BR112012030359B1 - composição compreendendo pelo menos uma cepa de bactérias e método de seleção de cepas de bactérias - Google Patents
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Abstract
cepas probióticas para uso no aperfeiçoamento do sistema nervoso entérico. a presente invenção refere-se ao uso de bactérias do ácido láctico, para uso na modificação do sistema nervoso entérico e, mais particularmente, no tratamento e/ou prevenção de distúrbios intestinais tais como constipação e/ou doença do intestino irritável.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO PELO MENOS UMA CEPA DE BACTÉRIAS E MÉTODO DE SELEÇÃO DE CEPAS DE BACTÉRIAS. CAMPO [0001] A presente invenção refere-se a composições que compreendem cepas de bactérias do ácido láctico para uso na modificação do sistema nervoso entérico. Tais composições são especialmente adequadas para tratar e/ou prevenir distúrbios intestinais tais como a constipação e/ou a doença do cólon irritável.
ANTECEDENTES [0002] A síndrome do cólon irritável (IBS) ou cólon espástico é um distúrbio intestinal funcional caracterizado por dor abdominal crônica, desconforto, inchação e alteração dos hábitos intestinais na ausência de qualquer causa orgânica detectável. Em alguns casos, foi relatada uma inflamação intestinal de grau discreto. A diarreia ou a constipação podem predominar ou elas podem se alternar (classificadas como IBSD, IBS-C, respectivamente). IBS pode começar depois de uma infecção (pós-infecciosa, IBS-PI), um evento de vida estressante ou começar na maturidade sem quaisquer outros indicadores médicos. Na IBS, testes clínicos de rotina não mostram anormalidades, embora os intestinos sejam mais sensíveis a certos estímulos, tais como o teste de insuflação do balão.
[0003] IBS é uma condição muito comum que afeta aproximadamente 15% da população em qualquer momento. Existem cerca de duas vezes mais mulheres do que homens com essa condição. IBS é uma fonte de dor crônica, fadiga e outros sintomas, e ela aumenta os gastos médicos do paciente e contribui para o afastamento do trabalho. Pesquisadores relataram que a alta prevalência de IBS, em conjunto com gastos aumentados produz uma doença com alto custo social. Ela também é considerada como uma doença crônica e pode afePetição 870190117718, de 14/11/2019, pág. 9/50
2/34 tar dramaticamente a qualidade de vida de um paciente.
[0004] Uma teoria principal a cerca da causa de IBS refere-se os sistema nervoso entérico (ENS). O sistema nervoso entérico (ENS) é uma subdivisão do sistema nervoso periférico (PNS) que controla diretamente as funções gastrintestinais e está embebido no revestimento do sistema gastrintestinal. Ele inclui neurônios eferentes, neurônios aferentes e interneurônios. O funcionamento estrutural e fisiológico do ENS é realizado pelas células da glia (astrócitos). O ENS é organizado em dois plexos principais com papéis funcionais específicos.
[0005] O plexo mioentérico, localizado entre o músculo longitudinal e o circular contém neurônios envolvidos principalmente no controle da motilidade intestinal. Através dos músculos intestinais, os neurônios eferentes ou motores controlam a peristalse e a agitação dos conteúdos intestinais. Os neurônios motores que controlam a motilidade são compostos por duas classes principais:
- neurônios mioentéricos excitatórios que liberam acetilcolina (referida como neurônios Imunorreativos a Colina Acetil Transferase (ChAT-IR ou ChAT ou neurônios ChAT ou nervos ChAT) e/ou a substancia P (SP) para as contrações e
- neurônios mioentéricos inibitórios que liberam óxido nítrico (identificados como neurônios Óxido Nítrico Sintetase (NOS-IR)) e/ou o Peptídeo Vasoativo Intestinal (VIP) para o relaxamento.
[0006] A colina acetiltransferase EC 2.3.1.6 é uma enzima que é sintetizada dentro do corpo de um neurônio e transferida para a terminação do nervo. O papel de ChAT é ligar a Acetil-CoA à colina, resultando na formação do neurotransmissor acetilcolina. Experimentalmente, o efeito sobre a produção de acetilcolina é extrapolado a partir da determinação do número de neurônios ChAT, tipicamente um aumento no número de neurônios ChAT é indicativo de um aumento de acetilcolina.
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3/34 [0007] O plexo submucoso, localizado entre a musculatura circular e a mucosa, contém neurônios envolvidos principalmente no controle das funções da barreira epitelial intestinal (IEB), tais como a permeabilidade paracelular. Em particular, a ativação de neurônios entéricos no plexo submucoso diminui a permeabilidade paracelular, através da liberação de VIP, enquanto que a acetilcolina (Ach) aumenta a permeabilidade paracelular, consolidando a base de um ajuste fino da permeabilidade do IEB pelo ENS. Portanto, no que diz respeito ao controle neuronal da permeabilidade paracelular, o aumento da liberação de VIP pelos neurônios submucosos aumenta a integridade de IEB enquanto que o aumento dos neurônios ChAT do plexo submucoso diminui a resistência do IEB.
[0008] Embora atualmente não haja cura para IBS, existem tratamentos que tentam aliviar os sintomas, incluindo ajustes dietéticos, medicação e intervenções psicológicas.
[0009] Os probióticos, em particular as cepas de bactérias do ácido láctico, são descritos serem benéficos no tratamento e/ou na prevenção de IBS. Exemplos de tais descrições estão no WO 2007/036230, WO 03/010297, e WO 2009/080800. Entretanto, as cepas bacterianas são selecionadas quanto aos seus efeitos sobre o sistema imune, sobre a permeabilidade intestinal ou sobre a microbiota intestinal e não por seus efeitos sobre o aperfeiçoamento da função do ENS. WO 2008/064489 descreve o uso de probióticos para bloquear um intermediário do fluxo de potássio dependente da condutância do cálcio, o que resulta em um efeito anti-inflamatório. WO 2007/132359 descreve o uso de Lactobacillus e um agonista de receptor opióide e/ou antagonista de receptor opióide em relação à percepção de dor. WO 2006/032542 descreve o uso de Lactobacillus com propósitos analgésicos. Kamm et al., 2004, Neurogastrointest. Motil 16: 53-60, descrevem os efeitos de S. boulardii sobre a diminuição de calbindina
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4/34 k (CALB), mas não de outros marcadores neuronais do jejuno do porco. Metugriachuk et al., 2006, Rejuvenation Res. 9: 342-345 descrevem que uma preparação simbiótica sobre a motilidade do intestino delgado e grosso de ratos Winstar aumentou significativamente a atividade mioelétrica do intestino delgado e do cólon, uma expressão aumentada de mRNA de VIP, mas sem efeito significativo sobre a concentração de VIP.
