CN103898007B - 一株有活性的双歧杆菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种神经元分离和培养方法及试剂。本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前海马神经元体外分离和培养的方法，解决了海马神经元原代培养的增殖性和活性无法保持的问题。本发明的细胞种植液含有双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002的活性发酵滤液。建立了一套比较成熟的体外培养海马神经元的方法，本发明得到的神经细胞数量充足，生长状态较好，能够从哺乳动物的海马组织中分离出高活性、高数量的海马神经细胞，符合原代海马细胞培养的要求，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一株有活性的双歧杆菌菌株。
背景技术
海马(hippocampal)是中枢神经系统的重要组成部分，作为神经元高度集中的区域，具有中枢神经系统的典型特性，在学习、记忆、情绪反应及自主神经功能等方面发挥重要作用。神经元细胞培养模型是研究神经元发育分化、神经再生、神经疾病的发生机制等重要的实验模型，体外培养海马神经元已成为研究阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病的重要技术手段。原代培养(primary culture)是指从活体细胞获得细胞、组织或器官，在体外条件下进行的第一次培养。神经元原代培养是将胚胎哺乳动物中枢神经系统的部分组织，如海马组织、大脑皮层、小脑、下丘脑、海马、脊髓和神经丛从机体直接取出，再接种培养的方法。目前国内、外有关神经元培养的方法较多，但在原代培养中神经元的纯度和产量方面还存在一些急待解决的问题。由于神经元是一种高度分化的细胞，动物出生后很少分裂，相对于其它细胞而言，神经元在体外更难以存活和生长。因此，体外培养神经元要求的培养方法和营养条件均较为特殊。
目前，导致难以获得足够数量和活力的原代海马神经元的因素有以下几方面：(1)海马神经组织分离过程中，多数人用D-hank′s或hank′s作为漂洗液，离体哺乳动物海马组织中去除红细胞、被膜及结缔组织等杂质，分离过程时间较长，有时候需要2小时以上，在漂洗液中时间会更长，海马神经元即已部分死亡，从而出现假阴性的培养结果。实验上无法开展海马神经元的常规培养，主要可能是因为没有合适的用于海马组织标本的神经元培养用漂洗液/解剖液之故。在组织分离过程中，即使冰浴，神经元依然进行着很大程度代谢，hank′s液的无糖环境对神经元分离很不利，在hank′s液中添加DMEM或者高糖来供给大脑的代谢，但葡萄糖浓度太高，易增加细菌污染的机会；添加DMEM培养液会碱性化，不利于神经元细胞存活。中国专利CN102978162A“一种神经元分离和培养方法及试剂”、中国专利CN102994452A“一种高效分离和培养神经元的方法”和中国专利CN102994451A“一种神经元分离和培养的改进型方法”，取脑组织放入盛有1×PBS的培养皿中，所采用清洗液均为PBS液，DMEM-高糖或DMEM-F12与马血清来浸泡解剖过程中的大脑，来供给大脑的代谢，考虑到了神经元能量代谢需要，但未添加任何抗菌物质，葡萄糖浓度太高，就容易增加细胞污染的机会。(2)采用大剂量胰蛋白酶消化后，海马神经细胞势必受到相当程度的生比和机械损害；细胞表面的粘附分子或膜蛋白极易受到破坏，对于这类具有立体结构用以维持细胞增殖及自我更新的细胞来说，很难迅速恢复细胞状态，往往伴随着大范围的细胞死亡/凋亡，细胞“老化”严重，细胞活力将明显减弱，组织中不能获得大量活细胞；(3)细胞种植液对原代培养海马神经元至关重要，细胞种植液不同于接下来的细胞维持液，需要给予神经细胞特殊的生长因子，这样才能保证获得足够数量和活力的海马神经元。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种哺乳动物的海马神经元体外原代培养的方法，目的是建立一种简单易行、高纯度的海马神经元体外原代培养的方法及试剂，满足神经科学研究的需求。
本发明提供的技术方案之一为：
本发明的双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，已于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为双歧杆菌(Bifidobacteriumsp.)，保藏编号为CGMCC No.8809。
本发明的双歧杆菌WZ002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。
本发明的双歧杆菌WZ002菌株具有下述微生物学特征：
(1)菌落形态：WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1～1.5mm。
(2)个体形态：G+无芽孢杆菌，杆状。
(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纤维二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸钠(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麦芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水杨素(-)；F6PPK酶(+)；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(-)；触酶(-)；靛基质反应(-)。
厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37～41℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH6.5～7.0；在pH4.5～5.0或8.0～8.5不生长。
所述双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，CGMCC No.8809应用于海马神经元的细胞种植液中。
我们实验过程中意外发现：双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002菌株的活性发酵滤液既能提供营养成分，又可促进神经元生长，获取神经元的数量可以满足实验的需要。
本发明提供的技术方案之二为：海马神经元的分离、原代培养方法，包括以下步骤：
1.漂洗：取离体哺乳动物的海马组织，置冰浴的漂洗液中，去除红细胞、被膜及结缔组织，用漂洗液冲洗2～5次；
2.消化：将步骤1漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块，用5倍组织体积的消化液37℃作用5～10分钟，组织成粥糜状，用细胞种植液终止消化，轻轻吹打至组织块10次以分散细胞。
3.制备细胞悬液：收集步骤2消化后初次细胞悬液，经200目细胞筛过滤后，
800～1000rpm4℃离心5～10分钟，弃去上清液，加入细胞种植液，重悬细胞，制成5×105～10×105个/mL的单细胞悬液；
4.接种、培养：将步骤3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，种植后24～72小时换成细胞维持液，之后每隔两天用细胞维持液换液，每次更换的量为原体积的1/2。
试剂购买：
DMEM/F12神经基础培养基、Neurobasal培养基和B27购于Gibco公司；多聚赖氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺购于美国Sigma公司；青链霉素混合液(双抗)，购于美国HyClone公司。
试剂的配置：
(1)所述的D-Hank′s液，经过如下步骤得到：NaCl8.0g，KCl0.4g，Na2HPO4·12H2O0.12g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g；依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀，加三蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2～7.4，分装，高压灭菌，分装，4℃保存备用。
(2)所述的漂洗液，经过如下步骤得到：2g海藻糖、3g葡萄糖和10mL双抗溶于100mLD-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。
(3)所述的消化液，经过如下步骤得到：1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于100mL D-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。
(4)所述的活性发酵滤液，经过如下步骤得到：
①双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，该菌株已于2014年1月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8809；
②双歧杆菌WZ002采用改良MRS培养基培养，培养基配方为：以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.5g，MnSO4·4H2O0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801mL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6.5，115℃高压灭菌15-20分钟。
③将双歧杆菌WZ002接种于冷却至40±2℃的步骤②改良MRS培养基中，菌种接种量为0.2～0.5％，35±2℃厌氧培养24小时，用分光光度计测定上述培养液A580nm值为1.2时，将上述培养液在转数5000～8500rpm下离心10分钟后，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，即得到活性发酵液滤液，4℃保存备用。
(5)所述的多聚赖氨酸，经过如下步骤得到：10mg多聚赖氨酸溶于10mL三蒸水中，混匀，加三蒸水定容至100mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，冰冻备用。
(6)所述的细胞种植液，经过如下步骤得到：DMEM/F12培养基加入胎牛血清、活性发酵滤液和双抗，使胎牛血清终浓度为10％、活性发酵滤液终浓度为0.2％，双抗终浓度为1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。
(7)所述的细胞维持液，经过如下步骤得到：Neurobasal培养基加入B27和谷氨酰胺，使B27终浓度为2％，谷氨酰胺终浓度1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。
(8)所述的双抗，为青霉素-链霉素溶液(100×)，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。1％双抗：青霉素含量为100U/mL，链霉素含量为0.1mg/mL。
本发明具有以下优点及效果：
1.漂洗步骤中，海马组织浸润在氢气环境下，最大化减少组织的分离操作对海马神经细胞的损伤，而且，氢气具有极强的生物学活性，最大限度保护海马神经细胞不受伤害，可提高了原代海马神经细胞的存活率和生物活性。
