CN103209698A - 用于改善肠神经系统的益生菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乳酸菌的用途，其用于改善肠神经系统，更特别地用于治疗和/或预防诸如便秘和/或易激性肠病的肠道疾病。

Description

用于改善肠神经系统的益生菌菌株
技术领域
本发明涉及包含用于改善肠神经系统的乳酸菌菌株的组合物。所述组合物尤其适于治疗和/或预防诸如便秘和/或易激性肠病(irritable bowel disease)的肠道疾病。
背景技术
肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)或痉挛性结肠(spastic colon)是功能性肠病，其特征为在没有任何可检测到的器质性病因的情况下的慢性腹部疼痛、不适、胀气以及肠排便习惯改变。有些情况下，报道有低度肠炎。其主要症状可以是腹泻或便秘，或二者交替(分别归类为IBS-D、IBS-C)。肠易激综合征可始于感染后(post-infectious，IBS-PI)、应激性生活事件之后，或在无任何其他医学指征的情况下成年发病。在肠易激综合征中，常规的临床检测不会出现异常，但肠对某些刺激(例如气球吹入试验)更为敏感。
肠易激综合征是一种非常常见的疾病，在任一时间，其影响大约15%的人群。患该疾病的女性大约为男性的两倍。肠易激综合征是慢性疼痛、疲乏以及其他症状的起因，并且其增加患者的医疗费用，并导致旷工。研究者已报道肠易激综合征的高流行率连同增加的费用导致该疾病具有高社会成本。还认为肠易激综合征是一种慢性疾病，其可显著影响患者的生活质量。
关于肠易激综合征病因的导向理论涉及肠神经系统(ENS)。肠神经系统(ENS)是外周神经系统(PNS)的一部分，其直接调节胃肠道(GI)功能，埋于胃肠系统的内膜中。其包含传出神经元、传入神经元以及中间神经元。肠神经系统的结构和生理功能通过神经胶质细胞(星形细胞)而实施。肠神经系统组成具有功能特异性作用的两个主要神经丛。
位于纵肌和环状肌之间的肠肌丛含有主要参与调节肠运动的神经元。传出神经元或运动神经元通过肠肌控制蠕动和肠内容物的搅拌。调节运动的运动神经元由如下两大类组成：
-释放用于收缩的乙酰胆碱(被称为胆碱乙酰基转移酶免疫反应性神经元(“ChAT-IR”或“ChAT”或“ChAT神经元”或“ChAT神经”))和/或P物质(SP)的兴奋性肠肌神经元；和
-释放用于松弛的一氧化氮(被鉴定为一氧化氮合酶神经元(NOS-IR))和/或血管活性肠肽(VIP)的抑制性肠肌神经元。
胆碱乙酰基转移酶EC2.3.1.6是一种在神经元主体内合成并转移至神经末端的酶。ChAT的作用是将乙酰辅酶A添加至胆碱，导致形成神经递质乙酰胆碱。实验上，通过测定ChAT神经元的数量来推断对于乙酰胆碱产生的影响，通常，ChAT神经数量增加提示乙酰胆碱增加。
位于环状肌和粘膜之间的粘膜下神经丛含有主要参与调节肠上皮屏障(IEB)功能(例如细胞旁渗透性)的神经元。具体地，粘膜下神经丛中的肠神经元激活通过释放血管活性肠肽VIP而降低细胞旁渗透性，而乙酰胆碱(Ach)则提高细胞旁渗透性，构成了由ENS微“调”肠上皮屏障渗透性的基础。由此，关于细胞旁渗透性的神经元调节，粘膜下神经元释放血管活性肠肽的增加提高了肠上皮屏障的完整性，而粘膜下神经丛ChAT神经元的增加则降低了肠上皮屏障IEB的电阻。
尽管目前尚无法治愈肠易激综合征，但有试图缓解症状的治疗方法，包括调整饮食、药物治疗以及心理干预。
已报道益生菌、尤其是乳酸菌菌株有益于治疗和/或预防肠易激综合征。这样的菌株的实例公开在WO2007/036230、WO03/010297以及WO2009/080800中。然而，这些菌株是根据其对免疫系统、对肠渗透性或对肠微生物群的作用选择的，而非根据其改善肠神经系统功能的作用对菌株进行筛选。WO2008/064489揭示了使用益生菌阻断中间电导钙依赖性钾电流，导致抗炎作用。WO2007/132359揭示了乳酸杆菌(Lactobacillus)和大麻素受体激动剂和/或阿片类受体拮抗剂在痛觉方面的应用。WO2006/032542揭示了乳酸杆菌用于止痛目的的用途。Kamm等(Kamm et al,2004,Neurogastrointest.Motil16:53-60)揭示了布拉酵母菌(S.boulardii)对有降低猪空肠钙结合蛋白-28k(CALB)的作用，但对于猪空肠的其他神经元标志物无作用。Metugriachuk等(Metugriachuk et al,2006,Rejuvenation Res.9:342-345)揭示了共生菌制备物对老龄Wistar大鼠的小肠和大肠运动性的影响，其显著增加小肠和结肠的肌电活性，增加血管活性肠肽的mRNA表达，但对血管活性肠肽浓度无显著作用。
因此，需要对肠神经系统具有有益作用而用于肠易激动综合征、便秘和/或其他疾病的各益生菌菌株个体进行进一步的研究。
发明内容
本发明人应用了新型模型系统用于筛选和选择对于肠神经系统(ENS)具有改善作用的乳酸杆菌和双歧杆菌菌株。该模型含有来自人结肠癌的肠上皮细胞(单)层，和位于所述单层的基底侧上包含来自肠肌层和粘膜下神经丛的神经元的肠神经系统细胞的原代培养物的混合物。使用该模型，可通过检测在顶面或腔面添加这些组分对于基底侧的血管活性肠肽(VIP)表达和/或ChAT释放神经的作用来评价食品级组分、特别是乳酸菌和双歧杆菌菌株对于肠神经系统的作用。
因此，该模型允许筛选和选择用于改善肠神经系统功能的新型乳酸菌和双歧杆菌菌株。这样的菌株改善肠运动和蠕动。使用某些菌株可减少肠运输时间，这可解决某些疾病，例如便秘。使用某些菌株可增加肠运输时间，这可解决某些疾病，例如腹泻。增加血管活性肠肽的菌株还改善肠上皮屏障完整性。这样的菌株尤其可用于预防和/或治疗肠易激综合征和/或便秘以及其他与肠神经系统功能降低相关的疾病，并且在这些方面比现有菌株更有效。
增加胆碱能表型、特别是ChAT神经表达对于与结肠运输抑制相关的胃肠道病理具有治疗意义。使用所选择增强神经元中胆碱能表达(即ChAT)作用增强的乳酸菌或双歧杆菌对于便秘患者和患有IBS-C的患者具有治疗意义。因此，本发明的一组乳酸菌或双歧杆菌菌株有利地增加了ChAT神经的数量，这标志着对于肠运动具有改善作用，尤其对于肠易激综合征有益，特别是IBS-C患者和患有便秘的患者。该组被称为组B)。良好的运动需要大量的ChAT神经，该神经负责收缩并具有促运动作用。在该组的某些令人感兴趣的实施方式中，由于优选肠上皮屏障的功能和松弛肌肉的能力未被破坏，TEER水平未被降低。根据这些实施方式的亚组被称为组B3)。
