CN111601895A

CN111601895A - 启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途

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Publication number: CN111601895A
Application number: CN201880084821.4A
Authority: CN
Inventors: 金容仁; 宋芝闰; 尹智爱; 赵胜纪; 卢炫辰
Original assignee: Medy Tox Inc
Current assignee: Libiwei Co ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2038-11-08
Also published as: KR101992345B9; EP3732292A4; US11661445B2; JP7189218B2; JP2022180395A; JP2022180396A; JP2021508464A; KR101992345B1; CN111601895B; WO2019132231A1; US20230295249A1; US20200339637A1; EP3732292A1

Abstract

本发明涉及一种启动子多核苷酸、信号多肽和将其编码的多核苷酸以及其用途。包括启动子多核苷酸和编码信号多肽的多核苷酸的载体和宿主细胞可以有效地表达和/或在细胞外分泌外源蛋白质。

Description

启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年12月29日提交的韩国专利申请号10-2017-0184819的优先权和权益,其通过引用合并于此用于所有目的,如同在此完全阐述一样。

技术领域

本发明涉及一种启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途。

背景技术

作为用于重组表达的宿主，诸如细菌、酵母和真菌等的微生物正变得越来越重要。

诸如乳杆菌属(Lactobacillus)或链球菌属(Streptococcus sp.)的细菌可以用作递送工具。通常被认为安全的GRAS(Generally Recognized As Safe)微生物可以施用于人类或动物。

为了在乳酸菌中实现高水平的外源产物表达，需要可以从乳酸菌中分离并以高水平表达和分泌外源产物，特别是蛋白质的新型启动子和信号多肽。

发明内容

本发明一方面提供一种分离的启动子。

本发明另一方面提供一种重组多核苷酸，其包括所述启动子。

本发明另一方面提供一种宿主细胞，其包括所述重组多核苷酸。

本发明另一方面提供一种使用所述宿主细胞生产产物的方法。

本发明另一方面提供一种分离的信号多肽和将其编码的多核苷酸。

本发明另一方面提供一种重组多核苷酸，其包括编码所分离的信号多肽的多核苷酸。

本发明另一方面提供一种宿主细胞，其包括编码所分离的信号多肽的重组多核苷酸。

本发明另一方面提供一种使用宿主细胞生产蛋白质的方法，其中，所述宿主细胞包括编码所分离的信号多肽的重组多核苷酸。

附图说明

通过与附图结合来考虑,这些或/其他方面将根据具体实施例的以下描述变得显而易见且更容易理解。

图1为大肠杆菌和乳酸菌之间的穿梭载体pMT48的结构图。

图2为pMT54-PR4-IL10-SP4载体的结构图。

图3为在用pMT54-PR4-IL10-SP4载体转化三种乳酸菌后确认细胞外表达水平的结果。

图4为在用pMT54-PR4-amylase-SP4载体转化LMT1-21菌株后确认细胞外表达水平的结果。

图5为通过测量pMT54-P11-IL10-SP4和pMT54-PR4-IL10-SP4载体中IL-10的mRNA水平来比较启动子强度的结果。

图6为通过确认由用pMT54-PR4-IL10-SP4和pMT54-PR4-IL10-USP45转化的LMT1-21分泌的IL-10的量来比较信号肽强度的结果。

具体实施方式

本发明一方面提供一种分离的启动子，其包括与SEQ NO.1(以下也称为“PR4启动子”)的核苷酸序列具有至少85％的序列同源性的多核苷酸。

本发明另一方面提供一种重组多核苷酸，其包括所述启动子。在本说明书中，“启动子(promoter)”是指RNA聚合酶结合并起始转录的核酸分子，特别是DNA分子上的区域。启动子通常位于由启动子调节的转录序列的上游，即，5′。所述启动子可以为组成型启动子(constitutive promoter)。所述启动子可以与SEQ NO.1的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性。所述启动子可以具有SEQ NO.1的核苷酸序列。

所述重组多核苷酸可以为载体。在本说明书中，“载体(vector)”是指可以繁殖(propagate)与其连接的其他核酸的核酸分子。所述载体不仅包括插入所引入的宿主细胞的基因组中的载体，还包括作为自我复制核酸结构(self-replicating nucleic acidstructure)的载体。表达载体(expression vector)是指可以指导与其可操作地连接的核酸的表达的载体。所述载体可以为质粒或病毒来源的载体。

所述载体可以为克隆载体或表达载体。所述表达载体可以包括编码可操作地连接至所述启动子的蛋白质的核苷酸序列。

所述表达载体可以包括所述启动子；以及包括编码可操作地连接至所述启动子的产物的核苷酸序列的第一多核苷酸。所述产物包括可以通过表达第一多核苷酸而产生的任何产物。所述产物可以为多肽或核酸。所述多肽可以为细胞因子如IL-10或酶如淀粉酶。所述核酸可以为DNA或RNA。