[00010] Portanto, é necessária uma pesquisa adicional sobre cepas individuais de bactérias probióticas com um efeito benéfico sobre ENS para uso em IBS, constipação e/ou outros distúrbios.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [00011] Os inventores empregaram um novo modelo de sistema para rastreamento e seleção de cepas de bactérias do ácido láctico e bifidobactérias que possuem um efeito aperfeiçoado sobre o sistema nervoso entérico (ENS). Esse modelo contém uma (mono)camada de células epiteliais intestinais de carcinoma de cólon humano e, no lado basolateral da monocamada, uma mistura de cultura primária de células do sistema nervoso entérico incluindo neurônios do plexo mioentérico e submucoso. Usando esse modelo, os efeitos de componentes de grau alimentício, em particular cepas de bactérias de ácido láctico e bifidobactérias, sobre o ENS pode ser avaliado pela medição dos efeitos da adição apical ou luminal desses componentes sobre a expressão de nervos que liberam o peptídeo vaso-intestinal (VIP) e/ou ChAT do lado basolateral.
[00012] Portanto, esse modelo permitiu rastrear e selecionar novas cepas de bactérias do ácido láctico e bifidobactérias para uso no aperfeiçoamento da função do sistema nervoso entérico. Tais cepas aperfeiçoam a motilidade e a peristalse intestinais. Com algumas cepas, o tempo de transito intestinal pode ser reduzido, o que pode visar algumas condições tais como a constipação. Com algumas cepas, o tempo
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5/34 de transito intestinal pode ser aumentado, o que pode visar algumas condições, tais como a diarreia. As cepas que aumentam VIP também podem aperfeiçoar a integridade da barreira epitelial intestinal. Tais cepas são em particular úteis e mais eficazes do que as cepas existentes na prevenção e/ou no tratamento de IBS e/ou constipação e outros distúrbios associados com a função diminuída do ENS.
[00013] Aumentar o fenótipo colinérgico, em particular a expressão de neurônios ChAT, é de interesse terapêutico em patologias do trato GI associadas com a inibição do transito colônico. O uso de bactérias do ácido láctico ou bifidobactérias selecionadas para ter um efeito aumentado sobre a expressão colinérgica intensificada, isto é, ChAT, em neurônios, é de interesse terapêutico para pacientes com constipação e pacientes que sofrem de IBS-C. Portanto, um grupo de cepas de bactérias do ácido láctico ou de bifidobactérias da presente invenção aumenta vantajosamente o número de nervos ChAT, o que é indicativo de um efeito aperfeiçoado sobre a motilidade intestinal e, especialmente, é benéfico para pacientes com IBS, em particular para pacientes com IBS-C e pacientes que sofrem de constipação. Esse grupo é referido como o grupo B). A boa motilidade requer um grande número de nervos ChAT, que são responsáveis pela contração e possuem um efeito procinético. Em algumas modalidades interessantes para esse grupo, os níveis de TEER não estão diminuídos, já que a função de IEB e a habilidade de relaxamento dos músculos, preferivelmente, não estão prejudicadas. O subgrupo de acordo com essas modalidades é referido como o grupo B3).
[00014] O aumento de VIP aperfeiçoa beneficamente o relaxamento dos músculos do trato GI e aperfeiçoa a IEB, o que é benéfico para pacientes que sofrem de IBS ou de doença inflamatória do intestino (IBD) e também para pessoas idosas, crianças e pessoas obesas. Para tais indivíduos, uma boa função de IEB é melhor, mas não é essen
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6/34 cial. Embora pacientes que sofrem de IBS ou IBD possuam uma supersecreção de neuropeptídeos tais como VIP, isso é suposto ser uma resposta adaptativa do ENS para o controle da inflamação intestinal, para restabelecer as funções da barreira intestinal e para aumentar a neuroproteção. Um grupo de cepas de bactérias que produzem ácido láctico, em particular bifidobactérias, da presente invenção aumenta, vantajosamente, VIP. Esse grupo é referido como grupo A). Em uma modalidade, o nível de ChAT não está aumentado. O grupo de acordo com essa modalidade é referido como grupo A3). Consequentemente, o nível de ChAT pode permanecer substancialmente inalterado ou pode diminuir.
[00015] Todas as cepas de bactérias aqui referidas foram depositadas, de acordo com o Tratado de Budapeste, anteriormente CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris) como uma autoridade depositária Internacional.
[00016] As cepas encontradas com o método de rastreamento eram pertencentes ao grupo B) e são DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010), DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) e DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro 2010). As cepas que pertencem ao grupo A) são DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000), DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010), DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de 1999), e DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010). A cepa DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000) foi descrita no pedido internacional WO 02/02800 e a cepa DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de 1999) foi descrita no pedido internacional WO 01/01785.
[00017] As composições que compreendem pelo menos uma dessas cepas selecionadas são, portanto, parte da invenção. Uma com
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7/34 posição que compreende uma mistura de pelo menos uma cepa que pertença ao grupo B) e pelo menos uma cepa que pertença ao grupo
A) é preferida. Tal mistura terá, vantajosamente, um efeito aperfeiçoado sobre a motilidade pelo aperfeiçoamento de ambas as contrações e os relaxamentos e, adicionalmente, terá um efeito vantajoso sobre a função da IEB.
[00018] Portanto, de acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição que compreende pelo menos uma cepa de bactéria, selecionada preferivelmente do grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias, para uso em:
A) aumentar os níveis de peptídeo vasoativo intestinal (VIP) do sistema nervoso entérico, ou
B) aumentar os níveis de neurônios Imunorreativos a Colina Acetil Transferase (ChAT) do sistema nervoso entérico ou
C) diminuir os níveis de ChAt do sistema nervoso entérico. [00019] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição que compreende, pelo menos, uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)],
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8/34 para uso no:
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio intestinal, preferivelmente no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio da motilidade intestinal, ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C,
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, infecção intestinal, IBS-D, IBS-PI e IBD ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS ou IBD, ou
- tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas.
[00020] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição que compreende pelo menos uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste das seguintes cepas:
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)], para uso na administração a indivíduos que sofrem de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em:
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- constipação, IBS-C,
- diarreia, infecção intestinal, IBS-D, IBS-PI, IBD
- IBS e
- distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas.
[00021] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição como mencionada acima para uso no aperfeiçoamento da motilidade gastrintestinal, aperfeiçoamento da peristalse intestinal e/ou diminuição da permeabilidade intestinal.