增加的血管活性肠肽有益地改善胃肠道肌肉的松弛并改善肠神经系统，这对于患有肠易激综合征或炎症性肠病(IBD)的患者有益，还对于老年人、婴儿以及肥胖者有益。对于这些受试者，良好的肠神经系统功能即便不是必要的，也是更好的。尽管患有肠易激综合征或炎症性肠病的患者过量分泌了诸如血管活性肠肽的神经肽，但推断这是肠神经系统控制肠炎症的适应性反应，以重建肠屏障功能和增加神经保护。本发明的一组产乳酸菌菌株、特别是双歧杆菌有利地增加血管活性肠肽。该组被称为组A)。在一种实施方式中，ChAT水平未被增加。根据该实施方式的组被称为组A3)。因此，ChAT水平可保持基本上不变或可降低。
本文中所提及的所有菌株均根据布达佩斯条约保藏于国际保藏单位法国国家微生物保藏中心(CNCM，“Collection Nationale de Cultures deMicroorganisms”,25Rue du Docteur Roux,Paris)。
使用选择方法发现的属于组B)的菌株为DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)、DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)以及DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)。属于组A)的菌株为DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)、DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)、DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)以及DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)。菌株DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)公开在国际申请WO02/02800中，菌株DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)公开在国际申请WO01/01785中。
因此，包含这些所选择的菌株中的至少一种菌株的组合物为本发明的一部分。优选包含属于组B)的至少一种菌株和属于组A)的至少一种菌株的混合物的组合物。这样的混合物有利地通过改善收缩和松弛而对于运动具有改善作用，另外还对于肠上皮屏障具有有利的作用。
因此，根据一方面，本发明涉及包含至少一种菌株的组合物，所述菌株优选选自乳酸杆菌和双歧杆菌组成的组，所述组合物用于：
A)提高肠神经系统的血管活性肠肽(VIP)水平；或
B)提高肠神经系统的胆碱乙酰基转移酶免疫活性神经元(ChAT)水平；或
C)降低肠神经系统的ChAT水平。
根据一方面，本发明涉及包含选自下述菌株组成的组的至少一种菌株的组合物：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)–B3)]，
所述组合物用于：
-治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
-治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病；
-治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
根据一方面，本发明涉及包含选自下述菌株组成的组的至少一种菌株的组合物：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)–B3)]，
所述组合物用于施用于患有选自如下疾病组成的组的疾病：
-便秘、IBS-C；
-腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI、IBD；
-IBS，以及
-见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
根据一方面，本发明涉及上文所述的组合物，所述组合物用于改善胃肠运动、改善肠蠕动和/或减少肠道渗透性。
根据一方面，本发明涉及选自下述菌株组成的组的新菌株：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；和
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]。
根据一方面，本发明涉及包含所述新菌株的组合物。
根据一方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含：
-选自B)提高肠神经系统中ChAT水平的乳酸杆菌和双歧杆菌组成的组的至少一种菌株；和
-选自A)提高肠神经系统中血管活性肠肽(VIP)水平的乳酸菌和双歧杆菌组成的组的至少一种菌株。
根据一方面，本发明涉及一种选择菌株的方法，所述方法包括如下步骤：
a)设置肠上皮细胞和肠神经元细胞的共培养物，其中所述肠上皮细胞作为单层存在，其中所述肠神经元细胞存在于所述单层的基底侧；
b)将菌株添加至肠上皮细胞单层的顶面或腔面，优选以每个上皮细胞约4至400个细菌细胞的量添加；
c)将所述共培养物与乳酸菌菌株一起温育；
d)优选分离出神经元细胞；以及
e)检测由神经元细胞产生的VIP、ChAT、P物质、一氧化氮神经、ATP和/或垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)的量，任选还检测肠上皮细胞层的跨上皮电阻(TEER)。
在该方法中，所述菌株优选属于乳酸杆菌和双歧杆菌组成的组。
具体实施方式
定义
在本申请中，化合物或组合物的用途不仅旨在涵盖用途自身，任选相关的意图，而且还涵盖具有商业或法律后果的与化合物或组合物相关的任何信息，例如广告，组合物包装上的说明书或建议书，诸如传单的商业载体上的说明书或建议书，宣传材料，广告招贴，出于安全目的、疗效目的或消费者保护目的提交(例如，向诸如欧洲EFSA的管理机构提交)以用于监管注册的文件。
在本申请中，菌株的组是指表现特定的一种性质或一组性质的菌株。特定的菌株可由此属于数个组。在本申请中，术语“或”具有非排他性。
在本申请中，如果相对于对照的变化不超过10%、优选1%，则认为诸如VIP和/或ChAT的性质相对于对照基本上没有改变。
优选实施方式
