CN102747084A

CN102747084A - 泛素蛋白内含子改造序列及其应用

Info

Publication number: CN102747084A
Application number: CN2012102514640A
Authority: CN
Inventors: 黄大昉; 郎志宏; 朱莉; 潘阳阳
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-07-19
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2032-07-19
Also published as: CN102747084B

Abstract

本发明通过对来源于玉米泛素蛋白基因ubil内含子进行改造，将该内含子特定位点突变为保守序列，提供了一种可以增强基因表达的内含子序列。本发明还提供了含有该改造的泛素蛋白基因ubil内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。

Description

泛素蛋白内含子改造序列及其应用

技术领域：

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种改造的泛素蛋白内含子序列。本发明还涉及该改造的内含子的应用。

背景技术：

大多数真核基因都被一个或多个内含子所间隔，这些间隔序列可以转录成pre-mRNA，这些转录本只有在细胞核中经剪接复合体的作用去除内含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿过核孔转移到细胞质中进行翻译。真核pre-mRNA的剪接是一个在细胞核中完成的、严格保守的化学反应，该过程包括：剪接体识别外显子-内含子连接区段，通过两步转酯反应切除内含子并使相邻的外显子连接。

已有研究发现，内含子在基因表达方面起着重要的调控作用。由内含子介导的使基因表达活性增强的效应叫做内含子增强效应（intron-mediated enhancement，IME）（Callis etal.，Genes Development，1987，1:1183-1200）。真核mRNA内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。

单子叶植物的内含子增强效应高于双子叶植物，双子叶植物内含子增强效应一般在2-5倍，而单子叶植物可达10-100倍（Simpson和Filipowicz,Plant Mol.Biol.，1996，32：1-41）。双子叶植物内含子可以提高单子叶植物基因的表达，而由于单子叶植物内含子与外显子AU的平均含量为59%和44%，双子叶植物的分别为74%和55%，高AU含量可以使内含子更易形成茎环结构从而有利于剪接，因此，单子叶植物内含子通常不会提高双子叶植物基因的表达（Vain et al.，Plant cell Rep,1996,15:489-494）。Ueki等将PLD、Cat和Ubi（玉米ubiquitin第一个内含子）内含子与不同启动子连接，分别转化玉米和烟草的原生质体，验证各个载体表达特点，结果发现，含有内含子载体的报告基因表达水平在玉米原生质体中普遍高于同样载体的烟草原生质体的表达水平，内含子载体增强效应与启动子、内含子和报告基因等紧密相关（Ueki et al.，Plant Biotech，2004，21(1)：15-24）。

现在人们普遍接受内含子像其他调控基因表达的顺式作用元件一样含有一定的关键序列，这些序列在调控中起到关键作用，而其余的序列对于调控来说并不是必需的。内含子的两个剪接位点5’GU--AG3’和分支位点的A碱基具有高度的保守性，在完成RNA正确剪接中是必须的。Rose等对拟南芥全基因组序列分析发现，内含子增强基序是分散排布，距离启动子近端的内含子增强效应高于其他位置，并且构建了一个增强序列识别器--IMEter，以此预测了拟南芥中内含子增强相关基序（见图1，Rose et al.,Plant cell,2008,20:543-551），并对水稻的内含子分析后发现这种增强基序具有一定的保守性。

泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的由76个氨基酸残基组成的高度保守的蛋白质。1992年，Christensen等从玉米中克隆出了编码泛素蛋白的Ubi-1和Ubi-2基因，并准确定位了Ubi-1的启动子、转录起始位点、5’侧翼序列处的0.9kb转录调控区和完整的5’非编码区，并构建pUBI-CAT载体，在玉米和其它单子叶植物的原生质体中进行验证，发现Ubi-1启动子比CaMV35S具有更高的增强基因表达的效应(Christensen et al.,PlantMol Biol，1992，18：675-689)。

Vain等通过比较发现，ubi1内含子与侧翼外显子的41nt所构建的载体（p35SubiGUS）在玉米悬浮细胞中的增强效应高于其它载体，增强效应可提高71倍(Vain et al.,Plant cellRep，1996，15：489-494）。王悦冰比较了玉米泛素蛋白基因的第一内含子（ubi1）、水稻肌动蛋白基因的第一内含子（act1）、玉米乙醇脱氢酶基因的第一内含子(adh1)和马铃薯高赖氨酸基因SBgLR基因的第二内含子(SBgLR2)对基因表达的增强作用，结果发现ubi1增强报告基因的表达能力最强。

