 9일에 마우스를 안락사하였다. DSS 처리 후 2일 간격으로 생존율을 확인하였으며 체중, 털의 곤두섬, 동물의 움직임 정도, 설사여부를 체크하여 DAI 점수를 산정하였다. 또한 에타너셉트(TNF blocker; Enbrel)와의 병용 투여 효능을 평가하기 위한 그룹에는 엔브렐을 10mg/kg으로 0, 2, 4, 및 6일에 복막내(IP) 투여하였다.

도 9는 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 DAI AUC 스코어로 나타낸 도면이다. 각각의 균주 및 화학물질에 대한 설명은 위에 기재되었으며 DAI AUC는 8일차까지 DAI SCORE의 곡선하 면적을 나타낸다.

도 8 및 9에 나타낸 바와 같이, VIP를 발현하는 균주와 엔브렐을 병용투여 하였을 때 균주 또는 엔브렐만 처리한 그룹보다 DAI 스코어가 감소하였다.

본 실험에서 사용된 엔브렐은 염증성 장 질환을 치료하기 위한 예시적인 약물이며, 그외 염증성 장 질환을 치료하는 약물이 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 조합하여 사용될 수 있다.

(3) 조직병리학(histopathology) 실험 방법

실험동물을 실험 9일째 안락사한 뒤 2 cm 간격의 결장 원위부 두 부분을 0.5 cm 씩 적출하고 10% 포르말린 용액에 고정한 뒤 파라핀 포매하였다. 포매된 조직은 미크로톰(microtome)으로 5㎛ 간격으로 잘라서 슬라이드를 제작한 다음 H&E 염색을 하였다. 염색된 조직에 대해 Erben 등, Int J Clin Exp Pathol 2014;7(8):4557-4576의 평가법을 참고하여 조직의 심각도를 평가하였으며, 각 샘플 당 임의의 3 또는 4개 이상의 부위에 대해 평가하였다.

평가 방법을 간략히 기술하면, 장 상피세포의 손상과 염증세포의 침윤 정도에 대해 구분하여 평가하였고 각 부분의 점수를 합산하여 0 내지 8점으로 결과를 나타내었다.

먼저, 염증세포의 침윤 정도는 하기 기준에 따라 평가하였다:

0=정상(normal),

1=경도-움 기저 주의 침윤(mild-infiltrate around crypt basis),

2=중등도-점막근육판까지 침윤(moderate-infiltrate reaching to L. muscularis mucosae),

3=현저한-점막근육판까지 광범위 침윤 및 상기 점막의 두꺼워짐(marked -extensive infiltration reaching the muscularis mucosae and thickening of the mucosa),

4=심각-상기 점막하의 침윤(severe-infiltration of the L. submucosa).

또한, 상피세포의 손상 정도는 다음 기준에 따라 평가하였다:

0=정상, 1=초점 까짐-술잔세포의 상실(focal erosions-loss of goblet cells),

2=까짐-넓은 영역에서 술잔세포의 상실,

3=까짐/궤양화-움(초점)의 상실(erosion/ulceration-loss of crypts(focal)),

4=연장된 궤양화-과립화 조직, 넓은 영역에서 움의 상실(extended ulceration-granulation tissue, loss of crypts in large areas).

도 10은 DSS로 유도된 마우스 장염증 모델에서 LAB 형질전환 균주 유래 VIP와 엔브렐의 병용 치료효능을 조직병리학적 결과로 나타낸 도면이다. 도 10에서, Normal, PBS, Enbrel, LMT1-46 VIP, 및 LMT1-46 VIP+Enbrel은 도 9에서 설명한 바와 같다.

도 10에 나타낸 바와 같이, VIP를 발현하는 균주와 엔브렐을 병용투여 하였을 때 균주 또는 엔브렐만 처리한 그룹보다 치료 효능이 향상되었다.

구체적으로 도 10에 나타낸 바와 같이, DSS로 유도한 장염증 마우스 모델에서 현미경을 통하여 대장의 조직병리학적 검사를 수행하였는바, 단핵 세포의 침윤, 점막 손상 등이 DSS 군에서 가장 심각하게 나타났으며, Enbrel 단독 투여군은 병증에 대한 큰 개선 효과를 보이지 못했다. 반면, LMT1-46 VIP 단독 투여 및 LMT 1-46 VIP & Enbrel 병용 투여군에서는 양성 대조군으로 사용된 CyA 투여군과 같이 조직학적 손상 및 염증성 침윤의 병변이 감소되는 경향을 나타냈다. 이는 VIP를 발현하는 Lactobacillus 균주가 DSS로 유도된 염증성 장 질환 마우스 모델에 있어서 염증 완화 및 보호 효능이 있는 것으로 볼 수 있다.