在优选的实施方式中，所述组合物用于：
A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP；或
B3)在不增加VIP，不降低肠上皮细胞层的电阻(TEER)的前提下增加ChAT；或
C3)在不减少VIP的前提下减少ChAT；或
C2)减少ChAT和减少VIP。
例如，本发明的组合物可用于：
-治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
-治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
在特别优选的实施方式中，所述组合物可：
A)提高肠神经系统的VIP水平，可用于治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
B)提高肠神经系统的ChAT水平，可用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病；或
C)降低肠神经系统的ChAT水平，可用于治疗和/或预防选自腹泻、IBS-D、IBS-PI、IBD组成的组的疾病。
所述菌株可例如选自如下菌株组成的组：
-DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)–B3)]。
在一种实施方式中，所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；和
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
且所述组合物用于：
-治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
在一种实施方式中，所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)–B3)]，
且所述组合物用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病。
在一种实施方式中，所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；和
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]，
且所述组合物用于：
A)提高肠神经系统的血管活性肠肽(VIP)水平，优选用于A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP。
在该实施方式的特定实施方式中，所述组合物用于：
-治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
在一种实施方式中，所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，
且所述组合物用于：
B)提高肠神经系统的ChAT水平，优选用于B3)在不增加VIP的前提下增加ChAT水平。
在该实施方式的一种特定实施方式中，所述组合物用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病。
菌株的进一步细节
如上所述，所述组合物包含至少一种或两种特定菌株，优选乳酸菌。它们优选选自乳酸杆菌、双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳球菌(Lactococcus)和链球菌(Streptococcus)属组成的组。发现所述特定菌株能够影响共培养物模型中的VIP水平和/或影响其中的ChAT神经水平，所述模型表现肠和肠神经系统之间的相互作用。
使用下文更详细描述的共培养物模型，在体外筛选具有这些性质的乳酸菌或双歧杆菌菌株。筛选了102株属于乳酸杆菌、链球菌或双歧杆菌属的菌株。
对ChAT具有增加作用的组B)菌株典型地改善肠运动。对ChAT具有增加作用的组B3)表现为特定优选的实施方式，该组菌株排除了其中VIP未被增加(即，VIP基本上无变化或VIP被减少)的菌株。这些组的菌株典型地有益于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病。这可对于治疗和/或预防见于老年人的疾病具有进一步的特别意义，老年人常常会受到便秘的困扰。关于增加运动，增加ChAT表达的菌株是有利的。该特性似乎非常罕见。有趣的是，发现仅三种菌株在统计学上增加ChAT。这些被称为组B)或组B3)菌株。组B)或组B3)菌株包括菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)、DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)以及DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)。这些菌株有益地改善运动，尤其是收缩。优选地，肠上皮细胞层的电阻(TEER)不被减少。这样的性质标志着合适的屏障功能。菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)显著降低了VIP水平，而其他两种菌株对于VIP水平没有显著影响。由于VIP减少可对于IEB具有有害作用，使用具有肠上皮细胞单层的体外模型检测与该菌株温育是否导致跨上皮电阻(TEER)降低。结果证明并非如此，表明IEB功能未被破坏。
关于肌肉松弛和IEB功能的再加强(这在IBS和IBD患者中是有益的)，增加VIP表达的菌株是有利的(所述菌株还具有抗炎作用)。这样的菌株被称为组A)菌株。在优选的实施方式中，组A)菌株不增加ChAT表达(即，ChAT疾病上无改变或ChAT未被减少)。这样的菌株被称为组A3)菌株。这些组的菌株典型地有益于治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病，或治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。组A)或组A3)菌株包括菌株DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏),DN_156_0032(CNCMI-4321，2010年5月19日保藏),DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏),DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)。有趣的是，注意到除了一个菌株DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)以外，所有具有该性质的菌株为双歧杆菌。此外，使用具有T84单层和跨上皮电阻(TEER)的另一种体外模型，发现特别是菌株DN_173_010(CNCMI-2494，2000年6月20日保藏)、DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)、DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)以及DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)在LPS的存在下对IEB具有保护作用。因此，这些特定菌株尤其为优选的。