在本说明书中，术语“可操作地连接(operably linked)”是指可以进行转录或翻译以产生功能性转录或翻译产物的连接。

所述载体可以进一步包括选自核糖体结合位点(ribosomal binding site，RBS)、克隆位点(cloning site)、选择标记基因(selection marker gene)、转录终止子和翻译起始因子中的至少一个。所述克隆位点可以与所述启动子可操作地连接。所述克隆位点可以为多克隆位点。

在所述重组多核苷酸中，编码包括与SEQ NO.2(以下也称为“SP4信号多肽”)的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的信号多肽的第二多核苷酸可以在所述启动子与第一多核苷酸之间可操作地连接。此时，所述第一多核苷酸可以编码多肽。

在本说明书中，“信号多肽(signal polypeptide)”是指存在于分泌蛋白质前体的N末端侧但不存在于天然存在的成熟蛋白质的序列。所述信号多肽可以从蛋白质前体切下。通常，当细胞外分泌时，信号多肽被蛋白酶切割。所述蛋白酶通常也称为信号肽酶(signalpeptidase)。所述信号多肽可以与SEQ NO.2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性。所述信号多肽具有可以使与将其编码的核苷酸序列在框内连接的基因表达产物在细胞外分泌的活性。

在本说明书中，蛋白质或多肽分子的“分泌(secretion)”是指将蛋白质或多肽分子转运到细菌细胞外(outside)，其包括：蛋白质或多肽分子以完全游离的形式存在于培养基中；蛋白质或多肽分子中只有一部分存在于细菌细胞外；以及蛋白质或多肽分子存在于细菌细胞的表面层上。

所述信号多肽源自副干酪乳杆菌，并可以具有促分泌能力。第二多核苷酸可以具有SEQ NO.3的核苷酸序列。

本发明另一方面提供一种宿主细胞，其包括所述重组多核苷酸。所述宿主细胞可以为细菌细胞。所述细菌细胞可以为革兰氏阳性细菌。所述细菌细胞可以属于乳酸菌或埃希氏菌属。所述乳酸菌可以属于乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、片球菌(Pediococcus)或肠球菌(Enterococcus)属。

所述重组多核苷酸可以通过常规核酸导入方法导入所述宿主细胞。核酸导入方法包括电穿孔、转化、转导或转染。

本发明另一方面提供一种产物或其代谢产物的生产方法，其包括：通过在培养基中培养所述宿主细胞来生产产物；以及从培养物中分离所述产物或其代谢产物。所述产物包括可以通过表达第一多核苷酸而产生的任何产物。所述产物可以为多肽或核酸。所述多肽可以为细胞因子如IL-10或酶如淀粉酶。所述核酸可以为DNA或RNA。所述代谢产物可以为通过所述产物在细胞中发挥其活性而产生的物质。例如，当所述产物为酶时，所述代谢产物可以为通过发挥其酶活性而产生的直接产物或从该酶所属的代谢途径产生的物质。

在所述方法中，所述培养可以根据所选的宿主细胞通过本领域已知的常规方法来进行。所述培养中使用的培养基可以单独或以混合物的形式包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉；油和脂肪，诸如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、椰子油等；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸；以及有机酸，诸如甘油、乙酸作为糖源。所述培养基可以单独或以混合物的形式包括例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵作为氮源。所述培养基可以包括例如磷酸氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。所述培养基可以包括例如生长所需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。另外，在所述培养中，可以将如氨基酸和维生素的生长所需的物质或合适的前体加入培养物中。所述物质可以在培养期间以适当的方式，例如分批或连续的方式添加到培养物中。

所述培养可以在有氧条件、微氧条件、厌氧条件或其组合条件下进行。

所述方法可以进一步包括：从培养物中分离所述产物。所述分离可以根据所选产物的类型选择合适的方法。当所述产物为蛋白质时，所述分离可以包括：通过离心分离培养液来除去细胞并将从上清液中分离蛋白质，或通过回收和破碎细胞来分离蛋白质。所述分离可以经历盐析、沉淀、色谱、离心分离和过滤中的至少一种过程。所述色谱可以为阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻和亲和性色谱中的至少一种。

本发明另一方面提供一种分离的信号多肽，其包括与SEQ NO.2的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。所述信号多肽可以与SEQ NO.2的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同源性。

本发明另一方面提供一种编码所述信号多肽的多核苷酸。编码所述信号多肽的多核苷酸可以具有SEQ NO.3的核苷酸。

本发明另一方面提供一种表达载体，其包括启动子；可操作地连接至所述启动子的编码所述信号多肽的第二多核苷酸；以及与所述第二多核苷酸在框内连接的编码蛋白质的第一多核苷酸。

本发明另一方面提供一种宿主细胞，其包括所述表达载体。所述宿主细胞可以为细菌细胞。所述细菌细胞可以为革兰氏阳性细菌。所述细菌细胞可以属于乳酸菌或埃希氏菌属。所述乳酸菌可以属于乳杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、链球菌(Streptococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、片球菌(Pediococcus)或肠球菌(Enterococcus)属。