2.漂洗液含有海藻糖，替换常规使用的蔗糖，蔗糖粘度较大，不利于组织分离操作。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护神经细胞，维持生命体的生命过程和生物特征，而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。
3.消化步骤中，采用了富含氢气的消化液，使得胰蛋白酶与所消化组织充分接触和作用，气体搅拌均匀，胰蛋白酶消化效率大大提高，胰蛋白酶使用剂量和经历的时间有所缩短(从原来的10～20分钟缩短到不超过10分钟)，同时又增加了海马神经元生理呼吸，氢气本身又是健康因子，使海马神经元细胞更多地保持了原有的生物活性。短时间、低浓度胰酶即达到必要的消化效果，对神经元损伤更小，也提高了神经元的体外存活率。
总之，本发明建立了一套比较成熟的原代培养海马神经元的方法，即在氢气环境下漂洗和酶消化，漂洗液含有保护功能的海藻糖，低浓度、短时间的酶分离细胞和含活性发酵滤液的特殊种植培养基；本发明得到的神经细胞数量充足，生长状态较好，能够从哺乳动物的海马组织中分离出高活性、高数量的海马神经细胞，符合海马细胞神经元原代培养的要求。
具体实施方式
以下结合具体实施例，实验材料取新生SD大鼠的海马组织，对本发明进行详细说明。
实施例1
本发明的双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，已于2014年1月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为双歧杆菌(Bifidobacteriumsp)，保藏编号为CGMCC No.8809。
本发明的双歧杆菌WZ002分离于一名浙江省健康青年人粪便中。
本发明的双歧杆菌WZ002菌株具有下述微生物学特征：
(1)菌落形态：WZ002菌株在平板上菌落呈灰白色或乳白色，不透明、有光泽、表面光滑、凸起、质地软、边缘整齐，直径1-1.5mm。
(2)个体形态：G+无芽孢杆菌，杆状。
(3)生理生化特征：D-核糖(+)；L-阿拉伯糖(+)；乳糖(+)；纤维二糖(-)；松三糖(+)；棉籽糖(+)；山梨醇(-)；淀粉(-)；葡萄糖酸钠(-)；木糖(+)；甘露糖(-)；果糖(+)；半乳糖(+)；蔗糖(+)；麦芽糖(+)；海藻糖(-)；密二糖(+)；甘露醇(+)；菊糖(-)；水杨素(-)；F6PPK酶(+)；对氧的反应(在好气固体培养基上不生长)；硝酸盐还原(-)；触酶(-)；靛基质反应(-)。
厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度37-41℃；最低生长温度25-28℃；
最高43-45℃；生长最适pH6.5-7.0；在pH4.5-5.0或8.0-8.5不生长。
所述双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，CGMCC No.8809应用于海马神经元的细胞种植液中。
我们实验过程中意外发现：双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002菌株的活性发酵滤液既能提供营养成分，又可促进神经元生长，获取神经元的数量可以满足实验的需要。
实施例2
试剂购买：
DMEM/F12神经基础培养基、Neurobasal培养基和B27购于Gibco公司；多聚赖氨酸、胎牛血清(FBS)、海藻糖和L-谷氨酰胺购于美国Sigma公司；青链霉素混合液(双抗)，购于美国HyClone公司。
试剂的配置：
(1)所述的D-Hank′s液，经过如下步骤得到：NaCl8.0g，KCl0.4g，Na2HPO4·12H2O0.12g，KH2PO40.06g，NaHCO30.35g；依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀，加三蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2～7.4，分装，高压灭菌，分装，4℃保存备用。
(2)所述的漂洗液，经过如下步骤得到：2g海藻糖、3g葡萄糖和10mL双抗溶于100mLD-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。
(3)所述的消化液，经过如下步骤得到：1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于100mL D-Hank′s液中，混匀，加D-Hank′s液定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用。
(4)所述的活性发酵滤液，经过如下步骤得到：
①双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，该菌株已于2014年1月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8809；
②双歧杆菌WZ002采用改良MRS培养基培养，培养基配方为：以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O0.5g，MnSO4·4H2O0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-801mL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6.5，115℃高压灭菌15-20分钟。
③将双歧杆菌WZ002接种于冷却至40±2℃的步骤②改良MRS培养基中，菌种接种量为0.2～0.5％，35+2℃厌氧培养24小时，用分光光度计测定上述培养液A580nm值为1.2时，将上述培养液在转数5000～8500rpm下离心10分钟后，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，即得到活性发酵液滤液，4℃保存备用。
