KR20140000620A - 장신경계의 개선을 위한 프로바이오틱 균주의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 장신경계 및 보다 구체적으로 변비 및/또는 과민성 대장증후군(irritable bowel disease)과 같은 장질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 젖산균 이용의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 변형된 장신경계(enteric nervous system)에 있어서, 젖산균(lactic acid bacteria) 균주(strain)를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 특히 변비(constipation) 및/또는 과민성 대장 증후군(irritable bowel disease)과 같은 장질환의 치료 및/또는 예방에 유용하게 사용될 것이다.
과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome, IBS) 또는 경련성 대장(spastic colon)은 만성적 복부 통증(chronic abdominal pain), 불편감(discomfort), 복부팽창(bloating), 및 탐지할 수 있는 기질적 원인(organic cause)이 없는 배변습관(bowel habit)의 변화로 특징지어지는 기능적 장 이상이다. 어떤 경우에는, 심각하지 않은 소화관 염증(gut inflammation)도 보고되었다. 설사(diarrhoea) 또는 변비(constipation)가 뚜렷할 것이고, 또는 상기 설사 또는 변비가 변할 수 있다(각각 IBS-D, IBS-C로 분류됨). IBS는 감염 후[감염 후(post-infection), IBS-PI], 스트레스가 많은 삶의 사건 또는 어떤 다른 의학적인 지표(medical indicator) 없는 성숙함의 시작 후에 시작될 것이다. IBS에 있어서, 풍선흡입검사(balloon insufflation testing)와 같은 특정 자극(stimuli)에 의해 장이 더욱 민감할 것임에도 불구하고, 규칙적인 임상실험(clinical test)에선 이상(abnormality)을 나타내지 않는다.
IBS는 어떤 한 시점에서, 인구의 약 15%가 영향을 받는 매우 흔한 상태(condition)이다. 상기 상태는 남자가 여자보다 2배 정도 많다. IBS는 만성적인 통증, 피로(fatigue) 및 다른 증상의 원인이고, 이것은 부모의 의료비를 증가시키며, 결근에 기여한다. 본 발명자들은 IBS의 높은 보급율과 함께 증가된 비용이 높은 사회비용(societal cost)의 병을 생산하고 있다고 보고했다. 또한 이는 만성적인 질병(chronic illness)으로 여겨지고, 환자의 삶의 질에 극적으로(dramatically) 영향을 줄 수 있다.
IBS의 원인에 대한 이론은 장신경계(enteric nervous system, ENS)와 관련된다. 상기 장신경계(ENS)는 직접적으로 위-장(gastro-intestinal, GI) 기능을 조절하는 말초신경계(phripheral nervous system)로 세분화되고, 위장 계(gastrointestinal system)의 계열(lining)에 포함된다. 이는 원심성 뉴런(efferent neuron), 구심 뉴런(afferent neuron), 및 중간 뉴런(interneuron)을 포함한다. 상기 ENS의 구조적 및 생리학적인 기능은 교질세포(glial cell)[성상세포(astrocyte)]에 의해 수행된다. 상기 ENS는 기능적 특이 역할에 의해 두 개의 주요 망상조직(major plexus)으로 구성된다.
세로힘살(longitudinal muscle) 및 환상근(circular muscle) 사이에 위치한 근층간 신경층(myenteric plexus)은 주로 장의 운동성(intestinal motility)을 조절하는데 포함되어 있는 뉴론을 포함한다. 장의 근육을 통해, 원심성 또는 운동(motor) 뉴런이 연동운동(peristalsis) 및 장 내용물(intestinal content)의 배출(churning)을 조절한다. 상기 운동 뉴런 조절 운동성은 하기의 주요 두 균주로 구성된다:
- 수축을 위한 아세틸콜린(acetylcoline)[콜린 아세틸기전이효소 면역반응성의 뉴론(coline acetyltransferase immunoreactive neuron("ChAT-IR" 또는 "ChAT" 또는 "ChAT 뉴론" 또는 "ChAT 신경") 및/또는 기질 P(substance P, SP)로 언급되는] 유리(liberating)의 흥분성 장관근 뉴론, 및
- 완화를 위한 산화질소(nitric oxide)[산화질소 합성효소 뉴론(nitric oxide synthase neuron, NOS-IR) 및/또는 바소-활성 장 펩티드(vaso-active intestinal peptide, VIP)로 동정된] 유리의 억제성 장관근 뉴론.
콜린 아세틸기전이효소 EC 2.3.1.6은 뉴론의 중심에서 합성되고, 신경말단(nerve terminal)으로 전달되는 효소이다. 상기 ChAT의 역할은 아세틸-코에이(acetyl-coA)와 콜린을 연결하여 신경전달물질(neurotransmitter)인 아세틸콜린(acetylcoline)을 형성하는 것이다. 실험적으로, 아세틸콜린 생산의 영향은 ChAT 뉴론의 수의 계산에 의해서 추정되고, 전형적으로 ChAT 뉴론 수의 증가는 아세틸콜린의 증가를 나타낸다.
환상근 및 점막(mucosa)의 사이에 위치한 점막하신경층(submucosal plexus)은, 세포사이(paracellular)의 투과성과 같은 창자의 상피장벽(intestinal epithelial barrier, IEB) 기능을 조절하는 뉴론을 주로 포함한다. 특히, 점막하신경층에서 장신경계의 활성화는 ENS에 의한 IEB 투과성의 좋은 '전환(turning)' 근거를 맞추어 VIP의 유리(liberation)을 통하여 세포 사이의 투과성을 감소시키고, 반면에 아세틸콜린은 세포 사이의 투과성을 증가시킨다. 따라서, 세포 사이에서 투과성의 뉴론 조절에 대하여, 점막의 뉴론에 의한 VIP 유리의 증가는 점막하신경층 ChAT 뉴론의 증가에 의해 IEB 저항이 감소하는 동안, IEB 완전성을 증가시킨다.
비록 현재 IBS의 치료법은 없지만, 음식물의 조절, 약물 및 심리학적 상담(psychological intervention) 등 증상을 덜어주기 위한 시도의 치료법이 있다.
프로바이오틱(probiotic), 특히 젖산균 균주는 IBS의 치료 및/또는 예방에 있어서 유익함이 보고되었다. 공지된 예로는 WO 2007/036230, WO 03/010297, 및 WO 2009/080800가 있다. 그러나, 상기 박테리아 균주는 면역 시스템(immune system), 장 투과성 또는 장 소화세균상(intestinal microbiota)에의 효과를 위해 선택되었으나, ENS 기능의 개선을 위한 효과로 선택된 것이 아니다. WO 2008/064489는, 항염증(anti-inflammatory) 영향의 결과로 칼슘 의존적 포타슘 전류 중간 전도(intermediate conductance)를 막기 위한 프로바이오틱 균주의 사용을 공개하고 있다. WO 2007/132359는 고통의 지각(perception)에 관계하여, 락토바실러스(Lactobacillus)의 사용 및 카나비노이드(canabinoid) 수용체 경쟁물질(agonist) 및/또는 오피오이드(opioid) 수용체 대항물질(antagonist)의 사용을 공개하고 있다. WO 2006/032542는 락토바실러스의 진통제 목적의 사용을 공개하고 있다. Kamm et al., 2004, Neurogastrointest. Motil 16: 53-60에는 돼지의 빈창자(jejunum)에서 다른 뉴런의 마커가 아닌 칼빈딘-28k(calbindin-28k, CALB)의 감소에 따른 사카라마이세스 보울라디(saccharomyces boulardii, S. boulardii)에의 영향을 공개하고 있다. Metugriachuk et al., 2006, Rejuvenation Res. 9: 342-345에는 늙은 위스타 랫(Wistar rat)에서 소장 및 대장의 운동성에 의한 공생적인 준비는, 소장 및 결장(colon) 근전성의 활성을 상당히 증가시키고, VIP의 mRNA의 발현을 증가시켰으나, 그러나 VIP 농도에는 유의한 영향을 주지 않았다.