本发明另一方面提供一种蛋白质的生产方法，其包括：通过在培养基中培养所述宿主细胞来生产蛋白质；以及从培养物中分离所述蛋白质。

所述方法可以进一步包括：从培养物中分离所述蛋白质。所述分离可以包括：通过离心分离培养液来除去细胞并将从上清液中分离蛋白质，或通过回收和破碎细胞来分离蛋白质。所述分离可以经历盐析、沉淀、色谱、离心分离和过滤中的至少一种过程。所述色谱可以为阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻和亲和性色谱中的至少一种。

根据本发明一方面，分离的启动子以及将其包括的重组多核苷酸可以用于有效表达外源基因。

根据本发明另一方面，包括所述重组多核苷酸的宿主细胞可以用于有效地表达外源基因。

根据本发明另一方面，使用所述宿主细胞来生产产物的方法可以用于有效地生产产物。

根据本发明另一方面，分离的信号多肽、将其编码的多核苷酸以及将其包括的重组多核苷酸可以用于在细胞外分泌外源蛋白。

根据本发明另一方面，包括重组多核苷酸的宿主细胞可以有效地在细胞外分泌外源基因的产物，其中所述重组多核苷酸包括编码分离的信号多肽的多核苷酸。

根据本发明另一方面，使用所述宿主细胞来生产蛋白质的方法可以用于有效地生产蛋白质。

以下将详细参考具体实施例,其示例在附图中示出,并且,在整个说明书中,附图中类似的参照号代表类似的要素。因此,这些具体的实施例可以具有其他不同的形式而不应被解释为限于本说明书中公开的说明。因此,在下面参照附图来简单地说明具体实施例,以说明本发明的各方面。

本发明将参考实施例以详细描述下文。然而，这些实施例是为了描述本发明，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1：确认启动子和信号多肽的克隆以及其效果

1.启动子和信号多肽的克隆

使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction:PCR)来扩增编码启动子和信号多肽的核苷酸序列。具体地，将副干酪乳杆菌LMT1-21(保藏号：KCTC13422BP)的基因组用作模板并使用引物进行PCR，以获得593kb大小的扩增产物。所使用的引物为PS4_F/R(SEQNO.4和5)。

将所述扩增产物通过Infusion cloning(Clontech)连接至用EcoRV和SalI消化的pMT54载体。然后，用Sambrook等人的方法(Sambrook et al.Molecular cloning：Alaboratory Manual，2nd edition，1989)将所述载体转化到大肠杆菌Top10菌株(Invitrogen)中。然后，将转化的大肠杆菌涂抹在添加有10μg/ml氯霉素的LB平板上以获得菌落。从所获得的菌落中回收pMT54载体并测序。结果，确认了包括编码PR4(SEQ NO.1)-SP4的核苷酸序列(SEQ NO.3)。在下文中，将该载体分别称为pMT54-PR4-SP4载体。

所述pMT54载体为将多克隆位点(SEQ NO.6)导入pMT48载体的HindIII酶和XhoI酶位点的载体。所述多克隆位点使用人流感血凝素(human influenza hemagglutinin，HA)来标记以确认多个限制酶识别位点和靶蛋白质的表达。在pMT48载体中，将作为质粒pLMT1-74的复制起点序列的Rep基因(SEQ NO.7)导入pUC19(New England Biolabs)的EcoRI位点。pMT48载体的构建如下。

首先，使用质粒中提试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，美国加利福尼亚州瓦伦西亚市)，从分离自泡菜的LMT1-74菌株(Leuconostoc mesenteroides KCTC 13164BP)中分离暂定的质粒pLMT1-74。通过以质粒pLMT1-74作为模板且以SEQ NO.8和9的寡核苷酸作为引物进行PCR来扩增了作为质粒pLMT1-74的复制起点序列的Rep基因(SEQ NO.7)。扩增后的产物用EcoRI消化，并连接至用相同酶消化的pUC19，以获得pMT48载体。另外，SEQ NO.7的多核苷酸也可以化学合成。载体pUC19具有SEQ NO.10的核苷酸序列。

图1为大肠杆菌和乳酸菌之间的穿梭载体pMT48的结构图。在所述载体中，Rep具有SEQ NO.7的核苷酸序列，是作为广泛乳酸菌宿主载体pLMT1-74的复制起点的Rep起源序列的部分序列，并赋予乳酸菌复制能力。E.coli ori是大肠杆菌的DNA复制起点，具有pUC19ori，即，SEQ NO.11的核苷酸序列。CM是编码氯霉素乙酰基转移酶的基因，并且是氯霉素抗性基因。