根据一种实施方式，所述菌株可降低肠神经系统的ChAT水平。相应组的菌株被称为组C)。在一种特定的实施方式中，所述菌株使得减少ChAT，前提是VIP不被减少(即，VIP基本上不改变或VIP被增加)。该组被称为组C3)。在一种特定的实施方式中，所述菌株使得在减少VIP的同时减少ChAT。这些菌株被称为组C2)。组C3)的菌株典型地对于治疗和/或预防选自腹泻、IBS-D组成的组的疾病。这可对于治疗和/或预防见于常会受到便秘困扰的老年人的疾病具有进一步的特别意义。组C2)的菌株典型地有益于治疗和/或预防选自腹泻、IBS-D、IBS-PI以及IBD组成的组的疾病。这可对于治疗和/或预防见于常会受到这些疾病，尤其是腹泻困扰的老年人的疾病具有进一步的特别意义。
本发明还包括上述菌株的用途，以及衍生自任一亲本菌株且仍对VIP具有活性和影响ChAT神经的突变菌株或基因转化菌株。这些突变菌株或基因转化菌株可为其中亲本菌株的一种或多种内源性基因已被突变以例如修饰其某些代谢特性(即，其发酵糖的能力，其对于酸的抗性，其经胃肠道运输的存活力，其后酸化或其代谢物产生)的菌株。它们还可为这样的菌株，即，通过一种或多种感兴趣的基因对亲本菌株进行基因转化以例如赋予所述菌株另外的生理特征，或使得其表达期望通过所述菌株而施用的具有治疗或免疫意义的蛋白的菌株。
优选地，使用属于组B)、优选组B3)的至少一种菌株和属于组A)、优选组A3)的至少一种菌株的混合物。这样的混合物有利地对于运动以及IEB具有改善作用。
共培养模型和筛选测定
在一种实施方式中，本发明涉及一种筛选乳酸菌菌株的方法，所述方法包括如下步骤：
a)使用肠上皮细胞和肠神经元细胞的共培养物，其中所述肠上皮细胞作为单层存在，其中所述肠神经元细胞存在于所述单层的基底侧；
b)将乳酸菌添加至肠上皮细胞单层的顶面或腔面，优选以每个上皮细胞约4至400个细菌细胞的量添加；
c)将所述共培养物与乳酸菌菌株一起温育；
d)优选分离出所述神经元细胞；以及
e)检测由所述神经元细胞产生的VIP、ChAT、P物质和一氧化氮、ATP、PACAP组成的组的至少一种神经递质的量，任选还检测肠上皮细胞层的跨上皮电阻(TEER)。
与蠕动反射一致，ENS含有由上升兴奋性运动神经元和下降抑制性神经元组成的固定回路(hardwired circuit)，其中，所述上升兴奋性运动神经元释放通过毒蕈碱性受体收缩平滑肌的乙酰胆碱和P物质，所述下降抑制性神经元释放递质混合物，例如NO、ATP、VIP以及PACAP，所有这些递质都抑制环状肌。
细胞培养
建立具有极化肠上皮细胞的单层的共培养物的合适方法在实施例1中有描述，且在J.Chevalier et al,2008,J.Physiol.5861963-1975中也有描述。
所有形成单层的肠上皮细胞培养物均是合适的，例如Caco-2、T84、HT29、以及TC7。优选地，使用T84细胞。
作为原代肠神经系统细胞，优选细胞分离自非人的哺乳动物胎儿、优选啮齿动物、更优选大鼠。
优选地，将所试验的菌株在合适的生长培养基中培养至晚期指数期，并进行洗涤。优选地，以4至400个细菌/上皮细胞的量、更优选以10至100个细菌/上皮细胞、甚至更优选以30至50个细菌/上皮细胞的量将细菌添加至共培养物的顶面。优选地，不添加细菌作为对照。优选地，使用1mM丁酸或40mM KCl作为阳性对照。
优选地，在约37°C下进行温育步骤。优选地，温育步骤耗时1至72h，更优选2至36h，甚至更优选4至12h。
优选地，在共温育之后，移去含有上皮细胞和细菌的隔室(compartment)，并将原代神经元细胞在含5%CO2的湿度培养箱中温育12至48h，更优选20至28h。
优选地，使用免疫组织染色、使用抗神经元特异性烯醇酶(NSE)抗体对神经元总数进行计数和使用抗胆碱乙酰基转移酶抗体对ChAT神经进行计数，从而检测ChAT神经和总神经的数量。
优选地，在收集神经元细胞和在蛋白酶抑制剂混合物存在下提取蛋白之后，通过ELISA检测VIP。
关于组合物的进一步细节
本发明包括允许上述用途或特性的菌株的组合物。本发明还包括包含一种或多种如下菌株(包括由其衍生的突变菌株或基因转化菌株)的组合物：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)-B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，
通常，当将所述组合物体内施用于受试者时，所述组合物用于：
-治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
-治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
在本发明的组合物中，所述菌株可以以活菌或非活菌的完整细菌形式使用。可选地，它们可以以细菌裂解物或以细菌级分(bacterial fraction)的形式使用；可通过例如检测其缓解对本发明描述的共培养物模型的VIP水平和ChAT水平的作用的特性而选择适于该应用的细菌级分。优选地，所述细菌细胞作为有活力的活细胞存在。
本发明的组合物可为适于施用、特别是口服施用的任何形式。这包括例如固体、半固体、液体以及粉末。由于较易于施用，例如作为饮料施用，通常优选液体组合物。
所述组合物可包含例如每克干重至少105cfu、优选至少1x106cfu的至少一种菌株，优选上述菌株。这些菌株优选选自乳酸杆菌和双歧杆菌组成的组。