따라서, 추가적인 연구는 변비 및/또는 다른 질병 등 IBS에서 ENS의 사용에 있어서 이로운 영향을 주는 프로바이오틱 각각의 균주에 대한 것이다.
발명의 요약
본 발명의 발명자는 장신경계(enteric nervous system, ENS) 개선효과를 갖는 젖산균(lactic acid bacteria) 및 비피더스균(bifidobacteria)의 균주를 스크리닝(screening) 및 선별하기 위한 새로운 모델 시스템을 사용하였다. 상기 모델은 사람 결장암(colon carcimona)로부터 장상피세포(intestinal epithelial cell)의 (단층)막[(mono)layer] 및, 단층막의 기저막 측면(basolateral side), 근층간(myenteric) 및 점막하(submucosal) 신경층(plexus)으로부터 뉴론을 포함한 장신경계 초대배양의 혼합물을 포함한다.
ENS에 있어서 식품등급요소(food grade component)의 영향에 상기 모델, 특히 젖산균 및 비피더스균 균주의 사용은, 기저막 측면의 신경에서 분비한 바소-장 펩티드(VIP) 및/또는 ChAT의 발현에 상기 요소를 추가한 아피칼(apical) 또는 루미날(luminal)의 효과를 측정함으로써 평가될 수 있다.
따라서, 상기 모델은 장신경계의 기능 개선용 사용을 위한 젖산균 및 비피더스균의 새로운 균주를 스크린(screen) 및 선택하기 위한 것을 고려한다. 상기 균주는 장 운동성 및 연동운동(peristalsis)을 개선한다. 어떤 균주와 함께, 변비(constipation)와 같은 어떤 상태를 해결할 수 있게 장의 체류시간(transit time)을 줄일 수 있다. 어떤 균주와 함께, 설사(diarrhoea)와 같은 어떤 상태를 해결할 수 있게 장의 체류시간을 늘릴 수 있다. VIP가 증가시키는 균주는 상피장벽(intestinal epithelial barrier)의 온전함 또한 개선할 수 있다. 상기 균주는 IBS 및/또는 변비 및 ENS의 기능감소와 연관되어 있는 다른 질병의 예방 및/또는 치료에 있어 기존에 존재하는 균주보다 특히 유용하고, 효과적이다.
콜리성 표현형의 증가는, 특히 ChAT 뉴론의 발현은 결장 수송(colonic transit)의 억제와 연관된 GI관 병적 측면들(GI tract pathologise)에 있어서 치료상의 관심사이다. 뉴론에서 예를 들어, ChAT와 같이 콜린성 발현 향상에 증가한 효과를 갖는 선택된 젖산균 또는 비피더스균의 이용은, 변비환자, 및 IBS-C에 시달리는 환자를 위한 치료상의 관심사이다. 따라서, 본 발명의 젖산균 또는 비피더스균 균주의 한 군은, 장운동에 개선된 효과를 나타내고, 및 특히 IBS 환자, 특히 IBS-C 환자, 및 변비에 고통받는 환자를 위해 유익한 ChAT 신경(nerves)의 수를 유의적으로 증가시킨다. 상기 군은 B)군으로 언급된다. 좋은 운동성은 수축을 맡고 있고, 프로키네틱(prokinetic) 효과를 갖는 많은 수의 ChAT 신경을 필요로 한다. 상기 군을 위한 어떤 흥미로운 실시예에서, TEER 수준은 근육 이완을 위한 IEB 기능 및 능력이 바람직하게도 손상되지 않은 이후에는 감소하지 않았다. 상기 실시예에 따르면 상기 하위그룹은 B3)군으로 언급된다.
증가한 VIP는 GI관 근육의 이완을 유의적으로 개선시키고, IBS 또는 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)에 고통받는 환자 및, 또는 노인, 유아, 및 비만인 사람들을 위해 IEB를 개선시킨다.
이와 같은 개체는, 만약 필수적이지 않다면 좋은 IEB 기능이 더 낫다. 비록 IBS 또는 IBD로부터 시달리는 환자는 VIP와 같은 신경펩티드(neuropeptide)의 과다분비(oversecretion)를 갖고 있지만, 이는 장염(intestinal inflammaion)의 조절, 장벽(intestinal barrier)의 기능 재수립, 신경보호(neuroprotection)를 위한 ENS의 적응반응(adaptive response)일 것이라 추정된다. 본 발명의 박테리아 균주, 특히 비피더스균에서 생산되는 젖산의 군은, VIP를 유의적으로 증가시킨다. 상기 군은 군 A)로 언급된다. 하나의 실시예에서, ChAT 수준은 증가하지 않는다. 상기 실시예에 따르면, 상기 군은 군 A3)로 언급된다. 그래서 상기 ChAT 수준은 주로 변함없이 유지될 수 있고, 또는 감소할 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 박테리아 균주는, 부다페스트 조약(Budapest treaty)에 따라, 국제수탁기관(International depositary authority)인 파스퇴르연구소(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue de Docteur Rous, Paris)에 제출되어 기탁되었다.
B)군에 속하는, 본 발명의 스크리닝 방법으로 발견된 균주는 DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317) 및 DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)이다. A)군에 속하는 균주는 DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494, DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321), DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), 및 DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)이다. 균주 DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494는 국제출원번호 WO 02/02800에서 공개 및 균주 DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)는 국제출원번호 WO 01/01785에서 공개되었다.
상기 선택된 균주의 최소 하나로 구성된 조성물은 따라서 본 발명의 일부이다. B)군에 속한 균주의 최소 하나 및 A)군에 속한 균주의 최소 하나의 혼합체로 구성된 조성물이 바람직하다. 상기 혼합체는, 수축(contraction) 및 이완(relaxation) 양쪽의 개선에 의해 운동성의 개선된 효과를 유의적으로 가질 것이고, 추가적으로는 IEB 기능에 유의적인 효과를 가질 것이다.
따라서, 본 발명의 한 측면에 따르면 하기의 용도를 위한 락토바실러스 및 비피더스균을 포함하는 군으로부터 바람직하게 선택된, 박테리아의 최소 하나의 균주로 구성된 조성물을 고려한다:
A) 장신경계의 바소-활성 장펩티드(vaso-active intestinal peptide, VIP) 수준의 증가, 또는
B) 장신경계의 콜린 아세틸기전이효소 면역반응성의 뉴론(Choline AcetylTransferase ImmunoReactive neuron, ChAT) 수준의 증가, 또는
C) 장신경계의 ChAT 수준의 감소.
본 발명의 한 측면에 따르면 하기의 균주를 포함하는 군으로부터 선택된 박테리아의 최소 하나의 균주로 구성된 조성물을 고려한다:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)],
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)],
용도로는,
- 장질환의 치료 및/또는 예방, 바람직하게 장 운동성 질환(intestinal motility disorder)의 치료 및/또는 예방, 또는
- 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방,
- 설사, 장 감염(intestinal infection), IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게서 발견된 질환의 치료 및/또는 예방.
본 발명의 한 측면에 따르면 하기의 균주를 포함하는 군으로부터 선택된 박테리아의 최소 하나의 균주로 구성된 조성물을 고려한다.
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)],
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)],
하기로 구성된 군으로부터 선택된 질환으로 고통받는 개체에 투여하기 위한 용도로는:
- 변비, IBS-C,
- 설사, 장 감염, IBS-D, IBS-PI, IBD,
- IBS, 및
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게서 발견된 질환.
본 발명의 한 측면에 따르면 위-장(gastro-intestinal) 운동성 개선, 장 연동운동 개선, 및/또는 장 투과성(permeability) 감소의 용도로 사용되는 상기 언급된 조성물을 고려한다.
본 발명의 한 측면에 따르면 하기로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 새로운 균주를 고려한다:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)], 및
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)],
본 발명의 한 측면에 따르면 새로운 균주로 구성되는 조성물을 고려한다.