2.靶蛋白质IL-10的克隆

(1)制备实验组载体：pMT54-PR4-IL10-SP4载体

IL-10基因(SEQ NO.12)的合成委托外部公司(Macrogen公司，韩国)进行。用限制酶SalI和XhoI处理所合成的所述基因片段和所述pMT54-PR4-SP4载体，以切割所述载体的克隆位点。所切割的产物用凝胶纯化试剂盒(Bioneer公司)纯化，然后用碱性磷酸酶去磷酸化。向如此准备的所述载体DNA1μl、所述基因(IL-10)3μl、T4 DNA连接酶(Takara公司)0.5μl和缓冲溶液1μl的混合物添加蒸馏水5.5μl以制备总量为10μl的反应混合物。将所述反应混合物在16℃下孵育12小时，并将所述基因连接至所述载体的克隆位点。以与上述相同的方式将所获得的连接产物转化到大肠杆菌Top10菌株中，并确认了其序列。结果，确认了所述基因的导入，并将其命名为pMT54-PR4-IL10-SP4载体。图2为pMT54-PR4-IL10-SP4载体的结构图。在图2中，启动子、信号肽和靶基因分别代表PR4、SP4和IL-10。所述载体为大肠杆菌和乳酸菌穿梭载体，并包括大肠杆菌复制起点(origin)、乳酸菌复制起点(rep gene)和氯霉素抗性基因。启动子、信号肽、靶基因、HA标签和His标签在多克隆位点连接。

(2)制备对照组1载体：pMT54-PR4-IL10-USP45载体

除了用USP45多核苷酸替换编码信号多肽的多核苷酸SP4以外，制备了与实验组载体相同的载体。这是为了确认不同信号多肽在相同启动子中对IL-10蛋白质细胞外分泌的影响。

具体地，通过以pMT54-PR4-IL10-SP4载体作为模板且以SEQ NO.13和14的寡核苷酸作为引物进行PCR来扩增了所述载体中除SP4以外的部分。合成了编码USP45的多核苷酸(SEQ NO.15)(Macrogen公司，韩国)。通过Infusion cloning方法来连接所述扩增产物和编码USP45的多核苷酸，并将其导入大肠杆菌以进行克隆pMT54-PR4-IL10-USP45载体。USP45为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)来源的信号多肽，已知在诸如同源性蛋白酶(homologous proteinase：PrtP)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的α-淀粉酶的分泌蛋白质产物中发挥作用(van Asseldonk M1等，Mol GenGenet.1993Sep；240(3)：428-34)。

(3)制备对照组2载体：pMT54-P11-IL10-SP4载体

除了用P11启动子替换启动子PR4以外，制备了与实验组载体相同的载体。这是为了确认不同启动子在信号多肽中对IL-10蛋白质表达的影响。P11为在植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)具有强转录起始活性的合成启动子(Lars Axelsson，Microbiology(2006)，152，1011-019)。

具体地，通过以pMT54-PR4-IL10-SP4载体作为模板且以SEQ NO.16和17的寡核苷酸作为引物进行PCR来扩增了所述载体中除PR4以外的部分。合成了P11启动子(SEQ NO.18)(Macrogen公司,韩国)。通过Infusion cloning方法来连接所述扩增产物和P11启动子，并将其导入大肠杆菌以进行克隆pMT54-P11-IL10-SP4载体。

3.转化和IL-10蛋白质表达

(1)确认pMT54-PR4-IL10-SP4载体IL-10蛋白质表达

将pMT54-PR4-IL10-SP4载体和pMT54-P11-IL10-SP4载体分别转化到三种乳酸菌。三种乳酸菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KCTC 13422BP、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KCTC 13421BP和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)KCTC13423BP，均从泡菜中分离。这些菌株也分别称为LMT1-21、LMT1-9和LMT1-46。

将所述每种菌株在50mL的MRS培养基(Difco公司，美国)中培养直至OD₆₀₀达到0.5，然后在4℃和7000rpm下离心分离10分钟。并用25mL冷EPS(EPS：含有1mM K₂HPO₄、1mMKH₂PO₄、pH7.4、1m MgCl₂和0.5M蔗糖)洗涤细胞团块两次。

洗涤后，将细胞重悬于1mL冷EPS，制备用于电穿孔的感受态细胞，并储存在-80℃的深冷柜(deep freezer)中。将感受态细胞40μl和每个载体DNA(1μg/μl)1μl放入比色皿，并在冰上放置5分钟。在25μF、8kV/cm、400欧姆条件下施加电脉冲后，立即添加到1mL MRS液体培养基中，并在37℃下培养1小时。然后，将所培养的细胞涂抹于含有10μg/ml氯霉素的MRS培养基，并在37℃下培养48小时。

图3为在用pMT54-PR4-IL10-SP4载体转化三种乳酸菌后确认细胞外表达水平的结果。在图3中，作为对照组的载体，使用pMT54-P11-IL10-USP45替换pMT54-PR4-IL10-SP4。