目前尚未见到对ubi1内含子进行特定位点的突变，以获得增强基因表达能力更强的内含子序列的报道。

发明内容：

本发明的目的是对来源于玉米泛素蛋白基因ubi1内含子进行改造，提供一种可以增强基因表达的内含子，通过构建该改造的泛素蛋白内含子的植物表达载体，将其应用于转基因植物的培育中，可以提高其他基因在转基因植物中的表达。

本发明通过如下工作达到了上述发明目的：

1、内含子突变载体的构建策略

本发明以P5内含子序列（SEQ ID NO:1）为目标序列，增加内含子增强序列基序TCGATC的数量，改造ubi1-P5内含子，通过序列分析，将11-16bp、78-83bp、282-287bp和510-515bp依次突变为保守序列--TCGATC（SEQ ID NO:1中有下划线处为待突变位点）。

SEQ ID NO:1

1 GTACACGGAT GCGACCTGTA CGTCAGACAC GTTCTGATTG CTAACTTGCC AGTGTTTCTC

61 TTTGGGGAAT CCTGGGATGG CTCTAGCCGT TCCGCAGACG GGATCGATTT CATGATTTTT

121 TTTGTTTCGT TGCATAGGGT TTGGTTTGCC CTTTTCCTTT ATTTCAATAT ATGCCGTGCA

181 CTTGTTTGTC GGGTCATCTT TTCATGCTTT TTTTTGTCTT GGTTGTGATG ATGTGGTCTG

241 GTTGGGCGGT CGTTCTAGAT CGGAGTAGAA TTAATTCTGT TTCAAACTAC CTGGTGGATT

301 TATTAATTTT GGATCTGTAT GTGTGTGCCA TACATATTCA TAGTTACGAA TTGAAGATGA

361 TGGATGGAAA TATCGATCTA GGATAGGTAT ACATGTTGAT GCGGGTTTTA CTGATGCATA

421 TACAGAGATG CTTTTTGTTC GCTTGGTTGT GATGATGTGG TGTGGTTGGG CGGTCGTTCA

481 TTCGTTCTAG ATCGGAGTAG AATACTGTTT CAAACTACCT GGTGTATTTA TTAATTTTGG

541 AACTGTATGT GTGTGTCATA CATCTTCATA GTTACGAGTT TAAGATGGAT GGAAATATCG

601 ATCTAGGATA GGTATACATG TTGATGTGGG TTTTACTGAT GCATATACAT GATGGCATAT

661 GCAGCATCTA TTCATATGCT CTAACCTTGA GTACCTATCT ATTATAATAA ACAAGTATGT

721 TTTATAATTA TTTTGATCTT GATATACTTG GATGATGGCA TATGCAGCAG CTATATGTGG

781 ATTTTTTTAG CCCTGCCTTC ATACGCTATT TATTTGCTTG GTACTGTTTC TTTTGTCGAT

841 GCTCACCCTG TTGTTTGGTG TTACTTCTGC AG

载体构建策略如附图5所示。

经改造的P5内含子的序列，为SEQ ID NO:2。

2、突变载体pSG（13i-Mn）N的构建

首先以p7ZGUS（13i-P5）质粒为模板，以MP78F与MP78R为引物（表2），用宝生物工程有限公司的TaKaRa MutanBEST Kit进行定点突变，在P5内含子片段的78bp-83bp处引入突变位点TCGATC，转化后获得第一个中间突变载体，命名为p7ZGUS（13i-M1）中间载体；

再以此质粒为模板，MP11F与MP11R为引物（表2）在11bp-16bp引入第二个突变位点，命名为p7ZGUS（13i-M2）中间载体；

依次以MP282F与MP282R、MP510F与MP510R为引物（表1）分别在282bp287bp和510bp-515bp引入第三个和第四个突变点，获得p7ZGUS（13i-M3）中间载体和p7ZGUS（13i-M4）中间载体；见如下表1：

表1四个中间载体的构建情况一览

用BamHI和Sac I双酶切此四个中间载体，回收2.6kb大小的GUS基因片段和突变内含子片段，随后与同样双酶切的pSG(+13i)N骨架片段相连构建得到最终瞬时表达载体pSG(13i-M1)N、pSG(13i-M2)N、pSG(13i-M3)N和pSG(13i-M4)N（以下分别简称为M1、M2、M3和M4）（表2），载体构建所用引物见表2。