한국생명공학연구원 KCTC13421BP 20171212 한국생명공학연구원 KCTC13422BP 20171212 한국생명공학연구원 KCTC13423BP 20171212

SEQUENCE LISTING <110> LIVEOME INC. <120> Microorganism expressing heterologous protein, and use thereof <130> PN144077KR <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP1 <400> 2 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn 20 25 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP Variant 2 <400> 3 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Ala Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Ile Gly Leu Arg Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP variant 3 <400> 4 Phe Thr Ala Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln Leu Ala Val Arg Arg 1 5 10 15 Tyr Leu Ala Ala Ile Leu Gly Arg Arg 20 25 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP variant 4 <400> 5 His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Asn 20 25 <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP variant 5 <400> 6 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Ala Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Met Ala Val Lys Lys Ala Leu Asn Ser Ile Leu Ala 20 25 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP variant 6 <400> 7 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln 1 5 10 15 Val Ala Ala Lys Lys Tyr Leu Gln Ser Ile Lys Asn Lys Arg Tyr 20 25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP variant 7 <400> 8 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg Arg 20 25 30 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VIP variant 8 <400> 9 His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln 1 5 10 15 Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu 20 <210> 10 <211> 500 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei LMT1-21 <400> 10 tccacaatca aggtgcttgg ctttttcgat cgcgaggtca ccatgtacat cagtcgtgag 60 agcattgtgt tgacagtgat cggcatcgtg ttcggctatc tgctcggcaa tttgctgaca 120 gcctacattt tgtatcaagc cgaaactgag gccgtggttt ttccactcac gatcagcatt 180 gtcggctacc tcacggccac gttactcatg ttggccttca ccggcgtcgt cacctggctc 240 acgcatcgtc gactccaacg ggtggacatg gtcgaagccc tgaaatcaaa cgaataacct 300 acaattttgt caggcagcgt cgtcacggcg ctgctttttt catacaaaat tcatcaaaaa 360 ttgggattaa aaacgttcat gatcgcaatt ttgaagcgca aatgaagatt gagaccaact 420 cctaacagtc ctgtaacgct gacgtaacat tgacacagta aagtagcctt tagttaatca 480 aattaagggt gaggtcaaaa 500 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Lactobacillus paracasei LMT1-21 <400> 11 Met Lys Phe Asn Lys Val Met Ile Thr Leu Val Ala Ala Val Thr Leu 1 5 10 15 Ala Gly Ser Ala Ser Ala Val Thr Pro Val Phe Ala Asp Thr Ser 20 25 30 <210> 12 <211> 93 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei LMT1-21 <400> 12 atgaaattca ataaagtcat gatcacgttg gttgctgcag ttaccttagc aggttctgct 60 agcgccgtaa caccagtttt cgctgataca agc 93 <210> 13 <211> 4259 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pMT54-PR4-SP4 vector <400> 13 ggtacctccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 60 gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 120 aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 180 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 240 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 300 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 360 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 420 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 480 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 540 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 600 tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 660 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 720 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 780 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 840 ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 900 tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtgaa ttcgcaaggt atagcccaat 960 atactttact tcgtaaagtt tgagctctgc gaggcaaaaa cgtcagatat tgaatctaaa 1020 caagagtata ataaacacag ttacacaaat aaaaacaaaa ggagtagatc ttaaaaatgg 1080 aagcaaatcc aaagtggcaa gaaacaggaa gacaacaaaa agtaaaacaa cttgactatt 1140 cagaaacatt agcagtaaga atagacaatg tggaattata caactcagaa