如图3所示，pMT54-PR4-IL10-SP4载体在三种乳酸菌中细胞外表达IL-10蛋白质，而在对照组没有表达。这表明PR4启动子起到表达基因的作用，并SP4信号肽具有将所表达的蛋白质分泌到细胞外的显著效果。

(2)mRNA水平的表达：确认启动子的强度

将pMT54-PR4-IL10-SP4载体和pMT54-P11-IL10-SP4载体以与(1)相同的方法转化到副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KCTC 13422BP(LMT1-21)乳酸菌中。

将导入了如此获得的所述载体的菌株在37℃的MRS液体培养基中静置培养16小时。将1ml培养物以7000rpm离心分离5分钟后，弃去上清液并取出细胞团块。根据制造商的说明，使用RNA制备试剂盒(Macherey-nagel，目录号740955.50)提取mRNA。以100ng的mRNA为模板合成cDNA。使用Bioneer的Roketscript cycle RT premix来进行cDNA合成。通过以所合成的cDNA作为模板且以SEQ NO.20和21的寡核苷酸作为引物来进行实时(Real time:RT)-PCR。根据制造商的说明，使用SYBR premix(takara，RR820B)进行RT-PCR。

图5为以转化细胞来源的cDNA作为模板的RT-PCR的图。如图5所示，与用pMT54-P11-IL10-SP4载体，即，对照组载体转化的副干酪乳杆菌KCTC13422BP菌株相比，用pMT54-PR4-IL10-SP4载体转化的菌株显示明显更高的IL-10mRNA水平。这表明PR4启动子比P11启动子驱动转录更强。作为分析相对转录水平的结果，图5中Y轴上的“2ΔΔCT”显示与对照组相比更高的转录水平。

(3)蛋白质水平的表达：确认信号肽的强度

将所述pMT54-PR4-IL10-SP4载体和pMT54-PR4-IL10-USP45载体以与(1)相同的方法转化到副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KCTC 13422BP(LMT1-21)乳酸菌中。

将导入了如此获得的每种载体的菌株在37℃的MRS液体培养基中静置培养16小时。将培养物以3(v/v)％接种到MRS液体培养基中，然后在相同温度下静置培养8小时。将1ml培养物以7000rpm离心分离5分钟，并取出上清液。向1ml上清液添加100μl三氯乙酸并在4℃下静置1小时以浓缩培养成分。在4℃和13000rpm下离心分离反应物10分钟后，将团块用1ml冷丙酮洗涤一次，在室温下干燥10分钟，并用100μl的Tris-HCl缓冲液(pH 8.8)洗脱。

向洗脱液添加4x上样缓冲液(Thermo)和10x还原剂(Thermo)后，在SDS-PAGE凝胶上进行电泳。使用Trans blot semi-dry cell(bio-rad)将所述凝胶转移至硝酸纤维素膜，并进行免疫印迹法。具体地，用含有1％脱脂乳(skim milk)的TBST缓冲液封闭所述膜1小时，在室温下反应抗HA抗体(santa cruz)2小时。用TBST洗涤三次，每次洗涤5分钟，然后使用ECL进行检测。在pMT54-PR4-IL10-SP4载体中，IL-10基因在其3′末端侧与HA基因可操作地连接，从而以HA标记的状态表达。

图6为通过确认由用pMT54-PR4-IL10-SP4和pMT54-PR4-IL10-USP45转化的LMT1-21分泌的IL-10的量来比较信号肽强度的结果。如图6所示，与USP45信号肽相比，分泌了更多表达SP4信号肽的蛋白质。

实施例2：使用PR4启动子和SP4序列表达淀粉酶基因

除了使用α-淀粉酶基因(SEQ NO.19)和引物F/R(SEQ NO.22和23)替换IL-10基因外，通过与实施例1中第2节和第3节相同的步骤制备pMT54-PR4-amylase-SP4载体，并将其转化到副干酪乳杆菌(L.paracasei)LMT1-21中以确认α-淀粉酶的细胞外表达水平。使用噬淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus，KCTC3597)的基因组DNA来进行α-淀粉酶基因扩增。

通过碘测试检测转化的LMT1-21菌株的淀粉酶活性度。首先，将导入了pMT54-PR4-amylase-SP4载体的LMT1-21菌株在37℃的MRS液体培养基中静置培养12小时。然后将培养物以小斑点的大小涂布于含0.5％可溶性淀粉和10mg/l氯霉素的MRS平板。将其在37℃下静置培养12小时，使得淀粉酶可以充分降解淀粉。然后，将卢戈氏碘溶液(碘/碘化钾溶液)均匀地涂布在所述MRS板上，以与未降解的淀粉反应。由于淀粉酶活性越低，残留的淀粉量越多，因此碘-淀粉的反应强烈并变成紫色；相反，由于淀粉酶活性越高，细胞周围残留的淀粉量越少，因此形成透明的圆。