[00022] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a novas cepas de bactérias selecionadas do grupo que consiste em:
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)].
[00023] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a composições que compreendem as novas cepas.
[00024] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição que compreende:
- pelo menos uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias que B) aumentam os níveis de ChAT no sistema nervoso entérico, e
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- pelo menos uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias que A) aumentam os níveis de peptídeo vasoativo intestinal (VIP) no sistema nervoso entérico.
[00025] De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a um método de seleção das cepas de bactérias, o dito método compreendendo as etapas de:
a) arranjar uma co-cultura de células epiteliais intestinais e células neuronais entéricas, em que a dita célula epitelial intestinal esteja presente como uma monocamada e em que as ditas células neuronais entéricas estejam presentes no lado basolateral da monocamada,
b) adicionar as cepas de bactérias no lado apical ou luminal da monocamada de células epiteliais intestinais, preferivelmente em uma quantidade de cerca de 4 a 400 células bacterianas por célula epitelial,
c) incubar a co-cultura com a cepa de bactéria de ácido láctico,
d) preferivelmente, isolar as células neuronais,
e) medir a quantidade de VIP, ChAT, substancia P, nervos de Óxido de Nitrogênio, ATP e/ou peptídeo que ativa a adenilato ciclase pituitária (PACAP) produzido pelas células neuronais e, opcionalmente adicionalmente, a Resistência Elétrica Trans-Epitelial (TEER) da camada de células epiteliais intestinais.
[00026] Nesse método, a cepa de bactérias preferivelmente pertence ao grupo qu8e consiste em lactobacilos e bifidobactérias.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Definições [00027] No presente pedido, o uso de um composto ou de uma composição é pretendido abranger o próprio uso, opcionalmente com
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11/34 a intenção conectada, mas também qualquer comunicação associada com o composto ou composição com consequências comerciais ou legais, por exemplo, propaganda, instruções ou recomendações na embalagem das composições, instruções ou recomendações de apoio comercial tais como folhetos, brochuras, posters, documentação arquivada em registros regulatórios quanto a propósitos de segurança, propósitos de eficácia ou proteção do consumidor, por exemplo, em administrações tais como EFSA na Europa.
[00028] No presente pedido, os grupos de cepas referem-se a cepas que exibem uma propriedade específica ou um grupo de propriedades. Uma cepa específica pode então pertencer a vários grupos. No presente pedido, a expressão ou não é excludente.
[00029] No presente pedido, uma propriedade tal como VIP e/ou ChAT é considerada substancialmente inalterada comparada a um controle, se a variação não exceder 10%, preferivelmente 1%, comparada ao controle.
Modalidades preferidas [00030] Em modalidades preferidas, a composição é para uso em:
A3) aumentar VIP, desde que ChAT não esteja aumentada, ou
B3) aumentar ChAT, desde que VIP não esteja aumentado, a Resistência Elétrica (TEER) da camada de células epiteliais não esteja diminuída ou
C3) diminuir ChAT, desde que VIP não esteja diminuído ou C2) diminuir ChAT e diminuir VIP.
Por exemplo, a composição da invenção pode ser usada em:
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio intestinal, preferivelmente no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio da motilidade intestinal, ou
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- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C,
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, infecção intestinal, IBS-D, IBS-PI e IBD ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS ou IBD, ou
- tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas.
[00031] Em modalidades especialmente preferidas, as composições podem:
A) aumentar os níveis de VIP do sistema nervoso entérico e serem usadas no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio intestinal, preferivelmente no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio da motilidade intestinal ou
B) aumentar os níveis de ChAT do sistema nervoso entérico e serem usadas no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C ou
C) diminuir os níveis de ChAt do sistema nervoso entérico e serem usadas no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, IBS-D, IBS-PI, IBD.
[00032] A cepa da bactéria pode ser selecionada, por exemplo, do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio
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13/34 de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)].
[00033] Em uma modalidade, a cepa da bactéria é selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)].
e a composição é para uso em:
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS ou IBD, ou
- tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas.
[00034] Em uma modalidade, a cepa da bactéria é selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)], e a composição para uso no tratamento e/ou na prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C.
[00035] Em uma modalidade, a cepa da bactéria é selecionada do
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14/34 grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)], e a composição é para uso em:
A) aumentar os níveis de peptídeo vasoativo intestinal (VIP) do sistema nervoso entérico, preferivelmente para uso em A3) aumentando VIP, desde que ChAT não esteja aumentada.
[00036] Em uma modalidade particular dessa modalidade, a composição é para uso em:
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS ou IBD, ou
- tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas.
[00037] Em uma modalidade, a cepa da bactéria é selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)], e a composição é para uso em:
B) aumentar os níveis de ChAT do sistema nervoso entérico, preferivelmente B3) aumentar ChAT, desde que VIP não esteja aumentado.
[00038] Em uma modalidade particular dessa modalidade, a com
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15/34 posição é para suo no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C.
Detalhes adicionais das cepas de bactérias [00039] Como mencionado acima, a composição compreende pelo menos uma ou duas cepas específicas de bactérias, preferivelmente de bactérias do ácido láctico. Elas são selecionadas preferivelmente do grupo que consiste no gênero Lactobacillus e Bifidobacterium, Lactococcus e Streptococcus. A dita cepa específica de bactéria foi encontrada ser capaz de afetar os níveis de VIP e/ou afetar os níveis de nervo ChAT em um modelo de co-cultura que representa a interação entre o intestino e o ENS.
[00040] Um modelo de co-cultura, descrito em mais detalhes abaixo, foi usado in vitro para selecionar as cepas de bactérias de ácido láctico ou bifidobactérias com essas propriedades. 102 cepas que pertencem aos gêneros Lactobacillus, Streptococcus ou Bifidobacterium foram rastreadas.