본 발명의 한 측면에 따르면 하기로 구성된 조성물을 고려한다:
- 장신경계에서 ChAT 수준을 증가시키는 B)인 락토바실러스 및 비피더스균으로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 적어도 어느 하나의 균주, 및
- 장신경계에서 바소-활성 장 펩티드(VIP) 수준을 증가시키는 A)인 락토바실러스 및 비피더스균으로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 적어도 어느 하나의 균주.
본 발명의 한 측면에 따르면 하기의 단계로 구성된 박테리아 균주 선택의 방법을 고려한다:
a) 단층막으로 제시된 장 상피세포 및 단층막의 기저막 측면에 제시된 장 신경세포의 공배양(coculture)을 배열하는 단계,
b) 장 상피세포의 단층막의 아피칼 또는 루미날 측면에 바람직하게 하나의 상피세포 당 약 4 내지 400개의 박테리아 균주를 더하는 단계,
c) 젖산균의 균주와 함께 공배양을 배양하는 단계,
d) 바람직하게 신경단위의 세포(neuronic cell)를 분리하는 단계,
e) 신경세포에 의해 생산된 VIP, ChAT, 기질 P(substance P), 산화질소 신경(nitrogen oxide nerves), ATP 및/또는 뇌하수체 아데닐시클라아제 활성 펩티드(pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP)의 양 및 선택적으로 추가적으로 장 상피세포 막의 상피 전기저항(TransEpithelial Electrical Resistance, TEER)을 측정하는 단계.
상기 방법에서, 상기 균주는 바람직하게 락토바실러스 및 비피더스균으로 구성된 군에 속한다.
정의
화합물 또는 조성물의 사용을 위한 본 출원은 그 자신의 사용, 임의로 이와 연결된 목적, 또는 상업적 또는 법적 처벌과 함께 화합물 또는 조성물과 연관된 어떠한 통신, 예를 들어, 전단지(leaflet), 안내책자(brochure), 포스터(poster), 안전 목적(safety purpose), 효능 목적(efficacy purpose), 또는 예를 들면 유럽에서 EFSA와 같은 행정서에서 소비자 보호(consumer protection)를 위한 규제등록(regulatory registration)의 지원을 위해 제출된 서류(documentation)와 같은 상업적 지원을 위한 조성물, 설명(instruction) 또는 권고(recommendation)의 패키지(package)의 광고, 설명 또는 추천을 포함하기 위한 것이다.
본 출원의 균주의 군은 특정 요소(specific property) 또는 요소의 셋트(set of property)가 존재하는 균주를 나타낸다. 따라서 특정 균주는 여러 군으로 존재할 수 있다. 본 출원에서 상기 용어 "또는"은 독점적이지 않다.
본 출원에서 VIP 및/또는 ChAT과 같은 요소는, 변화가 대조군과 비교하여 10%, 바람직하게는 1%를 초과하지 않았다면, 대조군과 비교하여 많이 변하지 않은 것으로 고려한다.
바람직한
실시예
바람직한 실시예에서, 조성물은 하기의 용도를 위한 것이다:
A3) ChAT가 증가하지 않고 VIP를 증가, 또는,
B3) VIP가 증가하지 않고, 바람직하게 장상피세포 막(intestinal epithelial cell layer)의 전기적 저항(electrical resistance)도 함께 감소하지 않고, ChAT가 증가, 또는
C3) VIP가 감소하지 않고, ChAT를 감소, 또한,
C2) ChAT를 감소 및 VIP를 감소.
본 발명의 조성물은 하기의 용도로 사용될 수 있다:
- 장 질환(intestinal disorder)의 치료 및/또는 예방, 바람직하게 장 운동성 질환(intestinal motility disorder)의 치료 및/또는 예방, 또는
- 변비(constipation) 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 설사(diarrhoea), 장 감염(intestinal infection), IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방,
- 노인, 유아 및 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방.
특히 바람직한 실시예에서, 상기 조성물은 하기의 용도로 사용될 수 있다:
A)는 장신경계(enteric nervous system)에서 VIP 수준을 증가시키고, 및 장 질환의 치료 및/또는 예방에 사용, 바람직하게는 장 운동질환의 치료 및/또는 예방, 또는
B)는 장신경계에서 ChAT 수준을 증가시키고, 및 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/예방에 사용, 또는
C)는 장신경계에서 ChAT 수준을 감소시키고, 및 설사, IBS-D, IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방.
박테리아의 균주는 예를 들어, 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:
- DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494)[A) - A3)],
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)],
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)].
하나의 실시예에서, 박테리아의 균주는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택되었다:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)], 및
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
및 상기 조성물은 하기의 용도를 위한 것이다:
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질병의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방.
하나의 실시예에서, 박테리아의 균주는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택되었다:
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)],
및 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및 또는 예방의 사용을 위한 조성물.
하나의 실시예에서, 박테리아의 균주는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택되었다:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)], 및
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
및 상기의 조성물은 하기의 용도를 위한 것이다.
A) 장신경계의 바소-활성 장 펩티드 수준의 증가, 바람직하게 A3) ChAT가 증가하지 않고 VIP를 증가.
본 발명의 실시예의 특정한 실시예에서, 조성물은 하기의 용도를 위한 것이다:
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견되는 질환의 치료 및/또는 예방.
하나의 실시예에서, 박테리아 균주는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된다:
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)],
및 상기의 조성물은 하기의 용도를 위한 것이다:
B) 장신경계의 ChAT 수준의 증가, 바람직하게 B3) VIP가 증가하지 않고, ChAT가 증가.
본 발명의 실시예의 특정 실시예에 있어서, 상기 조성물은 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용을 위한 조성물이다.
박테리아 균주의 추가적인 세부사항
상기에 서술된 바와 같이, 조성물은 최소 하나 또는 두 개의 특정한 박테리아의 균주, 바람직하게 젖산균으로 구성된다. 상기 균주는 바람직하게 락토바실러스(lactobacillus) 및 비피도박테리움(bifidobacterium), 락토코커스(lactococcus) 및 스트렙토코커스(streptococcus) 속(genus)을 포함하는 군으로부터 선택된다. 언급된 박테리아의 특정 균주는, 장 및 ENS 사이의 상호작용을 나타내는 공배양 모델(coculture model)에 있어서, VIP 수준에 영향 및/또는 ChAT 신경 수준에 영향을 줄 수 있는 것으로 발견되었다.
하기에 보다 자세하게 서술된 공배양 모델은 시험관 내에서(in vitro) 상기 특성을 갖는 젖산균 또는 비피더스균의 균주를 선택하기 위해 사용되었다. 락토바실러스, 스트렙토코커스 또는 비피더스균 속에 속하는 102개의 균주가 확인되었다.
ChAT를 증가시키는 효과를 갖는 B)군 균주는 일반적으로 장 운동을 개선할 것이다. ChAT를 증가시키는 효과를 갖고, VIP를 증가시키지 않는 상기 균주(예를 들어, VIP가 대체로 변하지 않거나 또는 VIP가 감소되는)를 제외하는 B3)군 균주는 특정한 바람직한 실시예에 나타난다. 상기 군의 균주는 일반적으로 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 이는 앞으로 변비로 종종 고통받을 수 있는 노인들에게서 찾을 수 있는 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 특별히 관심을 받을 것이다. 증가한 운동성에 관하여, ChAT 발현이 증가한 균주를 사람들이 선호할 것이다. 상기 특성은 매우 드문 일이다. 흥미롭게도, 오직 세 균주만 통계적으로 ChAT를 증가시킨다고 발견되었다. 이는 B)군 또는 B3)군으로 언급된다. B)군 또는 B3)군 균주는 DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279), DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)으로 구성된다. 상기 균주는 효과적으로 운동성, 특히 수축(contraction)을 개선시킨다. 이는 장 상피세포 단층막의 전기적 저항성(transepithelial electrical resistance, TEER)이 감소하지 않는다는 점에서 선호된다. 상기 특성은 적합한 장벽 기능을 나타낼 수 있다. DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 균주는 VIP 수준이 유의하게 감소하고, 반면에 다른 두 균주는 VIP 수준에 유의적인 효과를 나타내지 않는다. VIP의 감소가 IEB에 역효과를 줄 수 있는 이후에, 이는 장상피세포의 단층막으로, 상기 균주의 배양이 경상피 전기저항성(transepithelial electrical resistance, TEER)을 감소시키는 결과를 나타내는지 시험관 내 모델에서 조사되었다. 이는 IEB 기능이 손상되지 않았음을 나타내는 경우로 밝혀졌다.