图4为在用pMT54-PR4-amylase-SP4载体转化LMT1-21菌株后确认细胞外表达水平的结果。在图4中，除了使用P11启动子替换PR4且使用USP45替换SP4外，对照组的载体与pMT54-PR4-amylase-SP4载体相同。

如图4所示，使用pMT54-PR4-amylase-SP4载体的实验组由于在LMT1-21菌株中胞外表达α-淀粉酶而形成大的透明环，但对照组则由于没有表达而其环很小。这表明PR4起到表达淀粉酶基因的作用，并且SP4增强细胞外分泌的能力。

应理解,在本说明书中描述的实施例仅是描述性的,而其目的不在于限制本公开。对各实施例中的特征或方面的描述应被视为可适用于其他实施例中的类似特征或方面。

尽管参照附图描述了一个或多个实施例,本领域的普通技术人员应当理解在不脱离附加的权利要求书所公开的本公开的技术思想和范围的同时实施在形式和细节上的各种变化。

<110> 玫帝托克斯股份有限公司

<120> 启动子多核苷酸、信号多肽以及其用途

<130> PN119873KR

<160> 23

<170> KopatentIn 2.0

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<400> 1

tcgtcacggc gctgcttttt tcatacaaaa t 31

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 副干酪乳杆菌LMT1-21

<400> 2

Met Lys Phe Asn Lys Val Met Ile Thr Leu Val Ala Ala Val Thr Leu

1 5 10 15

Ala Gly Ser Ala Ser Ala Val Thr Pro Val Phe Ala Asp Thr Ser

20 25 30

<210> 3

<211> 93

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌

<400> 3

atgaaattca ataaagtcat gatcacgttg gttgctgcag ttaccttagc aggttctgct 60

agcgccgtaa caccagtttt cgctgataca agc 93

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

tctgcaggat atccgatcgt ccacaatcaa ggtgcttgg 39

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

ttactggcag gtcgacgctt gtatcagcga aaactgg 37

<210> 6

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 克隆位点

<400> 6

aagcttctgc aggatatcgt cgacgcggcc gcagatctca tatggagctc cccgggggat 60

cctctagaac tagtgcatgc cgatcggcta gcctcgag 98

<210> 7

<211> 1723

<212> DNA

<213> 肠膜明串珠菌KCTC 13164BP

<400> 7

tctgcttttt ggggtttgaa accgtcgttt tttcgacggt ttcttcttat cttgatacta 60

ttagaaacaa cgtcattttc aaaaagtgag gtaaaccctt gacacaactg ggtttaggcg 120

tattattgtg gtataaaata aatataaaaa aaacccacgt gagcttcgaa agtttgccga 180

cctcgaacgc gtgagttaat cttgtaaaaa tcgtatttgg atttactaga catagtttaa 240

agcttgaacc ctttgccgtc aagccttctg actgatttaa gtgaagcaag tacataacag 300

attaactctt ctcacgtggt tggtgagggg agtttttatt ttggctaatg aaaaagtctt 360

ggttgatcgg tcaaagtcag ggaaagttcg gccgtggcgg gagcgcaagt tggagaactt 420

gcagtatggt gactatttac aaatattgca ttataagaaa gctcatcgag ttaaagaatg 480

tggcgaagtt ttgcgttttg tggaagataa aaatggtcac aagaaattgg cgcagacttg 540

gttttgccat tctcgtttgt gtccgttatg taattggcgg cgggcaatga agcaatccaa 600

tcagttaaca cagattttga cggaagctgt taaacaacga aagacgggcc ggttcttatt 660

tttaacgttg acggttgaga atacaactgg tgatcaattg aagagtgagt tacgtcaaat 720

gggacgagct gttgcaaaaa tttttcagta tacaaaagtt gccaaaaatt tattgggcta 780

tgtacgttcg actgaagtga ctgttaatca tgaagcgggt cagccaatgt accaccatca 840

tatgcatgtt ttgctttttg tgaagaacca ttattttaag gggactgata actatatttc 900

acaagtagaa tggactggtt tttggcaacg ggcaatgaaa ttgacttatg taccaatggt 960

gaatgttgag gcagttaaac cgaatatgaa tcgccataaa aattcgttat tggctagtgc 1020

tcaagaaacg gctaaatatc aggtaaaatc taaagatatt ttgactaata atcaagaaca 1080

agacctacaa gtaattgatg atttggaacg agctttggct ggttcccggc aaattagcta 1140

tggcggtttg ctgaaagaaa ttcgcaagca gttgcaatta gaagacgttg agaatggtga 1200

tttgattaat acggatagtg atgatcaaaa ggttgaccaa gtggtacgcg agattgttgc 1260

taaatgggat tatcaaagaa aaaattattt tacattaaat gagttttgaa atctttaatg 1320

caaaataatt tttaggactt ttaatgtgca ataattttat gacacaatta ttttttgttt 1380

tgattctttt aatatttgac tttgtccctg gatacgccat tcattttttt ggggattccc 1440

aagaagggtt tgaattacta gataatataa tttcttttct gagttgtata attccacatt 1500

gtctattctt actgctaatg tttctgaata gtcaagttgt tttacttttt gttgtcttcc 1560

tgtttcttgc cactttggat ttgcttccat ttttaagatc tactcctttt gtttttattt 1620

gtgtaactgt gtttattata ctcttgttta gattcaatat ctgacgtttt tgcctcgcag 1680

agctcaaact ttacgaagta aagtatattg ggctatacct tgc 1723

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLMT1-74rep- For

<400> 8

aattgaattc tctgcttttt ggggtttg 28

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLMT1-74rep- Rev

<400> 9

aattgaattc gcaaggtata gcccaatata c 31

<210> 10

<211> 2686

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pUC19载体

<400> 10

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acccggggat 420

cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 480

gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540

aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600

gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 1320

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2686

<210> 11

<211> 589

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 11

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420

taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaa 589

<210> 12

<211> 471

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 12

caatacagcc gagaggataa ctcttgcact cacttcccgg tgggccagag ccacatgttg 60

ttggaattaa gaacagcttt ctcacaggta aaaactttct tccaaacaaa ggatcagttg 120

gacaatattt tattgacaga ttcattgatg caagacttca aaggctattt gggttgccag 180

gcgcttagcg aaatgataca gttctatctt gtcgaggtga tgccgcaggc agagaagcat 240

ggccctgaga taaaagagca tttgaacagc ttgggagaaa aattgaaaac ccttcgtatg 300

agattacgac gttgtcatag attcttgccg tgcgagaaca agtcaaaggc tgtagagcaa 360

gtcaaaagcg actttaacaa attgcaggac caaggggtat acaaggcaat gaatgaattt 420

gacatcttta tcaactgcat agaggcgtac atgatgatta aaatgaagag t 471

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ttttgacctc acccttaa 18

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

caatacagcc gagag 15

<210> 15

<211> 81

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌

<400> 15

atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60

ccgttgtcag gtgtttacgc t 81

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gatacaagcg tcgaccaata cagccgagag 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ggaagcggag gtaccctcga gttatcaatg 30