aagaaattat 1200 attatctagt aattcaaacc cttcttggga atccccaaaa aaatgaatgg cgtatccagg 1260 gacaaagtca aatattaaaa gaatcaaaac aaaaaataat tgtgtcataa aattattgca 1320 cattaaaagt cctaaaaatt attttgcatt aaagatttca aaactcattt aatgtaaaat 1380 aattttttct ttgataatcc catttagcaa caatctcgcg taccacttgg tcaacctttt 1440 gatcatcact atccgtatta atcaaatcac cattctcaac gtcttctaat tgcaactgct 1500 tgcgaatttc tttcagcaaa ccgccatagc taatttgccg ggaaccagcc aaagctcgtt 1560 ccaaatcatc aattacttgt aggtcttgtt cttgattatt agtcaaaata tctttagatt 1620 ttacctgata tttagccgtt tcttgagcac tagccaataa cgaattttta tggcgattca 1680 tattcggttt aactgcctca acattcacca ttggtacata agtcaatttc attgcccgtt 1740 gccaaaaacc agtccattct acttgtgaaa tatagttatc agtcccctta aaataatggt 1800 tcttcacaaa aagcaaaaca tgcatatgat ggtggtacat tggctgaccc gcttcatgat 1860 taacagtcac ttcagtcgaa cgtacatagc ccaataaatt tttggcaact tttgtatact 1920 gaaaaatttt tgcaacagct cgtcccattt gacgtaactc actcttcaat tgatcaccag 1980 ttgtattctc aaccgtcaac gttaaaaata agaaccggcc cgtctttcgt tgtttaacag 2040 cttccgtcaa aatctgtgtt aactgattgg attgcttcat tgcccgccgc caattacata 2100 acggacacaa acgagaatgg caaaaccaag tctgcgccaa tttcttgtga ccatttttat 2160 cttccacaaa acgcaaaact tcgccacatt ctttaactcg atgagctttc ttataatgca 2220 atatttgtaa atagtcacca tactgcaagt tctccaactt gcgctcccgc cacggccgaa 2280 ctttccctga ctttgaccga tcaaccaaga ctttttcatt agccaaaata aaaactcccc 2340 tcaccaacca cgtgagaaga gttaatctgt tatgtacttg cttcacttaa atcagtcaga 2400 aggcttgacg gcaaagggtt caagctttaa actatgtcta gtaaatccaa atacgatttt 2460 tacaagatta actcacgcgt tcgaggtcgg caaactttcg aagctcacgt gggttttttt 2520 tatatttatt ttataccaca ataatacgcc taaacccagt tgtgtcaagg gtttacctca 2580 ctttttgaaa atgacgttgt ttctaatagt atcaagataa gaagaaaccg tcgaaaaaac 2640 gacggtttca aaccccaaaa agcagagaat tcggtacctg gagctgtaat ataaaaacct 2700 tcttcaacta acggggcagg ttagtgacat tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg 2760 cattatctca tattataaaa gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt 2820 cataaacaat cctgcatgat aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg 2880 taaatatatt gaattacctt tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta 2940 attactatta ttattgatat ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga 3000 aagagaaaaa gcattttcag gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata 3060 tttctctaca tcagaaaggt ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt 3120 ccaaatacca gagaatgttt tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt 3180 atcccaataa cctaactctc cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt 3240 tatcaccctt gtcactaaga aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat 3300 gtttcggtat aaaacactaa tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt 3360 caaataatga ttaaatatct cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt 3420 catttgatat gcctcctaaa tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct 3480 ttcttcatta gaatcaatcc ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt 3540 ttaaaaatat cccactttat ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa 3600 gaataaagac cacattaaaa aatgtggtct aagcttctgc aggatatccg atcgtccaca 3660 atcaaggtgc ttggcttttt cgatcgcgag gtcaccatgt acatcagtcg tgagagcatt 3720 gtgttgacag tgatcggcat cgtgttcggc tatctgctcg gcaatttgct gacagcctac 3780 attttgtatc aagccgaaac tgaggccgtg gtttttccac tcacgatcag cattgtcggc 3840 tacctcacgg ccacgttact catgttggcc ttcaccggcg tcgtcacctg gctcacgcat 3900 cgtcgactcc aacgggtgga catggtcgaa gccctgaaat caaacgaata acctacaatt 3960 ttgtcaggca gcgtcgtcac ggcgctgctt ttttcataca aaattcatca aaaattggga 4020 ttaaaaacgt tcatgatcgc aattttgaag cgcaaatgaa gattgagacc aactcctaac 4080 agtcctgtaa cgctgacgta acattgacac agtaaagtag cctttagtta atcaaattaa 4140 gggtgaggtc aaaaatgaaa ttcaataaag tcatgatcac gttggttgct gcagttacct 4200 tagcaggttc tgctagcgcc gtaacaccag ttttcgctga tacaagcgtc gacctcgag 4259 <210> 14 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VIP variant 1 <400> 14 cattcagatg ctgttttcac cgataactat acccgtttgc gtcgtcaatt ggctgttcgt 60 cgttatttga actcaatctt gaac 84

Claims (1)

1. 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) LMT1-21 (KCTC 13422BP).

Images