(5)所述的多聚赖氨酸，经过如下步骤得到：10mg多聚赖氨酸溶于10mL三蒸水中，混匀，加三蒸水定容至100mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装，冰冻备用。
(6)所述的细胞种植液，经过如下步骤得到：DMEM/F12培养基加入胎牛血清、活性发酵滤液和双抗，使胎牛血清终浓度为10％、活性发酵滤液终浓度为0.2％，双抗终浓度为1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。
(7)所述的细胞维持液，经过如下步骤得到：Neurobasal培养基加入B27和谷氨酰胺，使B27终浓度为2％，谷氨酰胺终浓度1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。
(8)所述的双抗，为青霉素-链霉素溶液(100×)，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。1％双抗：青霉素含量为100U/mL，链霉素含量为0.1mg/mL。
实施例3
以SD大鼠海马神经元的分离、原代培养方法包括以下步骤：
以实施例1和实施例2所准备的试剂和配置试剂。
(1)漂洗：取离体哺乳动物的海马组织，置冰浴的漂洗液中，去除红细胞、被膜及结
缔组织，用漂洗液冲洗2～5次；
(2)消化：将步骤1漂洗后的海马组织剪成直径1mm3小块，用5倍组织体积的消化液37℃作用5～10分钟，组织成粥糜状，用细胞种植液终止消化，轻轻吹打至组织块10次以分散细胞。
(3)制备细胞悬液：收集步骤2消化后初次细胞悬液，经200目细胞筛过滤后，800～1000rpm4℃离心5～10分钟，弃去上清液，加入细胞种植液，重悬细胞，制成5×105～10×105个/mL的单细胞悬液；
(4)接种、培养：将步骤3细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中，种植后24～72小时换成细胞维持液，之后每隔两天用细胞维持液换液，每次更换的量为原体积的1/2。
(5)镜检判定：神经细胞种植后12小时后，倒置显微镜观察，显示：大部分细胞贴壁，形态呈圆形，其中少数神经细胞外观为长梭型，并开始伸出1～2个突起。第2天更换细胞维持液，培养24小时后，细胞形态多样，如梭形、三角形、椎体形或不规则形，伸出突起的神经细胞逐渐增多长短不一。培养第72小时，神经元胞体增大，饱满；3天后神经元形状已很典型：胞体饱满，多呈梭形、锥形，少数呈多边形，胞浆丰富，核大，核仁隐约可见，突起明显增长，背景中仍然可见极少数扁平状多边形的神经胶质细胞铺垫。
在培养第3～5天，进行显微镜镜检，培养细胞出现体积变大、且大部分细胞出现典型的神经元形态，没有杂细胞增殖，则说明培养成功。
本发明方法建立的海马神经元原代培养细胞可存活5～9天，能够满足开展神经元细胞功能研究的需要。
(6)细胞纯化
如果观测到有杂细胞存在，则进行细胞纯化处理。
如果细胞培养48～72小时，观察到有杂细胞存在，每孔加入阿糖胞苷(浓度为2～10μg/mL)1mL，再加入与阿糖胞苷溶液等体积的步骤(3)配制的细胞种植液，使阿糖胞苷终浓度为1～5μg/mL，24～48小时后，用步骤(4)配制的细胞维持液完全换液。
实施例4
1.细胞活力试验
表1培养的海马神经元的细胞活力
注：**表示P＜0.01表示差异极显著。
本发明细胞种植液(含活性发酵滤液)组的细胞活力效果为最好。
2.神经细胞存活率试验
本发明实施例3对神经细胞的存活起明显的促进作用，培养4天时神经元存活率，与DMEM/F12+20％小牛血清组(存活率58％)、Neurobasal Medium+2％B27组(存活率62％)相比，本发明实施例3组神经细胞存活率为81％，本发明明显促进神经细胞的存活，差异极显著(p＜0.01)。
结论：体外原代培养极为“娇气”的神经元并不困难，通过本发明方案培养的海马神经元较为大量，存活率高，形态佳且体外生存力强，体外培养前三天的神经元的存活率远高于文献报道的50％，可作为神经科学研究。
Claims (2)
1.双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002，该菌株已于2014年1月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8809。
2.活性发酵滤液，经过如下步骤得到：
①权利要求1所述的双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002采用改良MRS培养基培养，培养基配方为：取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·4H2O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温-80 1mL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6.5，115℃高压灭菌15-20分钟；
②将权利要求1所述的双歧杆菌(Bifidobacterium sp.)WZ002接种于冷却至40±2℃的步骤①改良MRS培养基中，菌种接种量为0.2～0.5％，35±2℃厌氧培养24小时，用分光光度计测定上述培养液A580nm值为1.2时，将上述培养液在转数5000～8500rpm下离心10分钟后，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，即得到活性发酵液滤液，4℃保存备用。
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