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P11启动子

<400> 18

agatctagcg ctatagttgt tgacagaatg gacatactat gatatattgt tgctatagcg 60

60

<210> 19

<211> 2774

<212> DNA

<213> 噬淀粉乳杆菌

<400> 19

gctagtgata cgacatcaac tgatcactca agcaatgata cagctgattc tgttagcgac 60

ggtgttattt tgcatgcatg gtgctggtcg ttcaacacga ttaaaaacaa cttgaaacag 120

attcatgacg ccggctacac agcggttcaa acttcacctg ttaatgaagt taaagttgga 180

aatagcgggt ctaagtcatt aaataactgg tattggctat atcagccaac taaatatagt 240

attggtaact attatttagg aacggaagct gaatttaagt caatgtgcgc tgctgctaaa 300

gaatataata tcaggatcat tgtcgatgca actctgaatg atacaacaag tgattatagt 360

gcaatttcgg atgaaattaa aagtatttca gattggacac atggtaacac acaaatttcg 420

aattggagtg atcgtgaaga tgttactcaa aattcgttgt taggtttcta tgattggaat 480

actcaaaatt ctcaagttca gacgtatttg aagaatcatt tggaacgctt gatttctgac 540

ggagcttcag gcttccgtta tgatgcagct acgcatattg aacttccaag tcaatatgat 600

ggcagctatg gcagcaattt ctggccaaat attactgata atgggtctga atttcagtat 660

ggtgaagttt tgcaggactc gatttcaaaa gaatcagatt atgctaatta catgagtgtt 720

acagcttcaa attacggcaa tacgattcgc aatgcgttaa agaatcgtga ttttaccgca 780

agtactttgc agaatttcaa catcagtgtt ccagcttcta aattagtaac ttgggtcgaa 840

tcgcatgata attatgctaa cgatgatcaa gtttcgactt ggatgaatag tagtgatatt 900

aaattaggct gggctgttgt tgcttcgcgt tctggtagtg ttccgctgtt ctttgaccgt 960

ccagttgatg gtggtaatgg tactcggttc cctggcagtt cagaaattgg tgatgctggc 1020

agcagtttgt attatgataa agcagttgta gctgttaata aattccataa tgcaatggct 1080

ggtcaatctg aatatatttc taatccaaat ggcaatacca agatttttga aaatgaacgt 1140

ggcagcaaag gggttgtttt tgcaaacgct tccgacagtt catatagttt gaatgttaaa 1200

actagtttag ctgatgggac ttatgaaaac aaggctggtt cagatgaatt taccgttaaa 1260

aatggttatt taaccggtac aattcaagga cgtgaagttg ttgttcttta cggggatcca 1320

acaagcagca gcagtacaac aacagaaact aaaaaggttt attttgaaaa gccttcaagt 1380

tggggtagta gagtttatgc ctatgtttat aataaaaata cgaataaagc tataacttca 1440

gcttggcctg gcaaaaaaat gaccgcttta ggtaacgaca aatatgaatt ggatctcgac 1500

actgatgaag atgactctga tttagctgtt atctttaccg atgggacaaa gcaaacacca 1560

gcagctaatg aggctggttt tacctttacg gctgatgcca cttatgatca aaatggtgtc 1620

gtaaaaaagg tttattttga aaagccttca agttggggta gtagagttta tgcctatgtt 1680

tataataaaa atacgaataa agctataact tcagcttggc ctggcaaaaa aatgaccgct 1740

ttaggtaacg acaaatatga attggatctc gacactgatg aagatgactc tgatttagct 1800

gttatcttta ccgatgggac aaagcaaaca ccagcagcta atgaggctgg ttttaccttt 1860

acggctgatg ccacttatga tcaaaatggt gtcgtaaaaa aggtttattt tgaaaagcct 1920