当细菌为活菌形式时，所述组合物通常可包含每克干重组合物105至1013菌落形成单位(cfu)，优选至少106cfu，更优选至少107cfu，还更优选至少108cfu，最优选至少109cfu。在液体组合物的情况下，这通常对应于每ml为104至1012菌落形成单位(cfu)，优选至少105cfu，更优选至少106cfu，还更优选至少107cfu，最优选至少109cfu/ml。
本发明的组合物的实例为营养组合物，包括食品，特别是乳制品。
所述组合物可为例如乳制品，优选发酵乳制品。以发酵乳制品形式的施用具有低乳糖水平的额外优点，这对于肠易激综合征具有进一步的益处。任选地，可存在其他乳酸菌菌株。所述发酵制品可以以液体存在，或以通过干燥发酵液体而获得的干粉形式存在。优选地，所述发酵制品为新鲜制品。未经严格热处理步骤的新鲜制品的优点是所存在的菌株为活体形式。优选地，所述发酵制品为乳制品，更优选地，为发酵乳和/或发酵乳清。优选地，所述营养组合物为固定、搅拌或可饮用形式的酸乳或发酵乳。优选地，所述发酵制品为乳酪。优选地，所述发酵制品为发酵的植物产品，例如固定、搅拌或可饮用形式的发酵大豆、谷物和/或水果。
优选地，本发明的营养组合物为婴儿食品，婴儿配方乳或较大婴儿配方乳。优选地，本发明的组合物为营养食品或药品、营养补充剂或医用食品。
本发明的营养组合物还包括食物补充剂以及功能性食物。“食物补充剂”是指由通常用于食品的化合物制成，但为片剂、粉末、胶囊、饮剂或通常与食物无关的任何其他形式，且对健康具有益处的产品。“功能性食物”也是对健康有益处的食物。特别地，食物补充剂和功能性食物可具有对抗疾病(例如慢性疾病)保护性或治愈性的生理作用。
优选包含增加ChAT神经的至少一种乳酸菌或双歧杆菌菌株和提高VIP水平的至少一种乳酸菌或双歧杆菌菌株的混合物的组合物。这样的混合物有利地对运动及IEB具有改善作用。
优选属于组B)、优选B3)的至少一种菌株和属于组A)、优选A3)的至少一种菌株的混合物。这样的混合物有利地对运动及IEB具有改善作用。
因此，本发明还涉及包含如下的组合物：
选自如下菌株组成的组的至少一种菌株：
-DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)[B)–B3)]；和
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)[B)-B3)]，以及
选自如下菌株组成的组的至少一种菌株：
-DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)[A)-A3)]；和
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)[A)-A3)]。
本发明的组合物还可包含一种或多种益生或非益生性的其他乳酸菌菌株，例如选自乳酸杆菌、乳球菌、链球菌以及双歧杆菌属的一种或多种菌株。特别地，所述其他菌株可包括一种或多种嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌株和/或一种或多种保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillusbulgaricus)菌株。
应用
在一种实施方式中，发现本发明的菌株增加ChAT神经的数量。胆碱乙酰基转移酶EC2.3.1.6是一种在神经元主体内合成并转移至神经末端的酶。ChAT的作用是将乙酰辅酶A添加至胆碱，导致形成神经递质乙酰胆碱。其用作运动神经元的免疫组织化学标志物。对于ChAT神经的作用导致收缩改善，从而导致蠕动改善。因此，有利地施用本发明能够增加ChAT神经的菌株和组合物，以改善ENS，改善或增强蠕动，改善肠运动和/或减少胃肠道运输时间。增加胆碱能表型在与抑制结肠运输相关的胃肠病理中具有治疗意义。特别地，多种研究已经显示缓慢的运输可与ChAT神经元的表达减少相关。特别地，(i)严重便秘患者通常具有较低的ChAT神经数量，(ii)在感染和感染后(PI)的过程中，肠肌层ACh的产生显著减少，(iii)已报道在衰老过程中，胆碱能神经元的比例降低。
在本文中，使用菌株、优选乳酸菌或双歧杆菌菌株以增强神经元中的胆碱能表达可以在未来对于严重便秘患者和IBS-C具有治疗意义。因此，有利地将本发明的菌株和组合物施用于患有IBS-C和/或便秘的患者。最有用的菌株为上述的组B)或B3)菌株。
在一种特定的实施方式中，由老年人或为老年人使用本发明的菌株和组合物。本发明所述的老年人被定义为年龄超过65岁、优选超过70岁、优选超过75岁、优选超过80岁、优选超过85岁的人。通常老年人位于结肠、最优选横结肠的肠神经系统中的ChAT神经元的数量减少。因此，有利地，施用本发明的菌株和组合物以治疗和/或预防老年人的IBS、优选IBS-C和/或便秘。能够增加ChAT神经的菌株为组B)，例如DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)，DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)，以及DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)。优选地，它们不减少VIP，原因是VIP是良好的IEB功能和胃肠道松弛(诸如蠕动的胃肠运动的另一重要部分)所必需的。符合该标准的菌株为DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)和DN_116_0047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)。然而，如TEER试验所确定的，由于TEER并未降低，因此，菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)对IEB功能没有负面影响。
在一种实施方式中，发现本发明的菌株提高VIP水平。对于消化系统，VIP诱导平滑肌松弛(低位食管括约肌、胃、胆囊)，刺激水分泌至胰液和胆汁中，并导致胃酸分泌和肠腔吸收的抑制。其在肠中的作用是大大刺激水和电解质分泌，扩张肠平滑肌，扩张外周血管，刺激胰腺碳酸氢盐分泌，以及抑制胃泌素刺激的胃酸分泌。这些作用一起发挥以增加运动性。因此，该发现标志着这些菌株对于肠运动、尤其是运动的松弛部分具有改善作用。VIP还有益地增加IEB功能。因此，有利地，施用本发明的菌株和组合物以改善ENS，改善或增强蠕动，减少渗透性，改善肠运动和/或减少胃肠道运输时间。因此，有利地，施用本发明的菌株和组合物以用于如下疾病或患有如下疾病的患者：