[00041] Cepas do grupo B) com efeito aumentado sobre ChAT tipicamente aperfeiçoarão a motilidade intestinal. As cepas do grupo B3) com efeito aumentado sobre ChAT, excluindo as cepas em que VIP não está aumentado (isto é, VIP está substancialmente inalterado ou VIP está diminuído), representam uma modalidade específica preferida. As cepas desses grupos são tipicamente benéficas para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C. Isso pode ser de interesse particular adicional para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, que podem frequentemente sofrer de constipação. No que diz respeito ao aumento da motilidade, as cepas que aumentam a expressão de ChAT poderão ser favoráveis. Essa propriedade parece ser muito rara. Interessantemente, apenas três cepas foram descobertas aumentar ChAT estatisticamente. Essas são referidas
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16/34 como cepas do grupo B) ou do grupo B3). As cepas do grupo B) ou do grupo B3) compreendem as cepas DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010), DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) e DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010). Tais cepas aperfeiçoam beneficamente a motilidade, especialmente as contrações. É preferível que a Resistência Elétrica (TEER) da camada de células epiteliais intestinais não esteja diminuída. Tal propriedade pode ser indicativa de uma função de barreira adequada. A cepa DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) diminuiu significativamente os níveis de VIP, enquanto que as outras duas cepas não tiveram um efeito significativo sobre os níveis de VIP. Como uma diminuição em VIP pode ter um efeito adverso sobre IEB, foi examinado com um modelo in vitro com uma monocamada de células epiteliais intestinais se a incubação dessa cepa resultou em uma resistência elétrica trans-epitelial (TEER) diminuída. Isso acabou por não ser o caso, indicando que a função de IEB não estava prejudicada.
[00042] No que diz respeito ao relaxamento dos músculos e no reforço da função de IEB, o que é benéfico nos pacientes com IBS e IBD, as cepas que serão favoráveis aumentam a expressão de VIP (o que pode ter efeitos anti-inflamatórios adicionais). Tais cepas são referidas como cepas do grupo A). Em uma modalidade preferida, as cepas do grupo A) não aumentam a expressão de ChAT (isto é, ChAT está substancialmente inalterada ou ChAT está diminuída). Tais cepas são referidas como cepas do grupo A3). As cepas desses grupos são tipicamente benéficas para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS e IBD ou para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas. As cepas do grupo A) ou do grupo A3) compreendem as cepas DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em
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17/34 de junho 2000), DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010), DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de 1999), DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010). É interessante notar que todas as cepas que possuem essa propriedade são bifidobactérias, exceto uma: DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010). Adicionalmente, usando outro modelo in vitro com uma monocamada de T84 e especialmente a resistência elétrica transepitelial (TEER), as cepas DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho 2000), DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de 1999), DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) e DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) do grupo A) ou A3) foram encontradas ter um efeito protetor sobre a IEB na presença de LPS. Portanto, essas cepas particulares são especialmente preferidas.
[00043] De acordo com uma modalidade, as cepas permitem uma diminuição dos níveis de ChAT do sistema nervoso entérico. O grupo correspondente de cepas é referido como o grupo C). Em uma modalidade particular, as cepas permitem a diminuição de ChAT, desde que VIP não esteja diminuído (isto é, VIP está substancialmente inalterado ou VIP está aumentado). Esse grupo é referido como o grupo C3). Em uma modalidade particular, as cepas permitem a diminuição de ChAT com diminuição de VIP. Essas cepas são referidas como grupo C2). As cepas do grupo C3) são tipicamente benéficas para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, IBS-D. Isso pode ser de interesse particular adicional para o tratamento e/ou prevenção de doenças encontradas em pessoas idosas que podem frequentemente sofrer de diarreia. As cepas do grupo C2) são tipicamente benéficas para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, IBS-D,
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IBS-PI e IBD. Isso pode ser de interesse particular adicional para o tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas que podem sofrer com frequência de tais condições, especialmente de diarreia.
[00044] A presente invenção também abrange o uso das cepas acima mencionadas, mas também de cepas mutantes ou cepas geneticamente transformadas derivadas de qualquer uma das cepas parentais que ainda possua atividade sobre VIP e afete os nervos ChAT. Essas cepas mutantes ou geneticamente transformadas podem ser cepas em que um ou mais genes endógenos da cepa parental tenham sido mutados, por exemplo, para modificar algumas de suas propriedades metabólicas (por exemplo, sua habilidade de fermentar açúcares, sua resistência à acidez, sua sobrevivência ao transporte no trato gastrintestinal, sua pós-acidificação ou sua produção de metabolito). Elas também podem ser cepas que resultem da transformação genética da cepa parental por um ou mais genes de interesse, por exemplo, a fim de dar a dita cepa aspectos fisiológicos adicionais ou para permitir que ela expresse proteínas de interesse terapêutico ou vacinal que se desejam administrar através das ditas cepas.
[00045] Preferivelmente, uma mistura de pelo menos uma cepa que pertença ao grupo B), preferivelmente ao grupo B3) e pelo menos uma cepa que pertença ao grupo A), preferivelmente ao grupo A3) é usada. Tal mistura terá vantajosamente um efeito aperfeiçoado sobre a motilidade assim como sobre IEB.
Modelo de co-cultura e ensaio de rastreamento [00046] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método de seleção de cepas de bactéria do ácido láctico, o dito método compreendendo as etapas de:
a) usar uma co-cultura de células epiteliais intestinais e células neuronais entéricas, em que as células epiteliais intestinais estão
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19/34 presentes como uma monocamada e em que as células neuronais entéricas estão presentes no lado basolateral da monocamada,
b) adicionar as bactérias de ácido láctico sobre o lado apical ou luminal da monocamada, preferivelmente em uma quantidade de cerca de 4 a 400 células bacterianas por célula epitelial,
c) incubar a co-cultura com as bactérias de ácido láctico,
d) preferivelmente isolar as células neuronais e
e) medir a quantidade de pelo menos um neurotransmissor selecionado do grupo que consiste em VIP, ChAT, substancia P e Óxido de Nitrogênio, ATP, PACAP produzidos pelas células neuronais e, opcionalmente adicionalmente, a Resistência Elétrica Trans-Epitelial (TEER) da camada de células epiteliais intestinais.
[00047] Em concordância com o reflexo peristáltico, o ENS contém circuitos fisicamente conectados que consistem em neurônios motores excitatórios ascendentes que liberam a acetilcolina e a substancia P, que contrai a musculatura lisa através dos receptores muscarínicos e de neurônios inibitórios descendentes que liberam um coquetel de neurotransmissores, como NO, ATP, VIP e PACAP, todos os quais inibem a musculatura circular.
Cultura celular [00048] Uma maneira adequada para adequar a co-cultura com uma monocamada de células epiteliais intestinais polarizadas é dada no exemplo 1 e também está descrita em J. Chevalier et al., 2008, J. Physiol. 586 1963-1975.
[00049] Todas as culturas de célula epitelial intestinal que formam monocamadas são adequadas, tais como Caco-2, T84, HT29 e TC7. Preferivelmente soa usadas células T84.
[00050] Como células primárias do sistema nervoso entérico, as células, preferivelmente, são isoladas de fetos de mamíferos não humanos, preferivelmente roedores, mais preferivelmente ratos.