근육의 이완, 및 IBS 및 IBD 환자에게 좋은 IEB 기능의 강화에 관하여, VIP 발현을 증가[항-염증(anti-inflammatory) 효과를 추가적으로 가질 수 있는]시키는 균주는 사람들이 선호할 것이다. 상기 균주는 A)군 균주로 언급된다. 바람직한 실시예에서, A)군 균주는 ChAT 발현(예를 들어, ChAT가 지속적으로 변하지 않거나, 또는 ChAT가 감소한다)을 증가시키지 못한다. 상기 균주는 A3)군 균주로 언급된다. 이들 군의 균주는 일반적으로 IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. A)군 또는 A3)군 균주는 DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494), DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321), DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)로 구성된다. 상기 특성을 갖는 모든 균주가 하나: DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)를 제외하고 모두 비피더스균이라는 것의 언급은 흥미롭다. 게다가, 다른 시험관 내 모델인 T84 단층막 및 경상피 전기저항성(TEER)이 특히 A)군 또는 A3)군의 DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494), DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318) 및 DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321) 균주에서, LPS가 존재할 때, IEB의 보호효과가 발견되었다. 따라서 상기 특정 균주는 특별히 바람직하다.
한 실시예에 따르면 상기 균주는 장신경계의 ChAT 수준 감소를 허용한다. 상기 균주에 상응하는 군은 C)군으로 언급된다. 특정한 실시예에서, 상기 균주는 VIP가 감소되지 않는 것(예를 들어, VIP는 지속적으로 변하지 않거나 또는 VIP가 감소된다)을 제공하는 ChAT의 감소를 허용한다. 상기 군은 C3)군으로 언급된다. 특정한 실시예에서, 상기 균주는 VIP의 감소와 함께 ChAT의 감소를 허용한다. 상기 균주는 C2)군으로 언급된다. C3)군의 균주는 일반적으로 설사, IBS-D로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 이는 변비로 자주 고통받을 수 있는 노인에게서 발견된 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 더욱 특히 흥미로울 것이다. C2)군의 균주는 일반적으로 설사, IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 이는 특히 설사와 같은 상기 상태로 자주 고통받을 수 있는 노인에게서 발견된 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 더욱 흥미로울 것이다.
또한 본 발명은 상기 언급된 균주뿐만 아니라, 또한 모균주의 어떤 하나로부터 유래되고, 여전히 VIP 활성을 갖고, ChAT 신경에 영향을 주는 돌연변이 균주 또는 유전적으로 형질전환된 균주를 포함한다. 상기 돌연변이 또는 유전적으로 형질전환된 상기 균주는, 모균주의 하나 또는 그 이상의 내생적인(endogenous) 유전자(들)을, 예를 들어 상기 균주의 어떤 물질대사의 특성을 변형하기 위해 돌연변이 시킨[예를 들어, 상기 균주의 당 발효 능력, 상기 균주의 산에 대한 저항성, 상기 균주의 위장관(gastrointestinal tract)에서의 수송에서 생존력, 상기 균주의 후산발효(post-acidification) 또는 상기 균주의 대사산물 생산성] 균주일 수 있다. 상기 균주는 또한, 흥미있는 하나 또는 그 이상의 유전자에 의한 모균주의 유전적인 형질전환, 예를 들어 언급된 균주에 추가적인 생리학적 특성을 주기 위하여, 또는 언급된 균주를 포함하여 투여되기 바라는 치료 또는 백신으로, 흥미있는 단백질의 발현을 허용하기 위한 결과인 균주일 수 있다.
바람직하게는 B)군에 속한 최소 하나의 균주, 바람직하게 B3)군 및 A)군에 속한 최소 하나의 균주, 바람직하게 A3)군의 혼합체가 사용된다. 상기 혼합체는 IEB뿐만 아니라 운동성의 개선효과를 유의적으로 가질 것이다.
공-배양 모델 및 스크리닝 분석법
한 실시예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 젖산균 균주의 선택 방법과 관련된다:
a) 단층막으로 제시된 장 상피세포 및 단층막의 기저막 측면에 제시된 장 신경세포의 공배양(coculture)을 사용하는 단계,
b) 장 상피세포의 단층막의 아피칼 또는 루미날 측면에 바람직하게 하나의 상피세포 당 약 4 내지 400개의 박테리아 균주를 더하는 단계,
c) 젖산균과 함께 공배양을 배양하는 단계,
d) 바람직하게 신경단위의 세포(neuronic cell)를 분리하는 단계, 및
e) 신경세포에 의해 생산된 VIP, ChAT, 기질 P, 산화질소(nitrogen oxide) 신경, PACAP, 및/또는 ATP의 양 및 선택적으로 추가적으로 장 상피세포 막의 상피 전기저항(TransEpithelial Electrical Resistance, TEER)을 측정하는 단계.
연동운동의 반사(peristaltic reflex)에 있어서 상기 ENS는, 무스카린성 수용체(muscarinic receptor)를 통해 민무니근(smooth muscle)과 접촉하는 아세틸콜린 및 기질 P를 방출하는 상승한 흥분 모터 뉴론(ascending excitatory motor neuron) 및 NO, ATP, VIP 및 PACAP과 같이 환상근(circular muscle)을 억제하는 신경전달물질 칵테일(cocktail)을 방출하는 강하한 억제 뉴론(descending inhibitory neuron)의 고정된 순환을 포함한다.
세포배양
유극 장상피세포(polarized intestinal epithelial cell)의 단층막과 공배양을 수립하기 위한 적절한 방법은 실시예 1에 나타나 있고, 또한 J. Chevalier et al., 2008, J. Physiol. 586 1963-1975에 서술되어 있다.
Caco-2, T84, HT29 및 TC7과 같은 단층막을 형성하는 모든 장상피세포의 배양이 적합하다. 바람직하게는 T84가 사용되었다.
초기 장신경시스템 세포로, 상기 세포는 비-인간 포유류 태아에서 수득한 것이 바람직하며, 설치류가 바람직하고, 랫(rat)이 더욱 바람직하다.
바람직하게는 적합한 성장 배지에서 늦은 지수기(late exponential phase)에서 성장 및 세척되어 사용되었다. 상기 박테리아는, 바람직하게는 4 내지 400 박테리아/상피세포, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 박테리아/상피세포, 심지어 더욱 바람직하게는 30 내지 50 박테리아/상피세포의 양으로 공배양의 애피컬 측면(apical side)에 더해졌고, 대조군으로는 박테리아를 넣지 않았다. 바람직하게 양성대조군으로는 1 mM 부티라트(butyrate) 또는 40 mM KCL을 사용하였다.
바람직하게 상기 배양 단계는 37℃에서 수행된다. 바람직하게 상기 배양단계는 1 내지 72 시간, 더욱 바람직하게 2 내지 36 시간, 심지어 더욱 바람직하게 4 내지 12시간이 걸린다.
바람직하게 공배양(co-incubation) 후, 상피세포 및 박테리아를 포함하는 칸(compartment)은 제거되고, 5% CO2 및 습기가 있는 인큐베이터에서 초기 신경세포를 12 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 20 내지 28시간 배양한다.