-治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
-治疗和/或预防选自便秘和IBS-C组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防选自IBS和IBD组成的组的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
最有用的菌株为上述组A)或A3)的菌株。
本发明的细节或优点可见于下文的非限制性实施例。
实施例
实施例1：在包含上皮细胞和肠神经元细胞的共培养物模型中筛选益生菌
细胞培养物
购买怀孕Sprague-Dawley大鼠(CERJ,Le Genest St Isle,France andJanvier-Breeding Center,Belgium)，通过过量CO2之后割断颈动脉处死。取出胚胎(每次从3只怀孕大鼠分离35-45个)并通过断头处死。取出胚胎的小肠，在HBSS(Sigma,France)中细切。将组织切片收集在5ml培养基(DMEM-F121:1培养基)并在0.1%胰蛋白酶(Sigma)中于37°C消化15min。通过添加含有10%胎牛血清的10ml培养基终止胰蛋白酶反应，然后通过DNA酶I(0.01%,Sigma)于37°C处理10min。使用10ml吸液管打碎之后，在750r.p.m.离心细胞10min。对细胞进行计数，然后以2.4x105个细胞/cm2的密度接种于预先使用于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中的明胶溶液(0.5%,Sigma)包被6h的24孔板上。24h之后，将培养基替换为无血清培养基(DMEM-F12(1:1)，含有1%N-2添加剂(Lifetechnologies,France))。将细胞在培养物中培养14天，以获得肠神经系统(ENS)的原代培养物。每隔一天更换一半培养基。在第14天，原代神经元细胞即可用于建立共培养物模型。
在补充有10%热灭活FBS和50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM-F12(1:1,GIBCO)中培养T84细胞系(EATCC)。在12孔
Figure BDA00002785003700171
过滤器(Corning,NY USA)中以2x105个细胞/插入片接种细胞，并培养以达到汇合。
在上皮细胞达到汇合之后1天，将
Figure BDA00002785003700172
过滤器转移至底部接种有肠神经元细胞的12孔培养板中。在上皮细胞的培养基中共培养上皮细胞和神经元细胞。
菌株培养
对于双歧杆菌和乳酸杆菌，在TGYH中培养细菌16小时(但菌株DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)在MRS+半胱氨酸培养基中培养)，在PBS洗涤两次，调整至4.108cfu/ml，以恒定地将相同体积的细菌悬浮液添加至过滤器。以40个细菌/上皮细胞的MOI将菌株添加至过滤器隔室。将不添加细菌作为对照。
在共温育8小时之后，去除含有上皮细胞和细菌的过滤器隔室，在含有5%CO2的湿度培养箱中温育原代神经元细胞24h。在对照孔中，当进行ChAT和VIP检测时，分别使用1mM丁酸和40mM KCl刺激神经元细胞。
免疫组织化学染色，检测ChAT神经
在温育之后，进行免疫组织化学以检测神经元细胞群。在细胞固定之后(在室温下于含有4%甲醛的0.1M PBS中1h)，于PBS中洗涤细胞3次，然后于含有0.5%Triton X-100和4%马血清的PBS/NaN3中透化30分钟。初级抗体：将兔抗神经元特异性烯醇酶(NSE)抗体(1:2000;Biovalley,France)和兔抗胆碱乙酰基转移酶抗体稀释于含有0.5%Triton X-100以及4%马血清的PBS/NaN3中，室温下过夜温育。在使用初级抗血清温育之后，使用PBS洗涤细胞3次，使用分别偶联有荧光素异硫氰酸酯(FITC)(1:200Immunotech，France)和7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸酯的驴抗兔IgG温育3h。在通过帧接收器卡(Scion Image,SL Microtest)，在连接于macintosh计算机的配备有黑白摄影机(Mod.4910,Cohu Inc,Germany)的Olympus IX50荧光显微镜下观察样品。
VIP检测
对于VIP检测，从12孔培养板收集神经元细胞，使用含有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics,France)的RIPA裂解缓冲液(Millipore,France)提取蛋白，通过ELISA(Bachem,Germany)检测VIP水平。
结果
表1显示了在包括乳酸菌和双歧杆菌的102种益生菌菌株中的某些菌株相互作用后原代肠神经对于VIP和ChAT标志物的差异反应。仅显示了属于组A3)或B3)或C3)的某些菌株。另外，还注意到，26种菌株对于VIP和ChAT无显著作用(包括长双歧杆菌菌株NCC2705(Bifidobacterium longum NCC2705,CNCM I-2618)，鼠李糖乳酸杆菌GG(Lactobacillus rhamnosus GG,ATCC53103)以及干酪乳酸杆菌代田株(Lactobacillus casei Shirota))，属于组C2)的11种菌株显示减少VIP和ChAT(包括Alfa-Wass的长双歧杆菌W11(LMG P-21586))，10种菌株减少VIP且对ChAT无作用(包括基准菌株婴儿双歧杆菌UCC3564(Bifidobacteriuminfantis UCC3564)、长双歧杆菌Bb536、动物双歧杆菌乳亚种Bb12(Bifidobacterium animalis spp lactis Bb12,DSM15954)以及动物双歧杆菌乳亚种Bi-07(ATCC SD5220)，属于组C3)的41种菌株减少ChAT且对VIP无作用，包括菌株约氏乳酸杆菌La1(Lactobacillusjohnsonii La1,CNCM I-1225)、植物乳酸杆菌299v(Lactobacillus plantarum299v,DSM9843)，罗伊氏乳酸杆菌SD2122(Lactobacillus reuteri SD2122,ATCC55730)。