tcaagttggg gtagtagagt ttatgcctat gtttataata aaaatacgaa taaagctata 1980

acttcagctt ggcctggcaa aaaaatgacc gctttaggta acgacaaata tgaattggat 2040

ctcgacactg atgaagatga ctctgattta gctgttatct ttaccgatgg gacaaagcaa 2100

acaccagcag ctaatgaggc tggttttacc tttacggctg atgccactta tgatcaaaat 2160

ggtgtcgtaa aaaaggttta ttttgaaaag ccttcaagtt ggggtagtag agtttatgcc 2220

tatgtttata ataaaaatac gaataaagct ataacttcag cttggcctgg caaaaaaatg 2280

accgctttag gtaacgacaa atatgaattg gatctcgaca ctgatgaaga tgactctgat 2340

ttagctgtta tctttaccga tgggacaaag caaacaccag cagctaatga ggctggtttt 2400

acctttacgg ctgatgccac ttatgatcaa aatggtgtcg taaaaaaggt ttattttgaa 2460

aagccttcaa gttggggtag tagagtttat gcctatgttt ataataaaaa tacgaataaa 2520

gctataactt cagcttggcc tggcaaaaaa atgaccgctt taggtaacga caaatatgaa 2580

ttggatctcg acactgatga agatgactct gatttagctg ttatctttac cgatgggaca 2640

aagcaaacac cagcagctaa tgaggctggt tttaccttta cggctgatgc cacttatgat 2700

caaaatggtg tcgtaagaac ttctgattca agcagcacat caagcaattc gtaagccgat 2760

accagcagtt catc 2774

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

aggcgcttag cgaaatgata 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ccttggtcct gcaatttgtt 20

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tgatacaagc gtcgacgcta gtgatacgac atcaactg 38

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

cggaggtacc ctcgagttat caatggtgat ggtgatggtg 40

Claims

1.一种分离的启动子，其包括与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的多核苷酸。

2.一种重组多核苷酸，其包括根据权利要求1所述的启动子。

3.根据权利要求2所述的重组多核苷酸，其中，所述重组多核苷酸为克隆载体或表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组多核苷酸，其中，所述表达载体包括可操作地连接至所述启动子的第一多核苷酸，并且所述第一多核苷酸包括编码产物的核苷酸序列。

5.根据权利要求4的重组多核苷酸，其中，所述产物为多肽。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的重组多核苷酸，其中，编码信号多肽的第二多核苷酸可操作地连接在所述启动子与所述第一多核苷酸之间。

7.一种宿主细胞，其包括根据权利要求2至6中任一项所述的重组多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞属于乳酸菌或埃希氏菌属。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述乳酸菌属于乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、链球菌、明串珠菌、魏斯氏菌、片球菌或肠球菌属。

10.一种产物或其代谢产物的生产方法，其包括：通过在培养基中培养权利要求7的宿主细胞来生产产物；以及从培养物中分离所述产物或其代谢产物。

11.一种分离的信号多肽，其包括与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。

12.一种编码根据权利要求11所述的信号多肽的多核苷酸。

13.一种载体，其包括启动子；可操作地连接至所述启动子的编码根据权利要求11所述的信号多肽的第二多核苷酸；以及与所述第二多核苷酸在框内连接的编码蛋白质的第一多核苷酸。

14.一种宿主细胞，其包括根据权利要求13所述的载体。

15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞属于乳酸菌或埃希氏菌属。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中，所述乳酸菌属于乳杆菌、乳球菌、双歧杆菌、链球菌、明串珠菌、魏斯氏菌、片球菌或肠球菌属。

17.一种蛋白质的生产方法，其包括：通过在培养基中培养根据权利要求14至16中任一项所述的宿主细胞来生产蛋白质；以及

从培养物中分离所述蛋白质。