바람직하게 ChAT 신경에 비해 전체 신경의 양은, 면역조직 염색(immunohistochemical staining) 사용, 뉴론의 전체 양을 세기위한 항-뉴론(anti-neuron) 특이적 에놀라아제(enolase) 사용, 및 ChAT 신경을 세기 위한 항-콜린 아세틸 전이효소(anti-choline acetyl transferase)로 측정된다.
바람직하게 VIP는 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail)이 있을 때, 신경세포의 수집 및 단백질의 추출(extracting)에 의해서 결정된다.
조성물에 대한 더 상세한 세부사항
본 발명은 상기 사용 및 특성에 언급된 박테리아의 균주를 포함하는 조성물을 고려한다. 본 발명은 또한 하기의 균주의 하나 또는 그 이상을 포함하는 조성물을 고려한다(상기 균주에서 유래한 돌연변이 또는 유전적으로 형질전환된 균주를 포함):
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)],
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)],
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)],
이의 용도는:
- 장 질환의 치료 및/또는 예방, 바람직하게는 장 운동질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 변비(constipation) 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 설사, 장 감염, IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방,
일반적으로 개체의 생체 내(in vivo)로 투약될 때.
본 발명의 조성물에 있어서, 언급된 균주는 살아있거나 또는 죽은 전체 박테리아의 형태로 사용될 수 있다. 반면에, 상기 균주는 박테리아 용해물(lysate)의 형태 또는 박테리아의 부분(fraction)의 형태로 사용될 수 있다; 상기 사용에 적합한 상기 박테리아 부분은, 예를 들어 VIP 수준 완화 효과의 특성 및 본 발명에 설명된 공배양 모델의 ChAT 신경의 수준을 테스트하여 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 박테리아 세포는 살아있고, 독자생존이 가능한(viable) 세포로 제공된다.
본 발명의 상기 조성물은 투여, 특히 경구투여(oral administration)를 위해서 적합한 어떤 형태일 수 있다. 이는, 예를 들어 고체, 반 고체(semi-solid), 액체 및 가루(powder)를 포함한다. 액체 조성물은 일반적으로 예를 들어, 음료수와 같이 쉬운 투여를 위해 선호된다.
상기 조성물은 예를 들어, 적어도 어느 하나의 박테리아, 바람직하게는 상기 언급된 박테리아 균주의 건조g 당 적어도 105, 바람직하게는 적어도 1 x 106 cfu/g으로 구성될 수 있다. 이는 바람직하게 락토바실리(lactobacilli) 또는 비피더스균(bifidobacteria)를 포함하는 군으로부터 선택되었다.
상기 박테리아가 살아있는 박테리아의 형태일 때, 상기 조성물은 일반적으로 상기 조성물의 g당 105 내지 1013 cfu(colony forming unit), 바람직하게는 적어도 106 cfu, 더욱 바람직하게는 적어도 107 cfu, 여전히 더욱 바람직하게는 적어도 108 cfu, 및 가장 바람직하게는 적어도 109 cfu로 구성된다. 액체 조성물의 경우, 상기는 일반적으로 104 내지 1012 cfu, 바람직하게는 적어도 105 cfu, 더욱 바람직하게는 적어도 106 cfu, 여전히 더욱 바람직하게는 적어도 107, 및 가장 바람직하게는 109 cfu/ml에 상응한다.
본 발명의 상기 조성물의 예는 식료품 및 특히 유제품을 포함하는 영양상의 조성물이다.
상기 조성물은 예를 들어 유제품, 바람직하게는 발효된(fermented) 유제품일 수 있다. 발효된 유제품의 형태에서 투약은 IBS를 위해 더욱 유리한 낮은 락토오즈(lactose) 수준의 추가적인 이점을 갖는다. 임의적으로, 젖산균의 다른 균주는 제공될 것이다. 상기 발효된 제품은 액체 형태로 제공 또는 발효된 액체를 건조한 건조 가루의 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게 상기 발효된 제품은 신선한 제품이다. 여러 번의 열처리 단계를 거치지 않은 신선한 제품은 박테리아 균주가 살아있다는 이점을 갖는다. 바람직하게 상기 발효된 제품은 유제품이고, 더욱 바람직하게 발효된 우유 및/또는 발효된 유장(whey)이다. 바람직하게 영양상의 조성물은 흔들어서, 또는 마실 수 있는 형태의 요거트(yoghurt), 또는 발효된 우유이다. 바람직하게 상기 발효된 제품은 치즈이다. 바람직하게 상기 발효된 제품은 흔들어서, 또는 마실 수 있는 형태의 발효된 콩, 시리얼 및/또는 과일과 같은 발효된 야채이다.
바람직하게 상기 본 발명의 영양상의 조성물은 유아용 조제유(infant milk formula) 또는 유아 성장기 조제유(infant follow-on formula)인 유아식이다. 바람직하게 상기 본 발명의 조성물은 영양보조제 또는 의료식품인 기능식품적(nutraceutical) 또는 약학적 제품이다.
본 발명의 영양상의 조성물은 또한 식품보충제, 및 기능성 식품을 포함한다. 상기 "식품보충제"는 정제(tablet), 가루, 캡슐(capsule), 물약(portion) 또는 영양물(aliment)과 일반적으로 결합하지 않는 어떤 다른 형태인 식품, 및 건강에 이로운 효과를 갖는 일반적으로 사용된 화합물(compound)로 만들어진 제품에 표기한다. 상기 "기능성 식품"은 또한, 건강을 위해 이로운 효과를 갖는 영양물이다. 특히, 식품보충제 및 기능성 식품은 질환에 대해서, 예를 들어 만성질환(chronic disease)에 대해서 생리학적인 효과[예방(protective) 또는 치유(curative)]를 가질 수 있다.
ChAT 신경을 증가시키는 젖산균 또는 비피더스균의 최소 하나의 균주의 혼합 및 VIP 수준을 증가시키는 젖산균 또는 비피더스균의 최소 하나의 균주의 혼합으로 구성된 상기 조성물이 바람직하다. 상기 혼합은 IEB에 더하여 운동성에 있어서 개선된 효과를 유리하게 가질 것이다.
B)군, 바람직하게 B3)군에 속한 최소 하나의 균주, 및 A)군, 바람직하게 A3)군에 속한 최소 하나의 균주의 혼합이 바람직하다. 상기 혼합은 IEB에 더하여 운동성에 있어서 개선된 효과를 유리하게 가질 것이다.
그러므로, 본 발명은 하기로 구성된 조성물 또한 관련한다:
- 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 적어도 어느 하나의 균주:
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)[B) - B3)],
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320)[B) - B3)], 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)[B) - B3)], 및
- 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 적어도 어느 하나의 균주:
- DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494)[A) - A3)],
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)[A) - A3)],
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219)[A) - A3)], 및
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)[A) - A3)].
본 발명의 상기 조성물은 또한 다른 젖산균의 하나 또는 그 이상, 프로바이오틱 균주이거나 아닌, 예를 들어 락토바실러스(lactobacillus), 락토코커스(lactococcus), 스트렙토코커스(streptococcus), 및 비피더스균 속으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주로 구성될 수 있다. 특히, 상기(상기들) 다른 균주(들)은 스트렙토코커스 서머필러스(streptococcus thermophilus)의 하나 또는 그 이상의 균주, 및/또는 락토바실러스 불가리쿠스(lactobacillus bulgaricus)를 포함할 수 있다.