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20/34 [00051] Preferivelmente, as cepas bacterianas testadas são cultivadas até a fase exponencial tardia em um meio de crescimento adequado e lavadas. Preferivelmente, as bactérias são adicionadas ao lado apical da co-cultura em uma quantidade de 4 a 400 bactérias/célula epitelial, mais preferivelmente 10 a 100 bactérias/célula epitelial, até mais preferivelmente 30 a 50 bactérias/célula epitelial. Preferivelmente, como um controle, nenhuma bactéria é adicionada. Preferivelmente, como um controle positivo, butirato 1 mM ou KCl 40 mM são usados.
[00052] Preferivelmente, a etapa de incubação é realizada em cerca de 37°C. Preferivelmente, a etapa de incubação leva de 1 a 72 h, mais preferivelmente 2 a 36 h, até mais preferivelmente 4 a 12 h.
[00053] Preferivelmente, depois da coincubação, o compartimento que contém as células epiteliais e bactérias é removido e as células neuronais primárias são incubadas por 12 a 48 h, mais preferivelmente por 20 a 28 h em uma incubadora umidificada contendo CO2 5%.
[00054] Preferivelmente, a quantidade de nervos ChAT versus o total de nervos é medida usando a coloração imuno-histoquímica, usando a enolase anti-neurônio específica (NSE) para contar o número total de neurônios e a anti-colina acetil transferase para contar os nervos ChAT.
[00055] Preferivelmente, VIP é determinado por ELISA depois de coletar as células neuronais e extrair as proteínas com a presença de um coquetel inibidor de protease.
Detalhes adicionais sobre as composições [00056] A invenção abrange composições com cepas de bactérias que permitem os usos ou as propriedades referidas acima. A invenção também abrange composições que compreendem uma ou mais das seguintes cepas (abrangendo mutantes ou cepas geneticamente transformadas derivadas dessas):
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- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)],
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)], para uso em:
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio intestinal, preferivelmente no tratamento e/ou prevenção de um distúrbio da motilidade intestinal, ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C, ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, infecção intestinal, IBS-D, IBS-PI e IBD ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS ou IBD, ou
- tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças ou pessoas obesas, tipicamente quando administradas in vivo a um indivíduo. [00057] Nas composições da invenção, as ditas cepas podem ser usadas na forma de bactérias íntegras que podem estar vivas ou não. Alternativamente, elas podem ser usadas na forma de um lisado bacteriano ou na forma de frações bacterianas; as frações bacterianas
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22/34 adequadas para esse uso podem ser escolhidas, por exemplo, pelo teste de suas propriedades em aliviar os efeitos sobre os níveis de VIP e os níveis de nervos ChAT do modelo de co-cultura descrito na presente invenção. Preferivelmente, as células bacterianas estão presentes como células vivas, viáveis.
[00058] As composições da invenção podem estar em qualquer forma adequada para administração, em particular para administração oral. Isso inclui, por exemplo, sólidos, semissólidos, líquidos e pós. As composições líquidas são geralmente preferidas para facilitar a administração, por exemplo, como bebidas.
[00059] A composição pode, por exemplo, compreender pelo menos 105, preferivelmente pelo menos 1x106 cfu por g de massa seca, de pelo menos uma cepa de bactéria, preferivelmente de cepas de bactérias como mencionadas acima. Essas são selecionadas preferivelmente do grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias.
[00060] Quando as bactérias estão na forma de bactérias vivas, a composição pode compreender tipicamente 105 a 1013 unidades formadoras de colônia (cfu), preferivelmente pelo menos106 cfu, mais preferivelmente pelo menos107 cfu, ainda mais preferivelmente pelo menos108 cfu, e o mais preferivelmente pelo menos109 cfu por g de peso seco da composição. No caso de uma composição líquida, isso corresponde geralmente a 104 a 1012 unidades formadoras de colônia (cfu), preferivelmente pelo menos105 cfu, mais preferivelmente pelo menos106 cfu, ainda mais preferivelmente pelo menos107 cfu, e o mais preferivelmente pelo menos109 cfu/ml.
[00061] Exemplos de composições da invenção são as composições nutricionais, incluindo produtos alimentícios e, em particular, produtos lácteos.
[00062] A composição pode ser, por exemplo, um produto lácteo, preferivelmente, um produto lácteo fermentado. A administração na
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23/34 forma de um produto lácteo fermentado tem a vantagem adicional de baixos níveis de lactose, o que é adicionalmente benéfico para IBS. Opcionalmente, outras cepas de bactérias de ácido láctico podem estar presentes. O produto fermentado pode estar presente na forma de um líquido ou presente na forma de um pó seco obtido pela secagem do líquido fermentado. Preferivelmente, o produto fermentado é um produto fresco. Um produto fresco, que não tenha sofrido etapas de aquecimento severas, tem a vantagem de que as cepas bacterianas presentes estão na forma viva. Preferivelmente, o produto fermentado é um produto lácteo, mais preferivelmente, leite fermentado e/ou proteína de soro do leite fermentada. Preferivelmente, a composição nutricional é o iogurte ou leite fermentado em forma agitada ou bebível. Preferivelmente, o produto fermentado é um queijo. Preferivelmente, o produto fermentado é um vegetal fermentado, tal como a soja fermentada, cereais e/ou frutas em forma de conjunto, agitadas ou bebíveis.
[00063] Preferivelmente, a presente composição nutricional é um alimento infantil, uma fórmula láctea infantil ou uma fórmula de transição infantil. Preferivelmente, a presente composição é um produto nutracêutico ou farmacêutico, um suplemento nutricional ou um alimento médico.
[00064] As composições nutricionais da invenção também incluem suplementos alimentícios e um alimento funcional. Um suplemento alimentício designa um produto feito a partir de compostos geralmente usados em gêneros alimentícios, mas que está na forma de comprimidos, pós, cápsulas, poções ou qualquer outra forma geralmente não associada com alimentos e que tem efeitos benéficos para a saúde. Um alimento funcional é um alimento que tem efeitos benéficos para a saúde. Em particular, suplementos alimentícios e funcionais podem ter um efeito fisiológico - protetor ou curativo - contra uma doença, por exemplo, contra uma doença crônica.
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24/34 [00065] Uma composição que compreenda uma mistura de pelo menos uma cepa de bactéria de ácido láctico ou de bifidobactéria que aumente os nervos ChAT e pelo menos uma cepa de bactéria de ácido láctico ou bifidobactéria que aumente os níveis de VIP é preferida. Tal mistura terá vantajosamente um efeito aperfeiçoado sobre a motilidade assim como sobre IEB.