表1：与乳酸杆菌和双歧杆菌温育对具有上皮细胞单层和原代ENS细胞的共培养物模型中的VIP和ChAT水平的影响
Figure BDA00002785003700191
*给出的数值为相对于未添加细菌菌株的对照的差异。
尽管菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)降低了VIP水平，但使用TEER模型(Hirotani et al,2008,Yakugaku Zasshi Sep;128(9):1363-8)显示与该菌株温育4h或6h未显著减少TEER值，即使在相对于对照的损害存在下也是如此。简言之，在TGYH中培养细菌。使用PBS洗涤培养物悬浮液。之后，将细菌(100cfu/细胞)添加至T84细胞单层的顶面。在温育2h之后，以40ng/ml添加LPS(L4516,–EPEC-0127:B8)至顶面上，或不添加LPS。然后，在温育2h和4h之后，检测TEER值以评价上皮屏障功能。所有试验在存在和不存在LPS的情况下分别独立进行三次，一式三份。将t=0的T84值设定为100%。使用菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)，在不存在LPS的情况下，T4的TEER为98.7%，T6的TEER为100.2%，对于单独T84，这仍旧为100%。在存在LPS的情况下，相对于t=0，对照T84在T4为56.2%，使用菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)为47.9%，对照T84在T6为46.7%，使用菌株DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)为52.2%。
使用该相同的TEER模型，尤其是菌株DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)，DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)，DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)以及DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)(均属于组A3)显示对于肠屏障功能的良好结果，如在LPS存在下通过TEER所评价的。见表2。
表2：显示最佳结果的所选菌株在LPS存在下的TEER结果
Figure BDA00002785003700201
***p值<0.05
PCT/RO/134表
Figure QDA00002785004200011
Figure QDA00002785004200031
Figure QDA00002785004200041
Figure QDA00002785004200061

Claims (26)

1.包含至少一种菌株的组合物，所述菌株优选选自乳酸杆菌(lactobacilli)和双歧杆菌(bifidobacteria)，所述组合物用于：
A)提高肠神经系统的血管活性肠肽(VIP)水平；或
B)提高肠神经系统的胆碱乙酰基转移酶免疫活性神经元(ChAT)水平；或
C)降低肠神经系统的ChAT水平。
2.根据权利要求1所述的组合物，其用于：
A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP；或
B3)在不增加VIP，优选也不增加肠上皮细胞层的电阻(TEER)的前提下增加ChAT；或
C3)在不减少VIP的前提下减少ChAT；或
C2)减少ChAT和减少VIP。
3.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其进一步用于：
-治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
-治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病；或
-治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI和IBD的疾病；或
-治疗和/或预防选自IBS和IBD的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿和肥胖者的疾病。
4.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述组合物：
A)提高肠神经系统的VIP水平，用于治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
B)提高肠神经系统的ChAT水平，用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病；或
C)降低肠神经系统的ChAT水平，用于治疗和/或预防选自腹泻、IBS-D、IBS-PI、IBD的疾病。
5.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述组合物：
A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP，且
所述组合物用于：
-治疗和/或预防选自IBS和IBD的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
6.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述组合物：
B3)在不增加VIP，优选也不减少肠上皮细胞层的电阻(TEER)的前提下增加ChAT，且
所述组合物用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病。
7.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述组合物：
C3)在不减少VIP的前提下减少ChAT，且
所述组合物用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病。
8.根据权利要求1至4任一项所述的组合物，其中所述组合物：
C2)减少ChAT和减少VIP，且
所述组合物用于治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD的疾病。
9.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)；