적용
하나의 실시예에서, 본 발명의 균주는 ChAT 신경의 수를 증가시키는 것이 발견되었다. 콜린 전이효소 EC 2.3.1.6(choline acetyltransferase EC 2.3.1.6)는 뉴론의 중심부 내에서 합성 및 신경 말단(nerve terminal)로 전달되는 효소이다. 콜린 전이효소의 역할은, 아세틸-코에이(acetyl-coA)를 콜린에 연결시켜, 그 결과로 신경전달물질(neurotransmitter) 아세틸콜린을 형성한다. 이는 운동뉴론을 위해 면역조직의 마커(immunohistochemical marker)로 사용된다. ChAT 신경에의 효과는 개선된 연동운동의 결과로 개선된 수축을 가져온다. 그러므로, ChAT 신경을 증가시킬 수 있는 본 발명의 균주 및 조성물은, ENS의 개선, 연동운동의 개선 또는 향상, 장 운동성의 개선, 및/또는 위-장 체류시간(gastro-intestinal transit time)의 감소를 위해 적절히 투약된다. 증가한 콜린성의 표현형(increasing cholinergic phenotype)은 장내 통과의 억제와 결합된 GI 병리학(pathology)에 있어서 치료상의 관심사이다. 특히 다양한 연구에서 느린 통과는 ChAT 뉴론의 감소된 발현과 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. 특히, (i) 심한 변비환자는 일반적으로 ChAT 신경의 더 낮은 수를 갖고, (ii) 장관근(myenteric) ACh의 생산은 감염 및 감염 후(post infection, PI)의 둘 다의 과정 동안 유의적으로 감소하며, (iii) 노화가 진행되는 동안 콜린성 신경의 부분의 감소는 보고되었다.
본 명세서에서, 박테리아 균주의 사용, 바람직하게 뉴론에서 콜린성 발현을 향상시키기 위한 젖산균 또는 비피더스균은 심한 변비환자 및 IBS-C를 위한 미래에 치료법으로 관심을 받을 것이다. 따라서, 본 발명의 상기 균주 및 조성물은 IBS-C, 및/또는 변비로 고통받는 환자에게 유용하게 투약 된다. 가장 유용한 균주는 상기 언급한 B) 또는 B3)군의 균주이다.
특정한 하나의 실시예에서, 본 발명의 균주 및 조성물은 노인을 위해 사용된다. 본 발명의 노인은 65세 이상, 바람직하게 70세 이상, 바람직하게 75세 이상, 바람직하게 80세 이상, 바람직하게 85세 이상의 사람으로 정의된다. 노인은 일반적으로 결장, 바람직하게 횡행결장(transversal colon)에 위치한 장신경계(enteric nervous system)의 ChAT 뉴론의 수가 감소되어 있다. 그러므로, 본 발명의 상기 균주 및 조성물은 노인을 위해 IBS, 바람직하게 IBS-C, 및/또는 변비의 치료 및/또는 예방을 위해 유용하게 투약된다. ChAT 신경을 증가시킬 수 있는 균주는, DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317), DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279)와 같은 B)군이다. 상기 균주는, VIP가 좋은 IEB 기능 및 연동운동과 같은 GI관 운동성의 또 다른 중요한 부분인 GI 관의 이완을 위해 필요한 이후, 바람직하게 VIP를 감소시키지 않는다. 상기 기준에 맞는 상기 균주는 DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및 DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317)이다. 그러나, 또한 DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 균주는, TEER이 감소하지 않은 것으로, TEER 실험에 의해 결정된 IEB 기능에 음성(negative)의 효과를 주지 않았다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 균주는 VIP의 수준을 증가시키기 위해 발견되었다. 소화기 계통(digestive system)에 관하여, VIP는 민무늬근(smooth muscle) 완화[식도 아랫부분의 괄약근(lower oesophageal sphincter), 위(stomach), 쓸개(gallbladder)], 췌액(pancreatic juice) 및 담즙(bile)으로 물의 분비를 자극, 및 장관 내강(intestinal lumen)로부터 위액(gastric acid) 분비 및 흡수의 억제 원인을 유도한다. 장에서 상기 역할은 장 민무늬근 확장, 말초혈관(peripheral blood vessel) 확장, 췌장의 중탄산염(bicarbonate) 분비 자극, 및 가스트린-자극된(gastrin-stimulated) 위산 분비의 억제에 더하여, 물 및 전해액(electrolyte)의 분비를 크게 자극하기 위한 것이다. 상기 효과는 운동성을 증가시키기 위해 함께 작용한다. 그러므로, 상기 발견은 장 운동성, 특히 장의 이완 부분의 개선된 효과를 갖기 위한 상기 균주를 나타낸다. VIP 또한 IEB 기능을 유의적으로 증가시킨다. 그러므로, 본 발명의 균주 및 조성물은 ENS의 개선, 연동운동의 개선 또는 향상, 투과성의 감소, 장 운동성의 개선 및/또는 위-장 체류시간의 감소를 위해 유용하게 투약된다. 따라서, 본 발명의 균주 또는 조성물은 하기로부터 고통받는 환자에게 또는 환자를 위해서 투약된다:
- 장 질환의 치료 및/또는 예방, 바람직하게 장 운동성 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 설사, 장 감염, IBS-C, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 및 비만인 사람에서 발견된 질환의 치료 및/또는 예방.
가장 유용한 균주는 상기 언급된 A) 또는 A3)군이다.
본 발명의 세부사항 또는 장점은 하기의 비한정적인 실시예에서 찾을 수 있다.
실시예
<
실시예
1> 상피세포(
epithelial
cell
) 및
장신경
세포(
enteric
neuronal
cell)를 포함하는
공배양
(
co
-
culture
) 모델에서 유산균의 스크리닝
세포배양
임신한 스프래그-다우리 랫(Sprague-Dawley rat)은 구입하였고(CERJ, Le Genest St Isle, France 및 Janvier-Breeding Center, Belgium), 절단된 경동맥(carotid artery)을 따라 과잉투여된 CO2로 죽였다. 배아(3 마리의 임신한 랫 당 분리된 35-45개)는 제거되고, 목을 베어 죽였다. 배아의 작은창자는 제거되고 HBSS(Sigma, France)에서 잘 깍둑썰기 되었다. 조직 조각(tissue fregment)은 배지(DMEM-F12 1:1 배지) 5 ml에 수득 및 0.1% 트립신(trypsin)을 넣고 37℃에서 15분간 소화되었다(digested). 상기 트립신 반응은 10% 우태혈청(foetal calf serum)을 첨가한 10 ml의 배지를 첨가하여 정지시키고, 그 후 DNAse I(0.01%, Sigma)을 37℃에서 10분간 처리하였다. 10 ml의 파이펫으로 가루로 빻은(triturating) 후, 세포는 750 r.p.m.에서 10분간 원심분리되었다. 상기 세포는 수를 세고, 그리고 2.4 × 105 cell/cm2의 밀도로 멸균된 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 젤라틴(0.5%, Sigma) 용액으로 6시간 동안 코팅된 24 웰 플레이트(24 well plate)에 심어졌다(seed). 24시간 후, 상기 배지는 무혈청배지(serum free medium)[1%의 N-2 보충제(Life technologies, France)가 포함된 DMEM-F12 1:1]로 교체되었다. 상기 세포는 장신경계(ENS)의 초대배양 세포를 얻기 위하여 14일 동안 계대배양 되었다. 이틀에 한 번씩 배지의 절반을 교체하였다. 14일째, 초대 신경세포는 공배양 모델의 수립을 위해 준비되었다.
T84 세포주(EATCC)는 DMEM-F12(1:1, GIBCO)에 10% 열비활성화된(heat inactivated) FBS 및 50 IU/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 배지에 배양되었다. 상기 세포는 12-웰 트랜스웰® 필터(12-well Transwell® filters, Corning, NY USA)에 2 × 105 cell/insert로 심어지고, 밀집도(confluence)를 얻기 위해 배양되었다.
상피 세포다 밀집도에 도달한 다음날, 트랜스웰® 필터는 장 신경세포가 바닥에 심어진 12-웰 플레이트로 이동되었다. 상피 및 신경 세포는 상피세포를 위한 배지에서 공배양되었다.