[00066] Uma mistura de pelo menos uma cepa que pertença ao grupo B), preferivelmente B3) e pelo menos uma cepa que pertença ao grupo A), preferivelmente A3) é preferida. Tal mistura terá vantajosamente um efeito aperfeiçoado sobre a motilidade assim como sobre IEB. Portanto, a presente invenção também se refere a composições que compreendem:
- pelo menos uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],
- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) [B) - B3)],e
- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) [B) - B3)]; e
- pelo menos uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:
- DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000) [A) - A3)],
- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)],
- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de
1999) [A) - A3)], e
- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) [A) - A3)].
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25/34 [00067] As composições da invenção também podem compreender uma ou mais de outras cepas de bactérias de ácido láctico, probióticas ou não, por exemplo, uma ou mais cepas bacterianas selecionadas dos gêneros Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus e Bifidobactérias. Em particular, essa(s) outra(s) cepa(s) pode(m) incluir uma ou mais cepas de Streptococcus thermophilus e/ou uma ou cepas de Lactobacillus bulgaricus.
Aplicação [00068] Em uma modalidade, as cepas da presente invenção foram encontradas aumentar o número de nervos ChAT. A colina acetiltransferase EC 2.3.1.6 é uma enzima que é sintetizada dentro do corpo de um neurônio e transferida para o terminal do nervo. O papel da colina acetiltransferase é unir a Acetil-CoA à colina, resultando na formação do neurotransmissor acetilcolina. Ela é usada como um marcador imuno-histoquímico para neurônios motores. Os efeitos sobre o nervo ChAT resultam nas contrações aperfeiçoadas que resultam em peristalse aperfeiçoada. Portanto, as cepas e composições da presente invenção capazes de aumentar os nervos ChAT são vantajosamente administradas para melhorar ENS, para aperfeiçoar ou intensificar a peristalse, para aperfeiçoar a motilidade intestinal e/ou para diminuir o tempo de transito gastrintestinal. Aumentar o fenótipo colinérgico é de interesse terapêutico em patologias GI associadas com a inibição do transito colônico. Em particular, vários estudos mostraram que o transito lento poderia estar associado com a expressão reduzida de neurônios ChAT. Em particular (i) pacientes severamente constipados geralmente têm uma menor quantidade de nervos ChAT, (ii) a produção de ACh mioentérica diminui significativamente durante a evolução de infecção e pós-infecção (PI), (iii) durante o envelhecimento, uma redução da proporção de neurônios colinérgicos tem sido relatada.
[00069] Nesse contexto, usar as cepas de bactéria, preferivelmente
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26/34 bactérias do ácido láctico ou bifidobactérias para intensificar a expressão colinérgica em neurônios, poderá ser terapeuticamente interessante no futuro para pacientes severamente constipados e para IBS-C. Portanto, as cepas e as composições da presente invenção são vantajosamente administradas a pacientes que sofrem de IBS-C e/ou constipação. As cepas que são mais úteis são as cepas do grupo B) ou B3) mencionadas acima.
[00070] Em uma modalidade particular, as cepas e as composições da presente invenção são usadas por ou para pessoas idosas. As pessoas idosas na presente invenção são definidas como humanos com uma idade acima de 65 anos, preferivelmente acima de 70 anos, preferivelmente acima de 75 anos, preferivelmente acima de 80 anos, preferivelmente acima de 85 anos. Pessoas mais idosas tipicamente possuem um número diminuído de neurônios ChAT no sistema mioentérico localizado no cólon, o mais preferivelmente no cólon transverso. Portanto, as cepas e as composições da presente invenção são vantajosamente administradas para tratar e/ou prevenir IBS, preferivelmente IBS-C e/ou a constipação em pessoas mais idosas. Cepas capazes de aumentar os nervos ChAT são do grupo B), tais como a cepa DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010), DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) e DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010). Preferivelmente, elas não diminuem VIP, por que VIP é necessário para uma boa função da IEB e para o relaxamento do trato GI, outra parte importante da motilidade do trato GI tal como a peristalse. As cepas que atingiram esse critério foram DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010), e DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010). Entretanto, a cepa DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) também não afetou negativamente a função da IEB como determinado pelos expePetição 870190117718, de 14/11/2019, pág. 34/50
27/34 rimentos de TEER, já que TEER não diminuiu.
[00071] Em uma modalidade, as cepas da presente invenção foram encontradas aumentar os níveis de VIP. Com relação ao sistema digestivo, VIP induz o relaxamento da musculatura lisa (esfíncter esofagiano inferior, estômago, vesícula biliar), estimula a secreção de água no suco pancreático e biliar e induz a inibição da secreção de ácido gástrico e a absorção a partir da luz intestinal. Seu papel no intestino é estimular acentuadamente a secreção de água e eletrólitos, assim como dilatar a musculatura lisa intestinal, dilatar os vasos sanguíneos periféricos, estimular a secreção de bicarbonato pancreático e inibir a secreção de ácido gástrico estimulada pela gastrina. Esses efeitos trabalham junto para aumentar a motilidade, em particular a parte de relaxamento da motilidade. VIP também aumente beneficamente a função da IEB. Portanto, as cepas e as composições da presente invenção são vantajosamente administradas para aperfeiçoar o ENS, aperfeiçoar ou intensificar a peristalse, diminuir a permeabilidade, aperfeiçoar a motilidade intestinal e/ou diminuir o tempo do transito gastrintestinal. Portanto, as cepas e as composições da presente invenção são vantajosamente administradas para uso em ou para pacientes que sofrem de:
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio intestinal, preferivelmente tratamento e/ou prevenção de um distúrbio da motilidade intestinal, ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em constipação e IBS-C, ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em diarreia, infecção intestinal, IBS-D, IBS-PI e IBD, ou
- tratamento e/ou prevenção de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em IBS e IBD, ou
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- tratamento e/ou prevenção de distúrbios encontrados em pessoas idosas, crianças e pessoas obesas.
[00072] As cepas que são as mais úteis são as cepas do grupo A ou A3 mencionadas acima.