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)；
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)。
10.组合物，其包含选自如下菌株中至少一种菌株：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)；
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)，
所述组合物用于：
-治疗和/或预防肠道疾病，优选治疗和/或预防肠运动性疾病；或
-治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病；或
-治疗和/或预防选自腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD的疾病；或
-治疗和/或预防选自IBS和IBD的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
11.组合物，其包含选自如下菌株中的至少一种菌株：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)；
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)，
所述组合物用于施用于患有选自如下疾病的受试者：
-便秘，IBS-C；
-腹泻、肠道感染、IBS-D、IBS-PI以及IBD；
-IBS，以及
-见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)；以及
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)，
所述组合物用于：
-治疗和/或预防选自IBS和IBD的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
13.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述菌株选自如下菌株组成的组：
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)，
所述组合物用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病。
14.根据权利要求10或11所述的组合物，所述组合物包含选自如下菌株中的至少一种菌株：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)；以及
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)，
所述组合物用于：
A)提高肠神经系统的血管活性肠肽(VIP)水平，优选用于A3)在不增加ChAT的前提下增加VIP。
15.根据权利要求14所述的组合物，其用于：
-治疗和/或预防选自IBS和IBD的疾病；或
-治疗和/或预防见于老年人、婴儿或肥胖者的疾病。
16.根据权利要求10或11所述的组合物，其包含选自如下菌株中的至少一种菌株：
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)，
所述组合物用于：
B)提高肠神经系统的ChAT水平，优选B3)在不提高VIP的前提下提高ChAT水平。
17.根据权利要求16所述的组合物，其用于治疗和/或预防选自便秘和IBS-C的疾病。
18.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其用于改善胃肠运动性、改善肠蠕动和/或减少肠道渗透性。
19.选自如下菌株：
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)；
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)。
20.组合物，其包含权利要求19所述的至少一种菌株。
21.组合物，其包含：
-选自B)提高肠神经系统ChAT水平的乳酸杆菌和双歧杆菌中的至少一种菌株；和
-选自A)提高肠神经系统血管活性肠肽(VIP)水平的乳酸杆菌和双歧杆菌中的至少一种菌株。
22.根据权利要求21所述的组合物，其包含：
-选自如下菌株中的至少一种菌株：
-DN_116_047(CNCM I-4317，2010年5月19日保藏)；
-DN_154_0067(CNCM I-4320，2010年5月19日保藏)；以及
-DN_119_0118(CNCM I-4279，2010年2月25日保藏)，和
-选自如下菌株中的至少一种菌株：
-DN_173_010(CNCM I-2494，2000年6月20日保藏)；
-DN_156_0032(CNCM I-4321，2010年5月19日保藏)；
-DN_156_007(CNCM I-2219，1999年5月31日保藏)；以及
-DN_121_0304(CNCM I-4318，2010年5月19日保藏)。
23.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述组合物为乳制品，优选为发酵乳制品。
24.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述组合物每克干重包含至少105cfu、优选至少1x106cfu的选自乳酸杆菌和双歧杆菌的至少一种菌株。
25.一种选择菌株的方法，所述方法包括如下步骤：
a)设置肠上皮细胞和肠神经元细胞的共培养物，其中所述肠上皮细胞作为单层存在，其中所述肠神经元细胞存在于所述单层的基底侧；
b)将菌株添加至肠上皮细胞单层的顶面或腔面，优选以每个上皮细胞约4至400个细菌细胞的量添加；
c)将所述共培养物与乳酸菌菌株一起温育；
d)优选分离出神经元细胞；以及
e)检测由神经元细胞产生的VIP、ChAT、P物质、一氧化氮神经、PACAP和/或ATP的量，任选还检测肠上皮细胞层的跨上皮电阻(TEER)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述菌株属于乳酸杆菌和双歧杆菌。
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