表2 ubi1内含子突变片段扩增所需引物

引物名称	引物序列	引物特征
			MP11F	TACACGGATTCGATCTGTACGTCAGAC	M2片段正向引物
MP11R	CCTGCAGAGGACGTAACATAAGGG	M2片段反向引物
			MP78F	ATCCTGGGATCGATCTAGCCGTTCCGC	M1片段正向引物
MP78R	TCCCCAAAGAGAAACACTGGCAAG	M1片段反向引物
			MP282F	TTAATTCTGTTTCGATCTACCTGGTGG	M3片段正向引物
MP282R	TTCTACTCCGATCTAGAACGACCGC	M3片段反向引物
			MP510F	GAATACTGTTTCGATCTACCTGGTGTAT	M4片段正向引物
MP510R	TACTCCGATCTAGAACGAATGAACG	M4片段反向引物

载体构建鉴定图见附图2和附图3，突变载体示意图见附图4。

3基因枪转化玉米愈伤组织的GUS检测

选取玉米胚性愈伤组织进行基因枪转化。轰击时用pUC19、pSGN和pSG（+13i）N作为对照载体，以此验证转化效率。

依次完成pUC19、pSG（+13i）N、pSG（13i-P5）N、pSG（13i-M1）N、pSG（13i-M2）N、pSG（13i-M3）N和pSG（13i-M4）N载体的基因枪转化。经轰击后的玉米愈伤组织在高渗培养基上过夜培养，之后转移到常规的诱导愈伤培养基上。36h后进行GUS的组织化学分析。

四个内含子突变载体轰击玉米的愈伤组织的GUS组织化学染色结果如附图6所示，染色效果明显表明：四个突变载体均染出较多蓝点，M1、M2、和M3载体与P5载体较为接近；M4载体蓝色最多，呈片状分布，说明其增强效应最强。

4、基因枪转化玉米愈伤组织的GUS荧光定量分析

将基因枪轰击的玉米愈伤组织进行GUS荧光定量分析，结果见附图7。四个内含子突变载体轰击玉米的愈伤组织的荧光定量分析结果与GUS组织化学染色效果相一致，实验表明：M4载体增强效应最强，是P5载体表达水平的两倍，是全长的ubiquitin第一内含子pSG（+13i）N载体表达水平的3倍；M1、M2、和M3载体与P5载体较为接近。结果表明，碱基突变影响内含子的增强效应，碱基突变引入的增强基序数目与增强效应呈一定的相关性，不同的突变点对增强效应影响不同，但某一突变所引发的增强效应尚不明确。

利用玉米愈伤组织瞬时表达系统，本研究获得了可以提高外源基因表达的新型内含子M4，M4内含子提高基因的表达水平已超过常用的ubiquitin1内含子，本发明获得的内含子可以用于植物表达载体的构建，在植物组织中提高外源基因表达水平。

附图说明：

图1是拟南芥中内含子增强基序与水稻的内含子增强基序；

图2和图3突变载体pSG（13i-Mn）N构建鉴定图；其中，图2是四个内含子突变载体pSG（13i-Mn）NPst I酶切图；图3是四个内含子突变载体pSG（13i-Mn）N Hind III和Eco RI酶切图

图4是构建的ubi1内含子突变载体pSG（13i-Mn）N示意图。

图5是P5内含子突变载体pSG（13i-Mn）N的构建策略；

图6是四个内含子突变载体轰击玉米愈伤组织的GUS组织化学分析；

图7是四个内含子突变载体轰击玉米愈伤组织的GUS荧光定量分析。

具体实施方式:

说明：以下所用到的部分生物材料的特征和来源如表3。

表3

实施例1突变载体pSG（13i-Mn）N的构建

首先以p7ZGUS（13i-P5）质粒为模板（表2），以MP78F与MP78R为引物（表1），用宝生物工程有限公司的TaKaRa MutanBEST Kit进行定点突变，在P5内含子片段的78bp-83bp处引入突变位点TCGATC，转化后获得第一个中间突变载体，命名为p7ZGUS（13i-M1）中间载体（表2）；

再以此质粒为模板，MP11F与MP11R为引物（表1）在11bp-16bp引入第二个突变位点，命名为p7ZGUS（13i-M2）中间载体（表2）；

依次以MP282F与MP282R、MP510F与MP510R为引物（表1）分别在282bp287bp和510bp-515bp引入第三个和第四个突变点，获得p7ZGUS（13i-M3）中间载体（表2）和p7ZGUS（13i-M4）中间载体（表2）；