[00073] Detalhes e vantagens da presente invenção podem ser encontrados nos exemplos não limitantes abaixo.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: RASTREAMENTO DE PROBIÓTICOS EM UM MODELO DE CO-CULTURA QUE ENVOLVE CÉLULAS EPITELIAIS E CÉLULAS NEURONAIS ENTÉRICAS
Cultura celular [00074] Ratas Sprague-Dawley prenhas foram adquiridas (CERJ, Le Genest St Isle, França e Janvier-Breeding Center, Belgica) e mortas por uma overdose de CO2 seguida pela separação das artérias carótidas. Os embriões (35 a 45 por isolamento de 3 ratas prenhas) foram removidos e mortos por decapitação. Os intestinos delgados dos embriões foram removidos e finamente picados em HBSS (Sigma, França). Os fragmentos de tecido foram coletados em 5 ml de meio (meio DMEM-F12 1:1) e digeridos a 37°C por 15 min em tripsina 0,1% (Sigma). A reação com a tripsina foi parada pela adição de 10 ml de meio contendo soro fetal bovino 10% e depois tratada por DNAse (0,01%, Sigma) por 10 min a 37°C. Depois de triturar com uma pipeta de 10 ml, as células foram centrifugadas a 750 r.p.m. por 10 min. As células foram contadas e depois semeadas em uma densidade de 2,4 x 105 células/cm2 em placas de 24 poços, previamente revestidas por 6 h com uma solução de gelatina (0,5%, Sigma) em salina tamponada com fosfato (PBS) estéril. Depois de 24 h, o meio foi trocado por um meio sem soro (DMEM-F12 1:1, contendo 1% de suplemento N-2, Life Technologies, França)). As células foram mantidas em cultura por 14 dias para obter uma cultura primária de sistema nervoso entérico
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29/34 (ENS). Metade do meio era substituído em dias alternados. Com 14 dias, as células neuronais primárias estavam prontas para o estabelecimento do modelo de co-cultura.
[00075] A linhagem celular T84 (EATCC) foi cultivada em DMEMF12 (1:1, GIBCO) suplementado como FBS 10% inativado pelo calor e 50 Ul/ml de penicilina e 50 pg/ml de estreptomicina. As células foram semeadas em filtros de 12 poços Transwell® (Corning, NY, USA) em uma densidade de 2 x 105 células/inserto e cultivadas para obter a confluência.
[00076] Um dia depois que as células epiteliais chegaram a confluência, os filtros Transwell® foram transferidos para placas de 12 poços semeadas no fundo com células nervosas entéricas. As células epiteliais e neuronais foram cocultivadas no meio para as células epiteliais.
Cultura de cepas de bactérias [00077] As bactérias foram cultivadas por 16 h em TGYH para bifidobactérias e lactobacilos, exceto para a cepa de DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000) que foi cultivada em meio MRS + cisteína, lavadas com PBS duas vezes e ajustadas para 4 x 108 cfu/ml a fim de adicionar consistentemente o mesmo volume de suspensão bacteriana ao filtro. As cepas foram adicionadas no compartimento do filtro em um MOI de 40 bactérias/célula epitelial. Como controle, nenhuma bactéria foi adicionada.
[00078] Depois de 8 horas de co-incubação, o compartimento do filtro contendo as células epiteliais e as bactérias foi removido e as células neuronais primárias foram incubadas por 24 h em uma incubadora umidificada contendo CO2 5%. Nos poços de controle, as células neuronais foram estimuladas com butirato 1 mM e KCl 40 mM quando as medidas de ChAT e VIP foram realizadas, respectivamente. Coloração imuno-histoquímica. Medição de nervos ChAT
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30/34 [00079] Depois da incubação, a imuno-histoquímica foi realizada para detectar as populações de célula neuronal. Depois da fixação das células (em PBS 0,1M contendo paraformaldeído 4% por 1 hora em temperatura ambiente), as células foram lavadas 3 vezes em PBS, depois permeabilizadas por 30 min em PBS/NaN3 contendo Triton X-100 0,5% e soro de cavalo 4%. Anticorpo primário: anti-enolase específica de neurônio de coelho (NSE) (1:2000; Biovalley, França) e anti-colina acetiltransferase de coelho foi diluído em PBS/NaN3 contendo Triton X-100 0,5% e soro de cavalo 4% e incubado por uma noite em temperatura ambiente. Depois da incubação com o antissoro primário, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas por 3 h com IgG de jumento anti-coelho conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1:200 Immunotech, França) e 7-amino-4-metil-cumarin-3acetato, respectivamente. Os espécimes foram visualizados sob um microscópio de fluorescência Olympus IX50 equipado com uma vídeo câmara branca (Mod. 4910, Cohu Inc., Alemanha) conectada a um computador Macintosh através de um cartão de placa de captura (Scion Image, SL Microtest).
Medições de VIP:
[00080] Para a determinação de VIP, as células neuronais foram coletadas das placas de 12 poços, as proteínas foram extraídas usando o tampão de lise RIPA (Millipore, França) contendo um coquetel inibidor de protease (Roche Diagnostics, França) e os níveis de VIP foram medidos por ELISA (Bachem, Alemanha).
Resultados [00081] As respostas diferenciais dos neurônios entéricos primários sobre os marcadores de VIP e ChAT depois da interação de algumas das 102 cepas probióticas, incluindo bactérias do ácido láctico e Bifidobactérias, são mostradas na Tabela 1. Apenas algumas cepas que pertencem ao grupo A3) ou B3) ou C3) são mostradas. Adicionalmen
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31/34 te, é mencionado que 26 cepas foram mostradas não ter efeito significativo sobre VIP e ChAT (incluindo as cepas de Bifidobacterium longum NCC 2705 (CNCM I-2618), Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) e Lactobacillus casei Shirota), 11 cepas que pertencem ao grupo C2) foram mostradas diminuir ambos VIP e ChAT (incluindo a cepa Bifidobacterium longum W11 de Alfa-Wass (LMG P-21586)), 10 cepas diminuíram VIP e não tiveram efeito sobre ChAT (incluindo as cepas de referencia Bifidobacterium infantis UCC 3564, Bifidobacterium longum Bb536, Bifidobacterium animalis spp lactis Bb12 (DSM 15954), e Bifidobacterium animalis spp lactis Bi-07 (ATCC SD5220) e 41 que pertencem ao grupo C3) diminuíram ChAT e não tiveram efeito sobre VIP incluindo as cepas Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM I1225), Lactobacillus plantarum 299v (DSM 9843) Lactobacillus reuteri SD 2122 (ATCC 55730)).