박테리아 균주의 성장
박테리아는, MRS+ 시스테인(cysteine) 배지에서 성장하는 DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494) 균주를 제외하고, 비피더스균 및 락토바실리(lactobacilli)를 위한 TGYH에서 16시간 동안 성장하였고, PBS로 2번 씻고, 박테리아 현탁액(suspension)과 같은 양을 필터에 지속적으로 첨가하여 4.108 cfu/ml로 맞춰졌다. 상기 균주는 필터의 칸에 40 박테리아/상피세포의 MOI로 첨가되었다. 대조군으로는, 박테리아를 넣지 않았다.
공-배양(co-incubation)의 8시간 후, 상피세포 및 박테리아를 포함한 상기 필터 칸은 제거되고, 초대 신경 세포는 5% CO2가 포함된 습기가 있는 인큐베이터에서 배양되었다. 대조군 웰에서 1 mM 부티라트(butyrate) 및 40 mM KCl로 자극된 신경 세포는 각각의 ChAT 및 VIP 측정이 수행되었다.
면역염색.
ChAT
신경 측정
배양 후, 신경세포의 수를 측정하기 위해 면역조직화학법이 수행되었다. 세포를 고정[4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)가 포함된 0.1 M PBS에 실온에서 1 시간동안 둠]한 후에, 상기 세포를 PBS로 3번 세척하고, 그리고나서, 0.5% 트리톤 X-100(triton X-100) 및 4% 말 혈청(horse serum)이 포함된 PBS/NaN3에 30분 동안 삼투화시킨다. 1차 항체: 토끼 항-신경 특이적 에놀라아제(rabbit anti-neurone specific enolase, NSE)(1:2000; Biovally, France) 및 토끼 항-콜린 아세틸 전이효소(rabbit anti-coline acetyl transferase)는 PBS/NaN3, 0.5% 트리톤 X-100 및 4% 말 혈청에 희석되었고, 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 일차 항혈청(antiserum)으로 반응 후, 세포는 PBS로 3번 세척하고, 당나귀 항-토끼 IgG 결합된 FITC(fluoresceine isothiocyanate)(1:200 Immunotech, France) 및 7-아미노-4-메틸-쿠머린-3-아세테이트(7-amino-4-methyl-coumarin-3-acetate) 각각으로 3시간 동안 반응시켰다.
견본(specimen)은 프래임 그래버 카드(frame grabber card, Scion Image, SL Microtest)를 통해 매킨토시(macintosh) 컴퓨터와 연결된 하얀 비디오 카메라(white video camera)(Mod, 4910, Cohu Inc, Germany)가 설치된 올림푸스(Olympus) IX50 형광현미경(fluorescence microscope)으로 보았다.
VIP
측정:
VIP 결정을 위해, 신경세포는 12-웰 플레이트로부터 수득되었고, 상기 단백질은 단백질 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics, France)가 포함된 RIPA 용해완충액(lysis buffer, Millipore, France)를 사용하여 추출하여, VIP 수준을 ELISA(Bachem, Germany)로 측정하였다.
결과
젖산균 및 비피더스균을 포함하는 102 프로바이오틱 균주의 일부의 상호작용이 언급되는 VIP 및 ChAT 마커에 있어 초대 장의 뉴런의 다른 반응은 <표 1>에 나타난다. 오직 A3) 또는 B3) 또는 C3)군에 속하는 일부 균주만 보인다. 게다가, 이는 VIP 및 ChAT에 어떤 영향도 주지 않는 26개의 균주[비피도박테리움 롱검(bifidobacterium longum) NCC 2705(CNCM I-2618), 락토바실러스 람노서스(lactobacillus rhamnosus) GG (ATCC 53103) 및 락토바실러스 카제이 시로타(lactobacillus casei shirota)을 포함], VIP 및 ChAT 양쪽을 감소시키는 C2)군에 속한 11개 균주[알파-와스(Alfa-Wass)의 비피도박테리움 롱검 W11(LMG P-21586)을 포함], VIP는 감소시키나 ChAT에는 효과없는 10개의 균주[비피도박테리움 인판티스(bifidobacterium infantis) UCC 3564, 비피도박테리움 롱검 Bb536, 비피도박테리움 애니멀리스 종 락티스(bifidobacterium animalis spp lactis) Bb12(DSM 15954), 및 비피도박테리움 애니멀리스 종 락티스 Bi-07(ATCC SD5220)을 포함] 및 ChAT는 감소시키나 VIP에는 효과가 없는 C3)군에 속하는 41개 균주[락토바실러스 존소니이(lactobacillus johnsonii) La1(CNCM I-1225), 락토바실러스 플렌타룸(lactobacillus plantarum) 299v(DSM 9843), 락토바실러스 루테리(lactobacillus reuteri) SD 2122(ATCC 55730)을 포함]가 언급된다.
| 군 | DN 번호 종(CNCM 번호) |
VIP | ChAT | ||||
| 추측된차이* vs 대조군 | p 값 | 경험적평균 | 추측된차이 vs 대조군 | p 값 | 경험적평균 | ||
| 1 | DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320) 비피도박테리움 비피덤 |
-0.0097 | 0.9 | 0.0790 | 0.2709 | 0.09 | 0.1796 |
| 1 | DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317) 락토바실러스 람노서스 |
-0.0389 | 0.7 | 0.0397 | 0.3151 | 0.10 | 0.2535 |
| 1 | DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 락토바실러스 애시도필러스 |
-0.1329 | 0.09 | -0.2221 | 0.2847 | 0.02 | 0.2796 |
| 2 | DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494) 비피도박테리움 락티스 |
0.2345 | 0.01 | 0.2001 | -0.2615 | 0.05 | -0.0825 |
| 2 | DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321) 비피도박테리움 브레브 |
0.2248 | 0.01 | 0.2020 | -0.5450 | 0.00 | -0.5723 |
| 2 | DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219) 비피도박테리움 브레브 |
0.2715 | 0.02 | 0.3552 | -0.3632 | 0.01 | -0.1281 |
| 2 | DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318) 락토바실러스 플랜타룸 |
0.5976 | 0.00 | 0.6813 | -0.6269 | 0.00 | -0.3918 |
*값은 박테리아 균주를 넣지 않은 대조군과 비교된 차이로 주어짐.
비록 DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 균주가 VIP 수준을 감소시켜도, 이는 균주와 함께 4 또는 6시간 동안 배양이, 심지어 손상군 대(vs) 대조군이 존재해도 TEER 값을 유의적으로 감소시키지 않는, TEER 모델로 나타났다(Hirotani et al., 2008, Yakugaku Zasshi Sep; 128(9):1363-8). 따라서, 박테리아는 TGYH에서 배양되었다. 상기 배양 현탁액은 PBS로 세척되었다. 그 후, 상기 박테리아(100 cfu/cell)는 T84 세포주 단층면의 아피칼 측면(apical side)에 첨가되었다. 2시간 배양 후, LPS(L4516, - EPEC - 0127: B8)가 40 ng/ml로 아피칼 측면에 첨가되거나 첨가되지 않았다. 그리고 나서, 2 시간 및 4시간 배양 후, 상기 TEER 값은 상피층 장막기능(epithelial barrier function)을 가늠하기 위하여 측정되었다. 모든 실험은 독립적으로 세 번(three times) 수행되었고, LPS가 존재 및 비존재 할 경우 세 번(triplicate) 수행되었다. t=0에서 상기 T84의 상기 값은 100%로 정해졌다. LPS TEER의 비존재는 DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 균주와 함께 T4에서 98.7% 및 T6에서 100.2%; T84 혼자의 경우, 이는 여전히 100%였다. LPS의 존재하에, 상기 대조군 T84는 T4에서 t=0일 때와 비교하여 56.2%였고, DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 균주와 함께 47.9%; T6에서 상기 T84 대조군은 46.7%였고, DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279) 균주와 함께 52.2%였다.