用Bam HI和Sac I双酶切此四个中间载体，回收2.6kb大小的GUS基因片段和突变内含子片段，随后与同样双酶切的pSG(+13i)N骨架片段相连构建得到瞬时表达载体pSG(13i-M1)N、pSG(13i-M2)N、pSG(13i-M3)N和pSG(13i-M4)N（以下分别简称为M1、M2、M3和M4）（表2），载体构建所用引物见表1。

载体构建鉴定图见附图2和附图3，突变载体示意图见附图4。

2基因枪转化玉米愈伤组织的GUS检测

取授粉后10-12d的HiII玉米穗进行消毒处理，剥取1-2mm大小的幼胚转入N6培养基进行胚性愈伤组织的诱导，每15d将诱导的愈伤组织转入新鲜的N6培养基，对胚性愈伤组织进行扩繁，扩繁3-4次后，提前一周选取颜色鲜黄、质地松脆的II型愈伤组织转入新鲜的N6培养基以备基因枪转化使用，基因枪转化前4h将愈伤组织转入高渗培养基（N6培养基+0.4M甘露糖）中，用金粉颗粒包被质粒，每枪质粒用量为1μg，基因枪转化条件为1100psi，真空度为25-28inches Hg，射击距离9cm。

依次完成pUC19、pSG（+13i）N、pSG（13i-P5）N（简称为P5）、pSG（13i-M1）N、pSG（13i-M2）N、pSG（13i-M3）N和pSG（13i-M4）N载体的基因枪转化，每个载体轰击三枪，整个实验流程重复三次。轰击后的玉米愈伤组织在高渗培养基上过夜培养，第二天转移到常规的N6诱导愈伤培养基上；12h后随机选取轰击的愈伤组织，用GUS染色液进行GUS的组织化学分析。以不含有gus基因的质粒pUC19轰击的玉米愈伤作为阴性对照，含有gus基因和完整内含子的pSG（+13i）N载体为阳性对照。

GUS组织化学染色结果如附图6所示，染色效果明显表明：四个突变载体均染出较多蓝点，M1、M2、和M3载体与P5载体较为接近；M4载体蓝色最多，呈片状分布，说明其增强效应最强。

3、基因枪转化玉米愈伤组织的GUS荧光定量分析

选取轰击36h后的玉米愈伤组织用GUS蛋白提取缓冲液在液氮条件下进行研磨，4℃离心收集蛋白上清。取40μl蛋白上清，加入到37℃预热的400μl GUS蛋白反应缓冲液（GUS提取缓冲液+1mM MUG）中，立即取100μl加入到900μl反应终止液中，以此作为0时的空白对照；37℃避光温浴，分别在15min、30min和60min各取100μl，加入到900μl反应终止液，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝3nm条件下的HITACHIF-4500荧光分光光度计中测定各样品的荧光值，以4-MU标准样品绘制的曲线为标准，再用考马斯亮蓝法测定蛋白上清的总蛋白含量，最终以nmol MU/min*mg Pr表示GUS蛋白表达量。

基因枪轰击的玉米愈伤组织进行GUS荧光定量分析结果见附图7。四个内含子突变载体轰击玉米的愈伤组织的荧光定量分析结果与GUS组织化学染色效果相一致，实验表明：M4载体增强效应最强，是P5载体表达水平的两倍，是全长的ubiquitin第一内含子pSG（+13i）N载体表达水平的3倍；M1、M2、和M3载体与P5载体较为接近。结果表明，碱基突变影响内含子的增强效应，碱基突变引入的增强基序数目与增强效应呈一定的相关性，不同的突变点对增强效应影响不同，但某一突变所引发的增强效应尚不明确。

Claims

1.一种可以提高基因表达的内含子序列，其特征是具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的内含子序列在培育转基因植物中的应用。

3.一种提高内含子表达水平的方法，其特征是在内含子的特定位点进行突变。

4.权利要求3所述的方法，所述内含子是泛素蛋白内含子，所述突变是将SEQ ID NO：1中11-16bp、78-83bp、282-287bp和510-515bp分别突变为保守序列—TCGATC。

5.一种植物表达载体，其特征是含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

6.权利要求5所述的载体在培育转基因植物中的应用。