Tabela 1: Efeito da incubação com bactérias do ácido láctico e bifidobactérias sobre os níveis de VIP e ChAT em um modelo de co-cultura com monocamada de célula epitelial e células primárias do ENS.
| VIP | ChAT | ||||||
| Grupo | Número DN espécie (número CNCM) | Diferença estimada* vs controle | valor de p | Média empírica | Diferença estimada vs controle | valor de p | Média empírica |
| 1 | DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010) Bifidobacterium bifidum | -0,0097 | 0,9 | 0,0790 | 0,2709 | 0,09 | 0,1796 |
| 1 | DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010) Lactobacillus rhamnosus | -0,0389 | 0,7 | 0,0397 | 0,3151 | 0,10 | 0,2535 |
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| 1 | DN_119_0118 (CNCM I-4279 filed February 25 2010) Lactobacillus acidophillus | -0,1329 | 0,09 | -0,2221 | 0,2847 | 0,02 | 0,2796 |
| 2 | DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000) Bifidobacterium lactis | 0,2345 | 0,01 | 0,2001 | -0,2615 | 0,05 | -0,0825 |
| 2 | DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) Bifidobacterium breve | 0,2248 | 0,01 | 0,2020 | -0,5450 | 0,00 | -0,5723 |
| 2 | DN_156_007 (CNCM I-2219 31 de maio de 1999) Bifidobacterium breve | 0,2715 | 0,02 | 0,3552 | -0,3632 | 0,01 | -0,1281 |
| 2 | DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) Lactobacillus plantarum | 0,5976 | 0,00 | 0,6813 | -0,6269 | 0,00 | -0,3918 |
*Valores são dados como uma diferença comparado com o controle, onde nenhuma cepa bacteriana foi adicionada.
[00082] Embora a cepa DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010) diminua os níveis de VIP, foi revelado com um modelo de TEER (Hirotani et al., 2008, Yakugaku Zasshi Sep; 128(9):1363-8) que a incubação com a cepa por 4 ou 6 h não reduziu significativamente os valores de TEER, mesmo na presença de dano vs. controle. Em resumo, as bactérias foram cultivadas em TGYH. As suspensões de cultura foram lavadas com PBS. Subsequentemente, as bactérias (100 cfu/célula) foram adicionadas ao lado apical das monocamadas de célula T84. Depois de 2 h de incubação, LPS (L4516 EPEC- 0127:B8) foi adicionado sobre o lado apical em 40 ng/ml ou não adicionado. Então, depois de 2h e 4 h de incubação, o valor de
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TEER foi medido para avaliar a função da barreira epitelial. Todos os experimentos foram realizados três vezes independentemente e em triplicata na presença e na ausência de LPS. O valor de T84 em t=0 foi ajustado em 100%. Na ausência de LPS, TEER em T4 foi de 98,7% e em T6 100,2 % com a cepa DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010); para T84 sozinha, esse ainda foi de 100 %. Na presença de LPS, o controle de T84 em T4 foi de 56,2% comparado com t=0 e com a cepa DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010), 47,9 %; em T6, o controle de T84 foi de 46,7% e com a cepa DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010), 52,2%.
[00083] Usando esse mesmo modelo de TEER, especialmente a cepa DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000), DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio 1999), DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) e DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) (todas pertencendo ao grupo A3), mostraram bons resultados sobre a função da barreira intestinal como avaliado por TEER na presença de LPS. Veja a Tabela 2.
Tabela 2: Resultados de TEER na presença de LPS de bactérias selecionadas que mostram os melhores resultados
| TEER T4/TEER T0 (%) | TEER T6/ TEER T0 (%) | ||||
| Cepa | Significância | Média empírica | Significância | Média empírica | |
| T84 de controle | 56,20 | 46,76 | |||
| DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2000) | B. lactis | *** | 71,27 | *** | 51,03 |
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| DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio de 1999) | B. breve | *** | 70,70 | *** | 55,87 |
| DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010) | L. plantarum | *** | 65,84 | *** | 64,37 |
| DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010) | B. breve | *** | 84,44 | *** | 80,38 |
*** valor de p < 0,05
Claims (7)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 105 cfu/g de pelo menos uma cepa de bactérias selecionada do grupo que consiste em CNCM I-4321, CNCM I-4318, CNCM I4317 e CNCM I-4320, em que a composição é um produto alimentício.
- 2. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 105 cfu/g de:- pelo menos uma cepa de bactérias selecionada do grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias que B) aumente os níveis de ChAT no sistema nervoso entérico, e- pelo menos uma cepa de bactérias selecionada do grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias que A) aumente os níveis de peptídeo vasoativo intestinal (VIP) no sistema nervoso entérico, em que a composição compreende:- pelo menos uma cepa de bactérias selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:- DN_116_0047 (CNCM I-4317 depositada em 19 de maio de 2010),- DN_154_0067 (CNCM I-4320 depositada em 19 de maio de 2010), e- DN_119_0118 (CNCM I-4279 depositada em 25 de fevereiro de 2010); e- pelo menos uma cepa de bactérias selecionada do grupo que consiste nas seguintes cepas:-DN_173_010 (CNCM I-2494 depositada em 20 de junho de 2010),- DN_156_0032 (CNCM I-4321 depositada em 19 de maio de 2010),- DN_156_007 (CNCM I-2219 depositada em 31 de maio dePetição 870190117718, de 14/11/2019, pág. 43/502/31999), e- DN_121_0304 (CNCM I-4318 depositada em 19 de maio de 2010), em que a composição é um produto alimentício.
- 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a composição é um produto lácteo.
- 4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a composição é um produto lácteo fermentado.
- 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição é um alimento infantil, uma fórmula láctea infantil, uma fórmula de transição infantil, um produto nutracêutico, um produto farmacêutico, um suplemento nutricional ou alimento medicinal.
- 6. Método de seleção de cepas de bactérias, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) arranjar uma co-cultura de células epiteliais intestinais e células neuronais entéricas, em que a dita célula epitelial intestinal esteja presente como uma monocamada e em que as ditas células neuronais entéricas estejam presentes no lado basolateral da monocamada,b) adicionar as cepas de bactérias no lado apical ou luminal da monocamada de células epiteliais intestinais em uma quantidade de 4 a 400 células bacterianas por célula epitelial,c) incubar a co-cultura com a cepa de bactéria de ácido láctico,d) preferivelmente, isolar as células neuronais,e) medir a quantidade de VIP, ChAT, substancia P, nervos de Óxido de Nitrogênio, ATP e/ou peptídeo que ativa a adenilato ciclase pituitária (PACAP) produzido pelas células neuronais e, opcio-Petição 870190117718, de 14/11/2019, pág. 44/503/3 nalmente adicionalmente, a Resistência Elétrica Trans-Epitelial (TEER) da camada de células epiteliais intestinais.
- 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cepa da bactéria pertence ao grupo que consiste em lactobacilos e bifidobactérias.
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