상기 TEER과 같은 모델, 특히 모두 A3)군에 속하는 DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494), DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318) 및 DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321)의 사용은 LPS가 존재할 때 TEER에 의해 가늠된 장 장막기능에 좋은 결과를 보여줬다. <표 2> 참조.
| 균주 | TEER T4/TEER T0(%) | TEER T6/TEER T0(%) | |||
| 중요성 | 경험적평균 | 중요성 | 경험적평군 | ||
| T84 대조군 | 56.20 | 46.76 | |||
| DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494) | B.락티스 | *** | 71.27 | *** | 51.03 |
| DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219) | B.브레베 | *** | 70.70 | *** | 55.87 |
| DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318) | L.플랜타룸 | *** | 65.84 | *** | 64.37 |
| DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321) | B.브레베 | *** | 84.44 | *** | 80.38 |
***p 값 < 0.05
Claims (26)
- A) 장신경계(enteric nervous system)의 바소-활성 장 펩티드(vaso-active intestinal peptide, VIP) 수준의 증가, 또는
B) 장신경계의 콜린 아세틸기전이효소 면역반응성의 뉴론(Choline AcetylTransferase ImmunoReactive neuron, ChAT) 수준의 증가, 또는
C) 장신경계의 ChAT 수준의 감소에 있어서, 적어도 어느 하나의 박테리아, 바람직하게 락토바실리(lactobacilli) 및 비피더스균(bifidobacteria)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 박테리아를 포함하는 조성물의 용도.
- 제 1항의 조성물에 있어서,
A3) ChAT가 증가하지 않고 VIP를 증가, 또는,
B3) VIP가 증가하지 않고, 바람직하게 장상피세포 막(intestinal epithelial cell layer)의 전기적 저항(electrical resistance)도 함께 감소하지 않고, ChAT가 증가, 또는
C3) VIP가 감소하지 않고, ChAT를 감소, 또한,
C2) ChAT를 감소 및 VIP를 감소시키기 위한 조성물의 용도.
- 상기 청구항 중 어느 항에 따른 조성물에 있어서,
- 장 질환의 치료 및/또는 예방, 바람직하게 장 운동성(intestinal motility) 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 설사, 장 감염, IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 비만인 사람들에서 발견된 질환의 치료 및/또는 예방용의 추가적인 용도.
- 상기 청구항 중 어느 항에 따른 조성물에 있어서, 상기 조성물은:
A) 장신경계의 VIP 수준 증가, 및 장 질환의 치료 및/또는 예방, 바람직하게 장운동성 질환의 치료 및/또는 예방에 사용, 또는
B) 장신경계의 ChAT 수준 증가, 및 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용, 또는
C) 장신경계의 ChAT 수준 감소, 및 설사, IBS-D, IBS-PI, IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물에 있어서, 상기 조성물은:
A3) ChAT이 증가하지 않고 VIP를 증가,
및 이는:
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아 또는 비만인 사람들에서 발견된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은:
B3) VIP는 증가하지 않고, 바람직하게 장상피세포막의 전기저항도 함께 감소하지 않고, ChAT를 증가,
및 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 조성물에 있어서, 상기 조성물은:
C3) VIP가 감소하지 않고, ChAT를 감소,
및 변비 및 IBS-C를 포함하는 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은:
C2) ChAT를 감소 및, VIP를 감소,
및 설사, 장 감염, IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되기 위한 것을 특징으로 하는 용도.
- 상기 청구항 중 어느 항의 조성물에 있어서, 상기 박테리아 균주는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 균주인 용도:
- DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494),
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219),
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318),
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317),
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279).
- - 장 질환의 치료 및/예방, 바람직하게 장운동성 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 설사, 장 감염, IBS-D, IBS-PI, 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 사용되기 위하여 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 균주를 포함하는 조성물의 용도:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219),
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318),
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317),
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279).
- - 변비, IBS-C,
- 설사, 장 감염, IBS-D, IBS-PI, IBD,
- IBS, 및
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견된 질환으로 구성된 군으로부터 고통받는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 균주를 포함하는 조성물의 용도:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219),
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318),
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317),
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279).
- 제 10항 또는 제 11항의 어느 한 항의 조성물에 있어서,
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서,
상기 박테리아 균주는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 박테리아의 균주로 용도:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), 및
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318).
- 제 10항 또는 제 11항의 어느 한 항의 조성물에 있어서,
변비 및 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서,
상기 박테리아 균주는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아 균주의 용도:
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317),
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279).
- 제 10항 또는 제 11항의 어느 한 항의 조성물에 있어서,
A) 장신경계의 바소-활성 장 펩티드(VIP)를 증가, 바람직하게는 A3) ChAT는 증가되지 않으나 VIP는 증가시키는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 박테리아를 포함하는 조성물의 용도:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), 및
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318).
- 제 14항의 조성물에 있어서:
- IBS 및 IBD로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방, 또는
- 노인, 유아, 또는 비만인 사람들에게 발견된 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 용도.
- 제 10항 또는 제 11항의 어느 한 항의 조성물에 있어서,
B) 장신경계의 ChAT 수준을 증가, 바람직하게 B3) VIP가 증가하지 않고, ChAT 증가시키는 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도:
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317),
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279).
- 제 16항의 조성물에 있어서, 변비 또는 IBS-C로 구성된 군으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 용도.
- 상기 청구항의 어느 항의 조성물에 있어서, 위-장 운동성 개선, 장 연동운동 개선 및/또는 장 투과성을 감소시키기 위한 용도.
- 하기로 구성된 군으로부터 선택된 박테리아의 균주:
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318),
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317), 및
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320).
- 제 19항의 적어도 어느 하나의 균주로 구성되는 조성물.
- B) 장신경계에서 ChAT 수준을 증가시키는 락토바실리(lactobacilli) 및 비피더스균(bifidobacteria)으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 박테리아 균주, 또는
A) 장신경계에서 바소-활성 장 펩티드(VIP) 수준을 증가시키는 락토바실리 및 비피더스균으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 박테리아의 균주로 구성된 조성물.
- 제 21항의 조성물에 있어서,
- 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 박테리아의 균주:
- DN_116_047(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4317),
- DN_154_0067(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4320), 및
- DN_119_0118(2010.02.25에 제출된 CNCM I-4279); 및
- 하기의 균주로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 어느 하나의 박테리아의 균주:
- DN_173_010(2000.06.20에 제출된 CNCM I-2494),
- DN_156_0032(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4321),
- DN_156_007(1999.05.31에 제출된 CNCM I-2219), 및
- DN_121_0304(2010.05.19에 제출된 CNCM I-4318)로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기 청구항의 어느 한 항의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 유제품, 바람직하게는 발효된 유제품인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상기 청구항의 어느 한 항의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 락토바실리 및 비피더스균으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 박테리아 균주 건조 무게 g당 적어도 105, 바람직하게 적어도 1 × 106 cfu인 것을 특징으로 하는 조성물.
- a) 단층막으로 제시된 장 상피세포 및 단층막의 기저막 측면에 제시된 장 신경세포의 공배양(coculture)을 배열하는 단계,
b) 장 상피세포의 단층막의 아피칼 또는 루미날 측면에 박테리아 균주를, 바람직하게 하나의 상피세포 당 약 4 내지 400개의 박테리아를 더하는 단계,
c) 젖산균의 균주와 함께 공배양을 배양하는 단계,
d) 바람직하게 신경단위의 세포(neuronic cell)를 분리하는 단계,
e) 신경세포에 의해 생산된 VIP, ChAT, 기질 P, 산화질소(nitrogen oxide) 신경, PACAP, 및/또는 ATP의 양 및 선택적으로 추가적으로 장 상피세포 막의 상피 전기저항(TransEpithelial Electrical Resistance, TEER)을 측정하는 단계로 구성된 박테리아의 균주를 선택하는 방법.
- 제 25항의 방법에 있어서, 상기 박테리아 균주는 락토바실리 및 비피더스균으로 구성된 군에 속한 것을 특징으로 하는 방법.
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